CZ303385B6

CZ303385B6 - Antitrombotická sloucenina

Info

Publication number: CZ303385B6
Application number: CZ20021958A
Authority: CZ
Inventors: Boeckel@Constant Adriaan Anton Van; Maria Tromp@Cornelia; Theodora Maria Geertsen@Tamara
Original assignee: Msd Oss B.V.
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2012-08-29
Also published as: BR0016217A; KR100776607B1; US20030114361A1; SK287682B6; EP1237897B1; IL149628A; AU781846B2; JP4820517B2; HUP0203471A2; PL355484A1; SK7942002A3; JP2003520208A; CO5251449A1; HUP0203471A3; PE20010935A1; KR20020070988A; CZ20021958A3; AU2003801A; NO20022689L; NZ519100A

Abstract

Pentasacharidové deriváty vzorce I, kde R je nezávisle SO.sub.3.n..sup.-.n. nebo CH.sub.3.n., mezerníková skupina je *-(CH.sub.2.n.CH.sub.2.n.O).sub.3.n.-(CH.sub.2.n.).sub.2.n.-NH-C(O)-(CH.sub.2.n.).sub.3.n.-NH-C(O)-CH.sub.2.n.-, pricemž konec oznacení * je navázán na pentasacharidový zbytek, farmaceutický prostredek je obsahující a jejich použití pri lécení nebo prevenci trombózy nebo jiných onemocnení souvisejících s trombinem.

Description

Předkládaný vynález se týká nové antitrombotické sloučeniny, farmaceutického prostředku s obsahem této sloučeniny jako účinné složky a použití této sloučeniny pro výrobu léků.

Dosavadní stav techniky

Serinové proteázy jsou enzymy, které mají důležitou úlohu v kaskádě krevní koagulace. Důležitou serinovou proteázou je faktor Xa, který katalyzuje konverzi protrobinu na trombin. Trombin je poslední enzym ze skupiny serinových proteáz v koagulační kaskádě. Hlavní funkcí trombinu je rozštěpení fibrinogenu za vytvoření fibrinových monomerů, které zesíťují za vytvoření nerozpustného gelu. Trombin navíc reaguje svou vlastní produkci aktivací faktorů V a VIII stojících v kaskádě dříve. Má také důležité účinky na buněčné úrovni, kde působí na specifické receptory pro agregaci destiček, aktivaci endoteliálních buněk a proliferaci fibroblastů. Trombin má tedy centrální regulační úlohu při hemostázi a tvorbě trombu.

Při vývoji syntetických inhibitorů serinových proteáz byl v poslední době ohlášen syntetický NAPAP-pentasacharidový konjugát jako antitrombotická látka s dvojím profilem, jednak přímým antitrombinovým účinkem, a zároveň anti-Xa aktivitou zprostředkovanou ATM (ATM: antitrombin III) (Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9 (14), 2013 - 8). I když může být tato ohlášená antitrombotická sloučenina zajímavá, s touto sloučeninou bude spojena zkřížená reaktivita s HIT a neutralizace PF4 v důsledku vysokého obsahu sulfátu pentasacharidového zbytku (Tromb. Haem. Suppl. 1997, str. 363 PD1485).

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že pentasacharidové deriváty vzorce jsou antitrombotické látky s vynikajícím a výhodným dvojitým profilem sloučeniny vzorce I mají farmakologicky zajímavý poločas umožňující podávání jednou za den a jsou obtížně neutralizovány působením PF4. Navíc je nízké riziko krvácení. Sloučeniny vzorce I tedy mají aktivní kombinaci farmakologických vlastností.

Vzorec I f—OR ’—O j—oso; ςοο-Κ» ;oc£> <OCH?j ** ^0R o ^r í o i och₃ es

OCHg j—vr .Ϊ—Ο

Λ __ori WóCH, ooM oso:

-OR [mezemíková skupina]

CH, !A.

H_aCO ii

NH (Π.

- 1 CZ 303385 B6 kde R je nezávisle SO₃' nebo CH₃;

mezerníková skupina je *-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-NH-C(OHCH₂)₃-NH-C(O)-CH₂-, přičemž konec označený * je navázán na pentasacharidový zbytek;

náboj pentasacharidového zbytku je kompenzován kladné nabitými protiionty; a celkový počet sulfátových skupin v pentasacharidovém zbytku je 4, 5 nebo 6;

ío nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, prekurzor nebo solvát.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčení a prevenci onemocnění podmíněných trombinem a souvisejících s trombinem. Patří sem řada trombotických a protrombotických stavů, pri kterých je aktivována koagulační kaskáda, které bez omezení zahrnují trombózu hlubokých žil, pticní embolii, tromboflebitídu, uzavření tepny způsobené trombózou nebo embolii, znovu uzavření tepny v průběhu nebo po angioplastice nebo trombolýze, restenózu po poranění tepny nebo invazních kardiologických postupech, postoperativní žilní trombózu nebo embolii, akutní nebo chronickou aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu, rakovinu a metastázy a neurodegenerativní onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako anti20 koagulanty v mimotělních krevních obězích nezbytných pri dialýze a chirurgických zákrocích. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako antikoagulanty in vitro.

Sloučeniny vzorce I jsou konkrétně použitelné jako antitrombotické látky pro arteriální indikace.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých má pentasacharidový zbytek následující strukturu:

Chemická povaha mezemíkové skupiny má pro antitrombotickou aktivitu sloučenin podle vynálezu nižší důležitost. Mezerníková skupina sloučenin podle vynálezu je však flexibilní, což zna30 mená, že mezerníková skupina neobsahuje rigidní prvky jako jsou nenasycené vazby nebo cyklické struktury. Vhodné mezemíkové skupiny mohou snadno navrhnout odborníci v oboru. Výhodné mezemíkové skupiny obsahují alespoň jeden prvek -(CH₂CH₂O)-. Výhodnější mezerníkové skupiny obsahují tri prvky -(CH₂CH₂O)-. Nej výhodnější mezerníková skupina je *-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)₃-NH-C(O)-CH₂-, přičemž konec označený * je navázán na pentasacharidový zbytek.

