CZ303099B6 - Trinácticlenný azalid, farmaceutická kompozice obsahující tento azalid a použití tohoto azalidu pri výrobe léciva - Google Patents

Abstract

Trinácticlenný azalid obecného vzorce 3, 4 a 14, ve kterých jsou obecné symboly definované v popisné cásti. Farmaceutická kompozice obsahující terapeutické množství uvedených azalidu a použití uvedených azalidu pri výrobe léciva urceného pro lécení bakteriální infekce nebo protozoální infekce savcu, ryb nebo ptáku.

Description

CZ 303099 B6 Třináctičlenný azalid, farmaceutická kompozice obsahující tento azalid a použití tohoto azaiidu při výrobě léčiva

Oblast techniky

Vynález se týká třináctičlenného azaiidu, farmaceutické kompozice, která tento třináctičlenný azalid obsahuje v terapeuticky účinném množství, a použití tohoto třináctičlenného azaiidu při výrobě léčiva pro léčení bakteriální infekce nebo protozoální infekce savce, ryby nebo ptáka.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že makrolidová antibiotika jsou prostředky vhodné k léčbě infekcí zahrnujících široké spektrum bakteriálních a protozoálních infekcí savců, ryb a ptáků. Tato antibiotika zahrnují různé deriváty erythromycinu A, jako je například aztithromycin. Azithromycin je obchodně dostupný a je popsán v patentech US 4 474 768 a US 4 517 359, jejichž obsahy jsou zde zahrnuty formou odkazů. Další makrolidy jsou popsané v četných patentových přihláškách.

Vzdor takto popsaným makrolidům v daném oboru stále přetrvává poptávka po snadno dostupných třináctičlenných azalidových antibiotikách účinných proti Širokému spektru bakterií a prvo-ku. Tento vynález představuje reakci na uvedenou poptávku.

Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je třináctičlenný azalid ze souboru sestávajícího ze sloučenin obecného vzorce 3 ve kterém R1 znamená

ÓH R6 znamená vodík - I - CZ 303099 B6 nebo R1 znamená acetylovou skupinu a R6 znamená vodík nebo R1 znamená 3-N,N-dimethylamino-2-propenoylovou skupinu a R6 znamená vodík nebo R1 znamená 3-pyrazoiylovou skupinu a R6 znamená vodík nebo R1 znamená acetylovou skupinu a Rb znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená 3—N,N-dimethylamino-2-propenoylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená 3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R! znamená 1—N-methyl-3-pyrazolylovou skupinu a RĎ znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená l-N-benzyl-3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená 1—N-(3-hydroxybenzyl)-3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená 2-{4-fluorfenyl)-3-pyrimidinylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená (2~fenylamino)-3-pyrimidinylovou skupinu a Rb znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená 1—N-methyl—5-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu, ze sloučenin obecného vzorce 4 CZ 303099 B6

(4), ve kterém X znamená skupinu -C(0>- nebo skupinu -CH(OH)-, a ze sloučenin obecného vzorce 14 N(CH3)2

ve kterém R1 znamená skupinu

io nebo skupinu

Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom. že obsahuje terapeuticky účinné množství uvedeného třináctičlenného azalidu a farmaceuticky přijatelný nosič. -3- CZ 303099 B6 Předmětem vynálezu je rovněž použití uvedeného třináctiělenného azalidu při výrobě léčiva pro léčení bakteriální infekce nebo protozoální infekce savce, ryby nebo ptáka.

Sloučeniny podle vynálezu, které jsou přirozeně kyselé, mohou tvořit bazické sole obsahující 5 různé farmakologicky přijatelné kationy. Příklady těchto solí zahrnují soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin a zejména zahrnují sole sloučenin podle vynálezu s vápníkem, hořčíkem, sodíkem a draslíkem.

Určité sloučeniny podle vynálezu obsahují asymetrická centra a mohou proto existovat v různých io enantiomemích a diastereomemích formách. Vynález se vztahuje na použití všech optických isomerů a stereoisomerů podle vynálezu a jejich směsí, a všechny popsané farmaceutické kompozice je mohou obsahovat a stejně tak je lze používat ve způsobech léčby podle vynálezu.

Vynález rovněž zahrnuje sloučeniny podle vynálezu, ve kterých jeden nebo více atomů vodíku, 15 uhlíku nebo jiných atomů je nahrazeno jejich isotopy. Tyto sloučeniny mohou být vhodné jako prostředky pro výzkum a diagnostiku ve farmakokinetických studiích matebolismu a ve studiích vazby. K lepšímu pochopení vynálezu slouží následující podrobný popis vynálezu a příklady, které však 2o mají pouze vynález dále znázornit formou příkladů provedení, aniž by však vynález nějak omezovaly. Výrazy „bakteriální infekce** a „protozoální infekce'* použité v tomto textu zahrnují, pokud není uvedeno jinak, bakteriální a protozoální infekce objevující se u savců, tyb a ptáků rovněž jako 25 choroby související s bakteriálními a protozoálními infekcemi, které lze léčit nebo preventivně léčit podáváním antibiotik, jako jsou sloučeniny podle vynálezu. Uvedené bakteriální infekce a protozoální infekce a choroby související s těmito infekcemi zahrnují následující: pneumonii, otitis media, sinusitidu, bronchitidu, tonsilitidu a mastoiditidu související s infekcemi Strepto-coccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus nebo .io druhy Peptostreptococcus; faryngitidu, revmatickou horečku a glomerulonefritidu spojenou s infekcí Streptococcus pyogenes, streptokoky skupin C a G, Clostridium diphteriae nebo Acti-nobacillus haemolyticum; infekce respiračního traktu spojené s infekcí Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae nebo Chlamydia pneumoniae; nekomplikované kožní infekce a infekce měkkých tkání, abscesy a osteomyelitidy, 35 a puerperální sepse vyvolané infekcí Staphylococcus aureus, stafylokoky pozitivními na koagulá-zu (tj. S. epidermis, S. haemolyticus atd.), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptokokové skupiny C-F (streptokoky tvořící drobné kolonie), streptokoky viridans, Coryne-bacterium minutissimum, druhy Clostridium, nebo Bartonella henselae; nekomplikované akutní infekce močových cest vyvolané Staphylococcus saprophyticus nebo druhy Enterococcus; uretri-m tidu a cervicitidu; a sexuálně přenosné choroby spojené s infekcí Chlamydia trachomatis, Haemo-philus ducreyi, Treponemu pallidum, Ureoplasma urealyticum, nebo Neisseria gonorrhoeae; choroby vyvolané toxiny související s infekcí S. aureus (otrava potravinami a syndrom toxického šoku), nebo streptokoky skupin A, B a C; vředy spojené s infekcí Helicobacter pylori; systémové febrilní syndromy související s infekcí Borrelia recurrentis; Lymskou chorobu spojenou s infekcí 45 Borrelia burgdorferi; konjunktivitidu, keratitidu, a dakryocystitidu spojené s infekcí Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae nebo druhy Listeria; diseminovanou chorobu komplexem Mycobacterium avium (MAC) způsobenou infekcí Mycobacterium avium nebo Mycobacterium intracelluiare; gastroenteritidu spojenou s infekcí Campylobacter jejuni; protozoální intestináiní onemocnění související s infekcemi 50 druhy Cryptosporidium; odontogenní infekce vyvolané streptokoky viridans; Černý kašel vyvolaný infekcí Bordetella pertussis; plynatou sněť související s infekcí Clostridium perfringens nebo druhy Bacteroides; a aterosklerózu související s infekcí Helicobacter pylori nebo Chlamydia pneumoniae. Bakteriální infekce a protozoální infekce a choroby spojené s uvedenými infekcemi, které je možné léčit nebo preventivně léčit u savců zahrnují: bovinní respirační chorobou spoje-55 nou s infekcí P. haem., P. multocida, Mycoplasma bovis nebo druhy Bordetella; střevní onemoc- -4- CZ 303099 B6 není hovězího dobytka spojené s infekcí E. coli nebo protozoálního původu (tj. kokcidiálního, krypiosporidíáiního původu atu,); mastitiuu krav spojenou s infekci Staph. aureus, Střep, ubens. Střep, agalactiae, Střep, dysgalactiae, druhy Klebsiella, Corynebacterium nebo druhy Entero-coccus; respirační chorobu prasat způsobenou infekcí A. pleuro, P. multocida nebo druhy Myco-5 plasma; střevní chorobu prasat způsobenou infekcí E. coli, Lawsonia intracellularis, Salmonella nebo Serpulina hyodyisinteriae; onemocnění kopyt kulhavkou u hovězího dobytka vyvolané infekcemi druhy Fusobacterium; metritidu krav vyvolanou infekcí E. coli; onemocnění vlasovými bradavicemi hovězího dobytka vyvolané infekcí Fusobacterium necrophorum nebo Bacte-roides nodosus; zánět spojivek hovězího dobytka vyvolaný infekcí Moraxella bovis; zmetání krav io vyvolané protozoální infekcí (tj. neosporium); onemocnění urinámího traktu psů a koček vyvolané infekcí E. coli; onemocnění kůže a měkkých tkání psů a koček vyvolané infekcí Staph. epider-midis, Staph. intermedius, druhy Staph. negativními na koagulázu nebo P. multocida; a dentální onemocnění nebo onemocnění úst psů a koček spojené s infekcemi druhy Alcaligenes, Bacte-roides, Clostridium, Enterobacter, Eubacterium. Peptostreptococcus, Porphyromonas nebo 15 Prevotella. Další bakteriální a protozoální infekce a choroby s nimi spojené, které je možné léčit způsobem podle vynálezu jsou uvedené v práci autorů J.P. Sanford a sp., „The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy“, 26. vydání (Antimicrobial Therapy, lne., 1996).

Sloučeniny podle vynálezu lze připravit způsoby podle schémat I a 2 uvedených níže a podle 20 popisu k těmto schématům. V následujících schématech, pokud není uvedeno jinak, substituenty R\ R\ R:\ R4, R5, R6. R7, R8, R9, R10, R11, R12, R'\ Rh a R15 mají výše uvedený význam.

