CZ200443A3 - Heterocyklické sloučeniny a jejich použití jakožto inhibitorů D@Ala@D@ala ligasy - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Nová třída heterocyklických sloučenin, které mají například antibakteriální vlastnosti. D-Ala-D-ala ligasa je enzym, který hraje kritickou úlohu při syntéze bakteriální buněčné stěny. Sloučeniny podle tohoto řešení se mohou vázat k D-Ala-D-ala ligase a inhibovat tak tento enzym. Účinek nových sloučenin podle řešení v kombinaci s jejich schopností procházet bakteriálními buněčnými membránami činí tyto sloučeniny vhodnými pro použití jakožto antibakteriální léčiva nebo při jiných antibakteriálních aplikacích.

• · · • · · • · · · · ·

Heterocyklické sloučeniny a jejich použití jakožto inhibitorů D-Ala-D-ala ligasy

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká heterocyklických sloučenin a jejich použití například při profylaxi a/nebo medicinální léčbě bakteriálních infekcí a jejich použití například jakožto antiseptických činidel, sterilizačních činidel nebo dezinfekčních činidel.

Dosavadní stav techniky

Patogenní procesy, při nichž mikroorganismy negativně působí na dané subjekty, jsou obecně složité a vyžadují definovanou sekvenci dějů, které zahrnují mnoho mikrobiálních složek. Pokud se uvedené procesy ponechají bez kontroly, může proliferace organismů poškodit daný subjekt, což může vést k vyvinutí chronické infekce nebo dokonce k úmrtí. Často je nezbytné podpořit obranné mechanismy pomocí exogenních faktorů, jako jsou antibiotika, za účelem odstranění infekčního organismu z daného subjektu.

Během doby a částečně také díky nerozvážnému použití existujících antibiotických léčebných režimů se organismy stávají stále více rezistentní vůči různým exogenním faktorům, které jsou v současné době k dispozici. Tak například byla popsána rezistence bakterií vůči fluorchinolonům a β-laktamům, přičemž je nanejvýš pravděpodobné, že během následující dekády tato rezistence ještě vzroste. V celosvětovém měřítku vzrůstá počet popsaných izolátů rezistentních na fluorchinolony, které • · • · · · · · · • · · · · · · · · · · ······ ·· · · · ····· způsobují infekční zápal plic. Dále byl zaznamenán vážný pokles citlivosti kmenů E. coli na β-laktamy (jako je například amoxicilin), přičemž tento pokles je způsoben přítomností enzymů R-TEM, a dále pokles citlivosti kmenů E. coli na kotrimoxazol a trimethoprim. Tyto zprávy jsou jen konkrétními příklady nutnosti a neustálé poptávky po objevení a vyvinutí nových antimikrobiálních léčiv za účelem zajištění alternativních a účinnějších léčebných režimů proti stále více rezistentním mikroorganismům.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká heterocyklických sloučenin, kompozic zahrnujících tyto sloučeniny a způsobů použití uvedených sloučenin a uvedených kompozic. Sloučeniny podle tohoto vynálezu a kompozice zahrnující tyto sloučeniny jsou vhodné pro léčení nemocí nebo symptomů nemocí. Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž způsoby přípravy sloučenin podle tohoto vynálezu a způsoby identifikace sloučenin s požadovanou biologickou aktivitou.

Předmětný vynález je založen na zjištění, že některé heterocyklické sloučeniny jsou potenciálně biologicky aktivní, konkrétněji že vykazují účinek proti enzymu označovanému jako D-alanyl-D-alaninlígasa (dále jen „D-Ala-D-Ala ligasa;

E.C. 6.3.2.4). Jak je schématicky znázorněno níže, předpokládá se, že D-Ala-D-Ala ligasa hraje kritickou roli při růstu bakteriální buňky, která spočívá v katalýze syntézy D-alanylD-alaninu (dále jen „D-Ala-D-Ala) , což je jeden ze stavebních bloků používaných pro síťování peptidoglykanu, jež je základem biosyntézy bakteriální buněčné stěny. Má se za to, že uvedený

4*4 *444 • · ·

4 4 4 · 4 • *44 • 4 enzym vytváří peptidovou vazbu, která nakonec po sesíťování peptidoglykanového rámce poskytuje místo transacylace (viz. publikace Ellsworth a spolupracovníci, Chemistry & Biology, 1996, 3, 37-44). Bez vazby na jakoukoli teorii týkající se mechanismu účinku nových sloučenin podle předmětného vynálezu se předpokládá, že tyto nové sloučeniny se vážou k D-Ala-D-Ala ligase v místě, ve kterém dochází k vázání adenosintrifosfátu (ATP) a ne v místě, ve kterém dochází k vázání D-Ala, což činí uvedené sloučeniny kompetitivními vůči ATP. V tomto ohledu se tedy sloučeniny podle předmětného vynálezu liší od ostatních inhibitorů D-Ala-D-Ala ligasy, jako jsou cykloserin a dipeptidfosfonátová analoga, což jsou kompetitivní inhibitory D-alaninu, o kterých se předpokládá, že se vážou k uvedenému enzymu v místě, ve kterém dochází k vázání D-alaninu.

UDP- NAM-tripeptid

9 9

9999 9 · • 9

99

9 9 9 99 9 9

9 • · · • · · · • ·9999 • 9 9

9

Obecně jsou předmětem tohoto vzorců (I a II) vynálezu sloučeniny obecných

a jejich použití.

Jedním aspektem předmětného vynálezu je sloučenina obecného vzorce

R² R³

R kde

A a B mohou nezávisle na sobě představovat atom dusíku nebo skupinu CR⁷, kde

R⁷ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu (jako je například atom vodíku, nebo substituovaná nebo nesubstituovaná, lineární, rozvětvená nebo cyklická alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina nebo alkarylová skupina, nebo derivát jedné nebo více z těchto skupin, ve kterém je jeden nebo • · ft··· ft · • ftft • ···* • ftft · ft · ftftft · ftft « · ftftft • ···· ftft · • ·· ·· ·· ♦ více atomů uhlíku a/nebo atomů vodíku nahrazeno heteroatomem (jako jsou například aminoskupiny, alkylaminoskupiny, hydroxylové skupina a alkoxylové skupiny, thiolové skupiny, halogeny, nitroskupiny, fenolové skupiny nebo jiné substituované aromatické nebo alifatické skupiny));

R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce

-NR⁵R⁶, kde

R⁵ a R⁶ mohou nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu;

R³ je atom vodíku, alkylová skupina, aminoskupina, hydroxylová skupina, alkoxylové skupina nebo alkylaminoskupina;

R⁴ představuje uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu;

s tou podmínkou, že (1) pokud obě skupiny A a B představují atomy dusíku a obě skupiny R⁵ a R⁶ představují atomy vodíku, potom skupina R⁴ nepředstavuje skupinu -NH₂, skupinu —N(H) (methyl), skupinu -N (H) (butyl), skupinu

-N(H)(hexyl), skupinu -N(H)(fenyl), skupinu

-N(H) (benzyl), skupinu -N (Η) (NH₂) , skupinu

-N (H) (CH₂CH₂OH) , skupinu -N (CH₂CH₂OH) ₂, fenylovou skupinu,

N-piperadinylovou skupinu nebo skupinu -S(ethyl);

(2) pokud skupina A představuje skupinu CH, skupina B představuje atom dusíku a obě skupiny R⁵ a R⁶ představují • ·

• · · · · · • · · · · · · · · • · ·· ··· ····· • · · · · · · atomy vodíku, potom skupina R⁴ nepředstavuje methylovou skupinu, isobutylovou skupinu, fenylovou skupinu,

4-methylfenylovou skupinu, 4-chlorfenylovou skupinu,

4-bromfenylovou skupinu, 2-(2,5-dimethoxyfenyl)ethylovou skupinu nebo skupinu -CH(OCH₃)₂; a (3) pokud obě skupiny A a B představují skupiny CH, potom skupina R⁴ představuje aminoskupinu, kterou není skupina -NH₂, (3,4-dichlorfenyl)methylaminoskupina nebo (3, 4-dichlorfenyl)methyleniminoskupina.

V některých případech představují obě skupiny R⁵ a R⁶ atomy vodíku.

