KR20020070988A

KR20020070988A - 항혈전성 화합물

Info

Publication number: KR20020070988A
Application number: KR1020027007186A
Authority: KR
Inventors: 반뵈켈콘스탄트아드리안안톤; 트롬프코르넬리아마리아; 헤르트센타마라테오도라마리아
Original assignee: 악조 노벨 엔.브이.
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2002-09-11
Also published as: SK7942002A3; NO323059B1; AU781846B2; CZ20021958A3; NO20022689L; SK287682B6; CN1407989A; CZ303385B6; BR0016217A; PL202840B1; CA2393042A1; TWI289566B; KR100776607B1; HUP0203471A3; US20030114361A1; CA2393042C; PL355484A1; WO2001042262A2; JP2003520208A; JP4820517B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적 허용 가능염, 이의 프로드러그 또는 용매화물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 항혈전성 활성을 지니며, 이는 트롬빈 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

화학식 I

상기 화학식에서, R은 독립적으로 SO₃ ^-또는 CH₃이고,

스페이서는 13∼25 원자의 길이를 갖는 플렉서블 스페이서이고,

5탄당 잔기의 하전은 양으로 하전된 반대이온에 의해 상쇄되며, 5탄당 잔기에서의 황산염기의 총수는 4, 5 또는 6이다.

Description

항혈전성 화합물{ANTITHROMBOTIC COMPOUND}

세린 프로테아제는 혈액 응고 다단계에서 중요한 역할을 하는 효소이다. 세린 프로테아제로는 인자 Xa가 중요한데, 이는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키는데 있어서 촉매 작용을 한다. 트롬빈은 응고 다단계에서의 최종의 세린 프로테아제 효소이다. 트롬빈의 주요 기능은 피브리노겐의 분해하여 피브린 단량체를 생성하는 것으로서, 이 단량체들은 불용성 겔을 형성하기 위하여 교차 결합을 형성한다. 또한, 트롬빈은 다단계에서의 초기의 인자 V 및 VIII의 활성화에 의하여 그 자신의 생산을 조절한다. 또한, 트로빈은 세포 단계에서 중요한 작용을 갖는데, 이 단계에서 혈소판 응집, 내피 세포 활성화 및 섬유아세포 증식을 야기하는 특정의 수용체상에 작용한다. 따라서, 트롬빈은 지혈 및 혈전 형성에 있어서 중추적인 조절 역할을 한다.

세린 프로테아제의 합성 억제제의 개발에 있어서, 최근 합성 NAPAP-5탄당 공액물은 직접적인 항-트롬빈 활성 및 ATIII-매개 항-Xa 활성(ATIII: 항트롬빈 III) 모두의 이중 프로파일을 지닌 항혈전제로 보고되었다. 문헌 [Bioorg. Med. Chem.Lett., 1999, 9(14), 2013-8]. 이와 같이 보고된 항혈전제는 관심을 끄는 화합물이 될 수 있기는 하나, 5탄당 잔기의 높은 황산염 함량으로 인한 PF4에 의한 HIT 교차 반응성 및 중화 반응이 이 화합물과 관련이 있다. 문헌 [Thromb. Haem. Suppl. 1997, p363 PD1485].

본 발명은 신규한 항혈전성 화합물, 활성 성분으로서 이 화합물을 함유하는 약학적 조성물, 약제의 제조에 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다.

하기 화학식 I의 화합물은 탁월하고도 이로운 이중 프로파일을 갖는 항혈전제인 것으로 밝혀졌다. 화학식 I의 화합물은 약리학적으로 중요한 반감기를 가지므로 1일 1회 처치가 가능하며, PF4에 의해서는 거의 중화되지 않는다. 또한, 출혈의 위험성도 낮다. 또한, 화학식 I의 화합물, 이의 약학적 허용 가능염, 이의 프로드러그 또는 용매화물은 약리학적 특성의 중요한 조합을 갖는다.

상기 화학식에서, R은 독립적으로 SO₃ ^-또는 CH₃이고,

스페이서는 13∼25 원자, 바람직하게는 16∼22 원자, 가장 바람직하게는 19원자의 길이를 갖는 플렉서블 스페이서이고,

5탄당 잔기의 하전은 양으로 하전된 반대이온에 의해 보상되며, 5탄당 잔기에서의 황산염기의 총수는 4, 5 또는 6이다.

본 발명의 화합물은 트롬빈 매개 질환 및 트롬빈 관련 질환의 치료 및 예방에 유용하다. 이러한 질환에는 응고 다단계가 활성화되는 다수의 트롬빈 및 프로트롬빈 상태가 포함되며, 이의 예로는 심부정맥 혈전증, 폐색전증, 혈전성정맥염, 혈전증 또는 색전증으로부터의 동맥 폐쇄, 혈관성형술 또는 혈전 용해중에 또는 그후의 동맥 재폐쇄, 동맥 손상 또는 침습성 심장 수술후의 재발협착증, 수술후 정맥 혈전증 또는 색전증, 급성 또는 만성 아테롬경화증, 졸중, 심근경색, 암 및 전이, 신경변성 질환 등이 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 투석 및 수술 중에 필요할 경우 체외 혈액 순환시 항응고제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 생체외 항응고제로서 사용될 수 있다.

화학식 I의 화합물은 정맥용의 혈전치료제로서 특히 유용하다.

본 발명에 의한 바람직한 화합물은 하기의 구조식을 갖는 5탄당 잔기를 갖는 화합물이다.

스페이서의 화학적 성질은 본 발명의 화합물의 항혈전성 활성에 관하여서는 그 중요성이 그리 크지 않다. 그러나, 본 발명의 화합물의 스페이서가 플렉서블이라는 것은 스페이서가 예를 들면 불포화 결합 또는 고리형 구조와 같은 단단한 원을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 스페이서의 적절한 예는 당업자에 의하여 용이하게 선택될 수 있을 것이다. 스페이서는 1 이상의 -(CH₂CH₂O)- 원을 포함하는 것이 바람직하다. 스페이서는 3 개의 -(CH₂CH₂O)- 원을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 스페이서는 *-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)₃-NH-C(O)-CH₂-인 것이 가장 바람직하고, *로 표시한 말단은 5탄당 잔기에 결합된다.

