CZ20021958A3

CZ20021958A3 - Antitrombotická sloučenina

Info

Publication number: CZ20021958A3
Application number: CZ20021958A
Authority: CZ
Inventors: Boeckel Constant Adriaan Anton Van; Cornelia Maria Tromp; Tamara Theodora Maria Geertsen
Original assignee: Akzo Nobel N. V.
Priority date: 1999-12-07
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2002-08-14
Also published as: SK7942002A3; NO323059B1; AU781846B2; NO20022689L; SK287682B6; KR20020070988A; CN1407989A; CZ303385B6; BR0016217A; PL202840B1; CA2393042A1; TWI289566B; KR100776607B1; HUP0203471A3; US20030114361A1; CA2393042C; PL355484A1; WO2001042262A2; JP2003520208A; JP4820517B2

Description

Antitrombotické sloučenina

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové antitrombotické sloučeniny, farmaceutického prostředku s obsahem této sloučeniny jako účinné složky a použití této sloučeniny pro výrobu léků.

Dosavadní stav techniky

Serinové proteázy jsou enzymy, které mají důležitou úlohu v kaskádě krevní koagulace. Důležitou serinovou proteázou je faktor Xa, který katalyzuje konverzi protrombinu na trombin. Trombin je poslední enzym ze skupiny serinových proteáz v koagulační kaskádě. Hlavní funkcí trombinu je rozštěpení fibrinogenu za vytvoření fibrinových monomerů, které zesíťují za vytvoření nerozpustného gelu. Trombin navíc reguluje svou vlastní produkci aktivací faktorů V a VIII stojících v kaskádě dříve. Má také důležité účinky na buněčné úrovni, kde působí na specifické receptory pro agregaci destiček, aktivaci endoteliálních buněk a proliferaci fibroblastů. Trombin má tedy centrální regulační úlohu při hemostázi a tvorbě trombu.

Při vývoji syntetických inhibitorů serinových proteáz byl v poslední době ohlášen syntetický NAPAP-pentasacharidový konjugát jako antitrombotická látka s dvojím profilem, jednak přímým antitrombinovým účinkem, a zároveň anti-Xa aktivitou zprostředkovanou ATIII (ATIII: antitrombin III) (Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9 (14), 2013 - 8). I když může být tato ohlášená antitrombotická sloučenina zajímavá, s touto sloučeninou bude spojena zkřížená reaktivita s HIT a neutralizace PF4 v důsledku vysokého obsahu sulfátu pentasacharidového zbytku (Tromb. Haem. Suppl. 1997, str. 363 PD1485).

a..

ί: :

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že sloučeniny vzorce (I) jsou antitrombotické látky s vynikajícím a výhodným dvojitým profilem. Sloučeniny vzorce (I) 5 mají farmakologicky zajímavý poločas umožňující podávání jednou za den a jsou obtížně neutralizovány působením PF4. Navíc je nízké riziko krvácení. Sloučeniny vzorce (I) tedy mají atraktivní kombinaci farmakologických vlastností.

w Vzorec (I):

kde R je nezávisle SO₃' nebo CH₃;

mezerníková skupina je flexibilní mezerníková skupina o délce až 25 atomů, s výhodou 16 až 22, a nejvýhodněji 19 atomů;

• « • ·«» náboj pentasacharidového zbytku je kompenzován kladně nabitými protiionty;

a celkový počet sulfátových skupin v pentasacharidovém zbytku je 4, 5 nebo 6;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, prekurzor nebo solvát.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro léčení a prevenci onemocnění podmíněných trombinem a souvisejících s trombinem. Patří sem řada trombotických a protrombotických stavů, při kterých je aktivována koagulační kaskáda, které bez omezení zahrnují trombózu hlubokých žil, plicní embolii, tromboflebitidu, uzavření tepny způsobené trombozou nebo embolii, znovu uzavření tepny v průběhu nebo po angioplastice nebo trombolýze, restenózu po poranění tepny nebo invazivních kardiologických postupech, postoperativní žilní trombózu nebo embolii, akutní nebo chronickou aterosklerózu, mrtvici, infarkt myokardu, rakovinu a metastázy a neurodegenerativní onemocnění. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako antikoagulanty v mimotělních krevních obězích nezbytných při dialýze a chirurgických zákrocích. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity jako antikoagulanty in vitro.

Sloučeniny vzorce (I) jsou konkrétně použitelné jako antitrombotické látky pro arteriální indikace.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou sloučeniny, ve kterých má pentasacharidový zbytek následující strukturu:

·»· ··· ' · « I • · 9 99 9 ·♦·· 9 t · • 9 9 9 9 9 9 9 ♦ * 9 9 9

9 9 · ···© « * « ·· ♦· ·· ·· ·♦ ····

Chemická povaha mezerníkové skupiny má pro antitrombotickou aktivitu sloučenin podle vynálezu nižší důležitost. Mezerníková skupina sloučenin podle vynálezu je však flexibilní, což znamená, že mezerníková skupina neobsahuje rigidní prvky jako jsou nenasycené vazby nebo cyklické struktury. Vhodné mezerníkové skupiny mohou snadno navrhnout odborníci v oboru. Výhodné mezerníkové skupiny obsahují alespoň jeden prvek -(CH₂CH₂O)-. Výhodnější mezerníkové skupiny obsahují tři prvky -(CH₂CH₂O)-. Nejvýhodnější mezerníková skupina je *-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)₃-NH-C(O)-CH₂-, io přičemž konec označený * je navázán na pentasacharidový zbytek.

Výhodné sloučeniny vzorce I jsou sloučeniny vzorce (la), kde p je 1 až 5, n je 1 až 5 a m je 1 nebo 2. Nejvýhodnější sloučenina je sloučenina vzorce (la), kde p je 3, n je 3 a m je 1.

Kladně nabitý protiiont znamená H⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺, apod.

Sloučeniny vzorce (I) jsou s výhodou ve formě sodných solí.

Termín „prekurzor“ znamená sloučeninu podle vynálezu, ve které je aminová skupina v amidinové skupině chráněná, například

·» · · skupinou hydroxy nebo (1-6C)alkoxykarbonyl. Mezi solváty podle vynálezu patří hydráty.