Skupina R⁴ může například představovat substituovanou nebo nesubstituovanou, lineární, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, aralkylovou skupinu nebo alkarylovou skupinu. V některých případech skupina R⁴ obsahuje alespoň jednu arylovou skupinu. Tak například může skupina R⁴ představovat některou z následujících skupin:

• · · ···· · ·

R nebo R“ , ve kterých mohou skupiny R⁸ až R¹² nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu (jako je například lineární nebo rozvětvená alkylová skupina).

V dalším případě, kdy skupina R⁴ obsahuje arylovou skupinu, je strukturu sloučeniny podle tohoto vynálezu možné popsat obecným vzorcem 'N

R² R³

• · · · · · · ······ · · • · · · kde skupiny R⁸ až R¹⁶ mohou nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslíkobsahující funkční skupinu. Skupinou R⁹ pak může být například atom vodíku nebo methylová skupina.

V některých případech pak je možné strukturu sloučeniny podle tohoto vynálezu vystihnout obecným vzorcem

kde

n	ίθ	1, 2, 3 nebo 4; a
Rn	je R18	skupina obecného vzorce -NR18R19, ve které jsou skupiny a R19 nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující

atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu.

Skupinou R¹⁷ pak může v některých případech být jedna z následujících skupin:

OH

V alternativním provedení může skupina R⁸ představovat například skupinu - (CH₂) _nNR¹⁸R¹⁹, ve které n představuje číslo 1, 2, 3 nebo 4; a skupiny R¹⁸ a R¹⁹ mohou nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogena/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu.

• ·

V alternativním provedení může skupina R⁴ představovat například -CH₂0-arylovou skupinu, -CH₂S-arylovou skupinu, -CH=CH-arylovou skupinu nebo NH (CH₂-aryl)ovou skupinu, kde uvedenou arylovou skupinou může být jakákoli aromatická skupina obsahující buď jen atomy uhlíku a vodíku (jako je například fenylová skupina, naftylová skupina toluylová skupina) nebo i další atomy (jako je například pyrrolylová skupina, pyridylová skupina, oxazolylová skupina, chlorfenylová skupina, bromnaftylová skupina).

V alternativním provedení může skupina R⁴ představovat skupinu -N(CH3)R²¹, skupinu -N (CH2CH₃) R²¹, skupinu

-N (CH (CH₃) ₂) R²¹, skupinu -N (benzyl) R²¹, skupinu -CH2NH2, skupinu -NHCH2CH2NR²²R²³ nebo skupinu -CH2NHC (=0) R²², ve kterých mohou skupiny R²¹ až R²³ nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu. Ve specifických případech představuje skupina R²² atom vodíku a skupina R²³ představuje skupinu -C(=O)R²⁴, ve které skupinou R²⁴ je atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupina.

V dalších případech může být skupina R⁴ zvolena tak, že strukturu sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné popsat obecným vzorcem

kde

R²⁰ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu.

V jiných případech může být skupina R⁴ zvolena tak, že strukturu sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné popsat obecným vzorcem

nr²⁵r²⁶ kde

R²⁵ a R²⁶ představují nezávisle na sobě atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu. Skupina R²⁵ může například představovat atom vodíku, alkylovou skupinu, hydroxyalkylovou skupinu nebo aralkylovou skupinu a skupina R²⁶ může představovat haloalkylovou skupinu, hydroxylovou skupinu, skupinu C (=0) NR²⁷R²⁸, skupinu C (=0) OR²⁷ nebo skupinu NR²⁷R²⁸, ve kterých skupiny R²⁷ a R²⁸ mohou • · • ··· • · · · · · ···· · · · · · · · nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu. V alternativním případě může R²⁶ představovat skupinu -C(H) (aryl) (R²⁹) , ve které skupinou R²⁹ je atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupina. V některých případech obsahuje skupina R²⁹ alespoň jednu acylovou skupinu (jako je například karboxylátová, ketonová skupina, aldehydová skupina, esterová skupina, amidová skupina nebo thioesterová skupina). V těchto nebo jiných případech může uvedenou arylovou skupinou být naftylová skupina nebo benzothiofenylová skupina. Skupina R²⁹ může obsahovat α-hydroxykarboxylátovou skupinu (jako je například skupina -C(R)(OH)(COOR'), kde skupiny R a R' mohou představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogena/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu).

V dalším provedení se předmětný vynález týká sloučeniny obecného vzorce

kde

R¹ a R² jsou stejné nebo různé skupiny obecného vzorce

-NR⁵R⁶, ve kterých každá ze skupin R⁵ a R⁶ může nezávisle představovat atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu; a

R⁴ je aminoskupina, jiná než skupina -NH₂ nebo skupina

V dalším provedení se předmětný vynález týká způsobu inhibice D-alanyl-D-alaninligasy (D-Ala-D-Ala ligasy). Tento způsob zahrnuje stupeň, ve kterém se D-Ala-D-Ala ligasa vystaví působení sloučeniny obecného vzorce (I) nebo obecného vzorce (II)

kde

A a B mohou nezávisle na sobě představovat atom dusíku nebo skupinu CR⁷, kde

R⁷ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce -NR⁵R⁶, kde

R⁵ a R⁶ mohou nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu; a • ·

Φ··· ·

• · φφφ φ φ φ · · • ·

R³ a R⁴ mohou nezávisle na sobě představovat atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

s tou podmínkou, že obě skupiny R³ a R⁴ nepředstavují současně atomy uhlíku.

Obě skupiny R¹ a R² mohou představovat například skupiny

NH₂

V některých případech mohou skupiny R³ a R⁴ nezávisle na sobě představovat rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, -O-alkylovou skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu

-O-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -O-alkyl-OH, skupinu -NR⁷R⁸, skupinu -NR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-alkyl-COOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu -CONR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu -CONR⁷-alkyl-OH,

-S-alkylovou skupinu, skupinu -S-alkyl-COOH, skupinu -S-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -S-alkyl-OH, -O-arylovou skupinu, skupinu -O-aryl-COOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -O-aryl-OH, -S-arylovou skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -S-aryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷-aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-aryl-COOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH nebo skupinu -CH2NR⁵C6H4COOH; s tou podmínkou, že skupiny R³ a R⁴ nemohou simultánně představovat shodné rozvětvené nebo lineární alkylové skupiny; skupiny R¹ a R² mohou nezávisle na sobě, představovat atom vodíku, skupinu -NH2 nebo skupinu -NR^1;LR¹², přičemž alespoň jedna ze skupin R¹ a R² představuje skupinu -NH2; skupina R⁵ může představovat nižší • · · • ·

• · • « · • ··*· alkylovou skupinu (tj. alkylovou skupinu obsahující od 1 do 6 atomů uhlíku) , atom vodíku nebo skupinu -CH₂NR¹⁰C6H4CONHR⁶; kde R⁶ je -alkylová skupina, skupina -alkyl-COOH, skupina -alkyl-NH2 nebo skupina -alkyl-OH; skupiny R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ a R¹² mohou nezávisle na sobě představovat lineární alkylovou skupinu, rozvětvenou alkylovou skupinu, arylovou skupinu nebo acylovou skupinu, které mohou být případně substituované jednou nebo více funkčními skupinami na bázi kyslíku, dusíku, síry nebo halogenu; a skupinou A může být atom dusíku nebo skupina CH.

Inhibovaná D-Ala-D-Ala ligasa může obsahovat například sekvenci, která je z alespoň 90 procent shodná se sekvencí D-Ala-D-Ala ligasy z organismu kmene vybraného například ze skupiny zahrnující Escherichia coli, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Thíobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Buchnera aphidicola, Bacillus halodurans, Geobacter sulfurreducens, Rickettsia prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus thermophile, Thermotoga maritima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp. , Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Legionella * ·

4444 • · · • · ♦·· « · 9 9 9 /- ···*··«*· _L Ό 444 4 44 44 44 4 pneumophila, Leuconostoc mesenteroides_r Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Vibrio cholerae a Helicobacter pylori.