화학식 I의 화합물은 p이 1∼5이고, n은 1∼5이며, m은 1 또는 2인 화학식 Ia의 화합물이 바람직하며, p는 3이며, n은 3이고, m은 1인 화학식 Ia의 화합물이 가장 바람직하다.

양으로 하전된 반대이온은 H⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺등이 있다. 화학식 I의 화합물은 이의 나트륨염의 형태인 것이 바람직하다.

용어 "프로드러그"란 아미디노 부분의 아미노기가 보호된, 즉, 예를 들면 히드록시 또는 C₁-C₆알콕시카르보닐기인 본 발명의 화합물을 의미한다. 본 발명에 의한 용매화물의 예로는 수화물 등이 있다.

유리 염기의 형태로 존재할 수 있는 본 발명의 화합물은 약학적 허용염의 형태로 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다. 또한, 약학적 허용염은 화학식 I의 유리 염기를 유기산 또는 무기산으로 처리하여 얻을 수 있으며, 여기서 유기산 또는 무기산의 예로는 염화수소, 브롬화수소, 요오드화수소, 황산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 말레산, 말론산, 메탄설폰산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 구연산, 안식향산, 아스코르브산 등이 있다.

본 발명의 화합물은 키랄 탄소 원자를 포함하므로 순수한 거울상 이성체로서, 거울상 이성체의 혼합물로서, 또는 부분입체 이성체를 포함하는 혼합물로서 얻을 수 있다. 순수한 거울상 이성체를 얻는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 이 방법의 예로는 광학적 활성 산 및 라세미 혼합물로부터 얻은 염을 결정화하는 방법 또는 키랄 컬럼을 사용한 크로마토그래피법 등이 있다. 부분입체 이성체의 경우, 직상 또는 역상 컬럼을 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 하기 화학식 II의 NAPAP 유사체의 카르복실레이트기를 활성화시킨 후, 이를 아민기를 포함하는 5탄당 스페이서 잔기(하기 화학식 III)를첨가하고, 그후 아미딘 부분을 탈보호함으로써 생성될 수 있다.

화학식 II의 화합물에서의 카르복실레이트기는 혼합 무수물로서 활성화될 수 있거나 또는, 더욱 바람직하게는 활성화된 에스테르, 예컨대 N-히드록시숙신이미드, 펜타플루오로페놀 또는 1-히드록시벤조트리아졸의 에스테르로서 활성화될 수 있다. 커플링 단계에서, 화학식 II의 벤즈아미딘기는 비보호될 수 있거나 (R'=R"=H) 또는, 카르바메이트기, 바람직하게는 알릴옥시카르보닐 (R' 및/또는 R"은 H₂C=CH-CH-C(O)O) 또는 벤질옥시카르보닐 (R' 및/또는 R"은 PhCH₂-C(O)O임)을 사용하여 임의로 보호될 수 있다. 알릴옥시카르보닐 및 벤질옥시카르보닐 보호기는 비교적 온화한 조건하에서 제거될 수 있다. 알릴옥시카르보닐기는 모르폴린 또는말론산 에스테르와 같은 약한 친핵성기의 존재하에 Pd를 사용하여 제거될 수 있다. 벤질옥시카르보닐기는 수소/Pd(C)와 같은 조건하에서 제거될 수 있다. 또는, N-알콕시벤즈아미딘 또는 N-벤질옥시벤즈아미딘(R'=H, R"=알콕시 또는 벤질옥시)과 같은 벤즈아미딘의 합성 전구체를 사용할 수 있다. 이러한 합성 전구체는 수소화 반응과 같은 환원성 조건을 사용하여 벤즈아미딘으로 전환시킬 수 있다. 문헌 [Fujii, T. et al.Chem. Pharm. Bull,39, 301, 1991 및 Fujii, T. et al.,Chem. Pharm. Bull,42, 1231, 1994].

바람직한 벤즈아미딘 전구체는 1,2,4-옥사디아졸린-5-온 (-R'-R"- = -C(O)O-)이다. 이러한 전구체는 수소화 반응에 의하여 벤즈아미딘으로 전환될 수 있다. 문헌[Bolton, R.E. et al.,Tetrahedron Letters, Vol. 36, No. 25, 1995, pp 4471-4474].

화학식 II의 화합물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양한 방법으로 제조할 수 있다. R' = R" = H이고, n이 3이며, m이 1인 화학식 II의 화합물을 제조하는 방법은 제EP0,513,543호에 기재되어 있다. 아미딘이 예를 들면 알릴옥시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐기로 보호된 화학식 II의 화합물은 펩티드 단절의 커플링에 대하여 당업계에 주지되어 있는 방법을 사용하여 아미딘이 알릴옥시카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐기로 보호된 하기 화학식 IV의 화합물로부터 생성될 수 있다. 화학식 IV의 카르바메이트는 예를 들면 문헌 [Weller, T. et al.,J. Med. Chem.39, 3119, 1996]에 기재되어 있는 바와 같이 해당 아미딘 (화학식 IV에서 R' = R" = H)으로부터 생성할 수 있다.

화학식 II의 N-알콕시벤즈아미딘 및 N-벤질옥시벤즈아미딘 화합물은 이 시아노 화합물을 O-알킬-히드록실아민 또는 O-벤질-히드록실아민의 처리후 산성 조건을 사용하여 t-부틸 에스테르를 제거함으로써 화학식 V의 화합물 (EP 0,513,543에 개시됨)로부터 생성될 수 있다. 또는, 화학식 II의 N-알콕시벤즈아미딘 및 N-벤질옥시벤즈아미딘 화합물은 하기 화학식 V의 t-부틸 에스테르를 산성 조건을 사용하여 우선 제거하여 하기 화학식 VI의 화합물을 얻은 후, 이 시아노 화합물을 O-알킬-히드록실아민 또는 O-벤질-히드록실아민과 반응시켜 생성될 수 있다.