Schéma 1 N(CH3)2

NHjOH-HjO NajCO,. MeOhf

-5- CZ 303099 B6

Schéma 1 (pokračováni) N(CH3)2

(5), kde R9 = kladinosyl (8)

Schéma 2 (5), kde R9 - kladinosyl

TFAA Swem ox. (-6«) -6- CZ 303099 B6

Cbz N(CH3)2

trimethylsulfonium bromid KOtBu Ch^Cl/THF (10)

PďC MTBE

HN(Ri3)(Ru) (5), kde R9 - 4*-{(R13)(R14)NCH2)( kladinosyl -7- (12) CZ 303099 B6 Příprava sloučenin podle vynálezu je snadná. Podle schématu 1 se jako výchozí sloučeniny použijí sloučeniny obecného vzorce 6, které jsou snadno dostupné buď obchodně neboje možné je připravit obvyklými způsoby syntézy. Výhodnou sloučeninou obecného vzorce 6 je erythromycin A (R10 = ethyl; Rn =-OH). Sloučeniny obecného vzorce 6 se převedou na sloučeniny obecného 5 vzorce 5 ve kterých R9 - kladinosyl způsoby v oboru známými, jako způsoby popsanými v US patentech 4 474 768 a 4 517 350. Obecně se sloučeniny obecného vzorce 6 zpracují s hydroxyl-aminem v přítomnosti báze, výhodně anorganické báze jako je hydrogenuhličitan nebo uhličitan alkalického kovu, nebo uhličitan kovu alkalické zeminy, v přítomnosti vody a organického rozpouštědla mísitelného s vodou, za výtěžku oximových sloučenin obecného vzorce 7. Výhodná io sloučenina vzorce 7 je sloučenina ve které R = ethyl aRM=~OH. Jako anorganická báze se výhodně použije uhličitan sodný a jako organické rozpouštědlo mísitelné s vodou methylalkohol. Sloučeniny obecného vzorce 7 se pak zpracují svodnou bází a s činidlem pomocí kterého se hydroxylová skupina oximu sloučeniny 7 převede na odštěpitelnou skupinu, a nakonec se tak získají iminoetherové sloučeniny obecného vzorce 8. Reakční činidla vhodná pro výše uvedený 15 účel zahrnují, ale bez omezení jen na ně, p-toluensulfonyl-halogenidy nebo anhydridy, methan-sulťonyl-halogenidy nebo anhydridy, trifluormethansulfonyl-halogenidy nebo anhydridy, p-brombenzensulfonyl-halogenidy nebo anhydridy a podobně. Výhodně se jako reakční činidlo použije p-toluensulfonyl-chlorid. Výhodné sloučeniny obecného vzorce 8 jsou sloučeniny ve kterých Rl0 = ethyl, a Rn --OH. Sloučeniny vzorce 8 se pak redukují obvyklým hydridovým 20 redukčním prostředkem, výhodně tetrahydroboritanem sodným na sloučeniny obecného vzorce 5, ve kterých R9 znamená kladinosylovou skupinu. Ve výhodném provedení sloučenin vzorce 5 je desmethylazithromycin.

Sloučeniny obecného vzorce 5 se převedou na sloučeniny obecného vzorce 1 způsoby popsanými 25 v tomto popisu. Pracovníkům v oboru bude zřejmé, že sloučeniny vzorce 5 se převedou na sloučeniny vzorce 1, ve kterých R1 je v poloze trans vůči methylové skupině v poloze 11 sloučeniny vzorce 1 a znamená skupinu vzorce

CH, OH

OH 30 R2 = methyl; R6, R7 a R8 = vodík; a R9 = kladinosyl. Uvedené sloučeniny obecného vzorce 1 ve

CH, OH kterých R1 = 0H ; R2 = methyl; R6, R7 a R8 = vodík; a R9 = kladinosyl, lze převést na další sloučeniny obecného vzorce 1 a na sloučeniny obecného vzorce 2 obvyklými způsoby organické syntézy a způsoby popsanými v tomto popisu.

Sloučeniny obecného vzorce 5 se převedou na sloučeniny obecného vzorce 15 způsoby popsanými v tomto popisu. Pracovníkům v oboru bude zřejmé, že sloučeniny vzorce 5 se převedeou na sloučeniny vzorce 15, ve kterých R1 je v poloze trans vůči methylové skupině v poloze 11 sloučeniny vzorce 15 a znamená skupinu vzorce CH3 R11

R1V

40 OH R2 = methyl; R6, R7 a R8 = vodík; a R9 = kladinosyl. Uvedené sloučeniny obecného vzorce 15, ve kterých -8- CZ 303099 B6 ch3_ r« kletých Rl 0H ; R2 = methyl; R6, R7 a R8 = vodík; a R9 = kladinosyl, lze převést na další sloučeniny obecného vzorce 2 obvyklými způsoby organické syntézy a způsoby popsanými v této přihlášce. s Pracovníkům v oboru bude zřejmé, že kromě sloučenin obecného vzorce 6, lze na prekurzory I3členných azalidů podle vynálezu převést další Mčlenné makrolidy podléhající expanzi kruhu Beckmanova typu jako je například erythromycin B, erythromycin C a klarithromycín.

Je-li žádoucí připravit sloučeniny obecného vzorce 1, ve kterých R9 = 4“-(R13)(R14)NCH2)-i o kladinosyl, je možné použít způsoby shrnuté ve schématu 2.

Například je možné nejprve zavést na 2’-hydroxylovou skupinu desosaminylové skupiny sloučenin obecného vzorce 5 vhodnou chránící skupinu, výhodné benzyloxykarbonylovou (,,Cbz“) skupinu s použitím Cbz-Cl a připravit tak sloučeninu obecného vzorce 9. Uvedenou reakci je možné 15 při teplotě od asi -78 °C do asi teploty místnosti, výhodně při asi 0 °C. Výhodná sloučenina obecného vzorce 9 je sloučenina, ve které Rl0 = ethyl, a R11 =-OH. 4“-hydroxylovou skupinu kladinosylové skupiny sloučenin vzorce 9 je pak možné oxidovat standardními způsoby oxidace a získat tak sloučeniny obecného vzorce 10, obsahující 4“-oxokladinosylovou skupinu. Výhodná sloučenina obecného vzorce 10 je sloučenina ve které R10 = ethyl, a R11 = ^OH. Vhodné podmínko ky oxidace je možné zjistit například v Journal of Antibiotics, 1988, str. 1029-1047. Obvyklé reakční podmínky zahrnují: a) oxidaci podle Moffatta ve které se použije N-ethyl-N’-(N,N-dimethylaminopropyl)-karbodiimid a DMSO v přítomnosti pyridinium-trifluoracetátu; nebo bjoxidaci podle Swema, kde po zpracování s oxalylchloridem a DMSO v CHiCl· následuje přídavek triethylaminu nebo alternativně po zpracování sanhydridem kyseliny trifluoroctové 25 a DMSO v CH2CI2 následuje přídavek triethylaminu. Výhodně se použije Swemova oxidace, která se provede v přítomnosti anhydridu kyseliny trifluoroctové při teplotě od asi -78 °C do asi 0 °C. Ještě výhodněji se Swemova oxidace provede při asi -60 °C.

Karbonylová skupina 4“—oxokladinosylové skupiny sloučenin vzorce 10 se pak převede na epo-30 xid a získají se tak sloučeniny obecného vzorce 11. Výhodné sloučeniny obecného vzorce 11 jsou sloučeniny, ve kterých R10 = ethyl, a Rn =-OH. Sloučeniny obecného vzorce 10 je pak možné převést na sloučeniny obecného vzorce 11 nejméně dvěma způsoby. Podle jednoho způsobu (způsob A) se sloučenina vzorce 10 zpracuje s (CH03S(O)X2, kde X3 znamená halogen, - BF4 nebo -PFs, výhodně jod, v přítomnosti báze jako je kalium-terc-butoxid, natřium-terc-butoxid, 35 natrium-ethoxid, hydrid sodný, 1,1,3,3-tetramethylguanidin, l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7- en, l,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-en, kalium-ethoxid nebo natrium-methoxid. výhodně báze obsahující sodík jako je hydrid sodný, v rozpouštědle jako je THF, etherové rozpouštědlo, dimethylformamid (DMF) nebo dimethylsulfoxid (DMSO), nebo směs dvou nebo více předcházejících rozpouštědel, při teplotě v rozmezí od asi 0 °C do asi 60 °C; alternativně s použitím tri-40 methylsulfonium-bromidu a silné báze jako je natřium-terc-butoxid, v přítomnosti CH2CI2/THF.

Podle druhého způsobu (způsob B), se sloučeniny obecného vzorce 10 zpracují s (CH^SÍOjX2, kde X2 znamená halogen, -BF4 nebo -PF6, výhodně BF4, v přítomnosti báze jako je kalium-terc-butoxid, natrium-ethoxid, natřium-terc-butoxid, hydrid sodný, 1,1,3,3-tetramethylguanidin, 45 I,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, kalium-ethoxid, natrium-hexamethyldisilazid (KHMDS) nebo natrium-methoxid, výhodně KHMDS, v rozpouštědle jako je THF, etherové rozpouštědlo, DMF nebo DMSO, nebo směs dvou nebo více výše uvedených rozpouštědel, při teplotě v rozmezí od asi -78 °C do asi 60 °C. 50 Výhodně se použije způsob B s použitím trimethylsulfonium-bromidu a kalium-terc-butoxidu. -9- CZ 303099 B6

Chránící skupina desosaminylové skupiny sloučenin vzorce 11 se pak podrobí hydrogenolýze v přítomnosti H2, Pd/C a každého vhodného organického rozpouštědla, výhodně methyl-terc-butyletheru („MTBE“) a získají se tak sloučeniny vzorce 12. Výhodná sloučenina obecného vzorce 12 je sloučenina, ve které R10 = ethyl a R11 = -OH. Nakonec se kruh epoxidové skupiny 5 v poloze 4‘-kladinosové cukerné skupiny sloučenin vzorce 12 otevře s použitím HN(R,3)(R14) v přítomnosti jodidu draselného a získají se tak sloučeniny obecného vzorce 5, kde R9 = ^'-((R1 ’)(Rl4)(NCH2)kladinosyl. Sloučeniny obecného vzorce HN(RI3)(R14) zahrnují primární a sekundární alkyl- alkenyl- a alkylaminy, a pracovníkům v oboru budou snadno dostupné. Uvedená reakce výhodně probíhá při teplotě od asi teploty místnosti do asi 80 °C, výhodně pro-lo bíhá při asi 30 °C až asi 60 °C. Sloučeniny obecného vzorce 5, ve kterých R9 = 4^-((^)-(Rl4(NCH2)kladinosyl je možné převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15 způsoby uvedenými v tomto popisu.

