CZ286781B6 - Pharmaceutical preparation for treating cancer and diseases caused by abnormally increased cell proliferation - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká farmaceutických prostředků pro léčení rakoviny, zvláště karcinomu, nebo onemocnění, způsobených zvýšenou buněčnou proliferací. Sloučeniny, aktivní v předkládaném vynálezu, jsou acylderiváty aromatických aldehydů, zvláště arylidenové diestery a α-alkoxyarylidenové estery.

Dosavadní stav techniky

Je již známo, mj. ze spisů EP 215395, J 63264411, J88009490, J 55069510 a EP0283139, že aromatické aldehydy a jejich deriváty mají protirakovinný účinek. Tyto sloučeniny působí uplatněním inhibiční účinku na syntézu proteinů buňky.

V pevných nádorech může mít toto snížení proteosyntézy za následek nedostatek životně důležitých proteinů, což vede ke smrti buňky. U normálních buněk existuje potenciál pro syntézu proteinů, který je vyšší, než u většiny rakovinných buněk a pevných nádorů. To se ukazuje při porovnání trvání buněčného cyklu u normálních kmenových buněk, který je často kratší než 10 h, s buněčným cyklem většiny rakovinných buněk a pevných nádorů, který je typicky 30 - 150 h (viz Gavosto a Pileri: The Cell Cycle and Cancer, vyd. Baserga, Marcel Dekker Inc., N. Y. 1971, str. 99). Protože během buněčného cyklu se v průměru zdvojnásobí množství proteinů, znamená to, že akumulace proteinů je vyšší u normálních buněk, stimulovaných k růstu, než u většiny typů rakovinných buněk.

Navíc k tomuto rozdílu mezi normálními a rakovinnými buňkami existuje další rozdíl podobné důležitosti; zatímco normální buňky reagují na stimulátory růstu, rakovinné buňky mají odpověď sníženou nebo žádnou. Zatímco tedy normální buňky mají za normálních růstových podmínek rezervu v růstovém potenciálu, rakovinné buňky ji mají malou nebo žádnou. Jestliže se trvale po delší dobu působí na normální i rakovinné buňky ve smyslu inhibice proteosyntézy, je pravděpodobné, že tyto dva rozdílné typy buněk budou odpovídat odlišně: normální tkáň může využít část své rezervy v růstovém potenciálu a tak si zachová normální buněčnou produkci. Rakovinné buňky však mají jen malou nebo žádnou takovou rezervu. Ve stejné době je rychlost akumulace proteinů u většiny rakovinných buněk poměrně nízká (tj. syntéza proteinů je jen nepatrně vyšší než jejich degradace). Proto může být inhibice proteosyntézy dostatečná pro způsobení nerovnováhy rakovinné tkáně vzhledem k akumulaci proteinů a tím může dojít pro určité proteiny k negativní rovnováze. V průběhu trvalého několikadenního působení to způsobí inaktivaci buněk a nekrózu nádorové tkáně, zatímco normální tkáň je nepoškozena.

Dnes je nejvíce testovanou sloučeninou, indukující reverzibilní inhibici proteosyntézy a vykazující protirakovinný účinek, zilascorb(²H) (kyselina [5,6-benzyliden-d]-askorbová]). Inhibiční aktivitu této známé sloučeniny na proteosyntézu detailně popisuje Pettersen a další (Anticancer Res., 11: 1077 - 1082, 1991) a EP0283139. Zilascorb(²H) indukuje in vivo nekrózu xenoimplantátu lidského tumoru u nahé myši (Pettersen a další, Br. J. Cancer, 67: 650 - 656, 1993), a sloučenina se v současnosti testuje ví. a II. fázi klinických zkoušek. Protože zilascorb(²H) je derivát aromatického aldehydu, aktivita nových sloučenin, popisovaných v předkládaném vynálezu, bude porovnávána s aktivitou zilascorbu(²H).

Z UK patentové přihlášky 9026080.3 je známo, že sloučeniny benzaldehydu, již dříve známé jako protirakovinné prostředky, mohou být použity v boji proti onemocněním, způsobených

-1 CZ 286781 B6 abnormálně zvýšenou buněčnou proliferací. Tyto sloučeniny také působí na buňky s abnormálně zvýšenou rychlostí buněčné proliferace a mohou tedy být použity pro léčení nemocí, jako je psoriáza, zánětlivá onemocnění, revmatická onemocnění a alergické dermatologické reakce.

Dermatologické abnormality, jako je psoriáza, se často charakterizují rychlou obměnou epidermis. Zatímco 1 cm² normální kůže, který se skládá z přibližně 27 000 buněk, produkuje 1250 nových buněk na den, psoriatická kůže produkuje 35 000 nových buněk na den a cm² z 52 000 buněk. Buňky, které jsou zapojeny do těchto onemocnění, jsou však „normální“ buňky, které se reprodukují lychle a opakovaně buněčným dělením. Zatímco obnovení buněk normální kůže trvá přibližně 311 hodin, je tento proces v případě psoriatické kůže urychlen na 10 až 36 hodin.

Je známo, že aromatické aldehydy a jejich určité acetálové deriváty mají inhibiční účinek na růst lidských buněk, který je svou podstatou reverzibilní. Inhibice růstu, indukovaná těmito sloučeninami, je primárně způsobena snížením syntézy proteinů buňkami (Pettersen a další, Eur. J. Clin. Oncol. 19, 935-940 (1983) a Cancer Res. 45, 2085-2091 (1985)). Inhibice proteosyntézy je účinná pouze tehdy, pokud jsou tyto prostředky přítomny v mikroprostředí buňky. Syntéza buněčného proteinu je např. rychle obnovena až na svou normální úroveň do 1 hodiny od doby, kdy byl prostředek z buňky odstraněn.

To vede k důsledku, že po působení uvedených látek zůstanou normální buňky bez poškození. Dále indukuje výsledná inhibice proteosyntézy prodloužení trvání buněčného cyklu, takže se během léčení dosáhne snížení tvorby buněk i snížení proteosyntézy.

Příklady onemocnění, která mohou být uvedenými prostředky léčena, jsou revmatoidní artritida, psoriatická artritida, systémový lupus erythrematosis (SLE), diskoidní lupus erythrematosis (DLE), akné, Bechtěrevova artritida, progresivní systémová skleróza (PSS) a mazotok.

Nyní bylo zjištěno, že třída aromatických aldehydových derivátů, například arylidenové diestery a -alkoxyaiylidenové estery mají překvapivě silnější účinek na inhibici proteosyntézy než dříve známé a testované sloučeniny.

Podstata vynálezu

Farmaceutické prostředky obsahují sloučeniny obecného vzorce I

O //

O-C-Y /

Ar-C-L (D \

O-Z kde

L znamená vodík nebo deuterium,

Ar znamená fenyl, 5- členný heterocyklický kruh s jedním heteroatomem ze skupiny O nebo S nebo 6-členný heterocyklický kruh, obsahující jako heteroatom jeden atom dusíku, přičemž aromatický kruh je popřípadě mono- nebo disubstituován stejnými nebo odlišnými substituenty ze skupiny CJalkyl, C^alkenyl, C₂_6 alkinyl, CF₃, atom halogenu, nitroskupina, kyanoskupina,

-2CZ 286781 B6 skupina OR, kde R znamená deuterium, Ci^alkyl nebo Ci_6acyl, skupina CA(ORi)₂, kde A znamená atom vodíku nebo deuteria a R] znamená Ci^alkyl nebo Ci^acyl, COR₂, kde R₂ znamená atom vodíku nebo deuteria nebo Ci_6alkyl, nebo COOR₂, kde R₂ má svrchu uvedený význam, přičemž v případě, že Y a Z společně netvoří kruh, má Ar význam, odlišný od nesubstituované fenylové skupiny,

Y znamená atom vodíku nebo deuteria, C^alkyl, C₂_6alkenyl nebo C₂_6alkinyl, popřípadě substituované atomem halogenu,

Z znamená Y nebo COY, přičemž Y a Z ve vzorci I jsou stejné nebo odlišné,

Y a Z mohou také společně tvořit 5-členný kruh přes atom uhlíku, který je popřípadě mononebo disubstituovaný stejnými nebo odlišnými substituenty ze skupiny Cí^alky 1, C₂_6alkenyl nebo C₂_«alkinyl nebo COOR₂, kde R₂ má svrchu uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, s výjimkou 5-nitro-2-furfurylidendiacetátu.