-R'-R"- = -C(O)O- (1,2,4-옥사디아졸린-5-온기)인 화학식 II의 화합물은 펩티드 단절의 커플링에 대하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 -R'-R"- = -C(O)O-인 화학식 IV의 화합물로부터 생성할 수 있다.

화학식 III의 아미노-올리고당-스페이서 잔기의 합성은 예를 들면 제EP0,649,854호에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 화합물의 당 잔기는 예를 들면 제WO99/25720호와 같이 당업계에 공지된 방법에 의하여 생성할 수 있다.

펩티드 단절의 커플링 --또는 축합--에 대하여 당분야에서 공지된 방법에 의하여, 예컨대 아지드 방법, 혼합 무수물 방법, 활성 에스테르 방법에 의하여, 또는 바람직하게는 카르보디이미드 방법에 의하여, 특히 N-히드록시숙신이미드 및 N-히드록시벤조트리아졸과 같은 촉매 및 라세미화 억제 화합물을 첨가함으로써, 본 발명의 화합물을 제조하기 위하여 전술한 방법 중의 한 단계인 펩티드 커플링 단계를 수행할 수 있다. 문헌 [The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, E. Gross and J. Meienhofer, 편저, 아카데믹 프레스, 뉴욕, 1981] 및 문헌 [Bodanszky, M.;Principles of peptide synthesis, Springer-Verlag, 1984]을 참고한다.

화합물 중에 존재하는 아민 작용기는 N-보호기에 의한 합성 절차 중에 보호될 수 있으며, 여기서 N-보호기는 α-아미노기, 예를 들면 t-부틸옥시카르보닐(Boc)기, 벤질옥시카르보닐(Z)기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)기 또는 프탈로일(Phth)기의 보호에 대한 펩티드 화학에 통상적으로 사용되는 기를 의미한다. 보호기의 제거는 이들 보호기의 성질에 따라서 여러가지의 방법으로 수행될 수 있다. 일반적으로 탈보호는 스캐빈저의 존재하에 그리고 산성 조건하에서 수행된다. 아미노 보호기 및 이의 제거 방법에 관하여서는 문헌 [The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3] 및 문헌 [Greene, T.W. 및 Wuts, P.G.M.,Protective groups in organic synthesis, 존 윌리 앤 썬즈 인코포레이티드, 1991]을 참고한다.

본 발명의 화합물은 소화관내 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물 및 이의 조성물의 정확한 투여량 및 섭생은 약제를 투여하고자 하는 개개의 환자의 필요량에 따라 달라진다. 일반적으로, 비경구 투여는 흡수에 더욱 의존하게 되는 투여의 기타의 방법보다 그 투여량이 낮다. 그러나, 사람의 경우 일일 투여량은 체중 1 ㎏당 0.001∼100 ㎎이 바람직하고, 0.01∼10 ㎎인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 화합물을 사용하여 제조된 약제는 급성 항응고 요법에서 아쥬번트로서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 약제는 그러한 질병 상태를 처치하는데 있어서 유용한 화합물과 함께 투여된다.

예를 들면 표준 문헌[Gennaro et al.,Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판 편저, Mack Publishing Company, 1990, 특히 Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture을 참조]에 기재된 바와 같이 약학적으로 적절한 보조제와 혼합된 화합물은 고형 투여 단위, 예컨대 환제, 정제로 압출될 수 있거나 또는, 캡슐 또는 좌제로 가공 처리될 수 있다. 또한, 화합물은 약학적 허용 액제에 의하여 예를 들면 주사용 제제로서 또는 스프레이, 예를 들면 비강 스프레이로서 사용하기 위하여 용액, 현탁제, 유탁액의 형태로 적용될 수있다.

투여 단위, 예컨대 정제를 제조하는 경우, 통상의 첨가제, 예컨대 충전제, 착색제, 중합체 결합제 등의 사용을 고려한다. 일반적으로 활성 화합물의 기능을 방해하지 않는 임의의 약학적 허용 첨가제를 사용할 수 있다. 조성물에서 함께 투여될 수 있는 적절한 담체로는 적량으로 사용된 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체 등, 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명은 이하의 실시예에 의하여 추가로 예시된다.

실시예 1

하기와 같은 약어를 사용하였다.

Ac= 아세틸

Bn= 벤질

DBU= 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔

DCC= 디시클로헥실카르보디이미드

DMF= N,N-디메틸포름아미드

Su= 숙신이미딜

Me= 메틸

TBTU= 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로붕산염

TEA= 트리에틸아민

TFA= 트리플루오로아세트산

Z= 벤질옥시카르보닐

화합물의 번호는 하기 반응식 1∼7에서의 화합물을 지칭한다.

화합물 3

DMF 930 ㎖ 중의 화합물 1 (53.6 g, 143.6 mmol) [문헌: R. Roy; W.K.C. Park; Q. Wu; S-N. Wang,Tetrahedron Lett., 1995, 36(25), 4377-80] 및 화합물 2 (27.9 g, 89.3 mmol) [문헌: S.J. Danishefsky; M.P. DeNinno; G.B. Philips; R.E. Zelle,Tetrahedron, EN, 1986, 42, 11, 2809-2819]의 교반된 용액에 수소화나트륨(7.7 g, 60% 분산액, 192.2 mmol)을 50℃에서 첨가하였다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 120℃로 가열하였다. 5 분간 교반한 후, 반응 혼합물을 40℃로 냉각하고, 이를 물로 희석한 후, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 물로 세정하고, 이를 진공하에서 농축시켜 미정제 산물 3 (54 g)을 얻었다. TLC: Rf = 0.23, 에테르 100%.

화합물 4

800 ㎖의 무수 톨루엔 및 800 ㎖의 아세트산 무수물 중의 화합물 3 (89.3 mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물 중의 361.5 ㎖의 황산의 냉각된 용액 (16.5 ㎖의 진한 황산 및 345.0 ㎖의 아세트산 무수물)을 -30℃에서 적가하였다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 240 ㎖의 TEA로 반응을 종결시키고, 실온에서 교반하였다. 이 용액에 탄산수소나트륨 수용액(5%)을 첨가하고, 수층을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 물로 2회 세정하고, 이를 진공하에서 농축시켰다. 이러한 절차를 반복하여 미정제 화합물 4 (53 g)을 얻었다. TLC: Rf = 0.29, 에테르 100%.