Sloučeniny podle vynálezu, které se mohou vyskytovat ve formě volné báze, mohou být z reakční směsi izolovány ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Farmaceuticky přijatelné soli mohou být také získány působením organické nebo anorganické kyseliny jako je chlorovodík, bromovodík, jodovodík, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina methansulfonová, kyselina fumarová, kyselina jantarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina askorbová apod.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu obsahují chiráiní atomy uhlíku a mohou být tedy získány ve formě čistého enantiomeru nebo jako směs enantiomerů nebo jako směs obsahující diastereomery. Způsoby získávání čistých enantiomerů jsou v oboru dobře známé, a patří sem například krystalizace solí získaných z opticky aktivních kyselin a racemické směsi nebo chromatografie na chirálních kolonách. Pro diastereomery mohou být použity kolony s přímými nebo převrácenými fázemi.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny nejprve aktivací karboxylátové skupiny analogu NAPAP vzorce II a potom přidáním zbytku pentasacharid-mezerníková skupina obsahujícího aminovou skupinu (vzorec III), popřípadě s následným odstraněním ochranné skupiny z amidinové skupiny.

(CH₂)_n

HO o

[mezerníková skupina] (ii)

OR

(i) nh₂ ·♦· · ·♦ « t * * • · ·»· · » »·* ♦ · ·

- θ “ · » · * · · · · · · * ·· ·· ·· ·« ·♦ ····

Karboxylátová skupina ve sloučeninách vzorce II může být aktivována jako směsný anhydrid nebo výhodněji jako aktivovaný ester jako je ester N-hydroxysukcinimidu, pentafluorofenolu nebo 1-hydroxy-benzotriazolu. Při kroku vazby může být benzamidinová skupina ve vzorci II zbavena ochranné skupiny (R’=R”= H), nebo na ni může být popřípadě navázána jako ochranná skupina karbamátová skupina, s výhodou allyloxykarbonyl (R’ a/nebo R” je H₂C=CH-CH-C(O)O) nebo benzyloxykarbonyl (R’ a/nebo R” je PhCH2-C(O)O). Ochranné skupiny allyloxykarbonyl a benzyloxykarbonyl mohou být odstraněny za poměrně mírných podmínek. Skupina allyloxykarbonyl může být odstraněna použitím Pd v přítomnosti slabého nukleofilního činidla jako je morfolin nebo ester kyseliny malonové. Skupina benzyloxykarbonyl může být odstraněna za podmínek jako je vodík/Pd(C). Alternativně je možno použít syntetické prekurzory benzamidinu jako je N-alkoxybenzamidin nebo N-benzyloxybenzamidin (R’=H, R” = alkoxy nebo benzyloxy). Tyto syntetické prekurzory mohou být převedeny na benzamidin za redukčních podmínek jako je hydrogenace (např. Fujii, T. a další, Chem. Pharm. Bull., 39, 301, 1991 a Fujii, T. a další, Chem. Pharm. Bull., 42, 1231, 1994).

Výhodný prekurzor benzamidinu je 1,2,4-oxadiazolin-5-on (-R'_R”_ = -C(O)O-). Tento prekurzor může být převeden na benzamidin hydrogenací (Bolton, R. E. a další, Tetrahedron Letters, díl 36, No. 25, 1995, str. 4471 - 4474).

Sloučeniny vzorce II mohou být připraveny různými způsoby použitím v oboru známých metod. Způsob přípravy sloučenin vzorce II, kde R’ = R” = Η; n je 3 a m je 1, se popisuje v EP 0513543. Sloučeniny vzorce II, ve kterých je amidinová skupina chráněná, například skupinou allyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl, mohou být připraveny ze sloučenin vzorce IV, kde amidin je chráněný skupinou allyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl použitím metod obecně známých v oboru pro vazbu peptidových fragmentů. Karbamáty vzorce IV mohou být například vyrobeny z odpovídajícího fc* ·*

9 9

9 999 • 9 9 9 fcfc • fc· * · ··« amidinu (vzorec IV, R’ = R” = H) jak je popsáno v literatuře, např Weller, T. a další, J. Med. Chem. 39, 3119, 1996).

(IV)

HOyO

N-alkoxybenzamidinové

N-benzyloxybenzamidinové sloučeniny vzorce II mohou být vyrobeny ze sloučeniny V (popsáno v EP 0513543) působením O-alkylhydroxylaminu nebo O-benzyl-hydroxylaminu na tuto kyanovou sloučeninu a následným odstraněním t-butylesteru za kyselých podmínek. Alternativně se mohou N-alkoxybenzamidinové a N-benzyloxybenzamidinové sloučeniny vzorce II připravit nejprve odstraněním t-butylesteru sloučeniny V za kyselých podmínek za získání sloučeniny VI a potom reakcí této kyanové sloučeniny s O-alkylhydroxylaminem nebo O-benzylhydroxylaminem.

Sloučeniny vzorce II, ve kterých -R’-R”- = -C(O)O- (skupina 1,2,4-oxadiazolin-5-on), mohou být připraveny ze sloučenin vzorce IV, ve kterých -R’-R”- = -C(O)O-, použitím způsobů známých v oboru pro vazbu peptidových fragmentů.

Syntéza zbytků aminoskupina-oligosacharid-mezerník vzorce III může být například prováděna použitím metod popsaných v EP 0649854. Sacharidové zbytky sloučenin podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsoby známými v oboru, například z WO 99/25720.

Peptidová vazba, krok ve výše popisované metodě pro přípravu sloučenin podle vynálezu, může být prováděna metodami běžně ♦* ♦ 9 9 9 9 9 ««

9» * 9 * * 9 * 9 • 9 999 φ 9 *·· 9 · 9

9 99 9·9 99 999 9 9

-9999 9999 9 · 9 • 9 · 9 99 9« »♦ 9 9 * 9 známými v oboru pro vazbu - nebo kondenzaci - peptidových fragmentů, jako například azidovou metodou, metodou směsného anhydridu, metodou aktivovaného esteru nebo s výhodou karbodiimidovou metodou, zvláště s přidáním katalytických a racemizaci potlačujících sloučenin jako N-hydroxysukcinimid a Nhydroxybenzotriazol. Přehled těchto reakcí se uvádí v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, díl 3, E. Gross a J. Meienhofer, ed. (Academie Press, New York, 1981) a Bodanszky, M.; Principles of peptide synthesis, Springer-Verlag, 1984.