Je také potřebné uvést, že konverzi sloučenin obecného vzorce 11 na sloučeniny obecného 15 vzorce 5 ve kterých R9 - 4“-((R,3)(Rl4(NCH2)kladinosyl, lze provést v jednom stupni zpracováním sloučenin obecného vzorce 10 s HN(RI3)(R14) v přítomnosti methanolu, kde se odstraní chránící skupina z desosaminylové skupiny sloučenin obecného vzorce 10. Výhodně se uvedená reakce provede v přítomnosti jodidu draselného. 20 Při přípravě sloučenin obecného vzorce 5 ve kterých R9 = 4“-oxokladinosa, se chránící skupina na 2’-hydroxylové skupině desosaminylové skupiny sloučenin obecného vzorce 10, výhodně Cbz, odstraní. Způsoby sejmutí takovýchto chránících skupin lze nalézt například v práci Greene a p., citované výše. 25 Překvapivě a neočekávaně autoři vynálezu zjistili, že sloučeniny obecného vzorce 5, které jsou 15člennými azalidy, jsou konvertibilní na sloučeniny vzorců 1 a 15, které jsou 13člennými azali- dy-

Autoři vynálezu zjistili, že konverzi sloučenin obecného vzorce 5 na sloučeniny obecných vzorců 30 1 a 15, výhodně na sloučeniny vzorců 1 a 15, kde R6, R7 a R8 znamenají vodík a výhodně na sloučeniny ve kterých skupina Rl je vůči methylové skupině v poloze 11 sloučenin 1 a 15, lze provést uvedením sloučeniny vzorce 5 do styku s kyselinou nebo s bází.

Kyseliny vhodné pro výše uvedený účel zahrnují, ale bez omezení jen na ně, anorganické kyseli-3? ny jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, fluorovodíková, sírová a dusičná; a organické kyseliny jako je kyselina mravenčí, octová, trifluoroctová, methansuifonová, trifluormethansulfonová, benzensulfonová a p-toluensulfonová. Anorganické kyseliny se výhodně použijí ve formě svých vodných roztoků; ještě výhodněji se anorganické kyseliny použijí ve formě svých zředěných, např. < 2 mol/1 vodných roztoků. Organické kyseliny je možné použít ve 40 formě zředěných vodných roztoků nebo roztoků v organických rozpouštědlech, kde uvedené organické roztoky obsahují rozpouštědlo dostatečně rozpouštějící jak organickou kyselinu tak sloučeninu obecného vzorce 5. Báze vhodné pro výše uvedený účel zahrnují anorganické báze jako je hydroxid sodný, lithný, 45 draselný, hořečnatý nebo vápenatý; uhličitany a hydrogenuhličitany sodíku, lithia nebo draslíku; uhličitan hořečnatý nebo hydrogenuhličitan vápenatý nebo uhličitan vápenatý. Vhodné jsou rovněž organické báze jako je triethylamin, ethyldiisopropylamin, pyridin, 4-dimethylaminopyridin, kolidin, lutidin, a jejich směsi. Výhodně se anorganická báze použijí ve formě zředěných vodných roztoku. Organické báze se výhodně použijí ve formě zředěných organických roztoků. 50 Anorganické nebo organické báze jsou výhodnější než anorganické nebo organické kyseliny.

Sloučeniny obecného vzorce 5 je možné přidat ke kyselině nebo k bázi nebo naopak. Reakce sloučenin vzorce 5 s kyselinou nebo s bází se v každém případě urychluje zahříváním směsi sloučeniny obecného vzorce 5 a kyseliny nebo báze při teplotě od asi teploty místnosti do asi 100 °C, 55 výhodně při teplotě rozmezí od asi teploty místnosti do asi 60 °C, a ještě výhodněji při teplotě od - 10- CZ 303099 Β6 asi 30 °C do asi 40 °C. Uvedené zahřívání může probíhat po dobu asi 20 minut až asi 48 hodin, výhodně po asi 1 hodinu až asi 36 hodin.

Vynález se dále vztahuje na způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce 1 a sloučeniny obecného vzorce 15, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí, který zahrnuje stupeň, ve kterém se sloučenina obecného vzorce 5 zahřívá v přítomnosti rozpouštědla. Zahřívání lze provést při teplotě od asi teploty místnosti do asi 100 °C, výhodně při teplotě rozmezí od asi teploty místnosti do asi 60 °C, a ještě výhodněji při teplotě od asi 30 °C do asi 40 °C. Uvedené zahřívání může probíhat po dobu asi 20 minut až asi 48 hodin, výhodně po asi 1 hodinu až asi 36 hodin.

Rozpouštědla vhodná pro výše uvedený účel jsou rozpouštědla, která dostatečně rozpouštějí sloučeniny vzorce 5 a zahrnují, ale bez omezení jen na ně, nižší alkanoly, diethylether, aceton, aceto-nitril, tetrahydrofuran, ethylacetát, benzen, toluen, chloroform, dichlormethan, dimethylformám id, dimethylsulfoxid, N-methylpyrrolidinon a podobně a jejich směsi.

Nicméně autoři vynálezu s překvapením a neočekávaně zjistili, že konverze sloučenin vzorce 5 na sloučeniny vzorce 1 a 15 probíhá nejrychleji v soustavě rozpouštědel, která obsahuje protické rozpouštědlo. Vhodná protická rozpouštědla zahrnují, ale nejsou omezená jen na ně, nižší alkanoly jako je methanol, ethanol, propanol, iso-propanol, butanol, iso-butanol, a sek-butanol; fenolové sloučeniny jako je fenol, halogenfenoly, naftoly a podobně; voda; a jejich směsi. Je však potřebné upozornit, že protickým rozpouštědlem není karboxylová kyselina.

Pokud sestava rozpouštědel obsahuje protické rozpouštědlo, tak protické rozpouštědlo je obsažené v množství asi 10 % až asi 75 % obj., výhodně v množství asi 25 % až asi 60 % obj.

Pracovníkům v oboru bude zřejmé, že se použijí protická rozpouštědla mísitelná s rozpouštědlem při teplotě ohřevu, ve kterém se provádí ohřívání sloučeniny vzorce 5. Výhodně uvedená soustava rozpouštědel obsahuje acetonitril. Ještě výhodněji dále obsahuje uvedená soustava rozpouštědel nižší alkanol nebo vodu. Jestliže soustava rozpouštědel obsahuje nižší alkanol, uvedený nižší alkanol je výhodně methanol.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15 je možné izolovat nebo přečišťovat standardními způsoby jako je například rekrystalizace; chromatografie na sloupci, preparativní chromatografie na tenké vrstvě nebo na zařízení Chromatotron®; nebo dalšími způsoby známými v oboru. Pokud se k izolaci nebo přečištění sloučenin obecných vzorců 1 a 15 použije chromatografie, autoři vynálezu zjistili, že zvýšenou separační schopnost vzhledem kjiným systémům má eluční systém obsahující uhlovodíkové rozpouštědlo a organický amin. Uhlovodíková rozpouštědla vhodná pro výše uvedený účel zahrnují, ale bez omezení jen na ně, pentan, hexan nebo hexany, heptan, pet-rolether, benzen, toluen, xyleny a podobně. Výhodně je uhlovodíkovým rozpouštědlem hexan nebo hexany. Vhodné organické aminy zahrnují, ale nejsou omezené jen na ně, diethylamin, tri-ethylamin, ethyldiisopropylamin, pyridin, 4—dimethylaminopyridin, kolidin, lutidin a jejich směsi. Výhodně je organický amin diethylamin. Výhodně eluční systém obsahující uhlovodíkové rozpouštědlo a organický amin dále obsahuje polární organické rozpouštědlo. Autoři vynálezu zjistili, že přídavek polárního organického rozpouštědla k elučnímu systému poskytuje lepší separaci sloučenin obecných vzorců 1 a 15 od ostatních sloučenin vzhledem k elučnímu systému, který polární organické rozpouštědlo neobsahuje. Vhodná polární organická rozpouštědla zahrnují, ale nejsou omezená jen na ně, nižší alkanoly, acetonitril, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, N-methylpyrrolidinon, 1,4-dioxan, tetrahydrofuran, diethylether, ethylacetát a podobně. Výhodně organické rozpouštědlo je acetonitril. Ještě výhodněji eluční systém obsahuje hexany, diethylamin a acetonitril.

Poměry organického rozpouštědla, organického aminu a případně polárního organického rozpouštědla mohou kolísat, ale obecně je poměr uhlovodíkového rozpouštědla k organickému CZ 303099 B6 aminu v rozmezí od asi 10 : 1, výhodně asi 7 : 1 až asi 2 : 1. Pokud eluční systém dále obsahuje polární organické rozpouštědlo, obsah polárního organického rozpouštědla v elučním systému je mezi asi 1 % až asi 15 % (obj.), výhodně mezi asi 1,5 % až 10 % (obj.).

Další výhodné provedení vynálezu zahrnuje sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 znamená acetylovou skupinu. Zvláště výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce 1, ve kterých Rl znamená acetyl, R6, R7 a R8 znamenají vodík, a R9 = kladinosyl („sloučenina 1B“, tabulka 1); a sloučeniny kde R1 znamená acetyl, R6 = methyl, R7 a R8 znamenají vodík, a R9 = kladinosyl („sloučenina 1 E“, tabulka 1).