Zvláště výhodné podskupiny prostředků podle vynálezu jsou:

A: Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vzorce I, kde Y je CH₃ a Z je COCH₃.

B: Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vzorce I, kde Ar je mono- nebo disubstituovaný fenyl, přičemž stejné nebo rozdílné substituenty jsou ze skupiny CH₃, CF₃, F, NO₂, CN, CO₂CH₃, CH(OCOCH₃)₂ a CD(O COCH₃)₂.

C: Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vzorce I, kde Ar je nitrofuranyl.

D: Farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu vzorce I, kde Ar je fenyl.

E. Farmaceutický prostředek obsahuj ící sloučeninu vzorce I, kde L je deuterium.

Zvláště výhodné prostředky jsou následující:

-3CZ 286781 B6

Tabulka 1

Číslo	Strukturní vzorec	1 Název
1	a u 0 OL °ΊΓ^ 0	benzyliden diacetát
**	a 0 o 'L—OL, ' ' O-η—CH, 0	benzyliden-d^diacetát
Λ	0 -- H 0—CH, 0x_., CH, ° WH3	3-methylbenzyliden diacetát
	0 /---k H. O-^-CH, Ο-η-CH, 0	4-methylbenzyliden diacetát
5	0 η c„„. !L......ch, Q~( / O-r-CH, °Λ	3-nitrobenzyliden diacetát
6	0 H c J.Lch, Vu/ /VM O—η-CH, a	4-nitrobenzyliden diacetát
7	0 o-H-ot, 0-j|· -CH, 0	4-kyanobenzyliden diacetát

-4CZ 286781 B6

Tabulka 1 - pokračování

Číslo	Strukturní vzorec	1 Název
8	0 — H 0—“-CH, O-n-CH, 0	4-fluorbenzyliden diacetát
9	0 0 z—. H O-íi-CH, WZyH och, o-jj—=«. 0	4-karbomethoxybenzyliden diacetát
10	0 0	4-natriumkarboxybenzyliden diacetát
11	(1 Ί o Ο'Ό O=J p=0 CH, CH,	3-diacetoxymethylbenzyliden diacetát
12	0 ChJÍ-O 0 r~ π- 0 CH,	3-acetoxy-5-ethoxy-benzyliden diacetát
13	0 ZA >H, W 0^X\^CH, a	benzylíden-di-dibutanoát
14	a a	4-natriumkarboxybenzyiiden dibutanoát

-5CZ 286781 B6

Tabulka 1 - pokračování

Číslo	Strukturní vzorec	| Název
15	0 0	benzyliden dihexanoát
16	0 -- H 0——CH, CM Ο-η-CH, a	2-furfuryliden diacetát
17	0 0—Γ-°Η, a	5-nitro-2-furfuryliden diacetát (nejde o účinnou látku podle vynálezu)
18	0'1 ,| CH, 0	thiofen-2-karboxaldehyd diacetát
19	°X C^	pyridin-3-karboxaidehyd diacetát
20		2-(R,S)-fenyl-1,3-dioxolan-4-on i
21	. Η n 0 (Rt +=/ Ο'Τ'γμ *CH,	(2R,S;5S)-2-fenyl-1,3-dioxolan -4-on
22	0 Q II c (I ^x: o	benzyliden-di-(a-chloracetát)

-6CZ 286781 B6

Příprava sloučenin

Je již dlouho známa syntéza benzyliden diacetátu oxidací toluenu v přítomnosti anhydridu kyseliny octové. Tento postup byl také použit pro výrobu benzaldehydu ve velkém měřítku, který je utvořením a následnou hydrolýzou diacetátového meziproduktu chráněn před předoxidací. Benzyliden diacetát může být ovšem syntetizován i přímým působením acetanhydridu na benzaldehyd.

Z chemické literatury je také dobře známa syntéza aryl - substituovaných benzyliden diacetátů ze substituovaných benzaldehydů. Tato oblast je velmi dobře popsána v některých standardních učebnicích organické chemie. Aktuální přehled a mnoho odkazů poskytuje Klausner a další, Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, E14a/1, 711-, Thieme, Stuttgart 1991. Následující odkazy vedou k některým klíčovým článkům: Knoevenangel, E., Justus Liebigs Ann. Chem. 402 (1914), Freeman, F. a Karachefski, E. M., J. Chem. Eng. Data 22 (1977), 355; Olah G. A. a Mehrotra, A. K., Synthesis (1982), 962; Kochar, K. S. a další, J. Org. Chem, 48 (1983), 1765; Cotelle, P. a Cotteau, J. P., Tetrahedron Lett. 33 (1992), 3855; Varma, R. S. a další Tetrahedron Lett. 34 (1993), 3207.

Určitá pozornost se rovněž věnuje použití různých druhů kyselých katalyzátorů. Bylo vypracováno použití kyseliny na pryskyřičném nosiči namísto běžných minerálních kyselin, protože pak lze vynechat zpracování vodné fáze (Olah, G. A. and Mehrotra, A. K., Synthesis (1982),962).

Náhradou acetanhydridu anhydridy různých karboxylových kyselin lze podobným způsobem připravit jiné benzylidenové diestery. Benzylidenové diestery se obecně nazývají acylaly, jako lingvistická analogie ke strukturně podobným acetalům.

Benzyliden dibenzoát byl již syntetizován: Wegscheider, R. and Spát, E. (Monatsch. Chem. 30 (1909), 825). Syntézu benzyliden dibutanoátu popisuje McKusick, B. C. (J. Am. Chem. Soc. 70 (1948), 1982) a Man. E. H. a další (J. Am. Chem. Soc. 72 (1950), 847).

Některé heterocyklické diacetáty jsou také známy z literatuiy. Diacetáty, odvozené od furfuralu nebo thiofen-2-karboxaldehydu, a jejich 5-nitro protějšky, jsou popisovány následujícími autory: Herman, E. C. (US. 2,680,117, 1. 6. 1954; Chem. Abstr. 1955,49, 6313b); Patric, T. M. a Emerson, W. S. (J. Am. Chem. Soc. 74 (1952), 1356; Freeman, D. a další, Aust. J. Chem. 29 (1976), 327 a Cymerman-Craig, J. and Willis, D. J. Chem. Soc. (1954), 1071.

Je rovněž možná syntéza acylalů se dvěma rozdílnými esterovými zbytky a podle: Klausener, A. a další (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, EI4a/l, 698, Thieme, Stuttgart 1991), se dá tohoto cíle dosáhnout nejlépe dvoustupňovou syntézou. V prvním kroku se připraví aryliden-alfa-halogenester a poté reaguje meziprodukt za obvyklých podmínek s karboxylovou kyselinou.