Výhodné sloučeniny vzorce I jsou sloučeniny vzorce Ia, kde p je 1 až 5, n je 1 až 5 a m je 1 nebo 2. Nej výhodnější sloučenina je sloučenina vzorce Ia, kde p je 3, n je 3 a m je I.

-2CZ 303385 B6

NH(la).

Kladně nabitý protiiont znamená H⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺, apod. Sloučeniny vzorce I jsou s výhodou ve formě sodných solí.

Termín prekurzor znamená sloučeninu podle vynálezu, ve které je aminová skupina v amidinové skupině chráněná, například skupinou hydroxy nebo (l-óC)alkoxykarbony 1. Mezi solváty podle vynálezu patří hydráty.

Sloučeniny podle vynálezu, které se mohou vyskytovat ve formě volné báze, mohou být z reakční io směsi izolovány ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Farmaceuticky přijatelné soli mohou být také získány působením organické nebo anorganické kyseliny jako je chlorovodík, bromovodík, jodovodík, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina methansulfonová, kyselina fumarová, kyselina jantarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina askorbová apod.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují chirální atomy uhlíku a mohou být tedy získány ve formě čistého enantiomeru nebo jako směs enantiomerů nebo jako směs obsahující diastereomery. Způsoby získávání čistých enantiomerů jsou v oboru dobře známé, a patří sem například krystalizace solí získaných z opticky aktivních kyselin a racemické směsi nebo chromatografie na chirálních kolonách. Pro diastereomery mohou být použity kolony s přímým nebo převrácenými fázemi.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny nejprve aktivací karboxylátové skupiny analogu NAPAP vzorce II a potom přidáním zbytku pentasacharid-mezemíková skupina obsahujícího aminovou skupinu vzorec III, popřípadě s následným odstraněním ochranné skupiny z amidinové skupiny.

-3CZ 303385 B6

HO

T o

[mezerníková skupina] | (Hl) nh₂

Karboxylátová skupina ve sloučeninách vzorce II může být aktivována jako směsný anhydrid nebo výhodněji jako aktivovaný ester jako je ester N-hydroxysukcintmidu, pentafluorfenolu nebo l-hydroxybenzotriazolu. Při kroku vazby může být benzamidinová skupina ve vzorci II zbavena ochranné skupiny (R-R=H), nebo na ni může být popřípadě navázána jako ochranná skupina karbamátová skupina, s výhodou allyloxykarbonýl (R* a/nebo R je H₂C=CH-CHC(O)O) nebo benzyloxykarbonyl (R' a/nebo R je pHCH2-<(O)O). Ochranné skupiny allyloxykarbonyl a benzyloxykarbonyl mohou být odstraněny za poměrně mírných podmínek. Skupina allyloxykarbonyl může být odstraněna použitím Pd v přítomnosti slabého nukleofilního činidla io jako je morfolin nebo ester kyseliny malonové. Skupina benzyloxykarbonyl může být odstraněna za podmínek jako je vodík/Pd(C). Alternativně je možno použít syntetické prekurzory benzamidinu jako je N-alkoxybenzamidin nebo N-benzyloxybenzamidin (R-H, R= alkoxy nebo benzyloxy). Tyto syntetické prekurzory mohou být převedeny na benzamidin za redukčních podmínek jako je hydrogenace (např. Fujii, T. a další, Chem. Pharm. Bull. 39, 301, 1991 a Fujii, T.a další,

Chem. Pharm., Bull., 42, 1231, 1994).

Výhodný prekurzor benzamidinu je l,2,4-oxadiazolin-5-on (-R’-R'^,-=-C(O)O-). Tento prekurzor může být převeden na benzamidin hydrogenací (Bolton, R.E. a další, Tetrahedron Letters, díl 36, No. 25, 1995, str. 4471 až 4474).

Sloučeniny vzorce II mohou být připraveny různými způsoby použitím v oboru známých metod. Způsob přípravy sloučenin vzorce II, kde R' = R = Η; n je 3 a m je 1, se popisuje v EP 0 513 543. Sloučenina vzorce II, ve kterých je amidinová skupina chráněná, například skupinou allyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl, mohou být připraveny ze sloučenin vzorce

IV, kde amidin je chráněný skupinou allyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl použitím metod obecně známých v boru pro vazby peptidových fragmentů. Karbamáty vzorce IV mohu být například vyrobeny z odpovídajícího amidinu (vzorec IV, R’ = R = H) jak je popsáno v literatuře, např. Weller, T. a další, J. Med. Chem. 39, 3119, 1996).

-4CZ 303385 B6

N-AIkoxybenzamidinové a N-benzyloxybenzamidinové sloučeniny vzorce II mohou být vyrobeny ze sloučeniny V (popsáno v EP 0 513 543) působením O-alkyl hydroxy laminu nebo Obenzylhydroxylaminu na tuto kyanovou sloučeninu a následným odstraněním t-butylesteru za kyselých podmínek. Alternativně se mohou N-alkoxybenzamidinové a N-benzyloxybenzamidi5 nové sloučeniny vzorce II připravit nejprve odstraněním t-butylesteru sloučeniny V za kyselých podmínek za získání sloučeniny VI a potom reakci této kyanové sloučeniny s O-alIylhydroxylaminem nebo O-benzylhydroxylaminem.

Sloučeniny vzorce II, ve kterých -R'-R- = -C(O)O- (skupina l,2,4-oxadiazolin-5-on), mohou io být připraveny ze sloučenin vzorce IV, ve kterých -R-R— -C(O)-, použitím způsobů známých v oboru pro vazbu peptidových fragmentů.

Syntéza zbytků aminoskupina-oligosacharid-mezemík vzorce III může být například prováděna použitím metod popsaných v EP 0 649 854. Sacharidové zbytky sloučenin podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby známými v oboru, například z WO 99/25720.