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 znamená acetylovou skupinu jsou kromě svého použití jako antibakteriální a antiprotozoální prostředky vhodné jako meziprodukty pro přípravu dalších sloučenin obecných vzorců 1 a 15 popsaných níže.

Obecně se sloučeniny obecných vzorců l a 15, ve kterých Rl znamená acetylovou skupinu připraví oxidací sloučenin obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 =

CH3v OH CH3^ y ^

OH které lze připravit způsoby popsanými v tomto popisu. Oxidační reakce probíhá v přítomnosti plumbium-tetraacetátu, jodistanu sodného nebo dalšího oxidačního prostředku, který převádí 1 -methyl-l,2-dioly na methylketony. Reakční podmínky vhodné pro oxidaci l-methyl-1,2-diolů na methyl keton jsou pracovníkům v oboru známé. Výhodně reakce probíhá v přítomnosti asi 1,0 až asi 1,5 ekvivalentů plumbium-tetraacetátu na ekvivalent sloučeniny vzorce 1 a 15 a při teplotě asi -78 °C až teploty místnosti, výhodně při asi -10 °C až asi 10°C s dobou průběhu reakce asi 10 minut až asi 6 hodin.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = acetyl, je možné převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl. Tato reakce výhodně probíhá v přítomnosti dimethylformamid-dimethylacetátu. Výhodně se reakce provede bez přítomnosti dalšího rozpouštědla.

Sloučeniny obecných vzorců I a 15, ve kterých Rl = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl, lze převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých Rl = l-N-substituovaný-3-pyrazolyl zpracováním sloučenin obecného vzorce 1, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl s asi 1 až asi 10 ekvivalenty 1-substituovaného hydrazinu nebo jeho soli. Při použití soli 1-substituovaného hydrazinu s kyselinou reakční směs soli s kyselinou a sloučeniny obecného vzorce 1 a 15 výhodně rovněž obsahuje slabou organickou bázi nebo bázi alkalického kovu k tlumení reakční směsi. Výhodné organické báze zahrnují diisopropylethylamin, pyridin, 4-dimethylaminopyridin, lutidin, kolidin, a podobně a jejich směsi. Výhodná organická báze je diisopropylethy lamin. Reakce mezi sloučeninami 1 a 15, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethyl-amino-2-propenoyl a 1-substituovaným-hydrazinem nebo jeho solí s kyselinou probíhá v protickém rozpouštědle jak je popsané výše při teplotě v rozmezí od asi 50 °C do asi 115 °C při době reakce asi l hodinu až asi 5 dnů. Výhodným protickým rozpouštědlem je 2-methoxyethanol nebo 2-propanol.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl lze převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých CZ 303099 B6

Rl ^ NHR3 způsobem popsaným k přípravě sloučenin obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = I —N—substituovaný—3—pyrazoly 1 s tím rozdílem, že místo 1-substituovaného hydrazinu se použije R3N(H)C(=NH)NH2. Způsoby přípravy R3N(H)C(^NH)NH2 jsou v oboru známé.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl je možné převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých

O U /

N—N R1 = reakcí sloučenin vzorců 1 a 15, kde Rl = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl s

(R*V

W N3 v polárním aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí od asi 50 °C do 110 °C při době reakce asi 1 hodinu až asi 5 dnů. Způsoby přípravy

jsou pracovníkům známé. Vhodná aprotická rozpouštědla zahrnují, ale nejsou omezená jen na ně, pentan, hexany, heptany, toluen, benzen, xyleny, petrolether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxan a podobně. Výhodné aprotické rozpouštědlo je toluen.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých Rl = 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl je možné převést na sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = 3-isoxazolyl reakcí sloučeniny vzorce 1 a 15, ve kterých R1 = 3-N,N-dimethyl-2-propenoyl s asi 1 až asi 10 ekvivalenty hydroxylaminu nebo jeho soli s kyselinou. Reakce použitá k přípravě sloučenin vzorců I a 15, ve kterých R1 = 3-isoxazolyl se výhodně provede v aprotickém rozpouštědle jako je některé z rozpouštědel popsaných výše, při teplotě okolo teploty místnosti při době reakce asi 1 hodinu až asi 5 dnů. Nej výhodněji se jako aprotické rozpouštědlo použije 1,4-dioxan.

Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 = acetyl, je možné převést na sloučeniny obecného vzorce 2, ve kterých x = -C(O)- reakcí sloučeniny vzorců 1 a 15, kde R1 = acetyl s přebytkem dÍmethylformamid-dimethylacetalu za vzniku sloučenin vzorců 1 a 15, ve kterých R znamená 3-N,N-dimethy!amino-2-propenoyl jak je popsané výše. Sloučeniny obecných vzorců 1 a 15, ve kterých R1 znamená 3-N,N-dimethylamin&-2-propenoyl se pak intramoleku-lámě cyklizují na sloučeniny obecného vzorce 2, ve kteiých x = -C(O)-. Uvedená intramoleku-lární cyklizace výhodně probíhá při vysokých teplotách, napr. při asi 110 °C nebo vyšších. Podle výše uvedeného se intramolekulámí cyklizace provede zahříváním směsi rozpouštědla o vysoké teplotě varu a sloučeniny vzorce 1 a 15, ve které R1 znamená 3-N,N-dimethylamino-2-prope-noyl při teplotě asi 110 °C nebo vyšší po asi 6 hodin až asi 48 hodin, výhodně asi 12 až asi 24 hodin. Vhodná vysoko v roučí rozpouštědla zahrnují, ale bez omezení pouze na ně, toluen, xyleny, CZ 303099 Β6 ehlorbenzen, dimethylformamid, 2-methoxyethanol, dimethylsulfoxid a podobně. Výhodné vysoko v roučí rozpouštědlo je 2-methoxyethanol.

Sloučeniny obecného vzorce 2, ve kterých x = -C(O)- je možné převést na sloučeniny obecného vzorce 2, ve kterých x - -CH(OH)- zpracováním sloučenin vzorce 2, ve kterých x = -C(O)-s hydridovým redukčním prostředkem jako je NaBH4, LiAlH4 SELECTIDE® nebo s jiným hyd-ridovým redukčním prostředkem známým v oboru.

Sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat asymetrické atomy uhlíku a mohou proto existovat v různých enantiomemích a diastereomemích formách. Diastereomemí směsi je možné separovat na jednotlivé diastereomery na základě jejich rozdílných fyzikálně-chemických vlastností způsoby v oboru známými, například chromatografíí nebo frakční krystal i žací. Enantiomeiy je možné separovat konverzí enantiomemích směsí na diastereomemí směsi reakcí s vhodnou opticky aktivní sloučeninou (např. alkoholem), separaci diastereomerů a konverzí (např. hydrolýzou) jednotlivých diastereomerů na odpovídající čisté enantiomery. Použití všech uvedených isomerů zahrnujících enantiomemí směsi a čisté enantiomery se pokládá za součást vynálezu.

Sloučeniny podle vynálezu mají bazickou podstatu a jsou schopné tvořit různé soli s různými anorganickými a organickými kyselinami. I když uvedené soli musí být pro podání savcům farmaceuticky přijatelné, často je v praxi žádoucí izolovat sloučeninu podle vynálezu z reakční soli ve formě solí farmaceuticky nepřijatelné a pak ji jednoduchou konverzí převést na volnou bazickou sloučeninu zpracováním s alkalickým prostředkem a následně konvertovat volnou bázi na farmaceuticky přijatelnou adiční sůl s kyselinou. Adiční soli bazických sloučenin podle vynálezu s kyselinami se snadno připraví uvedením bazické sloučeniny s v podstatě ekvivalentním množstvím zvolené minerální nebo organické kyseliny v rozpouštědle jako je vodné médium nebo vhodné organické rozpouštědlo jako je methanol nebo ethanol. Opatrným odpařením rozpouštědla sc snadno získá požadovaná sůl. Požadovanou sůl je také možné vy srážet z roztoku volné báze v organickém rozpouštědle přídavkem roztoku příslušné minerální nebo organické kyseliny.

Sloučeniny podle vynálezu, které jsou přirozeně kyselé jsou schopné tvořit bazické sole s různými kationty. U sloučenin určených pro podávání savcům, rybám nebo ptákům musí být uvedené sole farmaceuticky přijatelné. Pokud se požaduje příprava soli farmaceuticky přijatelné, může být žádoucí izolovat sloučeninu podle vynálezu z reakční soli ve formě soli farmaceuticky nepřijatelné a pak ji jednoduchou konverzí převést na sloučeninu farmaceuticky přijatelnou způsobem analogickým způsobu popsanému výše pro konverzi solí farmaceuticky nepřijatelných na soli farmaceuticky přijatelné. Příklady solí s bázemi zahrnují soli alkalických kovů a nebo kovů alkalických zemin a zejména sodné aminové a draselné soli. Uvedené sole se připraví obvyklými způsoby. Chemické báze vhodné jako prostředky k přípravě farmaceuticky přijatelných solí podle vynálezu zahrnují netoxické soli bází s kyselými sloučeninami podle vynálezu. Uvedené netoxic-ké soli bází jsou soli odvozené od farmakologicky přijatelných kationů jako je sodík, draslík, vápník, hořčík, různé aminové kationy atd. Uvedené sole je možné snadno připravit uvedením odpovídajících kyselých sloučenin podle vynálezu do styku s různými vodnými roztoky obsahujícími požadované farmakologicky přijatelné báze s kationty jako je sodík, draslík, vápník, hořčík, různé aminové kationy atd., a potom odpařením získaného roztoku do sucha, výhodně za sníženého tlaku. Alternativně je také možné uvedené soli připravit smísením roztoků obsahujících kyselé sloučeniny v nižších alkanolech a roztoku požadovaného alkoxidu alkalického kovu a následným odpařením získaného roztoku do sucha jak je popsané výše. V každém případě se výhodně reaktanty použijí ve stechiometrických množstvích, aby se zajistil kvantitativní průběh reakce a maximální výtěžky požadovaného produktu.