Kondenzace aldehydů s dikarboxylovými kyselinami za vzniku cyklických diesterů (acylalů) a kondenzace hydroxykarboxylových kyselin za vzniku cyklických alkoxyesterů (acylacetalů) se rovněž podrobně popisuje u: Klausener, A. a další (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, E14a/1, 716-, Thieme, Stuttgart 1991). Ačkoliv existují četné odkazy, které se zabývají alifatickými aldehydy, odpovídající benzylidenové deriváty se popisují zřídka. Syntézy některých benzylidenových dioxolanonů and benzyliden dioxanonů jsou z literatury nicméně známy. Příklady takových struktur se popisují u: Seebach, D. a další, Tetrahedron 40 (1984), 1313; Farines, M. and Souliers, J. Bull. Soc. Chim. Fr. (1970), 332; a Mashraqui, S. H: a další, J. Org. Chem. 49 (1984), 2513. Reakce se obvykle provádí v prostředí uhlovodíků a v průběhu kondenzace vytvořená voda se s výhodou oddestilovává jako azeotropní směs s rozpouštědlem.

-7CZ 286781 B6

Seebach a spolupracovníci upozornili na alternativní cestu pro přípravu některých obtížně získatelných dioxanonů. Hydroxykarboxylová kyselina se nejprve aktivuje jako bis— trimethylsilyl derivát a meziprodukt se potom uvede do reakce s aldehydem v přítomnosti 5 trimethylsilyl triflátu jako katalyzátoru. (Seebach. D. a další, Helv. Chim. Acta 70 (1987), 449).

Z uvedeného popisu je zřejmé, že některé látky, které jsou součástí předkládané patentové přihlášky, jsou z existující chemické literatury známy a mohou být snadno odborníky v oboru připraveny. Tak byly již například syntetizovány mnohé acylaly, zvláště typu benzyliden io diacetátu. Žádné z těchto látek však nebyly podle našich znalostí navrženy jako terapeutické prostředky pro léčení chorob, způsobených zvýšenou buněčnou proliferaci, zvláště rakoviny.

Acyklické deriváty podle předkládaného vynálezu mohou tedy být připraveny reakcí odpovídajícího aromatického nebo heterocyklického aldehydu sanhydridem karboxylové 15 kyseliny v přítomnosti kyselého katalyzátoru. Katalyzátorem může být minerální kyselina, například kyselina sírová, organická kyselina, například kyselina p-toluensulfonová nebo kyselina na pryskyřičném nosiči, například Nafíon NR 50.

Cyklické deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny kondenzací 20 odpovídajícího aldehydu s hydroxykarboxylovou kyselinou nebo trimethylsilylem aktivované hydroxykarboxylové kyseliny v přítomnosti vhodného katalyzátoru.

Reakce se běžně provádí v inertním rozpouštědle, jako je chlorid uhličitý, dichlormethan, pentan, toluen a podobně, nebo alternativně v přebytku anhydridu bez dalšího rozpouštědla.

Specifické reakční podmínky, rozpouštědlo a katalyzátor, které se v konkrétním případě použijí, závisí na rozpustnosti a reaktivitě reakčních složek a vlastnostech produktu.

Sloučeniny vzorce I, kde L je deuterium, se mohou připravit jak se popisuje výše z výchozích 30 aromatických nebo heterocyklických aldehydů, deuterovaných ve formylové poloze.

Následující příklady ilustrují, jak je možno sloučeniny podle vynálezu připravit. Koncentrace sloučenin v příkladové části jsou uvedeny v % hmotnostních, výtěžky produktů jsou uvedeny v % molámích.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Benzyliden diacetát

K roztoku benzaldehydu, chlazeného směsí led/voda (5.0 g, 0.047 mol) v přebytku acetanhydridu (50 ml), byla přidána konc. kyselina sírová (5 kapek). Po 1/2 hodině byla vodní lázeň odstraněna a reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po další 2 hodiny. Přebytek anhydridu byl potom odpařen a bezbarvý olejovitý zbytek byl destilován (140 až 145 °C / 1995 Pa.). Destilát po 45 stání ztuhl, teplota tání byla 45 až 47,5 °C. Výtěžek: 5,2 g, 53% teorie. NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,68 (s, 1H, CH(OAc)₂), 7,52 and 7,42 (m, 2+3H, Ar-H) a 2,15 (s, 6H, CH3).

Příklad 2. Benzyliden-di diacetát

Benzaldehyd-d] (10,0 g, 0,093 mol) a acetanhydrid (9,5 g, 0,093 mol) byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (10 ml) při 0 °C. Byl přidán Nafíon NR 50 (280 mg) a reakční směs byla 1/2 hodiny míchána. Lázeň voda/led byla odstraněna a reakce pokračovala při pokojové teplotě. Po 5 hodinách bylo přidáno navíc 0,95 g anhydridu a 300 mg katalyzátoru. Reakce byla po 24

-8CZ 286781 B6 hodinách přerušena odfiltrováním katalyzátoru (promytí etherem) a odpařením filtrátu. Zbytek byl destilován (teplota varu 135 až 136 °C /1995 Pa), a poskytl bílou pevnou látku, teplota tání 44,5 až 47,5 °C. Výtěžek byl 13,9 g, 71% teorie. *H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,53 a 7,43 (m, 2+3H, Ar-H) a 2,14 (s, 6H, CH₃); 168,743 C=O), 135,337, 129,726, 128,561 a 126,627 (Ar), ca. 89 (CD(OAc₂)) a 20,826 (CH₃).

Příklad 3. 3-Methylbenzyliden diacetát

V přebytku acetanhydridu (10 ml) byl rozpuštěn 3-methylbenzaldehyd (4,57 g, 0,038 mol) a za míchání byly přidány 4 kapky konc. kyseliny sírové. Směs byla ponechána reagovat při pokojové teplotě 1,5 hodiny. Poté byl přidán hexan (30 ml) a vzniklé dvě fáze dvakrát promyty 10% vodným roztokem NaHCO₃ (20 ml). Organické fáze byly vysušeny (MgSO₄) a odpařeny. Surový produkt byl destilován za sníženého tlaku (78 °C / 12 Pa) za vzniku bezbarvého oleje. Výtěžek byl 3,6 g, 43 % teorie. ’H- a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,66 (s, CH, CH(OAc)₂), 7,36-7,20 (m, 5H, Ar-H), 2,38 (s, 3H, Ar-CHJ a 2,12 (s, 6H, COCH₃); 168,695 (C=O), 138,304, 135,288, 130,434, 128,443, 127,180 a 123,621 (Ar), 89,690 (CH(OAc)₂), 21,270 (ArCH₃) a 20,778 (COCH₃).

Příklad 4. 4-Methylbenzyliden diacetát

V přebytku acetanhydridu (10 ml) byl rozpuštěn 4-methylbenzaldehyd (4,01 g, 0,033 mol) a za míchání bylo přidáno 5 kapek konc. kyseliny sírové. Výsledná směs byla ponechána reagovat 1,5 hodiny a přebytek acetanhydridu byl odstraněn odpařením. Zbytek byl promyt před rozpuštěním v acetonu 70 % ethanolem (20 ml), a zfiltrován přes lože silikagelu. Odpařením roztoku byly získány bílé krystaly, 2,56 g, 35 % teorie. ’H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,66 (s, 1H, CH(OAc)₂), 7,43 a 7,23 (q, 2+2H, Ar-H), 2,38 (s, 3H, Ar-CHj) a 2,12 (s, 6H, COCHj); 168,703 (C=O), 139,693, 132,519, 129,165 a 126,519 (Ar), 89,684 (CH(OAc)₂), 21,194 (ArCH₃) a 20,775 (COCH₃).