Peptidová vazba, krok ve výše popisované metodě pro přípravu sloučeniny podle vynálezu, může být prováděna metodami běžně známými v oboru pro vazbu - nebo kondenzaci - peptidových fragmentů, jako například azidovou metodou, metodou směsného anhydridu, metodou aktivova20 ného esteru nebo s výhodou karbodiimidovou metodou, zvláště s přidáním katalytických a racem i žací potlačujících sloučenin jako N—hydroxy sukcin i mid a N-hydroxybenzotriazol. Přehled těchto reakční se uvádí v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, díl 3, E. Gross a J, Meienhofer, ed. (Academie Press, New York, 1981) a Bodanszky, M,; Principles of peptide synthesis, Springer-Verlag, 1984.

Aminové funkční skupiny přítomné ve sloučeninách mohou být v průběhu postupu syntézy chráněny N-och rannou skupinou, která znamená skupinu běžně používanou v chemii peptidů pro ochranu α-aminoskupiny, jako je skupina Zerc-butyloxykarbonyl (Boc), skupina benzyloxykarbonyl (Z), skupina 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) nebo skupina ftaloyl (Phth).

Odstranění ochranných skupin se může provádět různými způsoby v závislosti na povaze těchto ochranných skupin. Odstraňování ochranných skupin obvykle probíhá za kyselých podmínek a v přítomnosti vy chytá vačů (scavengers). Přehled aminových ochranných skupin a způsoby jejich odstraňování je uveden ve výše uvedené publikaci The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, díl 3, a dále jak je popsáno v Greene, T.W. a Wuts, P. G. M., Protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons lne. 1991.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány enterálně nebo parenterálně. Přesná dávka a režim těchto sloučenin a prostředky s jejich obsahem budou nezbytně záviset na potřebách jednotlivce, kterému se farmaceutický prostředek podává, stupni postižení nebo potřebě a úsudku ošetřujícího lékaře. Parenterální podávání obecně vyžaduje nižší dávky než jiné způsoby podávání, které jsou více závislé na absorpci. Denní dávka pro člověka jsou s výhodou 0,001 až 100 mg na kg tělesné hmotnosti, výhodněji 0,01 až 10 mg na kg tělesné hmotnosti.

Farmaceutický prostředek vyráběný s použitím sloučenin podle předkládaného vynálezu může být také použit jako adjuvantní látka v akutní antikoagulační terapii. V takovém případě se farmaceutický prostředek podává spolu s jinými sloučeninami použitelnými při léčení těchto stavů onemocnění.

Ve směsi s farmaceuticky vhodnými pomocnými látkami, například jak se popisuje ve standardní referenční publikaci Gennaro a další, Remingtonů Pharmaceutical Sciences, (18. vydání, Mack Publishing Company, 1990, viz zvláště část 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), mohou být sloučeniny lisovány do pevných dávkových jednotek jako jsou pilulky, tablety, nebo mohou být zpracovány do kapslí nebo čípků. Použitím farmaceuticky vhodných kapalin mohou být také sloučeniny aplikovány ve formě roztoku, suspenze, emulze, například pro použití jako injekční preparát, nebo ve formě spreje, například pro použití jako nosní sprej.

-5CZ 303385 B6

Pro výrobu dávkových jednotek, například tablet, se uvažuje použití běžných pomocných látek jako jsou plniva, barviva, polymemí pojivá apod. Obecně může být použito jakékoli farmaceuticky přijatelné aditívum, které neinterferuje s funkcí účinných sloučenin.

Mezi vhodné nosiče, se kterými mohou být sloučeniny podávány, patří laktóza, škrob, deriváty celulózy apod., nebo jejich směsi použité ve vhodných množstvích.

Vynález bude dále ilustrován na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1
Použité zkratky:
Ac =	acetyl
Bn	benzyl
DBU	1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en
DCC	d i cy k lohexy 1 karbodi i m id
DMF	N,N-dimethylformamid
Su -	sukcinimidyl
Me	methyl
TBTU =	2-( 1 H-benzotriazol-1 ~yl)-l, 1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborát
TEA	triethylamin
TFA	kyselina trifluoroctová
Z	benzy loxy karbony 1

Čísla sloučenin označují sloučeniny ve schématech 1 až 7. Sloučenina 3

K míchanému roztoku sloučeniny 1 (53,6 g, 143,6 mmol) (R. Roy; W.K.C. Park; Q. Wu; S-N. Wang, Tetrahedron Lett, 1995, 36 (25), 4377 až 80) a sloučeniny 2 (27,9 g, 89,3 mmol), (S.J. Danishefsky; Μ. P. DeNinno; g.B. Philips; R. E. Zelle, Tetrahedron, EN, 1986, 42, II, 2809 až 2819) v 930 ml DMF byl přidán hydrid sodný (7,7 g 60% disperze, 192,2 mmol) při 50 °C. Po 1 h byla reakční směs zahřáta na 120 °C. Po míchání po dobu 5 min byla reakční směs ochlazena na 40 °C a zředěna vodou a extrahována třikrát dichlormethanem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a koncentrovány ve vakuu, za získání surového produktu 3 (54 g). TLC: Rf= 0,23, ether 100%.

Sloučenina 4

K míchanému roztoku sloučeniny 3 (89,3 mmol) v 800 ml suchého toluenu a 800 ml acetanhydridu byl po kapkách přidán vychlazený roztok 361,5 ml kyseliny sírové v acetanhydridu (16,5 ml koncentrované kyseliny sírové v acetanhydridu (16,5 ml koncentrované kyseliny sírové a 345,0 ml acetanhydridu) při -30 °C. Po 2 h byla reakce ukončena 240 ml TEA a směs byla míchána při teplotě místnosti. K roztoku byl přidán vodný hydrogenuhličitan sodný (5%) a vodná

-6CZ 303385 B6 vrstva byla extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly dvakrát promyty vodou a zkoncentrovány ve vakuu. Tento postup byl opakován za získání surové sloučeniny 4 (53 g). TLC: Rf = 0,29, ether 100 %.

Sloučenina 5

K míchanému roztoku sloučeniny 4 (89,3 mmol) a ethanthiolu (11,1 ml, 150,3 mmol) v 370 ml suchého toluenu byl po kapkách přidán roztok BF₃-etherátu v toluenu (23,9 ml BF₃-etherátu a 190 ml toluenu) při 0 °C. Po míchání po dobu 16 h při teplotě místnosti byla reakce ukončena TEA a vodným hydrogenuhličitanem sodným a byla extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Surový produkt byl čištěn chromatografíi na kloně (toluen/ethylacetát = 1/1 až 0/1, obj./obj.) za získání sloučeniny 5 (21,4 g). TLC: Rf = 0,31, toluen/ethylacetát = 4/6, obj./obj.