Antibakteriální a antiprotozoální aktivita sloučenin podle vynálezu bakteriálním a protozoálním patogenům je prokázaná schopností sloučenin inhibovat růst definovaných kmenů lidských nebo živočišných patogenů. - 14- CZ 303099 B6

Stanovení I

Ve stanovení I popsaném níže se použijí obvyklé způsoby a kritéria vyhodnocení k navržení směru pro určení chemických modifikací, které by mohly poskytnout sloučeniny umožňující obejít 5 definované mechanismy rezistence vůči makro lidům. Ve stanovení I je použit druh bakterií sestavený tak, aby zahrnoval různé cílené patogenní druhy zahrnující typické předem charakterizované mechanismy rezistencí vůči makro li dům. Použití výše uvedeného panelu umožňuje stanovit vztah struktura/aktivita s ohledem na potenci, spektrum účinnosti a strukturní prvky nebo modifikace, které mohou být nutné pro překonání daného mechanismu rezistence. Bakteriální io patogeny zahrnuté v uvedeném panelu pro screening jsou popsané v tabulce uvedené níže. V mnoha případech panel obsahuje jak mateřský kmen citlivý na makrolidy tak kmen rezistentní na makrolidy odvozený od mateřského kmene k získání přesnějšího zhodnocení schopnosti sloučenin obejít daný mechanismus rezistence. Kmeny obsahující gen označený ermA/emnB/ermC jsou rezistentní na makrolidová, linkosamidová a streptogramin B antibiotika díky modifikaci 15 (methylaci) molekul 23S rRNA Erm methylasou, která tak obecně brání vzniku vazby se všemi výše uvedenými strukturními třídami. Byly popsané dva typy transportních toků pro makrolidy; msrA kódující složku pro transportní tok u stafylokoků, bránící vstupu makrolidů a strepto-graminů, a meťA/E kódující transmembránový protein, kde se prozatím předpokládá, že ovlivňuje pouze tok pro makrolidy. Může rovněž docházet k inaktivaci makrolidových antibiotik, 20 která může být zprostředkovaná ťosforylací 2’-hydroxylové skupiny (mph) nebo štěpením mak-rocyklického laktonu (esterasou). Dané kmeny lze charakterizovat obvyklou polymerasovou řetězcovou reakcí (PCR) a/nebo sekvenováním determinantu rezistence. Technologie PCR použitá v této přihlášce je popsaná v práci autorů Sutclife J. a sp., „Detection of Erythromycin-Resistant Determinants by PCR“ Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40(11), 2562-2566 25 (1996). Stanovení se provede na destičkách pro mikrotitraci a vyhodnotí se standardním způso bem popsaným v „Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test - Sixth Edition; Approved Standard44 publikovaným „The National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) guidelines'4; ke srovnání hodnocení kmenů se použije minimální inhibiční koncentrace (MIC). Nejprve se připraví zásobní roztoky hodnocených sloučenin 30 v dimethylsulfoxidu (DMSO) o koncentracích 40 mg/ml.

označeni kmene mechanizmus rezistence na makrolidy Staphylococcus aureus 1116 citlivý mateřský kmen Staphylococcus aureus 1117 ermB Staphylococcus aureus 0052 citlivý mateřský kmen Staphylococcus aureus 1120 erir.C j ..............I Staphylococcus aureus 1032 msrA, mph esterasa \ Staphylococcus hemolyticus 1006 msrA, mph Streptococcus pyogenes 0203 citlivý mateřský kmen Streptococcus pyogenes 1079 ermB Streptococcus pyogenes 1062 citlivý mateřský kmen Streptococcus pyogenes 1061 ermB Streptococcus pyogenes 1064 ermB Streptococcus agalactiae 1024 citlivý mateřský kmen Streptococcus agalactiae 1023 ermB - 15- CZ 303099 B6 označení kmene mechanizmus rezistence na makrolidy Streptococcus pneumcnise 1016 citlivý Streptococcus pneumoniae 1046 ermB Streptococcus pneumoniae 1095 ermB Streptococcus pneumoniae 1175 mef E Streptococcus pneumoniae 0085 citlivý Haemophilus influenzae 0131 citlivý Moraxella catarrhalis 0040 citlivý Moraxella catarrhalis 1055 rezistence na meziprodukt erytromycinu Escherichia coli 0266 citlivý

Ve stanovení II se použije test stanovení účinnosti vůči Pasteurella multocida a ve stanovení III test stanovení účinnosti vůči Pasteurella haemolytica.

Stanovení II

Stanovení je založeno na postupných ředěních v mikrolitrovém měřítku. Jedna kolonie P. multo-cida (kmen 59A067) se inokuluje do 5 ml mozkové-srdeční intužní půdy (BHI). Testované slou-I» ceniny se připraví rozpuštěním 1 mg sloučeniny ve 125 μΐ dimethylsulfoxidu (DMSO). Ředění testované sloučeniny se připraví s použitím neinokulované BHI půdy. Koncentrace testované sloučeniny jsou v rozmezí od 200 ml/ml do 0,098 pg/ml postupným dvojnásobným ředěním. BHI inokulovaná P. multocida se pak zředí neinokulovanou BHI půdou tak, aby se získal suspenze obsahující 104 buněk v 200 μΙ suspenze. Suspenze obsahující buňky v BHI se pak smísí s přísluš-15 ným postupným ředěním testované sloučeniny a směs se inkubuje 18 hodin při 37 °C. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) je koncentrace rovnající se koncentraci sloučeniny vykazující 100% inhibici růstu ve srovnání s neinokulovaným kontrolním vzorkem.

Stanovení III 20

Stanovení je založené na metodě ředění v agaru s použitím Steersova replikátoru. Z agarové desky se izoluje dvě až pět kolonií a inokuluje se jimi BHI půda, která se pak inkubuje při 37 °C přes noc za třepání (200 ot/min). Následující ráno se 300 μ! plně narostlé prekultury P. haemolytica inokuluje do 3 ml čerstvé BHI půdy a naočkovaná půda se inkubuje při 37 °C za třepání 25 (2 00 ot/min). Příslušná množství testovaných sloučenin se pak rozpustí v ethanolu a připraví se postupná dvojnásobná ředění. Podíl objemu 2 ml příslušného postupného ředění se pak smísí s 18 ml tekutého BHI agaru a směs se nechá ztuhnout. V okamžiku, kdy půda inokulovaná kulturou P. haemolytica dosáhne standardní hustoty 0,5 podle McFarlanda se asi 5 μΐ kultury P. haemolytica naočkuje pomocí Steersova replikátoru na BHI agarové desky obsahující různé 30 koncentrace testované sloučeniny a inkubuje se 18 hodin při 37 °C. Počáteční koncentrace testované sloučeniny je v rozmezí 100 až 200 pg/ml. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) je koncentrace rovnající se koncentraci sloučeniny vykazující 100% inhibici růstu ve srovnání s neinokulovaným kontrolním vzorkem. - 16- CZ 303099 B6

Stanovení IV

Stanovení aktivity sloučenin podle vynálezu in vivo je možné určit obvyklými stanoveními chránícího účinku na zvířatech známými v oboru, obvykle s použitím myší.

Po dodávce se myši umístí do klecí (10 do jedné klece) a nechají se před zahájením pokusu nejméně 48 hodin aklimatizovat. Pak se zvířata naočkují intraperitoneálním podáním 0,5 ml bakteriální suspenze obsahující 3 x 103 CFU/ml (P. multocida, kmen 59A006). V každém pokusu jsou nejméně 3 nemedikované skupiny, z nichž jedna je infikovaná 0,1X provokační dávkou a dvě skupiny jsou infikované IX provokační dávkou; lze také použít provokační dávku Ι0Χ. Obecně se všem myším v dané studii podá provokační dávka v rozmezí 30 až 90 minut což umožňuje injekční stříkačka pro opakované podání (jako injekční stříkačka Comwall®) provokační dávky. Třicet minut po podání provokační dávky se podá první léčivá sloučenina. Zde může být potřebná pomoc druhého pracovníka pokud všem zvířatům nebyla podána provokační injekce do 30 minut. Léčivé složky se podávají subkutánně nebo orálně. Subkutánni podání se provádí do volné kůže vzadu na krku a orální dávky se podávají jehlou pro krmení. V obou případech se podá jedné myši objem 0,2 ml. Sloučeniny se podávají 30 minut, 4 hodiny a 24 hodin po provokaci. V každém testu se podá kontrolní sloučenina o známé účinnosti stejným způsobem jako hodnocená sloučenina. Zvířata se každý den pozorují a zaznamenává se počet přežitých zvířat v každé skupině. Pokus s použitím uvedeného modelu s P. multocida se nechá probíhat a výsledky se sledují 96 hodin (čtyři dny) po provokaci.

Hodnota PD50 je vypočtená dávka, při které testovaná sloučenina chrání 50 % zvířat ve skupině před mortalitou následkem bakteriální infekce, kde uvedená infekce by měla bez podání léčiva letální prii běh.

Sloučeniny podle vynálezu vykazují antibakteriální aktivitu v jednom z výše uvedených stanoveních, zejména ve stanovení IV.