화합물 5

370 ㎖의 무수 톨루엔 중의 화합물 4 (89.3 mmol) 및 에탄티올 (11.1 ㎖, 150.3 mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 톨루엔 (23.9 ㎖의 BF₃-에테레이트 및 190 ㎖의 톨루엔)중의 BF₃-에테레이트 용액을 0℃에서 적가하였다. 16 시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 TEA 및 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결하고, 이를 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 유기층을 합하고, 이를 물로 세정하고, 진공하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/에틸 아세테이트 = 1/1∼0/1, v/v)로 정제하여 화합물 5 (21.4 g)을 얻었다. TLC: Rf = 0.31, 톨루엔/에틸 아세테이트 = 4/6, v/v.

화합물 7

무수 에테르/디클로로메탄 (232 ㎖, 3/1, v/v) 중의 공여체 5 (15.0 g, 30.3 mmol) 및 수용체 6 (23.0 g, 30.3 mmol) (WO99/25720)의 용액을 질소 흐름하에 활성 분자체 4Å (7.6 g)의 존재하에 30 분간 교반하였다. 그후, 디옥산/디클로로메탄 (69.8 ㎖, 1/1, v/v) 중의 1,3-디브로모-5,5-디메틸히단토인 (5.5 g, 19.1 mmol) 및 트리플릭산(0.49 ㎖, 5.6 mmol)의 용액을 -20℃에서 반응 혼합물에 75 분간 적가하였다. 30 분후, TEA (5 ㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 10 분간 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 티오황산나트륨 수용액(10%) 및 탄산수소나트륨 수용액(10%)으로 세정하고, 진공하에서 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (디클로로메탄 중의 0∼5% 아세톤)로 생성물을 정제하여 화합물 7 (19.6 g)을 얻었다. TLC: Rf = 0.1, 에테르/헵탄 = 8/2, v/v.

화합물 8

무수 톨루엔/아세트산 무수물(442 ㎖, 1/1, v/v) 중의 화합물 7 (19.5 g 16.4 mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물 (11.5 ㎖의 진한 황산 및 120 ㎖의 아세트산 무수물) 중의 131.5 ㎖의 황산의 저온 용액을 -26℃에서 적가하였다. 75 분후, TEA (73.5 ㎖)를 -20℃에서 첨가하였다. 아세트산 무수물은 25℃∼30℃의 온도를 유지하면서 330 ㎖의 물을 점진적으로 첨가하여 분해하였다. 16 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 물 800 ㎖에 붓고, 이를 톨루엔으로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고, 이를 물로 세정한 후, 이를 진공하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (톨루엔/에틸 아세테이트/에탄올 = 96/2/2, v/v/v)로 정제하여 백색 발포물인 화합물 8 (13.2 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.29, 톨루엔/에탄올 = 9/1, v/v.

화합물 9

32℃에서 무수 톨루엔 (66 ㎖) 중의 화합물 8 (13.2 g, 11.7 mmol)의 용액에 모르폴린(4.1 ㎖, 46.9 mmol)을 첨가하였다. 42 시간 동안 32℃에서 교반한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 염산 수용액 (17.6 ㎖, 4 N)을 첨가하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기상을 합하고, 이를 물로 2회 세정한 후, 황산나트륨상에서 건조하고, 이를 진공하에서 농축시켜 미정제 화합물 9를 얻었다. (12.6 g).

TLC: Rf = 0.32, 톨루엔/아세톤 = 7/3, v/v.

화합물 12

디클로로메탄 (114 ㎖) 중의 화합물 9 (12.6 g, 11.6 mmol)의 용액에 트리클로로아세토니트릴 (3.5 ㎖, 34.9 mmol) 및 DBU (52.2 ㎕, 0.35 mmol)를 첨가하였다. 2 시간 동안 실온에서 교반한 후, 디클로로메탄 (45 ㎖) 중의 활성 분자체 4Å (24 g) 및 수용체 11 (8.9 g, 13.0 mmol) (WO99/25720)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 30 분간 실온에서 교반한 후, 혼합물을 -20℃로 냉각시키고, 디클로로메탄 (100 ㎖) 중의 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (405 ㎕, 2.1 mmol)의 용액을 적가하였다. 30 분간 이를 교반한 후, 탄산수소나트륨을 -20℃에서 첨가하고, 반응 혼합물을 여과하였다. 여과액을 탄산수소나트륨 수용액에 붓고, 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 물로 2회 세정하고, 진공하에서 농축시켰다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (1: SiO₂: 0-10% 에테르 중의 아세톤; 2: SiO₂톨루엔/아세톤 = 85/15∼80/20, v/v; 3: RP-18: 물/아세토니트릴 = 2/8∼0/10, v/v)로 정제하여 순수한 화합물 12 (8.9 g)을 얻었다. TLC: Rf = 0.37, 톨루엔/아세톤 = 7/3, v/v.

화합물 14

312 ㎖의 DMF 및 45 ㎖의 물 중의 화합물 12 (8.9 g, 5.1 mmol) 및 10% Pd/C (8.9 g)의 현탁액을 연속 수소류하에서 교반하였다. 4.5 시간 후, Pd/C 촉매를 여과로 제거하였다. 여과액을 부피 400 ㎖로 농축시키고, 이를 10% Pd/C (1.5 g)로 수소류하에서 5.5 시간 동안 처리하였다. 촉매를 여과로 제거하였다. 여과액 (900 ㎖)을 수산화나트륨 수용액 (32 ㎖, 4 N)에 첨가하였다. 4 시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 1 N 염산으로 pH=6.6으로 산성화시킨 후, 이를 진공하에서 농축시켰다. 미정제 생성물을 물로 용출시키는 Sephadex G-25 컬럼상에서 탈염처리하였다. 적절한 유분을 수집하고, 이를 동결건조시켜 화합물 14 (4.0 g)을 얻었다.