Příklad 5. 3-Nitrobenzyliden diacetát

3-nitrobenzaldehyd (20,0 g, 0,132 mol) a acetanhydrid byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (50 ml). Byl přidán Nafíon NR 50 (600 mg) a reakční směs byla míchána pod atmosférou N₂ při 35 °C přes noc. Byly přidány další 3,0 g anhydridu a reakční směs ponechána přes noc. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát odpařen. Destilační zbytek byl žlutý olej s vysráženými krystaly, které byly odfiltrovány (promytí studeným hexanem). Filtrát byl opět odpařen a zbytek rekrystalován z hexanu (900 ml). Produkt byly nažloutlé krystaly, teplota tání 67 až 70 °C. Výtěžek byl 21,1 g, 63 % teorie. ’H- a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. kTMS: 8,45-7,61 (m, 3xlH, Ar-H), 7,79 (s, 1H, Ar-CH(OAc)₂) a 2,19 (s, 6H, CHj); 168,583 (C=O), 148,344, 137,496,132,956, 129,742, 124,578, 121,881 (Ar), 88,337 (CH(OAc)₂) a 20,758 (CH₃).

Příklad 6. 4-Nitrobenzyliden diacetát

V chloridu uhličitém (25 ml) byly smíseny 4-nitrobenzaldehyd (10,0 g, 0,066 mol) a acetanhydrid (7,4 g, 0,073 mol). Byl přidán Nafion NR 50 (300 mg) a reakční směs míchána v atmosféře N₂ při 35 °C po několik dnů. Katalyzátor byl odfiltrován (promytí chloridem uhličitým) a filtrát koncentrován až do vytvoření nažloutlé sraženiny. Krystaly byly odfiltrovány, promyty etherem a použity bez dalšího čištění. Teplota tání byla 124 až 126 °. Výtěžek byl 4,6 g, 27 % teorie. ^!H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 8,27 a 7,71 (q, 2+2H, Ar-H), 7,74 ppm

-9CZ 286781 B6 (s, 1H, CH(OAc)₂) a 2,19 (s, 6H, CIL); 168,464 (C=O), 148,466, 141,819, 127,754 a 123,696 (Ar), 88,171 (CH(OAc)₂) a 20,599 (CH₃).

Příklad 7. 4-Kyanobenzyliden diacetát

4-kyanobenzaldehyd (10,0 g, 0,076 mol) a acetanhydrid (7,8 g, 0,076 mol) byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (15 ml). Byl přidán Nafíon NR 50 (300 mg) a reakční směs míchána v atmosféře N₂ při pokojové teplotě. Po 5 hodinách byly přidány další 4,0 g anhydridu, a reakční směs ponechána několik dnů. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát odpařen. Zbytek byl převeden do chloroformu (230 ml) a nezreagovaný výchozí materiál vysrážen přídavkem hexanu (100 ml) a odfiltrován. Filtrát byl odpařen a krok rozpouštění / srážení byl zopakován. Surový produkt byl nakonec překrystalován z etheru za vzniku bílých krystalů, teplota tání 104 až 107 °C. Výtěžek byl 5,9 g, 34 % teorie. *H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,72 a 7,63 (q, 2+2H, Ar-H), 7,69 (s, 1H, CH(OAc)₂) a 2,17 (s, 6H, CIL); 168,554 (C=O), 140,103, 132,442, 127,512, 118,166, 113,616 (Ar a C=N), 88,513 (CH(OAc)₂) a 20,737 (CH₃).

Příklad 8. 4-Fluorobenzyliden diacetát

4-fluorbenzaldehyd (10,0 g, 0,081 mol) a acetanhydrid (8,23 g, 0,081 mol) byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (10 ml). Byl přidán Nafíon NR 50 (300 mg) reakční směs míchána vN₂atmosféře při pokojové teplotě 21 hodin. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát odpařen za vzniku bezbarvého oleje, který stáním ztuhl. Tento surový produkt byl předestilován (kondenzátor s horkou vodou), teplota varu: 68,5 až 71,5 °C / 10 Pa. Produkt byla bílá pevná látka, teplota tání: 52 až 53,5 °C. Výtěžek byl 14,9 g, 82% teorie. ’NMR (CDC1₃) d (ppm) rel. k TMS: 7,67 (s, 1H, CH(OAc)₂), 7,52 a 7,11 (q, 2+2H, Ar-H) a 2,11 (s, 6H, CIL).

Příklad 9. 4-Karbomethoxybenzyliden diacetát

Ke směsi methyl-4-formyl benzoátu (10,0 g, 0,061 mol) a acetanhydridu (50 ml), chlazené ledem, byla přidána koncentrovaná kyselina sírová (5 kapek). Po opětném dosažení 0 °C, byla vodní lázeň odstraněna. Po 2 hodinách byla reakční směs odpařena a zbytek krystalizován z hexanu. První výtěžek byly kypré bílé krystaly s přijatelnou čistotou. Druhý výtěžek byl čištěn dále na koloně Lobar C silica column, a nejprve eluován směsí ethylacetát / hexan 1:10, potom směsí 1:1. (Teplota tání 64 až 67 °C). Celkový výtěžek (krystalizace a chromatografíe) byl 4,85 g, 30 % teorie. ^]H NMR (CDC1₃) d (ppm) rel. k TMS: 8,09 a 7,60 (q, 2+2H, Ar-H), 7,72 (s, 1H, CH(OAc)₂) a 2,14 (s, 1H, CH₃).

Příklad 10.4-Natriumkarboxybenzyliden diacetát

4-karboxybenzaldehyd (10,0 g, 0,067 mol) a acetanhydrid (35 ml) byly smíseny v Nr-atmosféře. Byl přidán Nafíon NR 50 (300 mg) a reakční směs byla míchána dva dny při pokojové teplotě. Katalyzátor byl odfiltrován a reakční směs byla zfíltrována a promyta etherem. Filtrát byl odpařen a míchán s 5% roztokem NaHCO₃ (100 ml). Pevná masa, která se nerozpustila, byla oddělena. Vodná fáze byla lyofilizována a čištěna na koloně Lobar C RP-8 reversed phase column, s elucí 10% methanolem ve vodě. Produkt, získaný z několika průběhů chromatografíe, byl lyofílizován a spojen, přičemž vznikl bílý kyprý prášek (1,0 g). *H NMR (D₂O), d (ppm) rel. k TMSP: 7,93 a 7,63 (q, 2+2H, Ar-H), 7,68 (s, 1H, CH(OAc)₂) a 2,19 (s, 6H, CIL).

-10CZ 286781 B6

Příklad 11. 3-Diacetoxymethylbenzyliden diacetát

Isoftalaldehyd (10,0 g, 0,075 mol) a acetanhydrid (16,7 g, 0,164 mol) byly smíseny v atmosféře N₂ v chloridu uhličitém (25 ml). Byl přidán Nafíon NR 50 a reakční směs míchána po několik dní při teplotě 30 °C. V průběhu této doby bylo přidáno další množství katalyzátoru (100 mg) a rozpouštědla (5 ml). Katalyzátor byl odfiltrován a zfiltrována byla rovněž reakční směs a promyta etherem. Surová pevná látka byla rekrystalována z cyklohexanu (540 ml), přičemž byly získány bílé krystaly, teplota tání 110 až 113 °C. Výtěžek byl 10,3 g, 41 % teorie. 'H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,72 (s, 1H, CH(OAc)₂), 7,70 - 7,42 (m, 1+2+1H, Ar-H) a 2,13 (s, 6H, CH₃); 168,591 (C=O), 135,908, 128,885, 128,047 a 124,879 (Ar), 89,072 (CH(OAc)₂) a 20,717 (CH₃).