Sloučeniny podle vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné sole (dále účinné sloučeniny) je možné podávat při léčbě bakteriálních a protozoálních infekcí orálním, parenterálním, topickým nebo rektálním podáním. Obecně je žádoucí podávat sloučeniny podle vynálezu v dávkách od asi 0,2 mg na kg tělesné hmotnosti a den (mg/kg/den) do asi 200 mg/kg/den v jedné nebo v rozdělených dávkách (tj. od 1 do 4 dávek denně), i když v závislosti na druhu infekce, hmotnosti a stavu pacienta a konkrétním způsobu podání bude někdy potřebné uvedené dávky změnit. Nicméně nejčastěji se budou potřebné dávky pohybovat v rozmezí od asi 4 mg/kg/den do asi 50 mg/kg/den. Nicméně variace dávek se vyskytnou také v závislosti na druhu savce, ryby nebo ptáka určeného k léčbě a na jeho individuální odezvě na dané léčivo, rovněž jako na druhu léčivého přípravku a době podávání a intervalech, ve kterých se podávání provede. V některých případech mohou být více než přiměřené dávky pod spodním limitem uvedeného rozmezí, zatímco v jiných případech bude možné použít dávky ještě vyšší aniž by došlo ke škodlivým vedlejším účinkům za předpokladu, že uvedené vyšší denní dávky se podávají rozdělené na několik menších denních dávek.

Uvedené účinné sloučeniny je možné podávat samotné nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly výše uvedenými způsoby podání, kde uvedené podání je možné provést formou podání jedné nebo více dávek. Konkrétněji, účinné sloučeniny je možné podávat obsažené v různých lékových formách, tj., je možné je spojit s různými farmaceuticky přijatelnými inertními nosiči a získat tak přípravky ve formě tablet, tobolek, pastilek, oplatek, tvrdých bonbonů, prášků, sprejů, krémů, balzámů, čípků, želé, gelů, past, omývadel, mastí, vodných suspenzí, injekčních roztoků, tinktur, sirupů a podobně. Uvedené nosiče zahrnují tuhé nosiče nebo plniva, sterilní vodná média a různá netoxická organická rozpouštědla atd. Farmaceutické kompozice pro orální podání je možné vhodně osladit a/nebo chuťově a čichově korigovat. Obecně je - 17- CZ 303099 Β6 v uvedených lékových formách účinná sloučenina obsažená v koncentracích v rozmezí od asi 5,0 % do asi 99 % hmotnostních.

Tablety pro orální podání mohou obsahovat různé přísady jako je mi kro krystalická celu losa, natrium-citrát, uhličitan vápenatý, hydrogenfosforečnan vápenatý a glycín společně s různými prostředky ovlivňujícími rozpadavost jako je škrob (výhodně kukuřičný, bramborový nebo tapio-kový škrob), kyselina alginová a určité komplexní křemičitany, a rovněž pojivá pro granulaci jako je pólyvinylpyrrolidon, sacharóza a arabská guma. Kromě toho lze pro přípravu tablet také v mnoha případech použít kluzné prostředky jako je magnesium-stearát, natrium-iaurylsulfát a talek. Tuhé kompozice podobného typu lze použít jako náplně želatinových tobolek; výhodné prostředky pro tento účel zahrnují laktózu nebo mléčný cukr a rovněž polyethylenglykoly o vysoké molekulové hmotnosti. Jestliže je potřebné připravit vodné suspenze a/nebo tinktury, je možné účinnou sloučeninu spojit s různými sladícími prostředky nebo prostředky korigujícími chuť a vůni, barvivý nebo pigmenty a je-li to žádoucí semulgačními a/nebo suspendačními prostředky, společně s ředidly jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerin a jejich různými kombinacemi.

Pro parenterální podání je možné použít roztoky účinné sloučeniny v buď sezamovém oleji nebo arašídovém oleji, nebo ve vodném roztoku propylenglykolu. Vodné roztoky by měly být pokud je to potřebné vhodným způsobem tlumené (výhodně na pH větší než 8) a tekuté ředidlo by mělo být nejprve isotonizované. Uvedené vodné roztoky jsou vhodné pro intravenózní injekční podání. Olejové roztoky jsou vhodné pro intraartikulární, intramuskulámí a subkutánní injekční podání. Příprava všech výše uvedených roztoků za sterilních podmínek je snadno realizovatelná standardními způsoby farmaceutické technologie, které jsou pracovníkům v oboru známé.

Kromě toho je možné sloučeniny podle vynálezu podávat topicky, ve formě krémů, želé, gelů, past, náplastí, mastí a podobně, v souladu se standardní farmaceutickou praxí. Při podávání živočichům jiným než je člověk, jako je skot nebo domácí zvířata, je možné účinné sloučeniny podávat zvířatům v krmivu nebo ve formě veterinárních kompozic. Účinné sloučeniny je také možné podávat ve formě liposomových podávačích systémů zahrnujících malájednolamelámí vezikula, velká jednolamelámí vezikula a vícelamelámí vezikula. Lipo-somy je možné připravit z různých fosfolipidů jako je cholesterol, stearylamin nebo fosfatidyl-choliny. Účinné sloučeniny je také možné spojovat s rozpustnými polymery jako cílenými nosiči léčiv. Uvedené polymery mohou zahrnovat poíyvinylpyrrolidon, kopolymer pyranu, polyhydroxy-propylmethakrylamidfenyl, polyhydroxyethyiaspartamid-fenol nebo polyethylenoxidpolylysin substituovaný palmitoylovými zbytky. Dále je možné účinné sloučeniny spojovat s polymery třídy biodegradovatelných polymerů vhodných k dosažení řízeného uvolňování léčiva zahrnujících například kyselinu polymléčnou, kyselinu polyglykolovou, kopolymery kyseliny polymléčné a kyseliny pólyglykolové, polyepsilon kaprolakton, kyselinu polyhydroxybutyrovou, polyorto-estery, polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanakryláty a zesítěné nebo amfipatické blokové kopolymery nebo hydrogely. K dalšímu znázornění způsobu podle vynálezu a meziproduktů podle vynálezu jsou zařazené příklady provedení vynálezu. Příklady uvedené níže je nutné chápat tak, že podrobnosti v nich uvedené vynález nijak neomezují. Příklady provedení vynálezu

Sloučeniny 1 až 12 mají níže uvedený obecný vzorec 3, kde substituenty Rl a Rb mají význam uvedený níže v tabulce 1. Uvedené sloučeniny se připraví způsoby popsanými v příkladech 1 až 12. - 18- CZ 303099 B6

Tabulka 1 sloučenina R1 1 Ř* 1 1A vodík ^ch3 Šh 13 acetyl vodík ic 3-N,N-dimethylamino-2-propenoyl vodík ID 3-pyrazolyl vodík 1E acetyl methyl 1F 3-N,N-dimethylamíno-2-propenoyl methyl 1G 3-pyrazolyl methyl 1H 1-N-methyl-3-pyrazolyl methyl IX 1-N-benzyl-3-pyrazolyl methyl U 1-N-(3-hydroxybenzyl)-3-pyrazolyl nic: x 1K (2-(4-fluorfenyl)-3-pyrimidinyl methyl 1L (2-fenylamino)-3-pyrimidinyl methyl 1M l-N-methyl-5-pyrazolyl methyl Příklad 1 10

Sloučenina (1 A) K deionizované vodě (2 1) se přidá desmethylazithromycin (30 g, 41 mmol), a potom acetonitril, aby se docílilo úplného rozpouštění (celkový objem je asi 4,5 1). Získaná směs se míchá 2 dny při 15 teplotě místnosti, kdy analýza HPLC indikuje přítomnost nového píku (asi 22 % plošných pro- - 19- CZ 303099 B6 cent píku). Acetonitril se pak odpaří ve vakuu, K získanému zbytku se pak přidá uhličitan drasel-ný (30 g) a potom dichlormethan (0,3 I). Směs se protřepe a spodní organická vrstva se oddělí. Vodná vrstva se reextrahuje dichlormethanem (2 x 0,3 1). Spojené organické fáze se vysuší síranem sodným a zahuštěním ve vakuu se získá suchá pěna (30 g), která se přečistí na sloupci plně-5 ném silikagelovou kaší s použitím směsi hexany-diethylamín-acetonitril 5/1/0,5 (obj./obj./obj.). Během separace se poměr rozpouštědel v mobilní fázi změní na 4/1/0,1 a nakonec na poměr hexany-dimethylamin-acetonitril 3/1,5/0,5. Zahuštěním posledních frakcí se ve formě suché pěny získá sloučenina 1 A. 10

Příklad 2 Sloučenina 1B 15 K roztoku sloučeniny 1A (7,63 g, 10,41 mmol) v dichlormethanu (100 ml) se při 0 °C přidá v jedné dávce plumbium-tetraacetát (5,54 g, 12,49 mmol). Získaná směs se míchá 30 minut při 0 °C a pak se zalije nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml). Pak se směs převede do dělicí nálevky a dichlormethanová vrstva se oddělí. Vodná vrstva se extrahuje dichlormethanem (2 x 50 ml). Spojené dichlormethanové podíly se promyjí solným roztokem 20 (50 ml), vysuší se síranem horečnatým, zfiltrují se za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2 % hydroxid amonný (10% vodný)/5 % metha-nol/94,8 dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1 B (5,64 g, 8,43 mmol). 25

Příklad 3 Sloučenina 1C .ίο Sloučenina 1B (100 mg, 0,15 mmol) se rozpustí v dimethylformamid-dimethylacetálu (2 ml) a zahřívá se 8 hodin při teplotě zpětného toku. Směs se nechá vychladnout na teplotu místnosti a pak se zředí ethylacetátem (25 ml). Pak se směs promyje vodou (10 ml) a solným roztokem (10 ml). Roztok ethyl-acetátu se pak vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2 % 35 hydroxid amonný (10% vodný)/10% methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak sloučenina lC(výtěžek: 65 mg, 60 %). Příklad 4 40

Sloučenina ID

Sloučenina 1C (100 mg, 0,14 mmol) a hydrazin-monohydrát (5 ml, 0,15 mmol) se rozpustí v 2-methoxyethanolu (1,5 ml) a zahřeje se na 105 °C v atmosféře dusíku. Za 2 hodiny se směs 45 nechá vychladnout na teplotu místnosti a potom se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/10 % methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1D (výtěžek: 58 mg, 60 %).