화합물 15

5탄당 14 (700 ㎎, 0.61 mmol)을 물 (13.2 ㎖) 및 DMF (3.3 ㎖)에 용해시키고, 이를 N-(벤질옥시카르보닐옥시)숙신이미드 (224 ㎎, 0.90 mmol) 및 N-에틸모르폴린 (233 ㎕, 1.83 mmol)으로 처리하였다. 15 분간 교반한 후, 반응 혼합물을 물/아세토니트릴 10/0∼7/3로 용출하는 RP-18 컬럼에 직접 가하였다. 적절한 유분을 수집하고, 이를 소량의 부피로 농축시키고, 물 중의 Dowex 50 WX4-H⁺이온 교환 컬럼에 가하였다. 용출액을 진공하에서 농축시켜 순수한 화합물 15 (482 ㎎)을 얻었다.

화합물 16

DMF (4.7 ㎖) 중의 화합물 15 (471 ㎎, 0.37 mmol)의 용액에 삼산화황-피리딘 착체 (1.1 g, 6.6 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 16 시간 동안 30℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이를 냉각된 10% 탄산수소나트륨 용액 (16.7 ㎖, 19.9 mmol)에 적가하고, 이를 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 소량으로 농축시키고, 이를 물로 용출시키는 Sephadex G-25 컬럼에 가하였다. 적절한 유분을 수집하고, 이를 소량으로 농축시키고, 그후, 물로 용출시키는 Dowex Na⁺HCRW2 컬럼에 통과시켰다. 용출액을 농축시키고, 이를 8.3 ㎖의 0.2 N 염산에 재용해시킨 후, 이를 16 시간 동안 4℃에서 정치시켰다. 반응 혼합물을 8 ㎖의 0.2 N 수산화나트륨으로 중화시키고, 이를 물로 용출시키는 Sephadex G-25 컬럼에서 탈염시켰다. 적절한 유분을 수집하고, 진공하에서 농축시켜 순수한 화합물 16 (840 ㎎)을 얻었다.

화합물 17

t-부탄올 (85 ㎖) 및 물 (79 ㎖) 중의 화합물 16 (0.37 mmol) 및 10% Pd/C (820 ㎎)의 현탁액을 연속 수소류하에서 교반하였다. 3 시간 후, Pd/C 촉매를 여과로 제거하고, 여과액을 농축시키고, 동결건조시켜 순수한 화합물 17 (675 ㎎)을 얻었다.

4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(아미노이미노메틸)페닐]메틸]-2-옥소-2-(1-피페리디닐)에틸]아미노]-3-[[(4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐)설포닐]아미노]-1,4(S)-디옥소부틸]아미노]-부타노산 벤질 에스테르·염산염 (18)

질소 대기하에서 DMF (40 ㎖) 중의 4-[[(1R)-1-[[4-(아미노이미노메틸)페닐]메틸]-2-옥소-2-(1-피페리디닐)에틸]아미노]-3-[[(4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐)설포닐]아미노]-4-옥소-(3S)-부타노산·염산염 (2.38 g, 3.96 mmol) [문헌:Tetrahedron51, 12047-12068, 1995] 및 벤질-(4-아미노부티르산)·벤젠설포네이트(1.52 g, 3.96 mmol) [문헌:J. Am. Chem. Soc. 105, 5278-5284, 1983]의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.689 ㎖, 3.96 mmol) 및 테트라메틸-벤조트리아졸릴 우로늄 테트라플루오로보레이트 (1.91 g, 5.94 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH는 N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하여 6으로 유지하였다. 반응 혼합물을 4 일간 실온에서 교반하고, 이를 농축시킨 후, 에틸 아세테이트에 용해시키고, 5% 탄산나트륨 및 0.1 N 염산으로 세정하고, 이를 황산마그네슘상에서 건조시킨 후, 농축시켰다. 잔류물을 무수 에탄올 (5 ㎖)에 용해시키고, 이를 무수 디이소프로필 에테르로 침전시킨 후, 여과하여 2.47 g의 표제 화합물 18을 얻었다.

Rf = 0.8, 에틸 아세테이트/피리딘/아세트산/물 = 88/31/18/7, v/v/v/v;

질량 스펙트럼 (ESI⁺): 777.4 [M+H]⁺

4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(아미노이미노메틸)페닐]메틸]-2-옥소-2-(1-피페리디닐)에틸]아미노]-3-[[(4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐)설포닐]아미노]-1,4(S)-디옥소부틸]아미노]-부타노산·염산염 (19)

메탄올/물 (40 ㎖, 3/1, v/v) 중의 화합물 18 (2.42 g, 3.11 mmol) 및 10% Pd/C (400 ㎎)의 현탁액을 연속 수소류하에서 교반하였다. 8 시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축시킨 후, 메탄올/톨루엔 (1/10, v/v)으로 3회 공증발시켰다. 잔류물을 무수 에탄올 (5 ㎖) 중에 용해시키고, 무수 디에틸 에테르로 침전시키고, 여과 및 건조시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고, 이를 구배 용출계로서 20% A/60% B/20% C∼20% A/14% B/66% C를 사용하여 60 분간 40 ㎖/분 (A: 0.5M 인산염 완충액 pH 2.1; B: 물; C: 아세토니트릴/물 = 6/4)의 유속으로 정제용 HPLC DeltaPak RP-C₁₈에 직접 가하였다. 수율: 598 ㎎.

Rt = 26.4 분 (3-10 분: 20 - 43 %C + 20 %A; 10 - 50 분: 43 - 66 %C + 20 %A), (A: 인산염 완충액 pH 2.1; B: 물; C: 아세토니트릴/물 = 6/4, v/v), 분석용 HPLC Supelcosil LC-18-DB;

질량 스펙트럼 (ESI⁺): 687.2 [M+H]⁺, (ESI^-): 685.2 [M-H].