Sloučenina 7

Roztok donoru 5 (15,0 g, 30,3 mmol) a akceptoru 6 (23,0 g, 30,3 mmol) (WO 99/25720) ve směsi suchého etheru/dichlormethanu (232 ml, 3/1, obj./obj.) byl míchán 30 min v proudu dusíku v přítomnosti aktivovaných molekulových sít 4A (7,6 g). Potom byl k reakční směsi přidán roztok 1,3-dibrom—5,5-dimethylhydantoinu (5,5 g, 19,1 mmol) a kyseliny trifluormethansulfonové (0,49 ml, 5,6 mmol) ve směsi dioxan/dichlormethan (69,8 ml, 1/1, obj./obj.) po kapkách v průběhu 75 min při teplotě -20 °C. Po 30 min byl k reakční směsi přidán TEA (5 ml) a směs byla míchána 10 min a potom zfiltrována. Filtrát byt promyt vodným thiosíranem sodným (10%) a vodným hydrogenuhličitanem sodným (10%) a zakoncentrován ve vakuu. Produkt byl čištěn chromatografíi na koloně (0 až 5% aceton v dichlormethanu) za získání sloučeniny 7 (19,6 g). TLC: Rf - 0,1, ether/heptan - 8/2, obj./obj.

Sloučenina 8

K míchanému roztoku sloučeniny 7 (19,5 g, 16,4 mmol) ve směsi suchý toluen/acetanhydrid (442 mmol, 1/1, obj./obj.) byl po kapkách přidán ochlazený roztok 131,5 ml kyseliny sírové v acetanhydridu (11,5 ml koncentrované kyseliny sírové a 120 ml acetanhydridu) při -26 °C. Po 75 min byla přidána TEA (73,3 ml) při -20 °C. Acetanhydrid byl rozložen postupným přidáním 330 ml vody za udržování teploty mezi 25 a 30 °C. Po míchání po dobu 16 h byla směs vlita do 800 ml vody a extrahována dvakrát toluenem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Surový produkt byl čištěn chromatografíi na koloně (toluen/ethylaceetát/ethanol = 96/2/2d, obj./obj./obj.) za získání sloučeniny 8 jako bílé pěny (13,2 g) TLC: Rf - 0,29, toluen/ethanol = 9/1, obj./obj.

Sloučenina 9

K roztoku sloučeniny 8 (13,2 g, 11,7 mmol) v suchém toluenu (66 ml) při 32 °C byl přidán morfolin (4,1 ml, 46,9 mmol). Po míchání po dobu 42 h pri 32 °C byla reakční směs ochlazena na teplotu místnosti a byla přidána vodná kyselina chlorovodíková (17,6 ml, 4M). Směs byla zředěna vodou a extrahována dvakrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly dvakrát promyty vodou, sušeny nad síranem sodným a zakoncentrovány ve vakuu za získání surové sloučeniny 9 (12,6 g), TLC: Rf = 0,32, toluen/aceton ~ 7/3, obj./obj.

Sloučenina 12

K roztoku sloučeniny 9 (12,6 g, 11,6 mmol) v dichlormethanu (114 ml) byl přidán trichloracetonitril (3,5 ml, 34,9 mmol) a DBU (52,2 μΙ, 0,35 mmol). Po míchání po dobu 2 h při teplotě místnosti byla k reakční směsi přidána aktivovaná molekulová síta 4Á (24 g) a akceptor 11 (8,9 g, 13,0 mmol) (WO 99/25720) v dichlormethanu (45 ml). Po míchání po dobu 30 min při teplotě místnosti byla směs ochlazena na -20 °C a po kapkách byl přidán roztok trimethylsilyltrifluor-7CZ 303385 B6 methansulfonátu (405 μΙ, 2,1 mmol) v dichlormethanu (100 ml). Po míchání po dobu 30 min byl přidán hydrogenuhličitan sodný při teplotě -20 °C a reakční směs byla zfiltrována. Filtrát by) vlit do vodného hydrogenuhličitanu sodného a extrahován třikrát dichlormethanem. Spojené organické vrstvy byly promyty dvakrát a zakoncentrovány ve vakuu. Produkt byl čištěn chromatografii na koloně (1: SiO₂ - 0 až 10% aceton v etheru; 2: SiO₂ toluen/aceton - 85/15 až 80/20, obj./obj., 3: RP-18: voda/aceton i trii = 2/8 až 0/10, obj./obj.) za získání čisté sloučeniny 12 (8,9 g). TLC: Rf = 0,37, toluen/aceton - 7/3, obj./obj.

Sloučenina 14

Suspenze sloučeniny 12 (8,9 g, 5,1 mmol) a 10% Pd/C (8,9 g) ve 312 ml DMF a 45 ml vody byla míchána v souvislém proudu vodíku. Po 4,5 h byl katalyzátor Pd/C odstraněn filtrací. Filtrát byl zakoncentrován na objem 400 ml a smísen s 10% Pd/C (1,5 g) v proudu vodíku 5,5 h. Katalyzátor byl odstraněn filtrací. K filtrátu (900 ml) byl přidán vodný hydroxid sodný (32 ml, 4M). Po míchání po dobu 4 h při teplotě místnosti byla směs okyselena na pH 6,6 1M kyselinou chlorovodíkovou a potom zakoncentrována ve vakuu. Surový produkt byl odsolen na koloně Sephadex G-25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a lyofílizovány za získání sloučeniny 14 (4,0 g).