Příklad 12. 3-Acetoxy-5-ethoxy-benzyliden diacetát

3- ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd (4,26 g, 0,025 mol) byl smísen s přebytkem acetanhydridu (10 ml). Přídavkem konc. kyseliny sírové (3 kapky), se barva směsi změnila z oranžové na temně červenou. Získaný roztok byl 3 hodiny míchán při pokojové teplotě. Reakční směs byla rozpuštěna v CH₂C1₂ a promyta vodným NaHCO₃. Organická fáze byla vysušena (MgSO₄) a odpařena. Surový produkt byl opakovaně rekrystalován z CHC1₃, a nakonec byla z CHC1₃ vysrážena přídavkem pentanu bílá krystalická látka. NMR spektroskopie ukázala, že produktem je 3-acetoxy-5-ethoxybenzyliden diacetát, který podle předpokladu vzniká acetylací a neočekávaným přeuspořádáním 4-hydroxyskupiny aldehydu. 'H a ¹³C NMR (CDC1₃) d (ppm) rel. kTMS: 7.61 a 7,25 (s+s, 1+1H, Ar-H), 7,12 (s, 2H, Ar-H+CH(OAc)₂), 4,11 (q, 2H, CH₃CH₂O), 2,25 (s, 3H, Ar-OCOCH₃), 2,10 (s, 6H, CHÍOCOCH^) a 1,35 (t, 3H, OCH₂CH₃) (CH(OCOCH₃)₂), 168,870 (Ar-OCOCH₃), 151,619, 142,068, 135,418, 123,697, 119,540 a 112,749 (Ar), 89,838 (CH(OAc)₂), 65,075 OCH₂), 20,669 (CH(OCOCH₃)₂), 20,389 (ArOCOCH₃) a 14,888 (OCH₂CH₃).

Příklad 13. Benzyliden-di-dibutanoát

Benzaldehyd-d] (10,0 g, 0,093 mol) a anhydrid kyseliny máselné (15,0g, 0,095 mol) byly rozpuštěny v atmosféře N₂ v chloridu uhličitém, byl přidán Nafion NR 50 a reakční směs byla míchána 3 dny při pokojové teplotě. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát odpařen. Zbytek byl destilován, přičemž poskytl bezbarvý olej, teplota varu 157 až 163 °C / 500 Pa. Výtěžek byl 17,7 g, 75 % teorie. 'HNMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,53 a 7,42 (m, 2H+3H, Ar-H), 2,38 (zdvojená t, 4H, COCHj), 1,69 (m, 4H, CHjCHjCHj) a 0,97 (t, 6H, CIL).

Příklad 14. 4-Natriumkarboxybenzyliden dibutanoát

4— karboxybenzaldehyd (8,6 g, 0,057 mol) a anhydrid kyseliny máselné (45 ml) byly smíseny v atmosféře N₂. Byl přidán Nafion NR 50 (300 Mg) a reakční směs byla míchána několik dnů při 30 °C. Během této doby byl přidán další katalyzátor (150 mg). Katalyzátor byl odfiltrován a zfiltrována byla i reakční směs a promyta hexanem. Filtrát byl odpařen a zbytek smísen s roztokem 5% NaHCO₃ (200 ml). Nerozpuštěná frakce byla odstraněna dekantací. Vodná fáze byla lyofilizována a čištěna na koloně Lobar C RP-8 reversed phase column, s elucí roztokem methanol / voda 1:1. Produkt z několika průběhů byl lyofilizován a spojen, přičemž bylo získáno 3,1 g bílého prášku. *H NMR (D₂O) d (ppm) rel. k TMSP: 7,95 a 7,63 (q, 2+2H, Ar-H), 7,73 (s, 1H, CH(OCOC₃H₇)₂), 2,43 (t, 4H, COCFL), 1,62 (m, 4H, CH^tbCHj) a 0,90 (t, 6H, CHj). ¹³C NMR (D₂O/dioxan) d (ppm) rel. kTMSP: 174.117 (CO₂Na), 173,434 (COC₃H₇),

-11CZ 286781 B6

137,970, 137,048, 129,352 a 126,146 (Ar), 88,499 (CH(OCOC₃H₇)₂), 35,476 (COCH₂), 17,810 (CH₂CH₂CH₃) a 12,779 (CH₃).

Příklad 15. Benzyliden dihexanoát

Benzaldehyd (26,3 g, 0,25 mol) a anhydrid kyseliny hexanové (53,3 g, 0,25 mol) byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (200 ml) v atmosféře N₂. K reakční směsi bylo přidáno katalytické množství kyseliny sírové a směs byla míchána při pokojové teplotě 1 hodinu. Reakční směs byla přes noc odpařena, zbytek rozpuštěn v hexanu a roztok zfiltrován přes lože oxidu křemičitého (silica). Filtrát byl přečištěn na koloně silica při eluci hexanem. Odpařením eluátu byl získán bezbarvý olej (14,0 g), 18% teorie. *H a ¹³C NMR (CDC1₃) d (ppm) rel. k TMS: 7,72 (s, 1H, CH(OC₅Hh)₂, 7,58-7,39 (m, 5H, Ar-H), 2,37 (zdvojená t, 4 H, COCH₂), 1,64 (m, 4H, COCHJHJ 1,30 (m, 4H, CH₂CH₂CH₃) a 0,88 (t, 6H, CH₃); 171,524 (C=O), 135,688, 129,523, 128,466 a 126,547 (Ar), 89,398 (CH(OC₅H_h)₂), 33,965, 31,030, 24,235 a 22,179 (CH₂) a 13,777 (CIL)

Příklad 16. 2-Furfuryliden diacetát

Furan-2-karboxaldehyd (4,85 g, 0,050 mol) byl rozpuštěn v přebytku acetanhydridu (10 ml). Přídavkem 2 kapek koncentrované kyseliny sírové roztok zčernal. Výsledná směs byla míchána při pokojové teplotě 5 hodin. Směs byla pak před promytím vodným roztokem NaHCO₃ zředěna CHC1₃. Organická fáze byla sušena (MgSO₄) a odpařena. Černý surový produkt byl rozpuštěn v diethyletheru a přečištěn aktivním uhlím. Kapalina byla odpařena a zbytek rozpuštěn v hexanu.' Nerozpustné nečistoty byly odstraněny a hexan byl odpařen, což poskytlo bílé nebo narůžovělé krystalky. Výtěžek byl 2,12 g, 21 % teorie. *H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,73 (s, 1H, CH(OAc)₂), 7,48, 6,55 a 6,41 (m, 3 x 1H, Ar-H), 2,14 (s, 6H, CHj); 168,308 (C=O), 147,751, 143,562, 110,276 a 109,639 (Ar), 83,328 (CH(OAc)₂) a 20,564 (CH₃).

Příklad 17. 5-Nitro-2-fiirfuryliden diacetát

Tato látka byl komerční vzorek, dodaný firmou FLUKA a byla použita bez dalšího čištění. Identita byla potvrzena analýzou NMR. Nejde o účinnou látku podle vynálezu.