화합물 17 및 화합물 19로부터의 화합물 21

DMF (800 ㎕) 중의 화합물 19 (40 ㎎, 58.3 μmol)의 용액에 N-히드록시숙신이미드 (9.0 ㎎, 78.1 μmol), DCC (18.5 ㎎, 89.7 μmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (8.8 ㎎, 65.1 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40 시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 디칼라이트상에서 여과하고, 디칼라이트를 DMF (284 ㎕)로 4회 세정하였다. 여과액에 0.1 M Na₂HPO₄완충액 (1,936 ㎕, pH=7.5) 및 5탄당 17 (94.7 ㎎, 52.6 μmol)을 첨가하였다. 30 분간 교반한 후, 혼합물을 다칼라이트상에서 여과하고, 농축한 후, 이를 아세토니트릴/물 (1/1, v/v)로 용출하는 Sephadex G-50 컬럼에 가하였다. 적절한 분획을 수집하고, 이를 농축시키고, Sephadex G-50 컬럼 크로마토그래피 (물)로 2회 탈염 처리하였다. 적절한 유분을 수집하고, 이를 동결건조시켜 백색 고형물인 공액물 21(95.8 ㎎)을 얻었다.

질량 스펙트럼 (ESI⁺) = 2469, HPLC: Rt = 8.3 분 (20-80% B, 15 분, A =물/아세토니트릴 8/2; B = 2M NaCl/아세토니트릴 8/2, v/v), 분석용 HPLC MonoQ HR 5.

화합물 22

무수 CH₂Cl₂(500 ㎖) 중의 (R)-N-Boc(4-시아노페닐)알라닌 (25.0 g, 86.1 mmol), 피페리딘 (21.3 ㎖, 215.3 mmol) 및 TBTU (41.5 g, 129.2 mmol)의 용액을 실온에서 질소류하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 연속적으로 0.2N 염산, 물, 탄산수소나트륨 수용액 (포화) 및 물로 세정하였다. 유기상을 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과 및 진공하에서 농축시켰다. 생성물을 고온의 에틸 아세테이트 (35 ㎖)에 용해시키고, 헵탄(190 ㎖)으로 침전시키고 여과하여 화합물 22 (27.75 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.58, 헵탄/에틸 아세테이트 = 3/7, v/v.

화합물 23

무수 에탄올 (307 ㎖) 중의 화합물 22 (25.6 g, 71.7 mmol), 히드록실아민·HCl (7.1 g, 101.8 mmol) 및 트리에틸아민 (16.8 ㎖, 120.5 mmol)의 용액을 80℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키자 결정이 형성되었다. 결정을 여과로 분리하고, 이를 에탄올 및 에테르로 세정한 후, 이를 데시케이터내에서 건조시켜 화합물 23 (24.5 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.15, 헵탄/에틸 아세테이트 = 3/7, v/v.

화합물 24

무수 피리딘 (245 ㎖) 중의 화합물 23 (24.5 g, 62.7 mmol) 및 에틸 클로로포르메이트 (7.2 ㎖, 75.3 mmol)의 용액을 115℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이를 물 (1,250 ㎖)에 붓고, 에틸 아세테이트 (500 ㎖)로 3회 추출하였다. 합한 유기 추출액을 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과 및 진공하에서 농축시켜 화합물 24 (24.3 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.42, CH₂Cl₂/MeOH 95/5, v/v.

화합물 25

무수 CH₂Cl₂(122 ㎖) 및 TFA (122 ㎖) 중의 화합물 24 (24.3 g, 58.4 mmol)의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 이를 톨루엔의 존재하에 진공하에서 농축시켜 화합물 25 (37.6 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.35, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, v/v.

화합물 26

DMF (950 ㎖) and 물 (450 ㎖) 중의 H-Asp-(OtBu)-OH (39 g, 206.35 mmol), 염화4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠-설포닐 (62 g, 249.3 mmol) 및 디이소프로필아민 (89 ㎖, 635 mmol)의 현탁액을 0℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음/물 (5 ℓ)에 붓고, 이를 디에틸 에테르로 2회 세정하고, 염산 수용액(4 N, 72 ㎖)으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸 아세테이트층을 합하고, 이를 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과하고 진공하에서 농축시켜 화합물 26(97.7 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.67, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, v/v.

화합물 27

무수 DMF (670 ㎖) 중의 화합물 25 (33.5 g), 화합물 26 (24.7 g), TBTU (36.8 g, 114.6 mmol) 및 디이소프로필아민 (27.2 ㎖, 194.1 mmol)의 용액을 2 시간 동안 교반하고, 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (750 ㎖)에 용해시키고, 탄산수소나트륨 수용액 (5%, 1,250 ㎖) 및 염산 수용액 (0.1 N, 1,250 ㎖)으로 세정하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 여과 및 진공하에서 농축시켜 화합물 27 (33.8 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.88, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, v/v.

화합물 28

무수 CH₂Cl₂(170 ㎖) 및 TFA (170 ㎖) 중의 화합물 27 (33.8 g, 48.3 mmol)의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 이를 톨루엔의 존재하에 진공하에서 농축시켜 화합물 28 (32.3 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.73, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, v/v.

화합물 29

무수 DMF (622 ㎖) 중의 화합물 28 (32.3 g), H-GABA-OtBu·HCl (9.5 g, 48.4 mmol), TBTU (29.0 g, 90.5 mmol) 및 디이소프로필아민 (25.2 ㎖, 179.8mmol)의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 이를 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (840 ㎖)에 용해시키고, 탄산수소나트륨 수용액 (5%, 1,400 ㎖) 및 염산 수용액 (0.1 N, 1,400 ㎖)으로 세정하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 이를 여과하고, 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 에탄올 (75 ㎖)에 용해시키고, 이를 교반된 디이소프로필에테르 (2,990 ㎖)에 서서히 첨가하여 회백색 결정인 화합물 29 (32.0 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.56, CH₂Cl₂/MeOH 9/1, v/v.

화합물 30

무수 CH₂Cl₂(15 ㎖) 및 TFA (15 ㎖) 중의 화합물 29 (3.0 g, 3.82 mmol)을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 이를 진공하에서 톨루엔의 존재하에 농축시켰다. 잔류물을 CH₂Cl₂/MeOH (0%-6% MeOH)를 사용하는 실리카 겔상에서 정제하여 순수한 화합물 30 (1.98 g)을 얻었다.