Aminové funkční skupiny přítomné ve sloučeninách mohou být v průběhu postupu syntézy chráněny N-ochrannou skupinou, která znamená skupinu běžně používanou v chemii peptidů pro ochranu aaminoskupiny, jako je skupina řerc-butyloxykarbonyl (Boc), skupina benzyloxykarbonyl (Z), skupina 9-fIuorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) 15 nebo skupina ftaloyl (Phth). Odstranění ochranných skupin se může provádět různými způsoby v závislosti na povaze těchto ochranných skupin. Odstraňování ochranných skupin obvykle probíhá za kyselých podmínek a v přítomnosti vychytávačů (scavengers). Přehled aminových ochranných skupin a způsoby jejich odstraňování je uveden 20 ve výše uvedené publikaci The Peptides Analysis, Synthesis, Biology, díl 3, a dále jak je popsáno v Greene, T. W. a Wuts, P. G. M., Protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons lne. 1991.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány enterálně nebo parenterálně. Přesná dávka a režim těchto sloučenin a prostředky s jejich obsahem budou nezbytně záviset na potřebách jednotlivce, kterému se farmaceutický prostředek podává, stupni postižení nebo potřebě a úsudku ošetřujícího lékaře. Parenterální podávání obecně vyžaduje nižší dávky než jiné způsoby podávání, které jsou více závislé na absorpci. Denní dávky pro člověka jsou s výhodou 0,001 až 30 100 mg na kg tělesné hmotnosti, výhodněji 0,01 až 10 mg na kg tělesné hmotnosti.

·♦ ·· ·· »· ·· ·» ·»· · · * »♦·· • · ··· · · ··· · 4 · • · 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9 9 · 9 • 9 99 99 99 99 9999

Farmaceutický prostředek vyráběný s použitím sloučenin podle předkládaného vynálezu může být také použit jako adjuvantní látka v akutní antikoagulační terapii. V takovém případě se farmaceutický prostředek podává spolu s jinými sloučeninami použitelnými při léčení těchto stavů onemocnění.

Ve směsi s farmaceuticky vhodnými pomocnými látkami, například jak se popisuje ve standardní referenční publikaci Gennaro a další, Remíngtoďs Pharmaceutical Sciences, (18. vydání, Mack Publishing Company, 1990, viz zvláště část 8: Pharmaceutical io Preparations and Their Manufacture), mohou být sloučeniny lisovány do pevných dávkových jednotek jako jsou pilulky, tablety, nebo mohou být zpracovány do kapslí nebo čípků. Použitím farmaceuticky vhodných kapalin mohou být také sloučeniny aplikovány ve formě roztoku, suspenze, emulze, například pro použití jako injekční preparát, nebo ve formě spreje, například pro použití jako nosní sprej.

Pro výrobu dávkových jednotek, například tablet, se uvažuje použití běžných pomocných látek jako jsou plniva, barviva, polymerní pojivá apod. Obecně může být použito jakékoli farmaceuticky přijatelné aditivum, které neinterferuje s funkcí účinných sloučenin.

Mezi vhodné nosiče, se kterými mohou být sloučeniny podávány, patří laktóza, škrob, deriváty celulózy apod., nebo jejich směsi použité ve vhodných množstvích.

Vynález bude dále ilustrován na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Použité zkratky:

Ac = acetyl

Bn = benzyl

99

9 9

9 9 99 ·* *» • * · • · ·♦· • · · 9

- · · · * • · · ·

99

9 9 9

9 · * 9

9999

DBU = 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en

DCC = dicyklohexylkarbodiimid

DMF = N,N-dimethylformamid

Su = sukcinimidyl

Me = methyl

TBTU = 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetra

-fluorborát

TEA = triethylamin

TFA = kyselina trifluoroctová io Z = benzyloxykarbonyl

Čísla sloučenin označují sloučeniny ve schématech 1 až 7.

Sloučenina 3

K míchanému roztoku sloučeniny 1 (53,6 g, 143,6 mmol) (R. 15 Roy; W. K. C. Park; Q. Wu; S-N. Wang, Tetrahedron Lett., 1995, 36 (25), 4377 - 80) a sloučeniny 2 (27,9 g, 89,3 mmol) (S. J. Danishefsky; Μ. P. DeNinno; G. B. Philips; R. E. Zelle, Tetrahedron, EN, 1986, 42, 11, 2809 - 2819) v 930 ml DMF byl přidán hydrid sodný (7,7 g 60% disperze, 192,2 mmol) při 50 °C. Po 1 hod byla reakční směs zahřáta na 120 °C. Po míchání po dobu 5 min byla reakční směs ochlazena na 40 °C a zředěna vodou a extrahována třikrát dichlormethanem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a koncentrovány ve vakuu, za získání surového produktu 3 (54 g). TLC: Rf = 0,23, ether 100 %.

Sloučenina 4

K míchanému roztoku sloučeniny 3 (89,3 mmol) v 800 ml suchého toluenu a 800 ml acetanhydridu byl po kapkách přidán vychlazený roztok 361,5 ml kyseliny sírové v acetanhydridu (16,5 ml koncentrovaná kyselina sírová a 345,0 ml acetanhydrid) pří -30 °C. Po

0 0 ©·· *»00 • 0000 0 0000 0 0 * 0 0* 00* 00 0 0 0 0 0 0000 0000 000

00 00 00 0» 0000 hod byla reakce ukončena 240 ml TEA a směs byla míchána při teplotě laboratoře. K roztoku byl přidán vodný hydrogenuhličitan sodný (5%) a vodná vrstva byla extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly dvakrát promyty vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Tento postup byl opakován za získání surové sloučeniny 4 (53 g). TLC: Rf = 0,29, ether 100 %.

Sloučenina 5

K míchanému roztoku sloučeniny 4 (89,3 mmol) a ethanthiolu w (11,1 ml, 150,3 mmol) v 370 ml suchého toluenu byl po kapkách přidán roztok BF₃-etherátu v toluenu (23,9 ml BF₃-etherátu a 190 ml toluenu) při 0 °C. Po míchání po dobu 16 hod při teplotě laboratoře byla reakce ukončena TEA a vodným hydrogenuhličitanem sodným a byla extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Surový produkt byl čištěn chromatografií na koloně (toluen/ethylacetát = 1/1 až 0/1, obj./obj.) za získání sloučeniny 5 (21,4 g). TLC: Rf = 0,31, toluen/ethylacetát = 4/6, obj./obj.