Sloučenina 15

Pentasacharid 14 (700 mg, 0,61 mmol) byl rozpuštěn ve vodě (13,2 ml) a DMF (3,3 ml) a smísen s N-(benzyloxykarbonyloxy)sukcinimidem (224 mg, 0,90 mmol) v N-ethylmorfolinem (233 μΐ, 1,83 mmol). Po míchání po dobu 15 min byla reakční směs přímo nanesena na kolonu RP-18, která byla eluována směsí voda/acetonitril 10/0 až 7/3. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na malý objem a naneseny na iontoměničovou kolonu Dowex 50 Wx4—HF⁺ ve vodě. Eluát byl zakoncentrován ve vaku za získání čisté látky 15 (482 mg).

Sloučenina 16

K roztoku sloučeniny 15 (471 mg, 0,37 mmol) v DMF (4,7 ml) byl přidán komplex oxid sírovýpyridin (1,1 g, 6,6 mmol) a směs byla míchána 16 h při 30 °C. Směs byla ochlazena na teplotu místnosti a po kapkách přidána k vychlazenému roztoku 10% hydrogenuhličitanu sodného (16,7 ml, 19,9 mmol) a míchána 1 h při teplotě místnosti. Směs byla zakoncentrována na malý objem a nanesena na kolonu Sephadex G-25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na malý objem, který byl postupně převeden přes kolonu Dowex Na⁺HCRW2 s elucí vodou. Eluát byl zakoncentrován a znovu rozpuštěn v 8,3 ml 0,2M kyseliny chlorovodíkové a ponechán stát 16 h při 4 °C. Reakční směs byla neutralizována 8 ml 0,2M hydroxidu sodného a odsolena na koloně Sephadex G—25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány ve vakuu za získání čisté sloučeniny 16 (840 mg).

Sloučenina 17

Suspenze sloučeniny 16 (0,37 mmol) a 10% Pd/C (820 mg) v Zcrc-butanolu (85 ml) a vodě (79 ml) a několik kapek kyseliny octové byly míchány v souvislém proudu vodíku. Po 3 h byl katalyzátor Pd/C odstraněn filtrací a filtrát byl zakoncentrován a lyofilizován, za získání čisté sloučeniny 17 (675 mg).

Hydroxid benzylesteru kyseliny 4—[[4—[[(1 R)-l-[[4—(aminoiminomethyl)fenyl]methyl]-2-oxo2-( Ipiperidinyl)ethyl]amino]-3-[[(4-methoxy-2,3,6-trimethyl)sulfonyl]amino]-l ,4(S)—dioxobutyl)amino]butanové (18)

K roztoku hydrochloridu kyseliny 4-[[(lR)-l-[[4-(aminoÍmÍnomethyl)fenyl]methyl3-2-oxo-2(l-piperidinyl)ethyl]amino]-3-[[(4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl)suIfonyl]amino]—4-oxo(3S)-butanové (2,38 g, 3,96 mmol) (Tetrahedron 51, 12047 až 12068, 1995) a benzensulfonátu

-8CZ 303385 B6 kyseliny benzyl-(4-aminomáse!né) 1,52 g, 3,96 mmol) (J. Am. Chem. Soc. 105, 5278 až 5284, 1983) v DMF (40 ml) v atmosféře dusíku byl přidán N,N-diisopropylethylamÍn (0,689 ml, 3,96 mmol) a tetramethylbenzotriazolyluroniumtetrafluorborát (1,91 g, 5,94 mmol). pH reakční směs bylo přidáno na 6 použitím Ν,Ν-diisopropylethylaminu. Reakční směs byla míchána 4 dny při teplotě místnosti, zakoncentrována, rozpuštěna v ethylacetátu, promyta 5% uhličitanem sodným a 0,lM kyselinou chlorovodíkovou, sušena nad síranem hořečnatým a zakoncentrována. Zbytek byl rozpuštěn v suchém ethanolu (5ml), vysrážen suchým diisopropyletherem, zfiltrován, za získání 2,47 g v názvu uvedené sloučeniny 18. Rf ~ 0,8 ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda = 88/31/18/7, obj./obj./obj./obj.; hmotnostní spektroskopie (ESF): 477,4 [M+Hf

Hydrochlorid kyseliny 4-[[4-[[(l R)-l-[[4-(aminoiminomethyl)fenyl]methyl]-2-oxo-2-(lpiperidinyl)ethyl]amino]-3-[[4—methoxy-2,3,6-trimethylfenyl)sulfonyl]amino]-l,4(S)-dÍoxobutyl] amino] butanové (19)

Suspenze sloučeniny 18 (2,42 g, 3,11 mmol) a 10% Pd/C (400 mg) ve směsi methanol/voda (40 ml, 3/1, obj./obj.) byla míchána v souvislém proudu vodíku. Po 8 h byla reakční směs zfíltrována, filtrát byl zakoncentrován a společně odpařen třikrát se směsí methanol/toluen (l/l0, obj./obj.). Zbytek byl rozpuštěn v suchém ethanolu (5ml), vysrážen suchým diethyletherem, zfiltrován a usušen. Zbytek byl rozpouštěn ve vodě a přímo nanesen na preparativní kolonu HPLC DeltaPak RP-C_i8 s použitím gradientovaného elučního systému 20 % A/60 % B/20 % až C 20 % A/14 % B/66 % C v průběhu 60 min při průtoku 40 ml/min (A: 0,5M fosfátový pufř pH 2,1; B: voda; C: acetonitril/voda = 6/4). Výtěžek 598 mg.