Příklad 18. Thiofen-2-karboxaldehyd diacetát

Thiofen-2-karboxaldehyd (5,66 g, 0,050 mol) byl rozpuštěn v přebytku acetanhydridu (10 ml) a za míchání byly přidány 3 kapky konc. kyseliny sírové. Výsledná zelená směs byla ponechána reagovat za pokojové teploty 2,5 hodiny. Reakční směs pak byla zředěna CHC1₃ (25 ml) a potom dvakrát promyta 10% vodným roztokem NaHCO₃ (20 ml). Organická fáze byla vysušena (MgSO₄) a odpařena. Surový produkt byl rozpuštěn v hexanu, a nerozpustné nečistoty byly odstraněny. Khexanovému roztoku bylo přidáno aktivní uhlí, a tím byla získána bezbarvá kapalina. Odpařením rozpouštědla byly získány bílé nebo narůžovělé krystaly. Výtěžek byl 3,8 g, 35 % teorie. ’H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,93 (s, 1H, CH(OAc)₂) 7,49, 7,27 a 7,02 (m, 3 x 1H, Ar-H) a 2,12 (s, 6H, CHJ 168,386, 137,867, 127,179, 126,917 a 126,599 (Ar), 86,227 (CH(OAc)₂) a 20,663 (CH₃).

Příklad 19. Pyridin-3-karboxaldehyd diacetát

Pyridin-3-karboxaldehyd (5,45 g, 0,051 mol) byl za míchání rozpuštěn v přebytku acetanhydridu (10 ml) a za míchání byly přidány 4 kapky konc. kyseliny sírové. Výsledná

-12CZ 286781 B6 červená směs byla ponechána reagovat 7 dní při 70 až 75 °C. Ochlazená černě zbarvená reakční směs byla zředěna CHC1₃, dvakrát promyta 10% vodným roztokem NaHCO₃ a potom několikrát solankou. Organická fáze byla vysušena (MgSO₄) a odpařena. Černý reakční produkt byl rozpuštěn v CHC1₃ a nečistoty vysráženy přídavkem pentanu. Sraženina byla odstraněna. Roztok byl odpařen a zbylý produkt destilován (Kugelrohr) za sníženého tlaku (140 °C / 20 Pa) za vzniku bezbarvého oleje. ^]H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 8,80, 8,68, 7,83 a 7,37 (m, 4xlH, Ar-H), 7,73 (s, 1H, CH(OAc)₂) a 2,14 (s, 6H, CH3); 168,443 (C=O), 150,778, 148,154, 134,303, 131,172 a 123,253 (Ar), 87,988 (CH(OAc)₂) a 20,587 (CH₃).

Příklad 20. (2R,S)-Fenyl-l,3-dioxolan-4-on

K suspenzi kyseliny glykolové (7,6 g, 0,100 mol) v dichlormethanu (200 ml), byl přidán triethylamin (31,2 g, 0,22 mol) při 0 až 5 °C. Při stejné teplotě byl přidán trimethylchlorosilan (28,8 ml, 0,22 mol). Bílá suspenze byla 20 hodin míchána, zfiltrována a odpařena pro odstranění CH₂C1₂. Ke zbytku byl pro vysrážení Et₃NHCl přidán pentan (150 ml). Suspenze byla zfiltrována přes 5 pm filtr Millipore a odpařena. Frakční destilace surového produktu za sníženého tlaku (28 °C / 100 Pa) poskytla bezbarvou kapalinu přijatelné čistoty. Výtěžek byl 15.7 g, 71 % teorie. Totožnost takto vytvořené bis-(trimethylsilyl)glykolové kyseliny byla potvrzena NMR spektroskopií.

K roztoku s obsahem bis-(trimethylsilyl)-glykolové kyseliny (8,0 g, 36 mmol) a benzaldehydu (2,6 g, 24 mmol) v dichlormethanu (70 ml) bylo přidáno při -75 °C katalytické množství trimethylsilyl trifluormethansulfonátu (0.4 ml). Roztok byl při této teplotě míchán 20 hodin. Byl přidán pyridin (0,2 g, 2,5 mmol) a teplota ponechána stoupnout na teplotu místnosti. Po chromatografické separaci (silica / CH₂CL₂), byly zbylé nečistoty odstraněny odpařením za sníženého tlaku (67 Pa) při 20 °C po dobu 16 h. Výtěžek byl 2,5 g, 42 % teorie. *H a ¹³C NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. kTMS: 7,55-7,41 (m, 5H, Ar-H), 6,51 (s, 1H, Ar-CH) a 4,45 (q, 2H, Cíh); 171,122 (C=O), 134,521, 130,495, 128,669 a 126,328 (Ar), 105,155 (Ar-CH) a 64,137 (CH₂).

Příklad 21. (2R,S;5S)-2-Fenyl-5-methyl-l,3-dioxolan—4-on

Benzaldehyd (88,5 g, 0,834 mol) a L(+)-kyselina mléčná byly smíseny v toluenu (600 ml) v 1 1 trojhrdlé baňce, opatřené zachycovačem vody typu Dean-Stark. Bylo přidáno katalytické množství kyseliny p-toluensulfonové a reakční směs byla za míchání zahřívána přes noc pod zpětným chladičem. Reakční směs byla ochlazena a promyta v dělicí nálevce 10% roztokem NaHCO₃ (600 ml). Organická fáze byla vysušena (MgSO₄), zfiltrována a odpařena. Surový produkt byl rozpuštěn v etheru, a byl přidáván pentan, dokud se roztok nezakalil. Ochlazením v lázni aceton / suchý led, se vytvořila nažloutlá sraženina. Ta byla izolována (teplota tání 50 až 53 °C) a bylo ukázáno, že se jedná o směs 4:1 cis/trans izomerů shora uvedené sloučeniny. Výtěžek byl 12,4 g, 42 % teorie. *H- a ¹³C NMR (aceton-d₆), d (ppm) rel. k TMS: 7,65 - 7,46 (m, SH, Ar-H), 6,71 a 6,51 (s+s, 1H, Ar-C -H), 4,69 (q, 1H, OCHCH₃) a 1,52 (d, 3H, CH₃); 174,167 (C=O) 136,248, 131,322, 130,984, 129,473, 127,836 a 127,293 (Ar), 103,585 (Ar-CH), 72,519 (OCHCH₃) a 16,544 a 15,983 (CH₃).

Příklad 22. Benzyliden di-(alfa-chloroacetát)

Benzaldehyd (10,0 g, 0,094 mol) a chloracetanhydrid (16,1 g, 0,094 mol) byly rozpuštěny v chloridu uhličitém (50 ml) v atmosféře N₂. Byl přidán Nafion NR 50 (240 mg) a reakční směs míchána přes noc při 35 °C. Bylo přidáno další množství benzaldehydu (5,0 g) a katalyzátoru

-13CZ 286781 B6 (120 mg) a reakce pokračovala několik dnů. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát odpařen. Zbytek byl destilován za sníženého tlaku (teplota varu 123 až 125 °C / 10 Pa) za získání nažloutlého oleje, který stáním ztuhl. Výtěžek byl 7,9 g, 30 % teorie. *H NMR (CDC1₃), d (ppm) rel. k TMS: 7,75 (s, 1H, CH(OCO-)₂), 7,57 - 7,41 (m, 2+3H, Ar-H) a 4,14 (d, 4H, CHjCl).

Biologické experimenty

V následujících experimentech in vitro byla měřena rychlost syntézy proteinů pro známou sloučeninu, deuterovanou kyselinu natrium-5,6-0-benzyliden-di-L-askorbovou (zilascorb(²H)), stejně jako pro 14 sloučenin podle předkládaného vynálezu. Koncentrace reakčních činidel i bílkovin jsou uvedeny v % hmotnostních.

Způsoby kultivace buněk

Lidské buňky stabilizované linie NHIK 3025, pocházející z nádoru děložního krčku in šitu (Nordbye, K. a Oftebro, R., Exp. Cell Res., 58: 458, 1969; Oftebro, R. a Nordbye, K., Exp. Cell Res., 58: 459 - 460, 1969) byly kultivovány v médiu E2a (Puck a další, J. Exp. Med., 106: 145 - 165, 1957) doplněném 20 % lidským (připraveným v laboratoři) a 10 % koňským sérem (GIBCO).