Sloučenina 7

Roztok donoru 5 (15,0 g, 30,3 mmol) a akceptoru 6 (23,0 g,

30,3 mmol) (WO 99/25720) ve směsi suchého etheru/dichloromethanu (232 ml, 3/1, obj./obj.) byl míchán 30 min v proudu dusíku v přítomnosti aktivovaných molekulových sít 4Á (7,6 g). Potom byl k reakční směsi přidán roztok 1,3-dibrom-5,5-dimethylhydantoinu (5,5 g, 19,1 mmol) a kyseliny trifluormethansulfonové (0,49 ml, 5,6 mmol) ve směsi dioxan/dichloromethan (69,8 ml, 1/1, obj./obj.) po kapkách v průběhu 75 min při teplotě -20 °C. Po 30 min byl k reakční směsi přidán TEA (5 ml) a směs byla míchána 10 min a potom zfiltrována.

Filtrát byl promyt vodným thiosíranem sodným (10%) a vodným

9 9 9 * o »99· • · 999 * 9 ·»* 9 9 9

99 >99 99 9 9 9 · 9

9 9 · 999 9 9 99

99 ·· 99 >9 9999 hydrogenuhličitanem sodným (10%) a zakoncentrován ve vakuu. Produkt byl čištěn chromatografií na koloně (0 až 5% aceton v dichloromethanu) za získání sloučeniny 7 (19,6 g). TLC; Rf = 0,1, ether/heptan = 8/2, obj./obj.

Sloučenina 8

K míchanému roztoku sloučeniny 7 (19,5 g 16,4 mmol) ve směsi suchý toluen/acetanhydrid (442 ml, 1/1, obj./obj.) byl po kapkách přidán ochlazený roztok 131,5 ml kyseliny sírové v acetanhydridu io (11,5 ml koncentrované kyseliny sírové a 120 ml acetanhydridu) při -26 °C. Po 75 min byla přidána TEA (73,5 ml) při -20 °C. Acetanhydrid byl rozložen postupným přidáním 330 ml vody za udržování teploty mezi 25 °C a 30 °C. Po míchání po dobu 16 hod byla směs vlita do 800 ml vody a extrahována dvakrát toluenem. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Surový produkt byl čištěn chromatografií na koloně (toluen/ethylacetát/ethanol = 96/2/2, obj./obj./obj.) za získání sloučeniny 8 jako bílé pěny (13,2 g). TLC: Rf = 0,29, toluen/ethanol = 9/1, obj./obj.

Sloučenina 9

K roztoku sloučeniny 8 (13,2 g, 11,7 mmol) v suchém toluenu (66 ml) při 32 °C byl přidán morfolin (4,1 ml, 46,9 mmol). Po míchání po dobu 42 hod při 32 °C byla reakční směs ochlazena na laboratorní teplotu a byla přidána vodná kyselina chlorovodíková (17,6 ml, 4N).

Směs byla zředěna vodou a extrahována dvakrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly dvakrát promyty vodou, sušeny nad síranem sodným a zakoncentrovány ve vakuu za získání surové sloučeniny 9 (12,6 g). TLC: Rf = 0,32, toluen/aceton = 7/3, obj./obj.

« 4

4 4 ···

4 4 • 44

4444

Sloučenina 12

K roztoku sloučeniny 9 (12,6 g, 11,6 mmol) v dichloromethanu (114 ml) byl přidán trichloracetonitril (3,5 ml, 34,9 mmol) a DBU (52,2 μΙ, 0,35 mmol). Po míchání po dobu 2 hod při teplotě laboratoře byla k reakční směsí přidána aktivovaná molekulová síta 4A (24 g) a akceptor 11 (8,9 g, 13,0 mmol) (WO 99/25720) v dichlormethanu (45 ml). Po míchání po dobu 30 min při teplotě laboratoře byla směs ochlazena na -20 °C a po kapkách byl přidán roztok trimethylsilyltrifluormethansulfonátu (405 μΙ, 2,1 mmol) io v dichlormethanu (100 ml). Po míchání po dobu 30 min byl přidán hydrogenuhličitan sodný při teplotě -20 °C a reakční směs byla zfiltrována. Filtrát byl vlit do vodného hydrogenuhličitanu sodného a extrahován třikrát dichloromethanem. Spojené organické vrstvy byly promyty dvakrát vodou a zakoncentrovány ve vakuu. Produkt byl čištěn chromatografíí na koloně (1: SiO₂ : 0 až 10% aceton v etheru; 2: SiO₂ toluen/aceton = 85/15 až 80/20, obj./obj.; 3: RP-18:

voda/acetonitril = 2/8 až 0/10, obj./obj.) za získání čisté sloučeniny 12 (8,9 g). TLC: Rf = 0,37, toluen/aceton = 7/3, obj./obj.

Sloučenina 14

Suspenze sloučeniny 12 (8,9 g, 5,1 mmol) a 10% Pd/C (8,9 g) ve 312 ml DMF a 45 ml vody byla míchána v souvislém proudu vodíku. Po 4,5 hod byl katalyzátor Pd/C odstraněn filtrací. Filtrát byl zakoncentrován na objem 400 ml a smísen s 10% Pd/C (1,5 g) v proudu vodíku 5,5 hod. Katalyzátor byl odstraněn filtrací. K filtrátu (900 ml) byl přidán vodný hydroxid sodný (32 ml, 4N). Po míchání po dobu 4 hod při teplotě laboratoře byla směs okyselena na pH 6,6 1N kyselinou chlorovodíkovou a potom zakoncentrována ve vakuu. Surový produkt byl odsolen na koloně Sephadex G-25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a lyofilizovány za získání sloučeniny 14 (4,0 g).