V dalším provedení se předmětný vynález týká způsobu léčby pacienta. Tento způsob zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému pacientovi podává účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I) nebo obecného vzorce (II)

4

4 4

9999

I II ve kterých A, B a R¹ až R⁴ mají shora definované významy.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek, který zahrnuje kteroukoli z výše popsaných sloučenin spolu s excipientem, který je vhodný pro podávání danému subjektu.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob léčení subjektu s bakteriální mikrobiální infekcí. Tento způsob zahrnuje podávání účinného množství výše popsaného farmaceutického prostředku uvedenému subjektu. Tímto subjektem může být například živočich, jako je savec (jehož příkladem je člověk, kůň, jehně, pes, kočka, králík, myš, potkan, kráva, býk, prase), pták (jehož příkladem je kuře, husa, krůta, kachna, slepice), ryba (jejímž příkladem je losos, pstruh, sumec, karas) nebo jiné hospodářské, společenské nebo okrasné zvíře.

V dalším provedení se předmětný vynález týká způsobu léčby pacienta. Uvedený způsob zahrnuje stupeň, ve kterém se pacientovi podává účinné množství kterékoli z výše popsaných sloučenin, a to případně spolu s vhodným nosičem.

Dále se tento vynález týká způsobu inhibice růstu bakterií v neživých systémech (jako je například sterilizace, dezinfekce nebo in vitro hubení bakterií). Tento způsob zahrnuje stupeň kontaktování daného systému (např. média, medicinálního zařízení, kuchyňského nebo koupelnového povrchu, operačního sálu) s takovým množstvím kterékoli z výše popsaných sloučenin, které je účinné pro inhibici bakteriálního růstu.

Při výběru sloučenin pro použití při nových způsobech podle tohoto vynálezu je možné použít několik parametrů.

Skupina těchto parametrů zahrnuje in vitro antibakteriální účinnost a spektrum účinku; fyzikálně-chemické vlastnosti, jako je lipofilicita a rozpustnost, bez omezení na tyto příklady. Farmakokinetické chování sloučenin podle předmětného vynálezu, jakož i jejich in vitro antibakteriální účinky jsou známkou toho, že sloučeniny podle předmětného vynálezu jsou vhodné jak pro profylaxi, tak pro medicinální léčbu subjektů s bakteriálními infekcemi a dále toho, že tyto sloučeniny mohou být použity jako antiseptika, sterilizační činidla nebo dezinfekční činidla.

• · · ··· ···

11 9 1 999 9 9 1 9 η Ο · ···· ·· ·· ··· · ···

Ιο 1 1 119 1111

911 1 91 11 19 9

Výrazem „halo, „halogen nebo „atom halogenu se v tomto textu rozumí atom fluoru, atom chloru, atom bromu nebo atom j odu.

Výrazy „alkylová skupina, „alkenylová skupina a „alkinylová skupina se v tomto textu rozumí uhlovodíkové řetězce, které mohou být lineární nebo rozvětvené a které obsahují uvedený počet atomů uhlíku, pokud je tento specifikován. Tak například specifikace „obsahující od 1 do 10 atomů uhlíku označuje, že daná skupina může obsahovat od 1 do 10 (včetně) atomů uhlíku nebo tato skupina může být i cyklická (a může obsahovat například jeden nebo více kruhů). Výrazy „kruh a „kruhový systém se v tomto textu označuje kruh obsahující uvedený počet atomů, přičemž těmito atomy mohou být atomy uhlíku nebo, tam kde je to uvedeno, heteroatomy, jako je atom dusíku, atom kyslíku nebo atom síry (jako je tomu například u heterocyklylových skupin). Samotný kruh, jakož i kterékoli substituenty na něm obsažené, může být vázán ke kterémukoli atomu, který umožňuje vytvoření stabilní sloučeniny.

Výrazem „aryl nebo „arylová skupina se v tomto textu rozumí monocyklický aromatický kruh obsahující 6 atomů uhlíku nebo bicyklický aromatický kruhový systém obsahující 10 atomů uhlíku, přičemž 0, 1, 2 nebo 3 atomy v každém kruhu mohou být substituovány. Jako příklad arylové skupiny je možné uvést fenylovou skupinu, naftylovou skupinu apod. a dále heteroarylové skupiny.

Výrazem „heteroaryl nebo „heteroarylové skupina se v tomto textu rozumí 5- až 8členný monocyklický, 8- až 12členný bicyklický nebo 11- až 14členný tricyklický kruhový systém obsahující v případě monocyklického systému 1 až 3 heteroatomy, v případě bicyklického systému 1 až 6 heteroatomů nebo v případě tricyklického systému 1 až 9 heteroatomů, přičemž uvedené heteroatomy jsou vybrané ze skupiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry, přičemž 0, 1, 2 nebo 3 atomy v každém kruhu mohou být substituovány. Jako příklad heteroarylové skupiny je možné uvést pyridylovou skupinu, furylovou skupinu nebo furanylovou skupinu, imidazolylovou skupinu, benzimidazolylovou skupinu, pyrimidinylovou skupinu, thiofenylovou skupinu nebo thienylovou skupinu, chinolinylovou skupinu, indolylovou skupinu, thiazolylovou skupinu apod.

Výrazem „heterocyklyl nebo „heterocyklylová skupina se v tomto textu rozumí nearomatický 5- až 8členný monocyklický, 8až 12členný bicyklický nebo 11- až 14členný tricyklický kruhový systém obsahující v případě monocyklického systému 1 až 3 heteroatomy, v případě bicyklického systému 1 až heteroatomů nebo v případě tricyklického systému 1 až 9 heteroatomů, přičemž uvedené heteroatomy jsou vybrané ze skupiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry, přičemž 0, 1, 2 nebo 3 atomy v každém kruhu mohou být substituovány. Jako příklad hetecyklylové skupiny je možné uvést piperizinylovou skupinu, pyrrolidinylovou skupinu, dioxanylovou skupinu, morfolinylovou skupinu, tetrahydrofuranylovou skupinu apod.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají jen takové kombinace a varianty substituentů, které vedou ke vzniku stabilních sloučenin. Výrazem „stabilní se v tomto textu rozumí sloučeniny, které jsou natolik stabilní, aby byla umožněna jejich výroba a aby byla zachována integrita dané sloučeniny po dobu, jež • · postačuje pro použití uvedených sloučenin pro účely podrobně popsané v tomto textu (např. po dobu terapeutického nebo profylaktického podávání subjektu nebo pacientovi, nebo po dobu použití dané sloučeniny jakožto antiseptika, po dobu použití dané sloučeniny pro impregnaci obvazu rány, po dobu použití dané sloučeniny jakožto dezinfekčního činidla).

Pokud není definováno jinak, jsou všechny technické a vědecké výrazy použity v tomto textu ve významech běžně používaných zkušenými odborníky v oboru. Ačkoli je při praktickém užití předmětu tohoto vynálezu nebo provádění testů podle předmětného vynálezu možné použít metody a materiály podobné nebo ekvivalentní k metodám a materiálům popsaným v tomto textu, jsou dále v textu popsány vhodné metody a materiály pro uvedený účel. V případě jakéhokoli rozporu je rozhodující znění tohoto popisu, včetně definic v něm uvedených. Kromě toho, materiály, metody a příklady popsané v tomto textu je třeba považovat jen za ilustrativní a ne omezující z hlediska rozsahu tohoto vynálezu.

S předmětným vynálezem je spojeno několik výhod oproti dosavadním způsobům léčby. Tak například, sloučeniny podle tohoto vynálezu se vážou k D-Ala-D-Ala ligase s vysokou specificitou v místě, ve kterém dochází k vázání adenosintrifosfátu (ATP) a z výsledků biochemických testů vyplývá, že jsou kompetitivními vůči ATP. Některé sloučeniny popsané tímto vynálezem mají své funkční skupiny interagující s proteinem situované tak, že jsou schopné se vázat rovněž k jednomu nebo oběma místům D-Ala-D-Ala ligasy, ve kterých dochází k vázání D-alaninu. Tyto typy nových sloučeniny (označované jako bisubstrátové analogy) mohou mít dále zvýšenou selektivitu a účinnost, což přímo souvisí se schopností spojit vazebné místo ATP a vazebné místo D-Ala.