R_t = 26,4 min (3 až 10 min: 20 až 43 % C + 20 % A; 10 až 50 min: 43 až 66 % C + 20 % A), (A: fosfátový pufr pH 2,1; B: voda; C: acetonitril/voda = 6/4, obj./obj.), analytická HPLC na koloně supelcosil LC-18-DB; hmotnostní spektrometrie (ESI⁺): 687,2 [M+H], (ESf): 685,2 [M-H]. Sloučenina 21 ze sloučeniny 17 a sloučeniny 19

K roztoku sloučeniny 19 (40 mg, 58,3 gmol) v DMF (800 μΐ) byl přidán N-hydroxysukcinimid (9,0 mg, 78,1 μπιοί), DCC (18,5 mg, 89,7 pmol) a 1-hydroxybenzotriazol (8,8 mg, 65,1 gmol). Reakční směs byla míchána 40 h při teplotě místnosti. Reakční směs byla zfiltrována přes dicalit a dicalit byl čtyřikrát promyt DMF (284 μΐ). K filtrátu byl přidán pufr 0,lM Na₂HPO₄ (1936 μΐ, pH 7,5) a pentasacharid 17 (94,7 mg, 52,6 μπιοί). Po 30 min míchání byla směs zfiltrována přes dicalit, zakoncentrována a nanesena na kolonu Sephadex G-50, která byla eluována směsí acetonitril/voda (1/1, obj ./obj.). Příslušné frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny dvakrát chromatografií na koloně Sephadex G-50 (voda). Příslušné frakce byly spojeny a Iyofílizovány a za získání konjugátu 21 jako bílé pevné látky (95,8 mg). Hmotnostní spektrometrie (ESf) = 2469, HPLC: Rt = 8,3 min (20 až 80 % B, v 15 min, A = voda/acetonitril 8/2; B = 2M NaCl/acetonitril 8/2, obj./obj.), analytická HPLC na koloně MonoQ HR 5.

Sloučenina 22

Roztok (R)-N-Boc(4-kyanofenyl)alaninu (25,0 g, 86,1 mmol), piperidinu (21,3, 215,3 mmol) aTBTU (41,5 g, 129,2 mmol) v suchém CH₂C1₂ (500 ml) byl míchán při teplotě místnosti v proudu dusíku 2 h. Reakční směs byla postupně promyta 0,2M kyselinou chlorovodíkovou, vodou, vodným hydrogenuhliěitanem sodným (nasyceným) a vodou). Organická vrstva byla sušena nad MgSO₄, zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu. Produkt byl rozpuštěn v horkém ethylacetátu (35 ml), vysrážen heptanem (190 ml) a zfiltrován za získání sloučeniny 22 (27,75 g). TLC: Rf = 0,58, heptan/ethylacetát = 3/7, obj./obj.

Sloučenina 23

Roztok sloučeniny 22 (25,6 g, 71,7 mmol), hydroxylaminu.HCl (7,1 g, 101,8 mmol) atriethylaminu (16,8 ml, 120,5 mmol) v absolutním ethanolu (307 ml) byl míchán při 80 °C 4 h. Po ochla-9CZ 303385 Β6 zení směsi na teplotu místnosti se utvořily krystaly. Krystaly byly odfiltrovány, promyty ethanolem a etherem a usušeny v exikátoru za získání sloučeniny 23 (24,5 g). TLC: Rf =0,15, heptan/ethylacetát = 3/7, obj./obj.

Sloučenina 24

Roztok sloučeniny 23 (24,5 g, 62,7 mmol) a ethylchlorformátu (7,2 ml, 75,3 mmol) v suchém pyridinu (245 ml) byl míchán při 115 °C 2 h. Reakční směs byla ochlazena na teplotu místnosti a vlita do vody (1250 ml) a extrahována třikrát ethylacetátem (500 ml). Spojené organické extrakty byly sušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a zakoncentrovány ve vakuu za získání sloučeniny 24 (24,3 g). TLC: Rf= 0,42, CH₂Cl₂/MeOH 95/5, obj./obj.

Sloučenina 25

Roztok sloučeniny 24 (24,3 g, 58,4 mmol) v suchém CH₂C1₂ (122 ml) a TFA (122 ml) byl míchán při teplotě místnosti 2 h a zakončentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu za získání sloučeniny 25 (37,6 g). TLC: Rf = 0,35, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, objVobj.

Sloučenina 26

Suspenze H-Asp-(OtBu)-OH (39 g, 206,35 mmol), 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylchloridu (62 g, 249,3 mmol) a di isopropyl aminu (89 ml, 635 mmol) v DMF (950 ml) a vodě (450 ml) byl míchán při 0 °C 3 h. Reakční směs byla vlita do směsi led/voda (5 1) a promyta dvakrát diethyletherem, okyselena vodnou kyselinou chlorovodíkovou (4M, 72 ml) a extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy byly sušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a zakoncentrovány ve vakuu za získání sloučeniny 26 (97,7 g). TLC: Rf = 0,67, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 27

Roztok sloučeniny 25 (33,5 g), sloučeniny 26 (24,7 g), TBTU (36,8 g, 114,6 mmol) adiisopropylaminu (27,2 ml, 194,1 mmol) v suchém DMF (670 ml) byl míchán 2 h a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (750 ml), promyt vodným hydrogen uhličitanem sodným (5%, 1250 ml) a vodnou kyselinou chlorovodíkovou (0,lM, 1250 ml), sušen na MgSO₄, zfiltrován a zakoncentrován ve vakuu za získání sloučeniny 27 (33,8 g). TLC: Rf = 0,88, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, objVobj.

Sloučenina 28

Roztok sloučeniny 27 (33,8 g, 48,3 mmol) v suchém CH₂C1₂ (170 ml) a TFA (170 ml) byl míchán při teplotě místnosti 2 h a zakoncentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu, za získání sloučeniny 28 (32,3 g). TLC: Rf = 73, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 29

Roztok sloučeniny 28 (32,3 g), H-GABA-OtBu.HCl (9,5 g, 48,4 mmol) TBTU (29,0 (32,3 g), H-GABA-OtBu.HCl (9,5 g, 48,4 mmol) TBTU (29,0 g, 90,5 mmol) v diisopropylaminu (25,2 ml, 179,8 mmol) v suchém DMF (622 ml) byl míchán pří teplotě místnosti 2h a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpouštěn v ethylacetátu (840 ml), promyt vodným hydrogen uhličitanem sodným (5%, 1400 ml) a vodnou kyselinou chlorovodíkovou (0,lM, 1400 ml), sušen nad MgSO₄, zfiltrován a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v ethanolu (75 ml) a pomalu přidáván k míchanému diisopropyletheru, (2990 ml) za získání sloučeniny 29 jako bělavých krystalů (32,0 g). TLC: Rf = 0,56, CH₂Cl/MeOH 9/1, obj./obj.