φφφ Φφφ • · φφφ φ « Φ·· · φ φ

14-· ·· · · · · · · ·♦ φφ ·φ φ· ·· φφ ··<*

Sloučenina 15

Pentasacharid 14 (700 mg, 0,61 mmol) byl rozpuštěn ve vodě (13,2 ml) a DMF (3,3 ml) a smísen s N-(benzyloxykarbonyloxy)5 -sukcinimidem (224 mg, 0,90 mmol) a N-ethylmorfolinem (233 μΙ, 1,83 mmol). Po míchání po dobu 15 min byla reakční směs přímo nanesena na kolonu RP-18, která byla eluována směsí voda/acetonitril 10/0 až 7/3. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na malý objem a naneseny na iontoměničovou kolonu Dowex 50 WX4-HF⁺ ve io vodě. Eluát byl zakoncentrován ve vakuu za získání čisté látky 15 (482 mg).

Sloučenina 16

K roztoku sloučeniny 15 (471 mg, 0,37 mmol) v DMF (4,7 ml) byl přidán komplex oxid sírový-pyridin (1,1 g, 6,6 mmol) a směs byla míchána 16 hod při 30 °C. Směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a po kapkách přidána k vychlazenému roztoku 10% hydrogenuhličitanu sodného (16,7 ml, 19,9 mmol) a míchána 1 hod při teplotě laboratoře. Směs byla zakoncentrována na malý objem a nanesena na kolonu

Sephadex G-25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány na malý objem, který byl postupně převeden přes kolonu Dowex Na⁺ HCRW2 s elucí vodou. Eluát byl zakoncentrován a znovu rozpuštěn v 8,3 ml 0,2N kyseliny chlorovodíkové a ponechán stát 16 hod při 4 °C. Reakční směs byla neutralizována 8 ml 0,2N hydroxidu sodného a odsolena na koloně Sephadex G-25, která byla eluována vodou. Příslušné frakce byly spojeny a zakoncentrovány ve vakuu za získání čisté sloučeniny 16 (840 mg).

to· toto • · · ·· ·· *· ·· • · · · · · • 1 ··· · · ··· · · ·

15-· · · · · · · · · · to ·· ·· ·· ·« ·· ····

Sloučenina 17

Suspenze sloučeniny 16 (0,37 mmol) a 10% Pd/C (820 mg) v terc-butanolu (85 ml) a vodě (79 ml) a několik kapek kyseliny octové byly míchány v souvislém proudu vodíku. Po 3 hod byl katalyzátor

Pd/C odstraněn filtrací a filtrát byl zakoncentrován a lyofilizován, za získání čisté sloučeniny 17 (675 mg).

Hydrochlorid benzylesteru kyseliny 4-ff4-ff(1R)-1-fí4-(aminoimino-methyl)fenvnmethvn-2-oxo-2-(1-piperidinyl)ethynamino1-3-[f(4io -methoxv-2,3,6-trimethylfenvl)sulfonvl1amino1-1,4(S)-dioxobutyl)-aminol-butanové (18)

K roztoku hydrochloridu kyseliny 4-[[(1 R)-1-[[4-(aminoimino-methyl)fenyl]methyl]-2-oxo-2-(1-piperidinyl)ethyl]amino]-3-[[(4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl)sulfonyl]amino]-4-oxo-(3S)-butanové (2,38 g, 3,96 mmol) (Tetrahedron 51, 12047 - 12068, 1995) a benzensulfonátu kyseliny benzyl-(4-aminomáselné) (1,52 g, 3,96 mmol) (J. Am. Chem. Soc. 105, 5278 - 5284, 1983) v DMF (40 ml) v atmosféře dusíku byl přidán N,N-díisopropylethylamin (0,689 ml, 3,96 mmol) a tetramethylbenzotriazolyluroniumtetrafluorborát (1,91 g,

2o 5,94 mmol). pH reakční směsi bylo udržována na 6 použitím N,Ndiisopropylethyiaminu. Reakční směs byla míchána 4 dny při teplotě laboratoře, zakoncentrována, rozpuštěna v ethylacetátu, promyta 5% uhličitanem sodným a 0,1N kyselinou chlorovodíkovou, sušena nad síranem horečnatým a zakoncentrována. Zbytek byl rozpuštěn v suchém ethanolu (5ml), vysrážen suchým diisopropyletherem, zfiltrován, za získání 2,47 g v názvu uvedené sloučeniny 18. Rf = 0,8, ethylacetát/pyridin/kyselina octová/voda = 88/31/18/7, obj./obj./obj./obj.; hmotnostní spektroskopie (ESI⁺): ΠΊ,4 [M+H]⁺ • · •· ·· • · • ··· • · · • · · ·· ·· • · • ··· • · « ♦ · • 9 • · ·· ·· • · · • · • · • · ····

Hydrochlorid kyseliny 4-f[4-ff(1R)-1-ff4-(aminoiminomethyl)fenvn-methyl1-2-oxo-2-(1-piperidinvl)ethyl1amino1-3-[f(4-methoxv-2,3,6-trimethylfenvl)sulfonyl]amino1-1,4(S)-dioxobutvnaminoj-butanové (19)

Suspenze sloučeniny 18 (2,42 g, 3,11 mmol) a 10% Pd/C (400 mg) ve směsi methanol/voda (40 ml, 3/1, obj./obj.) byla míchána v souvislém proudu vodíku. Po 8 hod byla reakční směs zfiltrována, filtrát byl zakoncentrován a společně odpařen třikrát se směsí methanol/toluen (1/10, obj./obj.). Zbytek byl rozpuštěn v suchém ethanolu (5ml), vysrážen suchým diethyletherem, zfiltrován a usušen. io Zbytek byl rozpuštěn ve vodě a přímo nanesen na preparativní kolonu HPLC DeltaPak RP-C-is s použitím gradientového elučního systému 20 % A/60 % B/20 % C až 20 % A/14 % B/66 % C v průběhu 60 min při průtoku 40 ml/min (A: 0,5M fosfátový pufr pH 2,1; B: voda; C:

acetonitril/voda = 6/4). Výtěžek 598 mg.