Některé sloučeniny podle předmětného vynálezu mohou být rovněž méně toxické než mnohá existující antibiotika. Nové sloučeniny podle předmětného vynálezu se specificky vážou k D-Ala-D-Ala ligase, což je enzym, jenž je přítomen v bakteriích, ale ne v lidských nebo jiných eukaryotických buňkách, takže nové sloučeniny podle tohoto vynálezu obecně neínterferují s biologickými systémy pacientů. Protože jsou peptidoglykany přítomné pouze v bakteriích a naopak nejsou vůbec přítomné v savčích buňkách, může specifická inhibice D-Ala-D-Ala ligasy vést k vysoce selektivnímu antibakteriálnímu účinku.

Kromě toho může být se sloučeninami podle tohoto vynálezu spojeno několik výhod z chemického a farmakologického hlediska v porovnání s existujícími sloučeninami, které se používají při léčbě bakteriálních infekcí. Mezi tyto výhody mohou spadat jak chemická, tak farmakologická stabilita, jakož i účinnost, různé rezistenční profily, různé profily selektivity a nižší míra vedlejších účinků. Účinnost a schopnost nových sloučenin podle předmětného vynálezu síťovat bakteriální buněčné membrány rovněž vede k tomu, že tyto sloučeniny se vhodně používají jako antibiotika. Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž spadá veterinární použití těchto sloučenin pro léčbu infekcí u ryb, drůbeže, dobytka, dalších jedlých zvířat, sportovních zvířat a společenských zvířat.

Sloučeniny podle předmětného vynálezu vykazují silný širokospektrální účinek proti reprezentativní skupině mikroorganismů, která zahrnuje kmeny E. coli, S. aureus,

S. pneumoniae, H. influenzae a další. Tento širokospektrální účinek rovněž vyplývá z velmi těsné homologie D-Ala-D-Ala ligas uvedených 51 reprezentantivních kmenů mikroorganismů, přičemž struktura D-Ala-D-Ala ligasy pro každý z uvedených reprezentativních bakteriálních organismů je však díky evolučními vývoji odlišná. Nicméně jednotlivé sloučeniny skutečně vykazují vyšší účinek proti specifickým bakteriím, což rovněž vytváří prostor pro vývoj selektivních a úzce specifických činidel.

Další aspekty předmětného vynálezu a výhody spojené s tímto vynálezem budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a ze znění patentových nároků.

Předmětem tohoto vynálezu jsou specifické sloučeniny, jejichž příklady jsou popsány v tomto textu. Jeden aspekt předmětného vynálezu je tak tvořen kteroukoli ze sloučenin, jež jsou konkrétně popsány v tomto textu, včetně níže sloučenin obecného vzorce (I) a (II)

kde

A a B v obecném vzorci (I) nebo (II) představují nezávisle na sobě -N-, skupinu -CH- nebo skupinu -CR⁷-; a

R¹, R², R³, R⁴ a R⁷ jsou vybrány nezávisle na sobě.

φ φ φ

·· · · φ · · · · · · • ΦΦΦ · φ · φ · * φ · φφφφ

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možné syntetizovat běžnými postupy. Ve výhodném provedení se uvedené sloučeniny vhodně syntetizují ze snadno dostupných výchozích látek.

Obecně se sloučeniny zde popsaných obecných vzorců vhodně získávají způsoby znázorněnými na níže uvedených schématech a postupy popsanými dále v příkladech provedení vynálezu.

Jedním aspektem předmětného vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecných vzorců popsaných v tomto textu, který zahrnuje syntézu kteréhokoli jednoho nebo více meziproduktů znázorněných na níže uvedených syntetických schématech a následnou konverzi tohoto/těchto meziproduktu/meziproduktů na sloučeniny obecných vzorců popsaných v tomto textu. Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecných vzorců popsaných v tomto textu, který zahrnuje syntézu kteréhokoli jednoho nebo více meziproduktů popsaných v níže uvedených příkladech provedení vynálezu a následnou konverzi tohoto/těchto meziproduktu/meziproduktů na sloučeniny obecných vzorců popsaných v tomto textu. Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecných vzorců popsaných v tomto textu, který zahrnuje syntézu kteréhokoli jednoho nebo více meziproduktů popsaných v níže uvedených příkladech provedení vynálezu a následnou konverzi tohoto/těchto meziproduktu/meziproduktů na sloučeniny obecných vzorců popsaných v tomto textu, a to s využitím jedné nebo více chemických reakcí popsaných dále na syntetických schématech nebo v příkladech provedení tohoto vynálezu. Nukleofilní činidla jsou v dané oblasti techniky známá a jsou popsána v odborných chemických statích a monografiích citovaných v tomto textu. Skupina chemikálií používaných při výše zmíněných způsobech může zahrnoφ φφφ φφφ φ φ φ φ φφφ φ φφφ »··* · · φ · · · φ φ ·Φ·Φ φ φφφφ φφ φ • φφ Φ· φφ φ ·· φ vat například rozpouštědla, reakční činidla, katalyzátory, činidla pro zavádění a odštěpování chránících skupin apod.

Výše popsané způsoby mohou rovněž zahrnovat další stupně, které se provádějí buď před nebo po stupních, jež jsou konkrétně popsány v tomto textu a které slouží pro zavedení nebo odstranění vhodné chránící skupiny, čímž je v konečném důsledku umožněna syntéza sloučenin obecných vzorců popsaných v tomto textu.

Jak je zkušenému odborníkovi z oblasti organické chemie zřejmé, syntetická schémata v tomto textu nejsou určena pro zahrnutí úplného seznamu prostředků, kterými je možné syntetizovat sloučeniny podle předmětného vynálezu..Kromě toho shora popsané syntetické stupně mohou být provedeny v jiném pořadí za vzniku požadované sloučeniny. Chemické transformace a metodologie týkající se chránících skupin (chránění a odchránění), které jsou vhodné pro syntézu sloučenin popsaných v tomto textu, jsou v dané oblasti techniky známé a jejich skupina zahrnuje například reakce popsané v následujících publikacích:

R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH

Publishers (1989); T. W. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser a M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); M.B. Smith a J. March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5. vydání, Wiley Interscience (2001); a Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, (editor L. Paquette), John Wiley and Sons (1995), a v následujících vydáních těchto publikací.

• · ·* »· ·« » ·· · «·· · · » • c · · · ··· · · · · • ··»« ·· ·· · f » · ···· • · ···· « · · ··· « ·· ·· ·· ·

Při obvyklém postupu je možné sloučeniny podle tohoto vynálezu hromadně testovat na antibakteriální účinek proti mnoha různým bakteriálním kmenům. Sloučeniny se testují na sílu a šíři účinků proti různým kmenům za účelem identifikace potenciálních vedoucích sloučenin, tj. sloučenin s nej lepší účinností. Uvedené sloučeniny se mohou hromadně testovat na bakteriostatický účinek (tj. na schopnost bránit růstu bakterií) a/nebo na baktericidní účinek (tj. na schopnost hubit bakterie). Takto vybrané vedoucí sloučeniny mohou být dále optimalizovány, například změnou substituentů za vzniku odpovídajících derivátů. Uvedené deriváty se mohou připravovat po jednom nebo je možné je připravit pomocí metod paralelní nebo kombinatorické syntézy. Ve všech případech mohou být uvedené deriváty testovány pro zjištění údajů týkajících se vztahu mezi strukturou a účinností (SAR) dané sloučeniny, které mohou být dále použity pro další optimalizaci uvedených vedoucích sloučenin.

Návrh, syntéza a biochemické testování inhibitorů ligasy

Struktura analogů byla navržena s použitím různých přístupů, jejichž skupina zahrnuje tradiční medicinální chemii, systematické vytváření analogů (např. systematické testování analogů s různě dlouhými alkylovými řetězci, s isosterickými funkčními skupinami, různými aromatickými substituenty), cílování struktury zbytků s využitím rentgenové analýzy krystalové struktury, molekulové modelování a počítačové experimenty modelující aktivní místo, počítačovou analýzu diverzity a iterační zpětnou vazbu s. použitím výsledků biochemických experimentů. Uvedené analogy byly syntetizovány pomocí různých syntetických metod, jež byly dříve popsány v odborné litera• · · · · · túře zkušenými odborníky z oboru. Upravené analogy byly následně analyzovány zde popsanými biochemickými metodami, čímž byla získána data týkající se účinnosti jednotlivých analogů. Různé vzorky některých analogů jsou popsány v dalším textu.