- 10CZ 303385 B6

Sloučenina 30

Roztok sloučeniny 29 (3,0 g, 3,82 mmol) v suchém CH₂C1₂ (15 ml) a TFA (15 ml) byl míchán pri teplotě místnosti 2 h a zakoncentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu. Zbytek byl čištěn na silikagetu s použitím CITCf/MeOH (0% až 6 % MeOH), za získání Čisté sloučeniny 30 (1,98 g), TLC: Rf = 0,56, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 31 io

Roztok sloučeniny 30 (900 mg, 1,23 mmol), TBTU (396 mg, 1,23 mmol) a diisopropylaminu (215 μΐ, 1,53 mmol) v DMF (45 ml) byl míchán 2 h teplotě místnosti. Byla přidána sloučenina 17 (2,0 g, 1,11 mmol) a po míchání po dobu 4 h byla směs zakoncentrována ve vakuu za získání sloučeniny 31 (4,17 g).

Sloučenina 21 ze sloučeniny 31

Suspenze sloučeniny 31 (4,17 g) a 10% Pd/C (2,8 g) v /erc-butylalkoholu (28 ml) a vodě (56 ml) byla míchána přes noc v souvislém proudu vodíku. Katalyzátor Pd/C byl odstraněn filtrací a fil20 trát byl zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpouštěn ve vodě a čištěn na koloně Q-sepharose. Příslušné frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny chromatografií na koloně Sephadex G-25 (voda). Příslušné frakce byly spojeny a lyofilizovány za získání konjugátu 21 jako bílé pevné látky (1,74 g).

-11 Schéma 1

I-O0n

J-—O ^N^_o-^h°'^oT„ * R?¹*· X.

ho —f (1) (2)

OMe

1Λ. }

OMe íá)l

OMe OMe

- 12CZ 303385 B6

Schéma 2

-13CZ 303385 B6

Schéma 3

Σ i

ÓMe OMa |-(34) V^H· “T05) í—*-ρβ) R,=Z, R,=so_ť

-14CZ 303385 B6

Schéma 4

-15CZ 303385 B6

Schéma 5

-16CZ 303385 B6

Schéma 6

- 17CZ 303385 B6

FTN

- 18CZ 303385 B6

Příklad 2

Biologické aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu se zjišťují následujícími testovacími metodami.

I. Antitrombinový test

Antitrombová aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu byla zjištěna spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromatogenního substrátu s-2238 prostřednictvím trombinu. ío Test antitrombinového aktivity v pufračním systému byl použit pro zjištění hodnoty IC₅₀ testované sloučeniny.

Testovací médium: Pufr tromethamin-NaCl-polyethylenglykol 6000 (TNP)

Referenční sloučenina: 12581 (Kabi)

Vehikulum: Pufr TNP

Rozpuštění může být usnadněno dimethyl sul foxidem, methanolem, ethanolem, acetonitrilem 20 nebo terc-butyl alkoholem, které nemají nepříznivé účinky až do koncentraci od 2,5 % v konečné reakční směsi.

Technika

Reakční činidla*

1, Tromethamin-NaCI (TN pufr; složení pufru: tromethamin (Tris) 6,057 g (50 mmol),

NaCl, 5,844 g (1000 mmol) voda do 1 1. pH roztoku se nastaví na 7,4 při 37 °C pomocí HC1 (10 moU*¹). 2. Pufr TNP: polyethylenglykol 6000 se rozpustí v pufru TN za získání koncentrace 30 3 g.f¹. 3. Roztok S-2238: jedna ampulka S-2238 (25 mg Chromogenix; Švédsko) se rozpustí v 20 ml pufru TN za získání koncentrace 1,25 mg.mf¹ (2 mmol.f¹) 4. Roztok trombinu: lidský trombin (1000 NI jednotek/lahvičku, Enzyme Res. Lab. Inc., USA) se rozpustí v pufru TNP za získání zásobníku roztoku 50 NIH jednotek.mf¹. Bezprostředně před použitím se tento roztok zředí pufrem TNF za získání koncentrace 30,2 NIH jednotek.mf¹.

* - Všechny použité složky jsou čisty pro analýzu

- Pro výrobu vodných roztoků se používá ultračistá voda (kvalita Milli-Q)

Příprava roztoků testovací a referenční sloučeniny 40

Testovací a referenční sloučeniny se rozpustí ve vodě Milli-Q za poskytnutí koncentrací zásobních roztoků I0‘² mol.f¹. Každá koncentrace se postupně ředí vehikulem za získání koncentrací 10'³, 10* a 10'⁵ mol.f¹. Ředění včetně zásobního roztoku se používají v testu (konečné koncentrace v reakční směsi: 3.10*; 10*; 3.10'⁵; 3.10⁶; 10^; 3.10'⁷ a 10*⁷ mol.f¹).

Postup

Při teplotě místnosti se 0,075 ml a 0,025 ml roztoků testované sloučeniny nebo referenční sloučeniny nebo vehikula střídavě pipetuje do jamek mikrotitrační destičky a tato ředění se dále ředí 0,115 ml, popřípadě 0,0165 ml pufru TNP. Do každé jamky se přidá alikvot 0,030 ml roztoku S-2238 a destička se předehřeje a předinkubuje za třepání v inkubátoru Amersham 10 min při 37 °C. Po predinkubaci se zahájí hydrolýza S-2238 přidáním 0,030 ml roztoku trombinu do každé jamky. Destička se inkubuje (za třepání 30 s) při 37 °C. Počínaje 1 min inkubace

- 19CZ 303385 B6 se měří absorbance každého vzorku při 405 nm každé 2 min po dobu 90 min použitím odečítacího zařízení pro mikrotitrační destičky pro kinetická měření (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všechny údaje se shromažďují v osobním počítači pomocí programu pro zpracování dat (Bioli5 se). Pro každou koncentraci sloučeniny (vyjádřenou v mol.l'¹ reakční směsi) a pro blank se vynese absorbance proti době reakce v minutách.

Vyhodnocení výsledků:

io Pro každou finální koncentraci byla z vynesených výsledků testu vypočtena maximální absorbance. Hodnota 1C_5O (finální koncentrace vyjádřená v μιηοΙ.Γ¹, která způsobí 50% inhibici maximální absorbance blanku) byla vypočtena pomocí transformační analýzy logit podle Hafner a další (Arzneim-Forsch./Drug Res. 1977; 27 (II): 1871 - 3).