Buněčná linie lidského plicního karcinomu A549 byla získána od Američan Type Culture Collection (ATCC CCL 185). Buňky byly kultivovány v médiu Eagles Minimum Essential Medium (D-MEM), v modifikaci Dullbecco's, doplněném 10 % teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem (GIBCO).

Buňky V79 3 79-A (Ford a Yerganian, J. Nati. Cancer Inst., 21: 393- 425, 1958) bylý poskytnuty od: Dr. Reversz, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden v roce 1976. Tyto buňky byly kultivovány v médiu Eagles Minimum Essential Medium (MEM), doplněným 10% novorozeneckým telecím sérem.

Buňky T-47D lidského karcinomu prsu (Keydar a další, Europ. J. Cancer, 15: 659 - 670, 1979) byly kultivovány v médiu RPMI 1640, doplněným 10 % fetálním telecím sérem.

Všechny buňky byly rutinně pěstovány jako monovrstvy v tkáňových kultivačních lahvích. Buňky byly udržovány v trvalém exponenciálním růstu častou rekultivací, tj. každý druhý nebo třetí den. Během rekultivace, stejně jako v průběhu experimentu, byly buňky v inkubátorech (stolních nebo komorových) při 37 °C.

Sféroidní růst byl iniciován trypsinací zásobní kultury, přičemž roztok trypsinu byl odstraněn centrifiigací (250 g) a vysetím přibližně 100 000 buněk do 25 cm² plastové kultivační tkáňové láhve (NUNC, Dánsko), obsahující 12 ml média (Wibe a další, Cell Tissue Kinet., 14: 639 - 651, 1981). Láhvemi pak bylo kýváno (30 period za minutu) 24 hodin na kývavé plošině (Rotaiy, Mixer, Labinco, Nizozemí) při 37 °C. Konstantní pohyb zabránil přichycení buněk na dno láhve a buňky tvořily agregáty, které sestávaly z 10 až 100 buněk. Po 24 hodinách míchání byly agregáty převedeny do 75 cm² plastové tkáňové kultivační láhve, předem pokryté tenkou (1 ml na 25 cm²) vrstvou 1 % sterilizovaného agaru (Bactoagar, Difco, USA). Agarový povlak zabraňoval přichycení agregátů na dno láhve. Médium (50 ml na láhev) bylo během růstové periody měněno 3x týdně. Po jednom týdnu růstu bylo 200 sféroidních shluků podobné velikosti z jedné láhve vyjmuto s použitím Pasteurovy pipety. Růst objemu sféroidů byl měřen přenesením jednotlivých sféroidů do jamek (průměr 16 mm), pokrytých agarem (0,15 ml) na plastických tkáňových kultivačních miskách (Falcon, Oxnard, USA), 1 sféroid na jamku. Médium bylo vyměňováno denně. Dva na sebe kolmé průměry sféroidů byly měřeny s použitím kalibrovaného okulárového měřítka mikroskopem s převráceným fázovým kontrastem. Průměrný objem byl

-14CZ 286781 B6 vypočten jako střední hodnota ze 48 sféroidů s použitím vzorce (p/6) x průměr³. Všechny objemy byly normalizovány tak, že objem těsně po začátku působení látky byl nastaven na 1.

Protirakovinné účinky byly testovány in vivo denním orálním podáváním roztoku testované sloučeniny žaludeční sondou. Byly použity samice bezthymové myši (BALB/C/nu/nu/BOM). Do každé myši ve věku 9 týdnů s průměrnou hmotností 25,5 ± 0,3 g byl podkožně do zadní části boku implantován tumor A549 lidského karcinomu plic nebo SK-OV lidského karcinomu vaječníků. Podávání léčiva začalo přibližně o 4 týdny později, když průměry tumoru byly 3 až 6 mm. Léčiva byla rozpuštěna v 0,9 % fyziologickém roztoku.

Syntéza proteinu

Rychlost proteosyntézy byla počítána podle popisu v: Ronning a další, J. Cell Physiol., 107: 47 57, 1981. Stručně, buněčný protein byl před experimentem označen do saturace během dvou až čtyřdenní preinkubace s [¹⁴C]valinem s konstantní specifickou radioaktivitou (1,85x10¹⁰ Bq/mol). Toho bylo dosaženo použitím vysoké koncentrace valinu, takže zředění [^I4C]valinu intracelulámím valinem a valinem, vzniklým proteolyticky, bylo zanedbatelné (Ronning a další, Exp. Cell Res., 123: 63 -72, 1979) a tak byla specifická radioaktivita udržena na konstantní úrovni. Rychlost proteosyntézy byla vypočtena z inkorporace [³H]valinu s konstantní specifickou aktivitou. Měření inkorporovaného [³H] byla vztažena na celkovou [¹⁴C] radioaktivitu v proteinu na začátku měřícího cyklu a vyjádřena v % za hodinu.

Výsledky

Inhibice proteosyntézy, indukované zilascorbem(²H) a 14 sloučeninami podle předkládaného vynálezu byla měřena pro několik savčích buněčných linií. Bylo měřeno několik koncentrací každé sloučeniny s 3 až 4 opakováními vzorku pro jednu koncentraci.

V obrázku 1 je ukázána rychlost proteosyntézy (jako % kontrolní rychlosti) v závislosti na koncentraci dvou nitrobenzylidenových diacetátů (sloučeniny 5 a 6) a jednoho nitrifuranu (sloučenina 17) u lidských buněk karcinomu děložního krčku NHIK 3025. Doba působení byla 1 hodina, během které obsahovalo buněčné kultivační médium navíc k testované sloučenině [³H]valin. Ve srovnání s účinkem známé sloučeniny zilascorb byla proteosyntéza třemi sloučeninami podle vynálezu inhibována v podstatě vyšší míře, přičemž nitrofuran (sloučenina 17) způsobil nejsilnější inhibici proteosyntézy.

V obrázku 2 je rychlost proteosyntézy (jako % kontrolní rychlosti) vztažena ke koncentraci nitrobenzyliden diacetátů (sloučenina 5), použitému při léčení lidského karcinomu prsu T-47D, kultivovaného in vitro. Podmínky působení jsou popsány v obrázku 1. Nitrobenzyliden diacetát (sloučenina 5) indukovala silnější inhibici proteosyntézy, než známá sloučenina zilascorb(²H).

V obrázku 3 je rychlost proteosyntézy (jako % kontrolní rychlosti) ukázána v závislosti na koncentraci 14 různých sloučenin, použitých při působení na buňky A549 lidského karcinomu plic, kultivovaných in vitro. Doba působení byla 1 hodina, během které buněčné kultivační médium obsahovalo navíc k testované sloučenině [³H]valin. V části A je ukázáno, že rychlost proteosyntézy je inhibována v podstatně větší míře působením benzyliden-dj-diacetátu (sloučenina 2) nebo jednoho ze dvou nitrobenzyliden diacetátů (sloučeniny 5 a 6) ve srovnání se známou sloučeninou zilascorb(²H).

V části B obrázku 3 je ukázáno, že rychlost proteosyntézy u buněk A549 lidského karcinomu plic je inhibována ve větší míře působením několika substituovaných benzyliden diacetátů (sloučenina 3,4, 8, 9) ve srovnání se známou sloučeninou zilascorb(²H).

-15CZ 286781 B6

V části C obrázku 3 je ukázáno, že rychlost proteosyntézy u buněk A549 lidského karcinomu plic je inhibována ve větší míře působením dioxanových derivátů (sloučeniny 20 a 21) ve srovnání se známou sloučeninou zilascorb(²H). Navíc rovněž acetoxybenzylidenové sloučeniny (sloučenina 11 a 12) inhibují proteosyntézu ve větší míře než známá sloučenina zilascorb(²H), přičemž sloučenina lije účinnější.