Byly identifikovány různé substituenty v poloze 6 a 7 chinazolinů, pteridinů, pyridopyrimidinů a pyrimidinopyrimidinů, které vykazují silný inhibiční účinek vůči ligase. Následující tabulka 1 uvádí různé substituenty v poloze 6 a 7 které jsou schopné inhibovat ligasu (atomy vodíku nutné pro doplnění vaznosti atomů dusíku, kyslíku a uhlíku v jednotlivých sloučeninách nejsou zobrazeny, ale odborníkovi v oblasti organické chemie je zřejmé, že tyto jsou v uvedených sloučeninách přítomné).

Tabulka 1

• · ··· · · · · · · • · · · · · · 0 · · · · • ···· 0 0 ·· 0 · 0 0 0000 • · 0 · · · ···

0 0 0 0 0 0 · · · ·

Struktura	Ki (Ligasa E. coli)/μΜ
N nAA, 0Λ 1 |) ii Xx /¼ X <A Xh N N N	55
N μΛχν i X	20
N ΝΑγ^Ν XA,	12
N nX<U X X X XI ►Γ N N N ||X ΥΧ'ΌΙ	20
N N<\j^N wX^M^Xid^Xil.__Í N N N N \-;0	29
N nA/^n	14
N Chirální ΝΧγ^>Ν nAxAAK	16
nX/X X Αχ J N N N N 1	3
N nA^n X A A N N N	9

• · • · · · · • · · · · · · • · · · ♦ · · · ··· ······ ·· ··· ····

• 4

4 • ♦♦♦

4 4

4*444

Struktura	Ki (Ligasa E. coli)/μΜ
N 1
nTOTOm
nAAiAn'' 1	TO	1,00
N / 1 li
N^N^N^N' y		0,50
1 (
0—	fý
N N N N— ^=0 0	toto	8,7
N 1
nTO^N ,
	JU
N N N N N	V	0,13

Substituce N7 nižšími alkylovými skupinami

Za účelem zvýšení účinku daných sloučenin je možné připravit různé analogy vzniklé substitucí na N7 (substituent R1 v níže uvedené tabulce 2). Jako nejúčinnější nižší alkylové a cykloalkylové substituenty byly identifikovány tyto skupiny: methylová skupina, ethylová skupina, allylová skupina a cyklopropylmethylová skupina. Bylo možné provést substituci v a-poloze (substituent R2 v níže uvedené tabulce 2), přičemž v některých případech způsobila substituce skupinou CH₃ a C₂H₅ dramatické zvýšení účinku. Nebylo by nijak překvapující, kdyby i jiné substituenty v poloze R2 rovněž zvyšovaly účinnost inhibice ligasy. Substituce naftylového kruhu v poloze 4 vedla • · · • · · · · • · · · · · ke zvýšení účinku v případech, kdy tímto substituentem byl atom vodíku, skupina -CH3 nebo atom halogenu. Bylo zjištěno, že nahrazení naftylového kruhu různými heterocykly (například benzothiofenem) vede ke vzniku analogů, jež vykazují silný in vitro enzymatický účinek. V případě této série analogů byly R-oí-methylové stereoizomery výrazně účinnější než odpovídající racemáty. V případě S-a-methylové stereokonfigurace byly získány analogy s účinností na širší spektrum ligas, avšak k tomuto rozšíření spektra účinnosti došlo na úkor účinku proti ligase E. coli, jenž je sérii těchto analogů vlastní.

Tabulka 2

NH, m Γ AY-R3
N-Rl	R2	Chiralita R2	R3	Ligasa E. coli (μΜ)	Ligasa Staph (μΜ)
-ch3	-ch3	R/S	H	0,718	9,28
-ch3	-c2h5	R/S	H	0,452	4,60
-ch3	-ch3	R	H	0,326	26,80
-ch3	-ch3	R/S	-ch3	0,277	12,25
-ch3	-ch3	R/S	4,5-butylen	0,240	12,00
-ch3	-ch3	R/S	Cl	0,201	4,90
-ch3	-ch3	R	F	0,104	27,00
-ch2ch3	-ch3	R/S	F	0,257	19,00
-ch2ch3	-ch3	R/S	-ch3	0,210	38,50
-ch2ch3	-ch3	R	-ch3	0,102	71,00

• · · · · ·

nh2 mA^Am R2 (As R1 ^AR3
N-Rl	R2	Chiralita R2	R3	Ligasa E. coli (μΜ)	Ligasa Staph (μΜ)
-ch2ch=ch2	-ch3	R/S	H	0, 258	30,50
-CH2CH(CH2) 2	-ch3	R/S	H	0,345	17,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	Br	0,279	25,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	-ch3	0,211	37,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	Cl	0,179	29,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R	-ch3	0,174	62,00

β-alaninamidové analogy

Amidy syntetizované s použitím β-alaninové spojovací skupiny vykazují širokospektrální účinky. Nejúčinnšjším širokospektrálním inhibitorem identifikovaným v této sérii byl ethylendiaminamidový derivát (tj . první sloučenina z následující tabulky 3), jehož Ki pro ligasy E. coli a H. influenzae byla nižší než 1 μΜ; a účinek tohoto derivátu na ligasy S. aureus a S. pneumoniae, vyjádřený pomocí Ki, byl řádově v jednotkách μΜ (viz. tabulka 3). Bylo zjištěno, že hodnota Ki m-aminomethylbenzylaminového analogu (tj. třetí sloučeniny z tabulky 3) byla menší než 1 μΜ pro 3 ze 4 ligas použitých při daném testu účinnosti. Podobně poslední sloučenina v tabulce 3 byla účinná proti 3 z uvedených 4 druhů ligas. Čtvrtá sloučenina z tabulky 3, ve které byla primární aminoskupina nahraze• · na amidinovou skupinou, vykázala účinek podobný účinku první sloučeniny.

Tabulka 3

					Ligasa	Ligasa	Ligasa	Ligasa
					Ε. coli	H influenzae	Staph	Střep
Struktura			Ki/ATP	Ki/ATP	Ki/ATP	Ki/ATP
					(μΜ)	(μΜ)	(μΜ)	(μΜ)
					prům.	prům.	prům.	prům.
NH1 2	CH3
JO h2n n	^N 0 — ^N^N —		y	Λ	0,7	1,0	4,7	1,9
	/O
h2n	0
nh2	/
	0- N^N- (		Λ	~Λ	9,6	0,267	9,5	3,1
	)		Λ
	0==\ N— H		N
nh2	CH,
Λ J h2n nh2	^N 0— <		y	Λ	5,3	0,4	0,9	0,9
	H
nh2	CH,
JO h2n n h2n Γ- ΗΝ	0— N^N—'		y	Λ	ι,ο	0,6	6, 3	1,4
	0

• ·

Struktura	Ligasa E. coli Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa H influenzae Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa- Staph Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Střep Ki/ATP (μΜ) prům.
r Γ3/-λ h2n \—/ c4	1,9	1,3	3,8	4,1
NH2 /CH3 νΛ^ν o—- λΧλ h) H2N N N N—' \—/	8,7	1,6	1,2	1,6

Karboxylové kyseliny a α-hydroxykarboxylové kyseliny

První sloučenina z tabulky 4 byla použita ve formě směsi alespoň dvou stereoizomerů přečištěné vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Krystalová analýza komplexu protein-ligand vytvořeného z této sloučeniny odhalila přítomnost dvou stereoizomeru, jejichž stereochemická konfigurace byla stanovena jako (2-R, l'-S) a (2-S, l'-R). Číslo 2 označuje α-hydroxy polohu a číslo 1' označuje oí-methyl polohu. Uvedené dva izomery, které byly pozorovány, jsou enantiomerní, tj. jsou zrcadlovými obrazy jeden druhého. Účinnost poslední sloučeniny v tabulce 4 proti ligase E. coli byla 143 nM.