TLC: Rf = 0.56, CH₂Cl₂/MeOH 8/2, v/v.

화합물 31

DMF (45 ㎖) 중의 화합물 30 (900 ㎎, 1.23 mmol), TBTU (396 ㎎, 1.23 mmol) 및 디이소프로필아민 (215 ㎕, 1.53 mmol)의 용액을 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 화합물 17 (2.0 g, 1.11 mmol)을 첨가하고, 이를 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 진공하에서 농축시켜 화합물 31 (4.17 g)을 얻었다.

화합물 31로부터의 화합물 21

t-부틸 알콜 (28 ㎖) 및 물 (56 ㎖) 중의 화합물 31 (4.17 g) 및 10% Pd/C (2.8 g)의 현탁액을 밤새 연속 수소류하에서 교반하였다. Pd/C 촉매를 여과로 제거하고, 여과액을 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고, Q-세파로스 컬럼에서 정제하였다. 적절한 분획을 수집하고, 이를 농축시키고, Sephadex G-25 컬럼 크로마토그래피 (물)로 탈염 처리하였다. 적절한 유분을 수집하고, 동결건조시켜 백색 고형물인 공액물(1.74 g)을 얻었다.

실시예 2

본 발명의 화합물의 생물학적 활성은 하기의 테스트 방법에 의하여 측정하였다.

I. 항-트롬빈 분석

트롬빈 (인자 IIa)은 응고 다단계에서의 인자이다.

본 발명의 화합물의 항-트롬빈 활성은 트롬빈에 의하여 나타나는 발색성 기질 s-2238의 가수분해 속도를 분광학으로 측정하여 평가하였다. 이와 같은 완충계내에서의 항-트롬빈 활성에 대한 분석을 사용하여 테스트 화합물의 IC₅₀값을 측정하였다.

테스트 배지: 트로메타민-NaCl-폴리에틸렌 글리콜 6000 (TNP) 완충액

기준 화합물: I2581 (Kabi)

비이클: TNP 완충액.

최종 반응 혼합물 중에서 2.5% 이하의 농도에서는 부작용이 없는 디메틸설폭시드, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 t-부틸 알콜을 사용하여 가용화를 촉진시킬 수 있다.

기법:

시약*1.트로메타민-NaCl (TN) 완충액; 완충액의 조성: 트로메타민 (Tris) 6.057 g (50 mmol), NaCl 5.844 g (100 mmol), 물을 합하여 1 ℓ까지. 용액의 pH는 HCl (10 mmol·ℓ^-1)를 사용하여 37℃에서 7.4로 조정하였다.2.TNP 완충액: 폴리에틸렌 글리콜 6000을 TN 완충액에 용해시켜 농도 3 g·ℓ^-1을 얻었다.3.S-2238 용액: 하나의 바이알 S-2238 (25 ㎎ 크로모게닉스; 스웨덴)을 20 ㎖의 TN 완충액에 용해시켜 농도 1.25 ㎎·㎖^-1(2 mmol·ℓ^-1)를 얻었다.4.트롬빈 용액: 사람 트롬빈 (1,000 NIH 단위/바이알, Enzyme Res. Lab. Inc., 미국)을 TNP 완충액에 용해시켜 스톡 용액 50 NIH 단위·㎖^-1를 얻었다. 사용 직전에, 이 용액을 TNP 완충액으로 희석하여 농도 30.2 NIH 단위·㎖^-1를 얻었다.

* - 모든 성분은 분석용 등급을 사용하였다.

- 수용액의 경우 초순수 (Milli-Q 품질)를 사용하였다.

테스트 및 기준 화합물 용액의 제조

테스트 및 기준 화합물을 Milli-Q 물에 용해시켜 스톡 농도가 10^-2mol·ℓ^-1를 얻었다. 각각의 농도를 비이클로 단계적으로 희석하여 농도 10^-3, 10^-4및 10^-5mol·ℓ^-1를 얻었다. 스톡 용액을 포함한 희석물을 분석에 사용하였다 (반응 혼합물 중의 최종 농도: 각각 3×10^-4; 10^-4; 3×10^-5; 10^-5; 3×10^-6; 10^-6; 3×10^-7및 10^-7mol·ℓ^-1).

절차

실온에서, 0.075 ㎖ 및 0.025 ㎖의 테스트 화합물 또는 기준 화합물 용액 또는 비이클을 미량역가 평판의 웰에 교대로 피펫으로 넣고, 이 용액을 0.115 ㎖ 및 0.0165 ㎖의 TNP 완충액 각각으로 희석하였다. 0.030 ㎖의 S-2238 용액의 분액을 각각의 웰에 첨가하고, 평판을 예열하고, 교반하면서 항온기(애머샴)내에서 37℃에서 10 분간 예비항온 처리하였다. 예비배양후, 각각의 웰에 0.030 ㎖의 트롬빈 용액을 첨가하여 S-2238의 가수분해를 개시하였다. 평판을 37℃에서 항온 처리하였다(30 초간 교반하면서). 1 분의 항온 처리후, 각 샘플의 405 ㎚에서의 흡광도를 매 2분 간격으로 90 분 동안 역학적 미량역가 평판 판독기(트윈리더 플러스, 플로우 래버로토리즈)를 사용하여 측정하였다.

모든 데이타를 데이터 프로세싱 프로그램(Biolise)을 사용하여 퍼스널 컴퓨터에서 수집하였다. 각각의 화합물의 농도(mol·ℓ^-1반응 혼합물) 및 공시험에 대하여 분 단위의 반응 시간에 대하여 플롯하였다.

반응의 평가: 각각의 최종 농도에 대하여 분석 플롯으로부터 최대 흡광도를 계산하였다. IC₅₀값(최종 농도, μmol·ℓ^-1단위, 공시험의 최대 흡광도의 50% 억제를 야기하는 농도)은 문헌 [Hafner et al.Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977; 27(II): 1871-3]에 의하여 로짓 변환 분석을 사용하여 연산하였다.