Antitrombinová aktivita sloučeniny z příkladu I: Hodnota IC_S0: 17Nm II. Test aktivity proti faktoru Xa

Aktivovaný faktor X (Xa) je faktor v koagulační kaskádě. Anti-Xa aktivita sloučenin podle před20 kládaného vynálezu byla zjišťována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2222 prostřednictvím faktoru Xa. Tento test na aktivitu proti faktoru Xa v systému pufru byl použit pro zjištění hodnoty IC₅o testované sloučeniny.

Referenční sloučenina: pentasacharid Org 31540

Vehikulum: PufřTNP

Solubilizaci je možno usnadnit dimethylsulfoxidem, methanolem, ethanolem, acetonitrilem nebo terc-butylalkoholem, které nemají nepříznivé účinky v koncentracích až do 1 % (pro DMSO) a 2,5 % (pro ostatní rozpouštědla) v konečné reakční směsi.

Technika

Reakční Činidla*

1. Pufr tromethamin-NaCI (TN); složení pufru: tromethamin (Tris) 6,11 g (50,4 mmol), NaCl 10,17 g (174 mmol), polyethylen gly kol 6000 3 g.l·¹, voda do 1 1. pH roztoku se nastaví na 7,4 pri 37 °C pomocí HC1 (10 mmol.l'¹). 3, Roztok S-2222: jedna lahvička S-2222 (25 mg; Chromogenix, Švédsko) se rozpustí ve vodě za poskytnutí koncentrace 0,375 mg.ml'¹ (0,5 mmol.l¹). 4.

Roztok Xa: bovinnť Faktor Xa Human (71 nKat.lahvička¹; Chromogenix) se rozpustí v 10 ml pufru TNP a potom dále zředí pufrem TNP za získání koncentrace 0,75 nKat. (1,5 U).ml'¹. Ředění se musí připravovat Čerstvá. 5. Roztok ATIII: Lidský ATIII (Chromogenix) se rozpustí ve vodě za získání koncentrace 1 U.mol¹, a potom se roztok dále zředí třemi objemy pufru TNP na koncentraci 0,25 U.mol.·¹. 6. Standardní roztok: zásobní roztok 5,7 anti-Xa U.ml' Org 31540 byl zředěn v pufru TNP na 0,05 U.mF¹. 6 Testované vzorky: každý preparát se rozpustí ve vodě a zředí pufrem TNP na koncentraci 0,05 nmol.mF¹. Z každého preparátu byla připravena řada devíti ředění (ředicí faktor 1,5).

Zjištění aktivity Xa

Každý testovaný vzorek (0,05 ml) se napipetuje do jamky mikrotitrační destičky pri teplotě místnosti. Do každého vzorku se přidá roztok AT-III (0,05 ml) a destička se třepá na třepačce varishaker. Do každé jamky se pipetuje alikvot roztok X_a (0,05 ml) 10 mil po přidání roztoku AT-III a destička se znovu protřepe. Přesně 2 min po přidání roztoku X_a se do každé jamky napipetuje 0,1 ml roztoku S-2222 a destička se znovu protřepe. Pro všechna přidávání se používá

-20CZ 303385 B6 dvanácti kanálové pipety. Zbylé množství X_a katalyzuje hydrolýzu S-2222, jejíž rychlost se měří fotometricky po inkubaěních dobách 2 a 22 min při teplotě místnosti. Absorbance každého vzorku se měří při 405 nm použitím přístroje Reader Microelisa, model 310C (Organon Teknika, Oss, Nizozemí) a vypočte se zvýšení absorbance (AOD). Každý testovaný vzorek se stanovuje dva5 krát. S každými deseti vzorky se zařadí blank (0,05 ml pufru TNP).

Kalibrační křivka

Z alikvotu standardního ředění kalibračního vzorku se připraví řada ředění (faktor ředění 1,4 pro io vzorky Org 31540). Získané standardní vzorky (přibližně 12 vzorků) by měly obsahovat mezi

0,01 až 0,05 anti-X_a U/ml. Při každé sérii měření se testuje každý standardní vzorek alespoň třikrát podle popisu v části Stanovení aktivity X_a. Kalibrační křivka se získá proložením přímky do hodnoty U/ml.

střední AOD (bank) - střední AOD (standard, vzorek) log - proti log anti-Xa střední AOD (standard, vzorek) metodou nej menších čtverců.

Vyhodnocení odpovědí:

Pro každý vzorek se použitím kalibrační křivky vypočte střední hodnota anti-X_a aktivity v jednotkách U/ml.

Aktivita proti faktoru X₃ sloučeniny z příkladu 1: 1012 U/pmol.

Claims

Pentasacharidový derivát vzorce /

OR

O

H,Ch₃co' kde Rje nezávisle SO₃‘ nebo CH₃;

-21 CZ 303385 B6 mezemíková skupina je *-(CH₂CH₃O)3-<CH₂)₂-NH-C(OHCH2)3-NH-C(O)-CH2-, přičemž konec označený * je navázán na pentasacharidový zbytek;

náboj pentasacharidového zbytku je kompenzován kladně nabitými proti ionty jako H⁺, Na⁺, K⁺, Ca^2í;

a celkový počet sulfátových skupin v pentasacharidovém zbytku je 4, 5, nebo 6;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, prekurzor nebo solvát, přičemž prekurzor je sloučenina vzorce I ve kterém je aminová skupina v amidinové skupině chráněná skupinou hydroxyl nebo (l-6C)alkoxykarbonyl.
2. Pentasacharidový derivát podle nároku 1, kde pentasacharidový zbytek má strukturu
4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje pentasacharidový derivát podle některého z nároků 1 až 3 a farmaceuticky vhodné pomocné látky.
5. Pentasacharidový derivát podle některého z nároků 1 až 3 pro použití jako léčivo.
6. Použití pentasacharidového derivátu podle některého z nároků 1 až 3 pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci trombózy nebo jiných onemocnění souvisejících s trombinem.