Uvedená sloučenina mělo poměrně široké spektrum účinků proti

H. influenzae (566 nM), Staph (4,1 μΜ) a Střep (2,6 μΜ).

Tabulka 4 ···· 0

Struktura	Ligasa E. coli Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa H influenzae Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Staph Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Střep Ki/ATP (μΜ) prům.
nh2 1 A JI X Η/Γ ^ν'^ΟΗ, •Ϊ HO 0	0,611	-	7,8	-
NH2 ,Clá hjXn^Xn-/ \—/ / OH	5, 3	3,7	6,7	2,1
nh2 Chirální HjN N N N HO 0	4,2	5,7	10	14,6
nh2 Chirální CH3 JX Xx H2N N N N η y h°„, ) xx HoX)	1,4	3,5	4,3	4,3

• · • · · • · · · · • · • · · · • ·

Struktura	Ligasa E. coli Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa H influenzae Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Staph Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Střep Ki/ATP (μΜ) prům.
NHj OH ΝΛγ^Ν Η0-γΧ0	0,143	0,566	4,1	2,6

Vztah mezi strukturou a účinností (SAR) pro N7-primární butylaminové analogy

Maximální in vitro účinnost pro tuto sérii analogů byla zjištěna v případě, kdy na dusíku N7 byl vázaný butylaminový řetězec (tj. v případě třetí sloučeniny z tabulky 5). α-Methylnaftylové chirální centrum může být nahrazeno achirálním 2-ethoxynaftylovým substituentem (viz. čtvrtá sloučenina z tabulky 5), přičemž je stále zachována vysoká účinnost proti ligase. Uvedená achirální sloučenina má širší spektrum účinku proti ligase a bylo zjištěno, že hodnota Ki pro tuto sloučeninu proti ligase izolované z kmene E. coli je 102 nM.

···· · ·

Tabulka 5

Struktura	Ligasa E. coli Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa H influenzae Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Staph Ki/ATP (μΜ) prům.	Ligasa Střep Ki/ATP (μΜ) prům.
		NH, I 2
	N'	A		CH,
Η2Ν'	Λ	J N	aA	||	XJ	2	2f7	58	439
				|l
			1 nh2
		NH, | 2
	N'	A	^N	CH,
	JI	J	.A.		jy			46	81,2
H2N'			N N	1	3	0,457	5,5
		H2N^
		NH, I 2
	N'	A	^N	CH,
		A	XN^N'		Jy
i 1^1 ’		y		0,135	4,2	32	23,1
			nh2
		NH, 1 2
	N'	A	^N		ιΆί
h2nz	Λ	J	xnA-		jy
		C> J	3	0,105	0,52	15	4,5
	f
	( H3C
			nh2

• * ··

• · • *·» ···· ·* ·· • · · • · · · · • · · · • · · ·· ··

Obecné syntetické postupy použité pro syntézu analogů podle tohoto vynálezu

Syntéza pyrimidopyrimidinů

Pyrimidopyrimidinové sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné připravit pomocí různých syntetických přístupů. Pyrimidopyrimidinový systém je možné syntetizovat v několikastupňové reakční sekvenci, při které se vychází z vhodně substituovaného amidinu (obecného vzorce R7-C=NHNH2) a R5-substituovaného alkoxymethylenmalonitrilu. Vzniklý kyanoaminopyrimidin může být kondenzován s guanidinem za vzniku pyrimidopyrimidinového kruhového systému. V případě, kdy skupina R7 v uvedeném kyanoaminopyrimidinu představuje atom chloru, atom bromu nebo -S-nižší alkylovou skupinu, mohou být tyto odstupující skupiny nahrazeny dusíkovými nebo kyslíkovými nukleofily za vzniku R7-N(nébo 0)-substituovaných alkylových nebo arylo39 • · ** ·· 49 4 * · · 4 4 9 9 9 4 «’ · · · · «·· · · 4 9 « ···· · » « · · · · · ···· ♦ · 4 4 4 4 4 4 4 vých meziproduktů. Tyto meziprodukty je možné cyklizovat na odpovídající pyrimidopyrimidiny substituované v poloze 7.

Další způsob syntézy 7-amino-substituovaných pyrimidopyri midinů zahrnuje nukleofilní atak aminů na 6-amino-2-brompyrimidin-5-karbonitril (jako odstupující skupina v poloze 2 může v tomto případě být použit i atom chloru nebo thiomethylová skupina nebo thioethylová skupina) a následnou cyklizaci vzniklého příslušně substituovaného kyanoaminopyrimidinu guanidinem.

Pokud není uvedený atakující, příslušně substituovaný nukleofilní amin komerčně dostupný, je možné jej připravit pomocí standardních metod používaných v organické chemii. Jednou z těchto standardních metod, které se používají při přípravě sloučenin podle předmětného vynálezu, je reduktivní aminace.

Při této všeobecně známé metodě kondenzuje aldehyd nebo keton s příslušně substituovaným aminem, a to v přítomnosti mírného redukčního činidla, jako je kyanoborohydrid sodný nebo kyanoborohydrid zinečnatý.

• · · · • · β-alaninamidy a oc-hydroxy-p-alaninamidy

R2

Amidy je možné syntetizovat reakcí odpovídajících karboxylových kyselin s různými primárními a sekundárními aminy.

Pro usnadnění tohoto adičního způsobu syntézy amidů je možné do reakční směsi přidat mnoho reakčních činidel popsaných v odborné literatuře. Do skupiny těchto reakčních činidel spadá karbonyldiimidazol (CDI), dicyklohexylkarbodiimid (DCC), HBTU, diethylfosforokyanidát a BroP.

Butylaminové analogy

Butylamínové analogy byly syntetizovány postupem zahrnujícím několik syntézních stupňů. Obecně lze tento postup popsat tak, že butandiamin, jehož jedna aminoskupina byla ochráněna Boc-skupinou, reagoval za podmínek reduktivní aminace za vzniku příslušně substituovaného naftylmethylaminu, jehož jedna aminoskupina byla ochráněna Boc-skupinou. Tento sekundární amin reagoval s 6-amino-5-kyano-2-halopyrimidinem, • · • · · · · • · · · · · · · • · · » · ····· • · · · · · • o · · · * · vzniklý meziprodukt byl cyklizován reakcí s guanidinem a po této cyklizaci následovalo odštěpení Boc-chránicí skupiny v kyselém prostředí, čímž byly získány odchráněné butandiaminové analogy.

Metody přímé substituce heterocyklu

HNR'R NH, R⁵ nebo HORK'

H₂N

Sloučeniny podle tohoto vynálezu lze připravit rovněž aromatickou nukleofilní substitucí odstupujících skupin v poloze 7 2,4-diaminopyrimidopyrimidinu. Skupina těchto odstupujících skupin (označených jako [LG] ) zahrnuje -Cl, -Br, —SCH₃, -SC₂H₅ a -N(CH₃)₃, bez omezení na tyto příklady. Uvedeným nukleofilem, jenž se používá při této substituci, může být -N-alkylová skupina, -N-arylová skupina nebo substitutované alkyl- nebo arylaminy, nebo -O-alkylová skupina, O-arylová skupina, nebo substituované alkoholy nebo fenoly.

Syntéza pterinových analogů

Obecně je možné 6- nebo 7-substituované pterinové analogy připravit reakcí aktivovaného reakčního činidla, jako je 6nebo 7-chlormethylpterin, s nukleofily, jako jsou aminy, přičemž je možné použít různé další metody popsané v odborné literatuře a jako syntetická reakční činidla pro přípravu 6nebo 7-substituovaných analogů je možné použít i jiné funkční skupiny vázané v poloze 6- nebo 7- pterinu, jako je brom• · methylová skupina, jodmethylová skupina, hydroxymethylová skupina, aktivovaná hydrodroxymethylová skupina, karbonylová skupina, aktivovaná karbonylová skupina, hydroxylová skupina, atom chloru, atom bromu nebo methylová skupina.

Výše uvedené obecné reakční schéma je možné použít pro syntézu širokého rozsahu 7-substituovaných pteridinových analogů. Obecně lze reakci popsat tak, že 7-chlormethylový derivát a příslušný amin spolu dostatečně dlouho reagují ve vhodném rozpouštědle, jako je N,N-dimethylformamid (DMF) nebo 2-methoxyethanol, přičemž doba nezbytná pro proběhnutí dané reakce se stanovuje analýzou reakční směsi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), pomocí chromatografie na tenké vrstvě (TLC) nebo pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR). Následně se odstraní uvedené rozpouštědlo a surový produkt se čistí vhodnou metodou, obvykle pak srážením, překrystalováním, opakovaným srážením vhodné soli bází, nebo pomocí chromatografie.