실시예 1의 화합물의 항트롬빈 활성: IC₅₀값: 17 nM.

II. 항-인자 Xa 분석

활성화된 인자 X (Xa)는 응고 다단계에서의 인자이다. 본 발명의 화합물의 항-Xa 활성은 Xa에 의하여 나타나는 발색성 기질 s-2222의 가수분해 속도를 분광학으로 측정하여 평가하였다. 완충계 중에서의 항-Xa 활성에 대한 분석을 사용하여 테스트 화합물의 IC₅₀값을 평가하였다.

기준 화합물: 5탄당 Org 31540

비이클: TNP 완충액.

최종 반응 혼합물 중에서 1% (DMSO의 경우) 및 2.5% 이하의 농도에서는 부작용이 없는 디메틸설폭시드, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 또는 t-부틸 알콜을 사용하여 가용화를 촉진시킬 수 있다.

기법

시약*1.트로메타민-NaCl (TN) 완충액; 완충액의 조성: 트로메타민 (Tris) 6.11 g (50.4 mmol), NaCl 10.17 g (174 mmol), 폴리에틸렌 글리콜 6000 3 g·ℓ^-1, 물 1 ℓ까지. 용액의 pH는 HCl (10 mmol·ℓ^-1)를 사용하여 37℃에서 7.4로 조정하였다.3.S-2222 용액: 하나의 바이알 S-2222 (25 ㎎ 크로모게닉스; 스웨덴)을 물에 용해시켜 농도 0.375 ㎎·㎖^-1(0.5 mmol·ℓ^-1)를 얻었다.4.Xa 용액: 소 인자 Xa 사람 (71 nKat·바이알^-1; 크로모제닉스)를 10 ㎖의 TNP 완충액에 용해시킨 후, TNP 완충액으로 추가로 희석하여 농도 0.75 nKat·(1.5 U)·㎖^-1를 얻었다. 희석물은 새로이 생성되어야 한다.5.ATIII 용액: 사람 ATIII (크로모제닉스)를 물에 용해시켜 1 U·㎖^-1의 농도를 얻고, 그후 용액을 3 부피의 TNP 완충액을 사용하여 0.25 U·㎖^-1의 농도로 추가로 희석하였다.6.표준 용액: 5.7 항-Xa (U·㎖^-1) Org 31540의 스톡 용액을 TNP 완충액에 0.05 U·㎖^-1로 희석하였다.6.테스트 시료: 각각의 제조물을 물에 용해시키고, TNP 완충액을 사용하여 농도 0.05 nmol·㎖^-1로 희석하였다. 각각의 제조물은 9 희석을 수행하였다 (희석율 1.5).

Xa 활성의 측정

각각의 테스트 시료 (0.05 ㎖)를 피펫을 사용하여 실온에서 미량역가 평판의웰에 넣었다. AT-III 용액 (0.05 ㎖)을 각각의 시료에 첨가하고, 평판을 Vari-교반기를 사용하여 교반하였다. AT-III 용액을 첨가한지 10 분후, Xa 용액의 분액(0.05 ㎖)을 피펫으로 각 웰에 가하고, 평판을 다시 교반하였다. Xa 용액을 첨가한지 정확히 2 분후, S-2222 용액 0.1 ㎖를 피펫으로 각각의 웰에 넣고, 평판을 다시 교반하였다. 모든 첨가에 대하여, 12-채널 피펫을 사용하였다. Xa의 잔량은 S-2222의 가수분해를 촉매화하며, 이의 속도는 각각 2 분 및 22 분의 항온 처리 기간 후 실온에서 광도계로 측정하였다. 각 시료의 흡광도는 리더 마이크로엘리사, 모델 310C (오르가논 테크니카, 오스, 네덜란드)를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였으며, 흡광도의 증분(ΔOD)을 계산하였다. 각각의 테스트 시료를 2회 측정하였다. 매 10 분마다 공시험(0.05 ㎖ TNP 완충액)이 포함되었다.

검정 곡선

검정 시료의 표준 용액의 분액으로부터, 여러가지 희석을 수행하였다 (Org 31540 시료의 희석율 1.4). 생성된 표준 시료(약 12 시료)는 0.01∼0.05 항-Xa U/㎖을 포함하여야만 한다. 매 실시에서, 각각의 표준 시료 0.05 ㎖을 "Xa 활성의 측정"에 기재된 바와 같이 3 회 이상 테스트하였다. 검정 곡선은 최소 제곱법을 사용하여 log 항-Xa (U/㎖)에 대하여에 직선을 적용시켜 얻는다.

반응 평가: 각각의 시료에 대하여, 평균 항-Xa 활성(U/㎖)은 검정 곡선을 사용하여 측정하였다.

실시예 1의 화합물의 항-인자 Xa 활성은 1,012 U/μmol이다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적 허용염, 이의 프로드러그 또는 용매화물.

화학식 I

상기 화학식에서, R은 독립적으로 SO₃ ^-또는 CH₃이고,

스페이서는 13∼25 원자의 길이를 갖는 플렉서블 스페이서이고,

5탄당 잔기의 하전은 양으로 하전된 반대이온에 의해 보상되며, 5탄당 잔기에서의 황산염기의 총수는 4, 5 또는 6이다.
제1항에 있어서, 5탄당 잔기는 하기 화학식을 갖는 것인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 스페이서는 길이가 16∼22 원자인 것인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스페이서는 길이가 19 원자인 것인 화합물.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스페이서는 *-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)₃-NH-C(O)-CH₂-이고, *로 표시한 말단은 5탄당 잔기에 결합되는 것인 화합물.
제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia를 갖는 것인 화합물.

화학식 Ia
벤즈아미딘 부분이 전구체의 형태이고, 1,2,4-옥사디아졸린-5-온기인 것인 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의한 화합물 및 약학적 허용 보조제를 포함하는 약학 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 것인 화합물.
혈전증 또는 기타의 혈전증 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 기재된 화합물의 용도.