R_t = 26,4 min (3 až 10 min: 20 až 43 % C + 20 % A; 10 až min: 43 až 66 % C + 20 % A), (A: fosfátový pufr pH 2,1; B: voda; C: acetonitril/voda = 6/4, obj./obj.), analytická HPLC na koloně supelcosil LC-18-DB; hmotnostní spektrometrie (ESI⁺): 687,2 [M+H]⁺, (ESI'): 685,2 [M-H]

Sloučenina 21 ze sloučeniny 17 a sloučeniny 19

K roztoku sloučeniny 19 (40 mg, 58,3 pmol) v DMF (800 pl) byl přidán N-hydroxysukcinimid (9,0 mg, 78,1 pmol), DCC (18,5 mg, 89,7 pmol) a 1-hydroxybenzotriazol (8,8 mg, 65,1 pmol). Reakční směs byla míchána 40 hod při teplotě laboratoře. Reakční směs byla zfiltrována přes dicalit a dicalit byl čtyřikrát promyt DMF (284 μΙ). K filtrátu byl přidán pufr 0,1M Na2HPO4 (1936 pl, pH 7,5) a pentasacharid 17 (94,7 mg, 52,6 pmol). Po 30 min míchání byla směs zfiltrována přes dicalit, zakoncentrována a nanesena na kolonu

Sephadex G-50, která byla eluována směsí acetonitril/voda (1/1, obj./obj.). Příslušné frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny

• · dvakrát chromatografii na koloně Sephadex G-50 (voda). Příslušné frakce byly spojeny a lyofilizovány za získání konjugátu 21 jako bílé pevné látky (95,8 mg). Hmotnostní spektrometrie (ESI⁺) = 2469, HPLC: Rt = 8,3 min (20 až 80 % B v 15 min, A = voda/acetonitril 8/2; Β = 2M

NaCI/acetonitril 8/2, obj./obj.), analytická HPLC na koloně MonoQ HR

5.

Sloučenina 22

Roztok (R)-N-Boc(4-kyanofenyl)alaninu (25,0 g, 86,1 mmol), io piperidinu (21,3 ml, 215,3 mmol) a TBTU (41,5 g, 129,2 mmol) v suchém CH2CI2 (500 ml) byl míchán při teplotě laboratoře v proudu dusíku 2 hod. Reakční směs byla postupně promyta 0,2N kyselinou chlorovodíkovou, vodou, vodným hydrogenuhličitanem sodným (nasyceným) a vodou. Organická vrstva byla sušena nad MgSO₄, zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu. Produkt byl rozpuštěn v horkém ethylacetátu (35 ml), vysrážen heptanem (190 ml) a zfiltrován za získání sloučeniny 22 (27,75 g). TLC: Rf= 0,58, heptan/ethylacetát = 3/7, obj./obj.

Sloučenina 23

Roztok sloučeniny 22 (25,6 g, 71,7 mmol), hydroxylaminu.HCI (7,1 g, 101,8 mmol) a triethylaminu (16,8 ml, 120,5 mmol) v absolutním ethanolu (307 ml) byl míchán při 80 °C 4 hod. Po ochlazení směsi na laboratorní teplotu se utvořily krystaly. Krystaly byly odfiltrovány, promyty ethanolem a etherem a usušeny v exikátoru za získání sloučeniny 23 (24,5 g). TLC: Rf = 0,15, heptan/ethylacetát = 3/7, obj./obj.

··· · · · · · » · * · · · · · ···· · · · ·· ·· ·· ·· ·· ····

Sloučenina 24

Roztok sloučeniny 23 (24,5 g, 62,7 mmol) a ethylchloroformátu (7,2 ml, 75,3 mmol) v suchém pyridinu (245 ml) byl míchán při 115 °C 2 hod. Reakční směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a vlita do vody (1250 ml) a extrahována třikrát ethylacetátem (500 ml). Spojené organické extrakty byly sušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a zakoncentrovány ve vakuu za získání sloučeniny 24 (24,3 g). TLC: Rf = 0,42, CH₂CI₂/MeOH 95/5, obj./obj.

io Sloučenina 25

Roztok sloučeniny 24 (24,3 g, 58,4 mmol) v suchém CH₂CI₂(122 ml) a TFA (122 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod a zakoncentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu za získání sloučeniny 25 (37,6 g). TLC: Rf = 0,35, CH₂CI₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 26

Suspenze H-Asp-(OtBu)-OH (39 g, 206,35 mmol), 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylchloridu (62 g, 249,3 mmol) a diisopropylaminu (89 ml, 635 mmol) v DMF (950 ml) a vodě (450 ml) byla míchána při 0 °C 3 hod. Reakční směs byla vlita do směsi led/voda (5 I) a promyta dvakrát diethyletherem, okyselena vodnou kyselinou chlorovodíkovou (4N, 72 ml) a extrahována třikrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy byly sušeny nad MgSO₄, zfiltrovány a zakoncentrovány ve vakuu za získání sloučeniny 26 (97,7 g). TLC: Rf = 0,67, CH₂CI₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 27

Roztok sloučeniny 25 (33,5 g), sloučeniny 26 (24,7 g), TBTU (36,8 g, 114,6 mmol) a diisopropylaminu (27,2 ml, 194,1 mmol) • 9 99 9999 v suchém DMF (670 ml) byl míchán 2 hod a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (750 ml), promyt vodným hydrogenuhličitanem sodným (5%, 1250 ml) a vodnou kyselinou chlorovodíkovou (0,1N, 1250 ml), sušen na MgSO₄, zfiltrován a zakoncentrován ve vakuu za získání sloučeniny 27 (33,8 g). TLC: Rf = 0,88, CH₂CI₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 28

Roztok sloučeniny 27 (33,8 g, 48,3 mmol) v suchém CH₂CI₂w (170 ml) a TFA (170 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod a zakoncentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu, za získání sloučeniny (32,3 g). TLC: Rf = 0,73, CH₂CI₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 29

Roztok sloučeniny 28 (32,3 g), H-GABA-OtBu.HCI (9,5 g,

48,4 mmol), TBTU (29,0 g, 90,5 mmol) a diisopropylaminu (25,2 ml, 179,8 mmol) v suchém DMF (622 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (840 ml), promyt vodným hydrogenuhličitanem sodným (5%, 1400 ml) a vodnou kyselinou chlorovodíkovou (0,1 N, 1400 ml), sušen nad MgSO₄, zfiltrován a zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn v ethanolu (75 ml) a pomalu přidáván k míchanému diisopropyletheru, (2990 ml) za získání sloučeniny 29 jako bělavých krystalů (32,0 g). TLC: Rf = 0,56, CH₂CI₂/MeOH 9/1, obj./obj.