Příklad 5 Sloučenina 1E -20- 50 CZ 303099 B6 K roztoku sloučeniny 1B (3,9 g, 5,8 mmol) v chloroformu (58 ml) se přidá kyselina mravenčí (330 ml, 869 mmol) a formaldehyd (37 % vodný, 1,3 ml, 17,33 mmol). Získaná směs se zahřívá 7 hodin při 60 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se směs převede do dělicí nálevky a promyje se vodným hydrogenuhličitanem sodným (20 ml). Chloroformová frakce se pak vysuší síranem horečnatým, zfiltruje se a zahuštěním se získá sloučenina 1C (výtěžek: 3,9 g, 98%), která se použije bez dalšího čištění.

Příklad 6 Sloučenina 1F

Sloučenina 1E se rozpustí v dimethylformamid-dimethylacetálu (25 ml) a zahřívá se 36 hodin při teplotě zpětného toku v atmosféře dusíku. Směs se pak nechá vychladnout na teplotu místnosti a zahustí se ve vakuu. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/10% methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak sloučenina 1F (výtěžek: 1,36 g, 80 %). Příklad 7

Sloučenina 1G

Sloučenina 1F (250 mg, 0,34 mmol) a hydrazin—monohydrát (16 ml, 0,5 mmol) se rozpustí v 2-methoxyethanolu (3,4 ml) a zahřívá se při 105 °C v atmosféře dusíku. Za 4 hodiny se směs nechá vychladnout na teplotu místnosti a zahustí se za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí ry chlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/10% methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1G.

Příklad 8 Sloučenina II

Sloučenina 1F (250 mg, 0,34 mmol), benzylhydrazin-dihydrochlorid (73 ml, 0,37 mmol) a diiso-propylethylamin (180 μΙ, 1,02 mmol) se rozpustí v 2-methoxyethanolu (3,5 ml) a reakční směs se zahřívá v atmosféře dusíku při 105 °C. Za 48 hodin se směs nechá vychladnout a pak se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2 % hydroxid amonný (10% vodný)/10 % methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 11 (výtěžek: 137 mg, 50 %).

Příklad 9 Sloučenina 1J

Sloučenina 1F (250 mg, 0,34 mmol), 3-hydroxybenzylhydrazin-dihydrochlorid (142 ml, 0,68 mmol) a diisopropylethylamin (148 μΐ, 0,85 mmol) se rozpustí v propan-2-olu (3,5 ml) a reakční směs se zahřívá při teplotě zpětného toku v atmosféře dusíku. Za 5 hodin se směs nechá vychladnout na teplotu místnosti a pak se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografií na silikagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/10% methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1J (výtěžek: 147 mg, 53 %). -21 - CZ 303099 B6

Příklad 10 Sloučenina 1K 5 Sloučenina 1F (250 mg, 0,34 mmol), 4-fIuorfenylguanidinkarbonát (240 mg, 0,68 mmol), a diisopropylethylamin (148 μΐ, 0,85 mmol) se rozpustí v propan-2-olu (3,5 ml) a reakční směs se zahřívá při teplotě zpětného toku v atmosféře dusíku. Za 24 hodin se směs nechá vychladnout na teplotu místnosti a pak se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatogra-fií na silikagelu s použitím směsi 0,2 % acetonitril/20 % diethylamin/hexany jako elučního proto středku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1K (výtěžek: 120 mg, 42 %). Příklad 11

15 Sloučenina 1L

Sloučenina 1F (125 mg, 0,168 mmol), fenylguanidinkarbonát (84 mg, 0,252 mmol) a uhličitan draselný (70 mg, 0,5 mmol) se rozpustí v propan-2-olu (1,5 ml) a reakční směs se zahřívá při teplotě zpětného toku v atmosféře dusíku. Za 48 hodin se směs nechá vychladnout na teplotu 20 místnosti a pak se zředí dichlormethanem (2 ml). Pak se směs promyje vodou (10 ml), vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chro-matografií na silikagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/Í0% metha-nol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 1L (54 mg, 40 %). 25 Příklad 12

Sloučeniny 1H a 1M 50

Sloučenina 1F (260 mg, 0,35 mmol) a methylhydrazin-monohydrát (56 μΐ, 1,05 mmol) se rozpustí v 2-methoxyethanolu (3,5 ml) a reakční smě> se zahřívá při 115 °C v atmosféře dusíku. Za 6 hodin se směs nechá vychladnout na teplotu místnosti a pak se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografíí na silikagelu s použitím směsi 1 % acetonitril/20 % 55 diethylamin/hexany jako elučního prostředku a získají se tak sloučenina 1H (výtěžek: 42 mg, 17 %) a sloučenina 1M (výtěžek: 21 mg, 8 %) ve formě bílých tuhých produktů.

Sloučeniny podle příkladů 13 až 14 mají obecný vzorec 4 znázorněný níže, kde význam substi-tuentu X je uveden v tabulce 2 uvedené rovněž níže. Tyto sloučeniny se připraví způsobem pop-40 sáným v příkladech 13 až 14.

(4) CZ 303099 B6

Tabulka 2 sloučenina X 2A -c(0)- 2B -CH(OH)- Příklad 13

s Sloučeniny 2A a 1C

Sloučenina 1B (1,5 g, 2,23 mmol) se rozpustí v dimethylformamid-dimethylacetálu (15 ml) a zahřívá se 16 hodin při 105 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se směs zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v 2-methoxyethanolu (25 ml) a zahřívá se 16 hodin při 125 °C. Pak se io směs nechá vychladnout na teplotu místnosti a potom se zředí ethylacetátem (100 ml). Pak se směs promyje vodou (2 x 20 ml), a solným roztokem (20 ml), vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje se a zahustí se za sníženého tlaku. Zbytek se přečistí rychlou chromatografu na sili-kagelu s použitím směsi 0,2% hydroxid amonný (10% vodný)/10% methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak sloučenina 2A (výtěžek: 221 mg, 15 %) a sloučenina 1C is (833 mg, 54 %). Příklad 14

Sloučenina 2B 20 K roztoku sloučeniny 2A (150 mg, 0,21 mmol) v ethanolu (2 ml) se při 0 °C přidá v jedné dávce tetrahydroboritan sodný (33 mg, 0,84 mmol). Získaná směs se míchá 2 hodiny při 0 °C a pak se pomalu vlije do vody (25 ml). Pak se směs převede do dělicí nálevky a extrahuje se dichlor-methanem (3 x 20 ml). Spojené dichlormethanové frakce se vysuší síranem hořečnatým. zfiltrují se a zahustí se. Zbytek se přečistí rychlou chromatografu na silikagelu s použitím směsi 0,2 % 25 hydroxid amonný (10% vodný)/5 % methanol/dichlormethan jako elučního prostředku a získá se tak ve formě bílé tuhé hmoty sloučenina 2B (výtěžek: 103 mg, 71 %).

Sloučeniny podle příkladů 15 až 17 mají obecný vzorec 14 znázorněný níže, kde význam substi-tuentu R1 je uveden v tabulce 3 uvedené rovněž níže. Tyto sloučeniny se připraví způsobem 30 popsaným v příkladech 15 až 17. N(CH3)2

-23 - (14) CZ 303099 B6

Tabulka 3 sloučenina R* 1N Chb OH <5h 10 Vo .CH’ Příklad 15

Sloučenina 1N (způsob A) io Do Frlenmayerovy baňky objemu 21 se vnese desmethylazithromycin (190,5 g, 259,2 mmol), dichlormethan (572 ml) a síran horečnatý (38 g). Směs se míchá 10 minut a pak se zfíltruje do baňky s kulovým dnem objemu 5 1. Potom se přidá další dichlormethan (2285 ml) a roztok se ochladí na 0 až 5 °C. Během 10 minut se pak přidá CBZ-C1 (58,4 ml). Reakční směs se pak míchá při ~ 0 °C 6 hodin a pak při teplotě místnosti přes noc. Po této době analýza metodou is HPLC indikuje přítomnost zbytkové složky a proto se reakční směs znovu ochladí na ~0°C a v jedné dávce se přidá další CBZ-C1 (19,5 ml). Reakční směs se míchá 5,5 hodin při 0 °C a pak 2,5 hodiny při teplotě místnosti. Po této době analýza TLC indikuje úplný průběh reakce. Pak se reakční směs zalije nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (953 ml) a fáze se oddělí. Organická fáze se vysuší síranem hořečnatým a pak se zfíltruje a zahuštěním se získá 20 sloučenina obecného vzorce 9, ve které Rt0 = ethyl a R" = -OH,

Do baňky s kulovým dnem objemu 5 1 obsahující sloučeninu obecného vzorce 9, ve které R10 = ethyl a R11 = -OH (225,3 g) v dichlormethanu (901 ml) a v DMSO (450 ml) se při -65 °C přidá anhydrid kyseliny trifluoroctové (82,4 ml). Během přídavku, který se ukončí během 25 9 minut se teplota udržuje na -60 °C. Reakční směs se pak míchá 20 minut při -65 až -70 °C.

Pak se reakční směs zalije triethylaminem (145 ml) a míchá se 20 minut při -60 °C až -65 °C. K reakční směsi se pak přidá během 3 minut voda (1127 ml), přičemž teplota vzroste na -2 °C. Reakční směs se pak míchá 10 minut a fáze se oddělí. Organická fáze se promyje vodou (675 ml), potom nasyceným vodným chloridem sodným (675 ml). Organická fáze se pak vysuší 30 síranem hořečnatým, potom se zfíltruje a organická rozpouštědla se odstraní destilací. Pak se přidá MTBE a oddestilují se stopy dichlormethanu a DMSO. Potom se přidá další MTBE na celkový objem 3380 ml. Pak se přidá monohydrát dibenzoyl-D-vinné kyseliny (87,8 g) v MTBE (1126 ml) čímž se vytvoří hustá kaše. Směs se pak zahřívá při teplotě zpětného toku a míchá se přes noc. Po ochlazení na teplotu místnosti se tuhé podíly oddělí v Biichnerově nálevce a promyjí 35 se MTBE. Tuhé podíly se pak vysuší v sušárně při 40 °C a získá se tak 258,3 g dibenzoyltartráto-vé soli sloučeniny obecného vzorce 10, ve které R10 - ethyl a R11 --OH.