Farmaceutické prostředky, soli sloučenin podle tohoto vynálezu a prekurzory léčiv

Sloučeniny podle tohoto vynálezu, včetně sloučenin zde popsaných obecných vzorců jsou v tomto textu definovány tak, že zahrnují i jejich farmaceuticky přijatelné deriváty nebo deriváty, které jsou prekurzory léčiv. Výrazem „farmaceuticky • · 9

99 · ·· přijatelný derivát nebo derivát, který je prekurzorem léčiva se v tomto textu rozumí jakákoli farmaceuticky přijatelná sůl, ester, sůl esteru nebo jiný derivát sloučeniny podle tohoto vynálezu, který je po podání pacientovi schopen poskytnout (přímo nebo nepřímo) sloučeninu podle tohoto vynálezu. Zvlášť výhodnými deriváty a prekurzory léčiv podle tohoto vynálezu jsou ty deriváty a prekurzory léčiv, které zvyšují biologickou dostupnost sloučenin podle tohoto vynálezu po podání takovýchto sloučenin savci (například tím, že umožní aby orálně podaná sloučenina byla snadněji absorbována do krve) nebo které zvyšují přísun základní sloučeniny do biologického systému (např. do mozku nebo lymfatického systému) v porovnání se základními sloučeninami. Skupina výhodných derivátů, které jsou prekurzory léčiv, zahrnuje deriváty, ve kterých je skupina, jež zvyšuje rozpustnost ve vodě nebo jež aktivuje transport skrz střevní stěnu, vázaná ke sloučeninám obecných vzorců popsaných v tomto textu. Jako konkrétní příklad je možné uvést případ, kdy se připravují esterové prekurzory léčiv, které mají analogům obsahujícím volnou karboxylovou skupinu napomáhat v absorpci a pronikání skrz buněčnou membránu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možné modifikovat navázáním vhodných funkčních skupin za účelem zlepšení vybraných biologických vlastností. Typy takovýchto modifikací jsou v dané oblasti techniky známé a jejich skupina zahrnuje modifikace za účelem zvýšení biologické penetrace dané sloučeniny do daného biologického systému (jako je například krev, lymfatický systém, centrální nervový systém), za účelem orální dostupnosti dané sloučeniny, za účelem zvýšení rozpustnosti pro umožnění injekčního podávání dané sloučeniny, za účelem změny metabolismu dané sloučeniny a za účelem změny rychlosti vylučování dané sloučeniny.

Skupina farmaceuticky přijatelných solí sloučenin podle tohoto vynálezu zahrnuje soli odvozené od farmaceuticky přijatelných anorganických a organických kyselin a bází. Jako konkrétní příklad vhodné soli odvozené od kyseliny je možné uvést acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzensulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, kafran, kafrsulfonát, cyklopentanpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, ethansulfonát, formiát, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, glykolát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, malonát, methansulfonát, 2-naftalensulfonát, nikotinát, nitrát, palmoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, fosfát, pikrát, pivalát, propionát, salicylát, sukcinát, sulfát, vínan, thiokyanát, tosylát a undekanoát. Ostatní kyseliny, jako je kyselina šťavelová, je možné použít při přípravě solí, které jsou vhodné jakožto meziprodukty při přípravě sloučenin podle tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí, a to i přes skutečnost, že samotné tyto kyseliny nejsou farmaceuticky přij atelné.

Skupina solí odvozených od příslušných bází zahrnuje soli alkalických kovů (například sodné soli), soli kovů alkalických zemin (například hořečnaté soli), amonné soli a N (alkyl) ₄ ⁺ soli. Do rozsahu tohoto vynálezu rovněž spadají kvarternizace kterýchkoli bazických, dusík-obsahujicích skupin sloučenin popsaných v tomto textu.

• · · · · ·

• · ·

Testy inhibice D-Ala-D-Ala ligasy

Inhibice D-Ala-D-Ala ligasy může být testována pomocí pyruvát kinasového/laktátdehydrogenasového (PK/LDH) testu popsaného v příkladu 2 a v odborné literatuře (např. v publikaci Sarthy a spolupracovníci, Anal. Biochem., 1997, 254, 288-290) . Při procesu syntézy bakteriální buněčné stěny katalyzuje ligasa konverzi adenosintrifosfátu (ATP) na adenosindifosfát (ADP) současně s ligací dvou zbytků D-alaninu za vzniku D-alanyl-D-alaninu. Pyruvátkinasa (PK) poté regeneruje ATP z ADP vzniklého při tomto procesu, přičemž zároveň dochází ke konverzi fosfopyruvátu na pyruvát. Laktátdehydrogenasa (LDH) katalyzuje redukci pyruvátu na laktát konverzí NADH na NAD⁺. Monitorováním rychlosti produkce NAD⁺ (např. pomocí UV/Vis spektroskopie) je možné stanovit aktivitu D-Ala-D-Ala ligasy.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu je možné hromadně testovat na procento inhibice jak je dále popsáno v příkladu 3.

Hodnotu inhibiční konstanty Ki a mechanismus účinku je možné zjistit postupem popsaným v příkladu 4.

Proteinová sekvence D-Ala-D-Ala ligasy byla stanovena v různých kmenech bakterií, a to s použitím standardních biochemických metod (viz. tabulka 5). Proteinovou sekvenci z kteréhokoli kmene je možné exprimovat ve vhodném hostitelském organismu, jako je E. coli, přičemž při této expresi se využívají standardní techniky používané v molekulární biologii.

• · · · · · · · · · ···· · ·

Daná ligasa může být izolována, přečištěna a použita při výše popsaných testech pro stanovení inhibičního účinku.

In vitro testy antibakteriálního účinku

Sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné s použitím standardních metod hromadně testovat na antibakteriální účinek. Při příkladu jednoho z těchto testů, který je popsán v příkladu 5, se používá technika mikroředění živné půdy za účelem měření in vitro účinku sloučenin podle tohoto vynálezu proti dané bakteriální kultuře, přičemž pomocí tohoto testu je možné zjistit hodnoty minimálních inhibičních koncentrací (MIC).

Mikrozřeďovací test antimikrobiálního účinku

Byly připraveny zásobní roztoky testovaných sloučenin v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) o koncentraci 5 miligramů/mililitr. Pracovní roztoky testovaných sloučenin byly připraveny z uvedených zásobních roztoků, a to v Muller-Hintonově živné půdě (MHB), přičemž výchozí koncentrace dané sloučeniny byla 64 mikrogramů/mililitr.

Bakteriální inokula byla připravena z kultury pěstované přes noc (tj. z čerstvé kolonie pěstované na agarovém platu v 5 mililitrech MHB; kmen H. influenzae byl pěstován v MHB s přídavkem kvasného extraktu, hematinu a NAD), která byla odstřeďována 2x5 minut při 3000 otáčkách za minut (v případě S. pneumoniae a H, influenzae 2 x 10 minut při 3000 otáčkách za minutu) a která byla rozředěna vždy v 5 mililitrech čerstvé živné půdy MHB tak, aby po naředění takto získané bakteriální ft ft • · ·««· · • ft

suspenze v jímce mikroplata (na celkový objem 100 mikrolitrů) bylo získáno 100 kolonii tvořících jednotek (CFU).

Jímky mikroplata byly plněny vždy 50 mikrolitry dvojnásobně ředěných roztoků testované sloučeniny, přičemž výchozí koncentrace testované sloučeniny byla vždy 64 mikrogramů/ mililitr. Poté byly jímky naplněny 50 mikrolitry bakteriálního inokula, takže konečný objem směsi obsažené v každé jímce činil 100 mikrolitrů. Plata byla inkubována 18 až 24 hodin při teplotě 37 °C (kmen S. pneumoniae byl inkubován v atmosféře obohacené oxidem uhličitým).

Poté byla pomocí přístroje TECAN SpectroFluor Plus® měřena optická hustota obsahu každé jímky při vlnové délce 590 nanometrů (OD590) a hodnota minimální inhibiční koncentrace (MIC) byla definována jako koncentrace, při které došlo k 90procentní inhibici růstu bakterií. V jednom z případů, který je ilustrován v příkladu 5, byla technika mikroředění živné půdy použita pro měření účinku sloučenin podle tohoto vynálezu proti dané bakteriální kultuře za účelem zjištění hodnot minimálních inhibičních koncentrací (MIC).