Sloučenina 30

Roztok sloučeniny 29 (3,0 g, 3,82 mmol) v suchém CH₂CI₂(15 ml) a TFA (15 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod a zakoncentrován ve vakuu v přítomnosti toluenu. Zbytek byl čištěn na silikagelu s použitím CH₂CI₂/MeOH (0% až 6% MeOH), za získání čisté sloučeniny 30 (1,98 g). TLC: Rf = 0,56, CH₂CI₂/MeOH 8/2, obj./obj.

Sloučenina 31

Roztok sloučeniny 30 (900 mg, 1,23 mmol), TBTU (396 mg,

1,23 mmol) a diisopropylaminu (215 pl, 1,53 mmol) v DMF (45 ml) byl míchán 2 hod při teplotě laboratoře. Byla přidána sloučenina 17 (2,0 g, 1,11 mmol) a po míchání po dobu 4 hod byla směs zakoncentrována ve vakuu za získání sloučeniny 31 (4,17 g).

Sloučenina 21 ze sloučeniny 31

Suspenze sloučeniny 31 (4,17 g) a 10% Pd/C (2,8 g) v tercbutylalkoholu (28 ml) a vodě (56 ml) byla míchána přes noc v souvislém proudu vodíku. Katalyzátor Pd/C byl odstraněn filtrací a filtrát byl zakoncentrován ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě a čištěn na koloně Q-sepharose. Příslušné frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny chromatografií na koloně Sephadex G-25 (voda). Příslušné frakce byly spojeny a lyofilizovány za získání konjugátu 21 jako bílé pevné látky (1,74 g).

Schéma 1 • · • · ·· • · φ ·

Schéma 2

OMe

Schéma 3

\z~o ♦ ♦ • · · · : :r • · · · · «

)Me

OMe

<E

OMe • ♦ • · · · · « • ·

Schéma 4 • ! * • * 1«

Schéma 5

• * • 0 • ·

RN

NHR' • « • »··

Příklad 2

Biologické aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu se zjišťují následujícími testovacími metodami.

I. Antitrombinový test

Trombin (faktor lla) je faktor v koagulační kaskádě.

Antitrombinová aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu byla zjišťována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2238 prostřednictvím trombinu. Test io antitrombinové aktivity v pufračním systému byl použit pro zjištění hodnoty IC50 testované sloučeniny.

Testovací médium: Pufr tromethamin-NaCI-polyethylenglykol 6000 (TNP)

Referenční sloučenina: 12581 (Kabi)

Vehikulum: Pufr TNP

Rozpuštění může být usnadněno dimethylsulfoxidem, methanolem, ethanolem, acetonitrilem nebo terc-butylalkoholem, které nemají nepříznivé účinky až do koncentrací do 2,5 % v konečné reakční směsi.

Technika

Reakční činidla*

1. Tromethamin-NaCI (TN) pufr; složení pufru: tromethamin 25 (Tris) 6,057 g (50 mmol), NaCl 5,844 g (100 mmol), voda do 1 I. pH roztoku se nastaví na 7,4 při 37 °C pomocí HCI (10 mol.l’¹). 2. Pufr TNP: Polyethylenglykol 6000 se rozpustí v pufru TN za získání koncentrace 3 g.l'¹. 3. Roztok S-2238: jedna ampulka S-2238 (25 mg ·· ·· ·* ♦ · ·* ·· ··· · * 9 9 · · · ί ί ·**· 9 I ί ί**· 9 9 · ♦* • · · 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 ·9 · · »· · ·

Chromogenix; Švédsko) se rozpustí v 20 ml pufru TN za získání koncentrace 1,25 mg.ml'¹ (2 mmol.l'¹). 4. Roztok trombinu: lidský trombin (1000 NIH jednotek/lahvičku, Enzyme Res. Lab. lne., USA) se rozpustí v pufru TNP za získání zásobního roztoku 50 NIH jednotek.ml'¹. Bezprostředně před použitím se tento roztok zředí pufrem TNP za získání koncentrace 30,2 NIH jednotek.ml'¹.

* - Všechny použité složky jsou čistoty pro analýzu

- Pro výrobu vodných roztoků se používá ultračistá voda (kvalita Milli-Q).

Příprava roztoků testovací a referenční sloučeniny

Testovací a referenční sloučeniny se rozpustí ve vodě Milli-Q za poskytnutí koncentrací zásobních roztoků 10'² mol.l'¹. Každá koncentrace se postupně ředí vehikulem za získání koncentrací 10'³, 10'⁴ a 10'⁵ mol.l'¹. Ředění včetně zásobního roztoku se používají v testu (konečné koncentrace v reakční směsi: 3.10'⁴; 10'⁴; 3.10'⁵; 3.10'⁶; 10'⁶; 3.10'⁷ a 10'⁷ mol.l'¹).

Postup

Při teplotě laboratoře se 0,075 ml a 0,025 ml roztoků testované sloučeniny nebo referenční sloučeniny nebo vehikula střídavě pipetuje do jamek mikrotitrační destičky a tato ředění se dále ředí 0,115 ml, popřípadě 0,0165 ml pufru TNP. Do každé jamky se přidá alikvot 0,030 mi roztoku S-2238 a destička se předehřeje a předinkubuje za třepání v inkubátoru Amersham 10 min při 37 °C. Po předinkubaci se zahájí hydrolýza S-2238 přidáním 0,030 ml roztoku trombinu do každé jamky. Destička se inkubuje (za třepání 30 s) při 37 °C. Počínaje 1 min inkubace se měří absorbance každého vzorku při 405 nm každé 2 min • 9 99 ·♦ ♦* 9« 99 po dobu 90 min použitím odečítacího zařízení pro mikrotitrační destičky pro kinetická měření (Twinreader plus, Flow Laboratories).

Všechny údaje se shromažďují v osobním počítači pomocí programu pro zpracování dat (Biolise). Pro každou koncentraci sloučeniny (vyjádřenou v mol.l'¹ reakční směsi) a pro blank se vynese absorbance proti době reakce v minutách.

Vyhodnocení výsledků:

Pro každou finální koncentraci byla z vynesených výsledků testu io vypočtena maximální absorbance. Hodnota IC₅o (finální koncentrace, vyjádřená v μιτιοΙ.Γ¹, která způsobí 50% inhibici maximální absorbance blanku) byla vypočtena pomocí transformační analýzy logit podle

Hafner a další (Arzneim-Forsch./Drug Res. 1977; 27 (II) ; 1871 - 3).