V části D obrázku 3 je ukázán vliv působení heterocyklické acetoxylové sloučeniny na proteosyntézu. Pyridinová sloučenina (sloučenina 19) indukovala podstatně větší inhibici proteosyntézy než známá sloučenina zilascorb(²H).

V obrázku 4 je ukázán účinek nitrobenzyliden diacetátu (sloučenina 5) na růst multicelulámích tumorových sféroidů in vitro. Z tohoto obrázku je vidět, že sloučenina 5 inhibuje růst sféroidů, tvořených plicními buňkami V79 čínského křečka, buněk NHIK 3025 lidského karcinomu děložního krčku a buněk T-47D lidského karcinomu prsu. Růst sféroidů všech tří typů buněk byl inhibován v závislosti na použité dávce, přičemž sféroidy T—47D jsou ke sloučenině 5 nejcitlivější.

Inhibice růstu tumoru in vivo denním podáváním benzyliden-dj-diacetátu (sloučenina 2) je ukázán na obr. 6. Část A obrázku ukazuje, že podávání 8,5 mg/kg benzyliden-d]-diacetátu (sloučenina 2) bezthymové myši s xenoimplantáty lidského karcinomu vaječníků SK-OV snižuje růst tumoru v podstatně větší míře než známá sloučenina zilascorb(²H), podávaná orálně v dávce 200 mg/kg. Další testovaný lidský tumor byl karcinom plic A549 (část B). Léčení myši orální dávkou 10 mg/kg sloučeniny 2 inhibovalo růst tumoru v podstatně větší míře než známá sloučenina zilascorb(²H), která měla na tento typ tumoru malý vliv.

Podávání

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu je možno podávat při léčbě rakoviny nebo při léčbě onemocnění, způsobených abnormálně zvýšenou buněčnou proliferací.

Pro tento účel mohou být sloučeniny vzorce I upraveny pro podávání pacientovi jakýmkoliv vhodným způsobem, buď samostatně nebo ve směsi se vhodnými farmaceutickými nosiči nebo pomocnými látkami.

Pro prostředky pro systémovou terapii je zvláště výhodná forma orálních prostředků nebo parenterálních prostředků.

Vhodnými enterálními prostředky budou tablety, kapsle, např. měkké nebo tvrdé želatinové kapsle, granule, zrna nebo prášky, syrupy, suspenze, roztoky a čípky. Ty se budou připravovat v oboru známými postupy míšením jedné nebo více sloučenin vzorce I s netoxickými, inertními, pevnými nebo kapalnými nosiči.

Vhodné parenterální prostředky pro sloučeniny vzorce I jsou injekce nebo infuzní roztoky.

Pokud se sloučenina podle vzorce I podávají místně, mohou být podávány jako omývací roztoky, mast, krém, gel, tinktura, sprej a podobně, přičemž sloučeniny vzorce I jsou obsaženy ve směsi s netoxickými, inertními, pevnými nebo kapalnými nosiči, obvyklými pro místní podávání. Je zvláště vhodné použít takových složení, která chrání aktivní složku proti vzduchu, vodě apod.

Prostředky mohou obsahovat inertní nebo farmakodynamicky účinné přídavné látky. Tablety nebo granuláty mohou například obsahovat řadu vazných prostředků, plnidel, nosných látek a/nebo diluentů. Kapalné prostředky mohou být například přítomny ve formě sterilního roztoku. Kapsle mohou obsahovat navíc k aktivní složce plnidlo nebo zahušťovací prostředek. Dále mohou být přítomny prostředky pro zlepšení chuti, stejně jako látky, které se obvykle používají

-16CZ 286781 B6 jako ochranné, stabilizující, udržující vlhkost a emulgující, soli pro změnu osmotického tlaku, pufry a jiné.

Dávky, ve kterých jsou prostředky podávány, se mohou lišit podle indikace, způsobu použití a cesty podávání, stejně jako podle potřeb pacienta. Obecně bude denní dávka pro systémovou terapii průměrného dospělého pacienta při potřebě protirakovinného léčení přibližně 0,1 až 500 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 2 až 200 mg/kg tělesné hmotnosti.

Denní dávka pro systémovou terapii průměrného dospělého pacienta při potřebě léčení zvýšené buněčné proliferace bude přibližně 0,1 až 50 mg/kg, s výhodou 1 až 15 mg/kg. Pro místní podání může vhodný roztok nebo mast obsahovat od 0,1 do 50% hmotnostních farmaceutického prostředku, s výhodou 1 až 20 %.

V případě potřeby může farmaceutický prostředek s obsahem sloučeniny podle vzorce I obsahovat antioxidant, například tokoferol, N-methyl-tokoferamin, butylovaný hydroxianisol, kyselinu askorbovou nebo butylovaný hydroxytoluen.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek pro léčení zhoubných nádorů a onemocnění, způsobených abnormálně zvýšenou buněčnou proliferací, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje sloučeninu obecného vzorce I

   O //

   0-C-Y /

   Ar-C-L (¹) \

   O-Z kde

   L znamená vodík nebo deuterium,

   Ar znamená fenyl, 5-členný heterocyklický kruh s jedním heteroatomem ze skupiny O nebo S nebo 6-členný heterocyklický kruh, obsahující jako heteroatom jeden atom dusíku, přičemž aromatický kruh je popřípadě mono- nebo disubstituován stejnými nebo odlišnými substituenty ze skupiny C^alkyl, C^alkenyl, C₂_6 alkinyl, CF₃, atom halogenu, nitroskupina, kyanoskupina, skupina OR, kde R znamená deuterium, Ci^alkyl nebo Ci^acyl, skupina CA(OR])₂, kde A znamená atom vodíku nebo deuteria a R] znamená Cj^alkyl nebo C]_6acyl, COR₂, kde R₂ znamená atom vodíku nebo deuteria nebo C í^alky 1, nebo COOR₂, kde R₂ má svrchu uvedený význam, přičemž v případě, že Y a Z společně netvoří kruh, má Ar význam, odlišný od nesubstituovaná fenylové skupiny,

   Y znamená atom vodíku nebo deuteria, Ci^alkyl, C₂_6alkenyl nebo C₂_6alkinyl, popřípadě substituované atomem halogenu,

   -17CZ 286781 B6

   Y znamená atom vodíku nebo deuteria, C i^alky 1, C₂_6alkenyl nebo C₂_6alkinyl, popřípadě substituované atomem halogenu,

   Z znamená Y nebo COY, přičemž Y a Z ve vzorci I jsou stejné nebo odlišné,

   Y a Z mohou také společně tvořit 5-členný kruh přes atom uhlíku, který je popřípadě mononebo disubstituovaný stejnými nebo odlišnými substituenty ze skupiny C^alkyl, C₂^alkenyl nebo C₂_6alkinyl nebo COOR₂, kde R₂ má svrchu uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, s výjimkou 5-nitro-2-furfuiylidendiacetátu.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I, kde Y znamená CH₃ a Z znamená COCH₃.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I, kde Ar znamená mono- nebo disusbtituovaný fenyl, přičemž stejné nebo rozdílné substituenty se volí ze skupiny CH₃, CF₃, F, NO₂, CN, CO₂CH₃, CH(OCOCH₃)₂ a CD(OCOCH₃)₂, kde D je deuterium.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I, kde Ar je nitrofuryl.
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I, kde Ar znamená fenyl.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu vzorce I, kde L znamená deuterium.