Do baňky s kulovým dnem objemu 3 1 se vnese dichlormethan (800 ml) a dibenzoyltartrátová sůl sloučeniny obecného vzorce 10, ve které R10 = ethyl a R11 =-OH (188 g). Pak se přidá voda 40 (400 ml) a uhličitan draselný (45,5 g), a směs se míchá při teplotě místnosti 5 minut. Pak se oddělí organická fáze, promyje se vodou (250 ml) a vysuší se síranem hořečnatým. Sušicí pro- -24- CZ 303099 B6 středek se odstraní filtrací a získaný roztok se odpaří v proudu dusíku na konečný objem 623 ml k získání ketonu volné báze.

Do baňky s kulovým dnem objemu 5 1 se vnese THF (623 ml) a trimethylsulfonium-bromid (74,7 g). Získaná kaše se ochladí na -10 °C a přidá se kalium-terc-butoxid (54,4 g). Reakční směs se míchá 10 minut při -10 °C a pak se ochladí na -70 °C během 5 minut. Pak se přidá během 11 minut keton volné báze přičemž teplota se udržuje v rozmezí -60 až 65 °C. Po 90 minutách analýza HPLC indikuje úplný průběh reakce. Reakční směs se pak zalije při teplotě -60 °C roztokem chloridu amonného (315 g) ve vodě (1800 ml). Během přerušení reakce teplota vzroste na -5 °C. Reakční směs se pak ohřeje na 5 až 10 °C a fáze se oddělí. Organická fáze se pak vysuší síranem sodným, zfiltruje a zahuštěním se získá sloučenina obecného vzorce 11, ve které R10 = ethyl a R11 = -OH (117.4 g) ve formě žluté pěny. Podle plošných procent píku analýzy HPLC je čistota produktu 61,4 %. K roztoku sloučeniny obecného vzorce 11, kde Rl0 = ethyl a Rll=-OH (275 g, 312mmol) v suchém methanolu (2,75 1) se přidá jod i d draselný (518g, 3,12 mol) a propylamin (250 ml, 3,04 mol). Směs se míchá přes noc při 45 °C. Analýza TLC v této době indikuje úplný průběh reakce. Pak se reakční směs zahustí na rotačním vakuovém odpařovači a zbytek se rozdělí mezi vodu (2,5 1) a dichlormethan (2,5 l). Potom se pH vodné fáze upraví na 6,7 s použitím vodné HC1 (3 mol/1). Extrakce se opakuje ještě jednou. Spojené vodné fáze se spojí s čerstvým dichlor-methanem (1,5 1) a pH vodné fáze se upraví na 8,5 pomocí tuhého uhličitanu draselného. Pak se fáze rozdělí a vodná fáze se dvakrát reextrahuje dalším dichlormethanem. Spojené organické fáze se vysuší síranem sodným a pak se zfíltrují. Filtrát se zahustí na rotačním vakuovém odpařovači a získá se tak béžové zbarvená pěna (230 g). Přečištění pěny se provede na koloně naplněné kaší silikagelu s použitím směsi hexany-diethylamin 19/3 (obj./obj.) jako mobilní fáze. Použitím 125 g surového produktu se tak získá 72 g sloučeniny obecného vzorce 5, kde R9 = 4“-(propyl-aminomethyl)kladinosyl, R10 = ethyl, a R11 = -OH ve formě bílé amorfní pěny.

Sloučenina obecného vzorce 5, kde R9 = 4‘,‘-(propylaminomethyl)kladinosyl, Rl0 = ethyl, a R11 =-OH (10 g, 12,4 mmol) se rozpustí v acetonitrilu (0,5 1) při teplotě místnosti. Pak se přidá deionizovaná voda (1 1), čímž se vyvolá tvorba sraženiny. Pak se přidá acetonitril k získání homogenního roztoku, který se míchá 30 hodin při teplotě místnosti. V této době analýza HPLC indikuje tvorbu nové složky odpovídající - 20 % celkové plochy píku.

Organická rozpouštědla se odstraní na rotačním vakuovém odpařovači. K vodnému zbytku se pak přidá uhličitan draselný (30 g) a potom dichlormethan (0,3 1). Směs se pak protřepe a spodní organická vrstva se oddělí. Provedou se ještě dvě další extrakce (2 x 0,3 1). Spojené organické fáze se vysuší síranem sodným, zfíltrují se a získaný roztok se zahustí na suchou pěnu (~ 10 g). Získaná směs sloučeniny obecného vzorce 5, kde R9 = 4“-(propy!am!nomethyl)kíadmosy!, R10 = ethyl, a R11 = -OH; a sloučeniny 1N se rozpustí ve směsi dichlormethanu a směsi v poměru 19/3 hexany/diethylamin a vnese se na sloupec naplněný silikagelem a pak se eluuje uvedeným systémem v poměru 19/3. Pak se mobilní fáze ve frakci 56 změní na fázi s poměrem hexany/-diethylamin 19/6. Frakce 9 až 17 se spojí a zahuštěním se získá suchá pěna obsahující pouze nezreagovanou výchozí složku. Frakce 52 až 72 se spojí a zahustí se na sloučeninu IN (79% čistota stanovená HPLC). Příklad 16

Sloučenina 1N (způsob B)

Sloučenina obecného vzorce 5, kde R9 = 4“-(propylaminomethyl)kladinosyl, Rl0 = ethyl, a R11 = -OH, se rozváží do 6 lahviček (25 mg/lahvička). Pak se přidá podle níže uvedeného rozpisu rozpouštědlo (0,5 ml/lahvička): -25- CZ 303099 B6 lahvička rozpouštědlo A propan-2-ol B aceton itril C acetonitril (0,35 ml)/voda(0,35 ml) D aceton E methanol F benzen in Všechny lahvičky se pak zahřívají 5 hodin v olejové lázni o teplotě 50 °C. V tomto okamžiku TLC analýza s použitím směsi hexany-diethylamin-acetonitril v poměru 6/1/01 (obj./obj./obj.) indikuje přítomnost sloučeniny 1N ve všech lahvičkách. Nej lepší poměr se však získá v lahvičkách C a E obsahujících protická rozpouštědla. 15

Příklad 17 Sloučenina lO 20 Směs sloučeniny obecného vzorce 5, kde R9 = 4“-<propylaminomethyl)kladinosyl, R10 - ethyl, a R11 = -OH; a sloučeniny 1N (~ 15 %) (0,8 g, 0,1 mmol) se rozpustí v ethylacetátu (30 ml). Pak se přidá uhličitan draselný (0,14 g, 1 mmol) a ethylen-karbonát (0,5 g, 5,67 mmol) a směs se zahřívá při teplotě zpětného toku v atmosféře dusíku přes noc. Po této době analýza TLC s použitím směsi hexany-diethylamin 19/3 indikuje nepřítomnost obou výchozích složek. 25

Reakční směs se pak zfiltruje a zahuštěním filtrátu se získá tmavý olej, kteiý se přečistí na 4mm vrstvě CHROMATOTRONU® (Harrison research, Palo Alto, Califomia), s použitím směsi hexany-diethylamin (19/3 obj./obj.) jako elučního prostředku. Frakce 8 až 13 se spojí a zahustí se; analýza NMR potvrzuje, že produkt odpovídá 11,12-cyklickému karbonátu výchozí složky. jo Frakce 18 až 39 obsahují méně mobilní složku, která se přečistí na desce tloušťky 2 mm s použitím směsi hexany-diethylamin 3/1 (obj./obj.). Obohacené frakce 16 až 23) se spojí a chromatografie se opakuje na lmm vrstvě s použitím výše popsané mobilní fáze a získá se tak ve frakci 20 sloučenina ÍO (30 mg). Výsledky analýz TLC a HPLC potvrzují vysokou čistotu produktu.

Vynález není nijak omezen rozsahem specifických provedení uvedených v příkladech, které jsou určené pro znázornění několika aspektů vynálezu a každé provedení, které je jejich funkčním ekvivalentem je v rozsahu předloženého vynálezu. Pracovníkům v oboru bude zřejmé, že do rozsahu vynálezu budou kromě popsaných provedení zahrnuté i různé modifikace vynálezu, které 40 budou v rámci připojených patentových nároků. -26-

Claims (3)

1. CZ 303099 B6 v a υπι/ν 1. Třináctičlenný azalid ze souboru sestávajícího ze sloučenin obecného vzorce 3 N(CH3)2

   ve kterém 10 Rl znamená

   15 R6 znamená vodík nebo R1 znamená acetylovou skupinu a RŘ znamená vodík 20 nebo R1 znamená 3-N,N-dÍmethy(amino-2-propenoylovou skupinu a Rů znamená vodík 25 nebo R1 znamená 3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená vodík nebo R1 znamená acetylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo -27- 30 CZ 303099 B6 R1 znamená 3-N,N-dimethylamino-2-propenoylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo 5 R1 znamená 3-pyrazo tylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo io R1 znamená l-N-methyl-3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená l-N-benzyl-3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu 15 nebo R1 znamená l-N-(3-hydroxybenzyl)-3-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu 20 nebo R1 znamená 2-{4-fluorfenyl)-3-pyrimidÍnylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu 25 nebo R1 znamená (2-tenylamino)-3-pyrimidinylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu nebo R1 znamená l-N-methyl-5-pyrazolylovou skupinu a R6 znamená methylovou skupinu, ze sloučenin obecného vzorce 4

   (4), 35 ve kterém X znamená skupinu -C(O)- nebo skupinu -CH(OH)-, a ze sloučenin obecného vzorce 14 40 -28- C.7. 303099 B6

   ve kterém 5 R1 znamená skupinu

   nebo skupinu

   10
2. 2. Farmaceutická kompozice vyznačená tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství třináctičlenného azalidu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
3. 3. Použití třináctičlenného azalidu podle nároku l při výrobě léčiva pro léčení bakteriální i 5 infekce nebo protozoální infekce savec, ryby nebo ptáka. 20 - Konec dokumentu -29-