Antitrombinová aktivita sloučeniny z příkladu 1; Hodnota IC50: 17 nM

II, Test aktivity proti faktoru Xa

Aktivovaný faktor X (Xa) je faktor v koagulační kaskádě. Anti-Xa aktivita sloučenin podle předkládaného vynálezu byla zjišťována spektrofotometrickým měřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu s-2222 prostřednictvím faktoru Xa. Tento test na aktivitu proti faktoru Xa v systému pufru byl použit pro zjištění hodnoty IC50 testované sloučeniny.

Referenční sloučenina: pentasacharid Org 31540

Vehikulum: Pufr TNP

Solubilizaci je možno usnadnit dimethylsulfoxidem, methanolern, ethanolem, acetonitrilem nebo terc-butylalkoholem, které nemají

00 • · • » • 0 · • 0 000 • 000 0 · · 0 ♦ · 0 00 00 ·· ·0 · * 000« nepříznivé účinky v koncentracích až do 1 % (pro DMSO) a 2,5 % (Pro ostatní rozpouštědla) v konečné reakční směsi.

Technika

Reakční činidla*

1. Pufr tromethamin-NaCI (TN); složení pufru: tromethamin (Tris) 6,11 g (50,4 mmol), NaCI 10,17 g (174 mmol), polyethylenglykol 6000 3 g.l·¹, voda do 1 I. pH roztoku se nastaví na 7,4 při 37 °C pomocí HCI (10 mmol.l'¹). 3. Roztok S-2222: jedna lahvička S-2222 (25 mg; io Chromogenix, Švédsko) se rozpustí ve vodě za poskytnutí koncentrace 0,375 mg.ml'¹ (0,5 mmol.l'¹). 4. Roztok Xa: bovinní Factor Xa Human (71 nKat.lahvička'¹; Chromogenix) se rozpustí v 10 ml pufru TNP a potom dále zředí pufrem TNP za získání koncentrace 0,75 nKat.(1,5 U).ml'¹. Ředění se musí připravovat čerstvá. 5. Roztok ATIII: Lidský

ATIII (Chromogenix) se rozpustí ve vodě za získání koncentrace 1 U.mol'¹, a potom se roztok dále zředí třemi objemy pufru TNP na koncentraci 0,25 U.mol'¹. 6. Standardní roztok: zásobní roztok 5,7 anti-Xa U.ml'¹ Org 31540 byl zředěn v pufru TNP na 0,05 U.ml'¹. 6 Testované vzorky: každý preparát se rozpustí ve vodě a zředí pufrem

2o TNP na koncentraci 0,05 nmol.ml'¹. Z každého preparátu byla připravena řada devíti ředění (ředicí faktor 1,5).

Zjištění aktivity Xa

Každý testovaný vzorek (0,05 ml) se napipetuje do jamky mikrotitrační destičky při teplotě laboratoře. Do každého vzorku se přidá roztok AT-III (0,05 ml) a destička se třepá na třepačce Varishaker. Do každé jamky se pipetuje alikvot roztoku X_a (0,05 ml) 10 min po přidání roztoku AT-III a destička se znovu protřepe. Přesně 2 min po přidání roztoku X_a se do každé jamky napipetuje 0,1 ml roztoku S30 2222 a destička se znovu protřepe. Pro všechna přidávání se používá • · ·· 99 99 99 99

9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 999 · 9 9 dvanáctikanálové pipety. Zbylé množství X_a katalyzuje hydrolýzu S2222, jejíž rychlost se měří fotometricky po inkubačních dobách 2 a 22 min při teplotě laboratoře. Absorbance každého vzorku se měří při 405 nm použitím přístroje Reader Microelisa, model 310C (Organon

Teknika, Oss, Nizozemí) a vypočte se zvýšení absorbance (áOD). Každý testovaný vzorek se stanovuje dvakrát. S každými deseti vzorky se zařadí blank (0,05 ml pufru TNP).

Kalibrační křivka io Z alikvotu standardního ředění kalibračního vzorku se připraví řada ředění (faktor ředění 1,4 pro vzorky Org 31540). Získané standardní vzorky (přibližně 12 vzorků) by měly obsahovat mezi 0,01 až 0,05 anti-Xg U/ml. Při každé sérii měření se testuje každý standardní vzorek alespoň třikrát podle popisu v části „Stanovení aktivity X_a“. Kalibrační křivka se získá proložením přímky do hodnot U/ml log střední ΔΟΡ (blank) - střední ΔΟΡ (standard, vzorek) proti log anti-Xa střední AOD (standard, vzorek) metodou nejmenších čtverců.

Vyhodnocení odpovědí:

Pro každý vzorek se použitím kalibrační křivky vypočte střední hodnota anti-X_a aktivity v jednotkách U/ml.

Aktivita proti faktoru X_a sloučeniny z příkladu 1: 1012 U/pmol.

Zastupuje:

Claims

Sloučenina vzorce (I) kde R je nezávisle SO₃' nebo CH₃;

15 mezerníková skupina je flexibilní mezerníková skupina o délce

13 až 25 atomů;

náboj pentasacharidového zbytku je kompenzován kladně nabitými protiionty;

a celkový počet sulfátových skupin v pentasacharidovém 20 zbytku je 4, 5 nebo 6;

nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, prekurzor nebo solvát.
2. Sloučenina podle nároku 1, kde pentasacharidový zbytek má strukturu
3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, kde mezemíková skupina má délku 16 až 22 atomů.

io 4. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 3, kde mezemíková skupina má délku 19 atomů.

5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde mezemíková skupina je *-(CH₂CH₂0)₃-(CH₂)₂-NH-C(0)-(CH₂)₃-NH-C(0)15 -CH₂-, přičemž konec označený * je navázán na pentasacharidový zbytek.

• 9 4 4 44 ♦ · • 44«
4·

7. Způsob výroby sloučeniny vzorce I, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, při kterém benzamidinová část je ve formě prekurzorů, kterým je skupina 1,2,4-oxadiazolin-5-on.
5 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 6 a farmaceuticky vhodné pomocné látky.
9. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 6 pro použití v lékařství.
10. Použití sloučeniny podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo prevenci trombózy nebo jiných onemocnění souvisejících s trombinem.