Antimikrobiální agarový zřeďovací test

Tento test byl proveden v podstatě tak, jak je popsán ve známé literatuře (viz. například publikace NCCLS. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Fourth Edition. NCCLS document Μ 11-A4.

NCCLS: Wayne, Pennsylvania; 1997).

• Φ ·» · · φφφ ··* ··· φφφ • φ φ · φφφφ φ φφφ • φφφφ φφ φφ φφφ φ φφφ • φ φφφφ φφφ • · · φ φφ · φ φφ φ

Agarové médium: Brucelový krevní agar doplněný heminem (v množství 5 mikrogramů/mililitr), 5 % ovčí krve a vitamínem Κχ (v množství 1 mikrogram/mililitr) .

Antimikrobiální činidla: Ze standardních antimikrobiálních prášků (jako je například azithromycin, chloramfenikol, nitrofurantoin, piperacilin, klindamycin, penicilín, imipenem) a testované sloučeniny byly připraveny zásobní roztoky (obsahující 5120 mikrogramů dané látky/mililitr Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF)) a tyto roztoky byly zředěny jak je uvedeno v tabulce 3 publikace NCCLS Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic bacteria; Approved Standard-Fourth Edition 1997; M11-A4, Vol.17 No 22.

Příprava inokula: Testovací anaerobní kmeny byly vybrány z obohaceného brucelového krevního agaru. Části pěti kolonií byly přímo suspendovány v brucelové živné půdě tak, aby bylo dosaženo turbidity odpovídající hodnotě 0,5 podle McFarlandova standardu.

Postup: Médium bylo připraveno podle instrukcí výrobce a bylo rozděleno do zkumavek se šroubovým uzávěrem. V den testu byla do příslušných zkumavek obsahujících agar zchlazený na teplotu 50 °C přidána krev a vždy 2 mililitry roztoku o dané koncentraci antimikrobiálního činidla. Vzniklá směs média a antimikrobiálního činidla byla vylita do standardních Petriho misek (o rozměrech 15 x 100 milimetrů) a ponechána ztuhnout.

Na každé plato byla inokulována kultura každého anaerobního kmene s předem upravenou turbiditou, přičemž k této inokulaci bylo použito replikační zařízení (objem každé nanesené kapičky byl přibližně 2 mikrolitry). Inokulovaná plata byla inkubována •··· · · • · • · · • ··· v anaerobní nádobě při teplotě 35 °C. Výsledky byly zaznamenávány po 48 hodinách inkubace a byly vyjádřeny jako hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC).

In vivo testy antibakteriálního účinku

Sloučeniny podle předmětného vynálezu je rovněž možné testovat na antibakteriální účinky v laboratorních zvířatech. Skupina těchto in vivo studií zahrnuje systemické a topické modely infekce, modely infekce močového traktu, modely sepse, antibiotiky zprostředkované kolitidy a péče o ránu, bez omezení na tyto příklady. Sloučeniny podle tohoto vynálezu je rovněž možné testovat ve zvířatech za účelem stanovení jejich farmakokinetických profilů, jako je například orální biologická dostupnost, orální absorpce, chemický poločas rozpadu, identifikace metabolitů, stanovení koncentrací v séru v různých časech po podání dané sloučeniny a rychlost vylučování dané sloučeniny.

Zvířecí model systemické bakteriální infekce

Systemické modely infekce jsou popsány v odborné literatuře. Pro testování sloučenin podle tohoto vynálezu je možné použít následující podmínky: Bakterie byly 24 hodin pěstovány v Muller-Hintonově agaru při teplotě 37 °C. Pro každý experiment se připraví bakteriální suspenze, a to tak, že se 4 až 5 bakteriálních kolonií inokuluje na Muller-Hintonovu živnou půdu (MHB) a tato se následně inkubuje 24 hodin při teplotě 37 °C, čímž je získáno přibližně 10⁹ CFU/mililitr. Samice myší BalbC se získají od společnosti Charles River. Zvířata se infikují podáním jedné dávky suspenze bakteriální kultury, • 4 ·

4·· 4

4 4 4 4

4 4 4 která odpovídá odpovídající LD_1Oo (tj. každému zvířeti je podáno 1 x 10⁸ CFU/100 mikrolitrů suspenze), do ocasní žíly. Myši se několikrát denně pečlivě klinicky vyšetřují a zaznamenávají se zřejmé klinické symptomy a mortalita. Počet přeživších zvířat se sleduje po dobu 6 dní. Azithromicin se rozpustí v 0,5procentním roztoku methocelu ve fyziologickém roztoku a vzniklý roztok se podává orálně. Testované sloučeniny se mikronizují pomocí třecí misky a tloučku a následně se rozpustí v roztoku methocelu ve fyziologickém roztoku s přídavkem 3 procent N,N-dimethylformamidu (DMF). První dávka se podává 30 minut po infekci a další dávky se podávají každých 12 hodin po dobu následujících 3 dnů.

Testy biochemických a fyzikálně-chemických vlastnosti

Heterocyklické sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné optimalizovat z hlediska jejich in vitro „antibakteriálního účinku, a to podle výsledků dvou typů metod, kterými jsou strukturální metoda a fyzikálně-chemická metoda. Danou chemickou strukturu je možné modifikovat použitím kombinací substituentů za vzniku sloučenin, které uspokojují všechna nebo některá z následujících kritérií: 1) vypočtená nebo experimentálně stanovená lipofilicita (logP) sloučeniny je v rozmezí od 0 do 2 jednotek logP; 2) sloučenina je substrátem pro D-Ala-D-Ala ligasu; 3) rozpustnost sloučeniny ve vodě je vyšší než 1 mikrogram/mililitr. Tyto fyzikálně-chemické a biochemické vlastnosti jsou faktory ovlivňující antimikrobiální účinky sloučenin podle tohoto vynálezu, které je možné pozorovat u daných subjektů (např. u zvířat).

Klinické použití heterocyklíckých sloučenin podle tohoto vynálezu

Sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné použít terapeuticky nebo profylakticky při léčení nebo prevenci bakteriálních infekcí a/nebo nemocí.

Předmětný vynález se rovněž týká například způsobu narušení vnitřní regulace mikrobiálního růstu u subjektu, který zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému subjektu podává sloučenina kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu nebo farmaceutická kompozice zahrnující sloučeninu kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu. V jednom provedení se předmětný vynález týká způsobu inhibice mikrobiální nebo bakteriální aktivity u subjektu, který zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému subjektu podává sloučenina kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu nebo farmaceutická kompozice zahrnující sloučeninu kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu. Ve výhodném provedení je uvedeným subjektem člověk nebo zvíře.

V jiném provedení se tento vynález týká způsobu léčby nemoci nebo symptomů onemocnění u subjektu, který zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému subjektu podává sloučenina kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu nebo farmaceutická kompozice zahrnující sloučeninu kteréhokoli z obecných vzorců popsaných v tomto textu. Ve výhodném provedení je uvedeným subjektem člověk nebo zvíře.

Infekce a infekční onemocnění jsou způsobeny různými mikroorganismy. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou nalézt ·* ·· ·· 9 • · 9 9 9 • ··· 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 999

9 9 9 9 9 ·· ♦· ·· · uplatnění medicinální léčbě infekčních onemocnění bakteriálního původu.

Sloučeniny, které hubí mikroorganismy nebo omezují růst mikroorganismů mohou nalézt uplatnění při léčbě infekcí a infekčních onemocnění. Je známo, že konkrétní bakteriální mikroorganismy jsou spojeny s určitým typem infekce nebo infekčního onemocnění. Příklady bakteriálních infekcí a patogenů, které je nejčastěji způsobují, jsou uvedeny v následujících odstavcích.

Skupina infekčních onemocnění horních a dolních cest dýchacích zahrnuje bronchitidu, sinusitidu, pneumonii, bolest v krku, chronické streptokokové infekce, difterii, akutní epiglotitidu, chřipku, chronickou bronchitidu, záněty středního ucha (otitis media), pneumonii, bronchopneumonii, legionářskou nemoc, atypickou pneumonii, černý kašel a tuberkulosu, bez mezení na uvedené příklady.

Skupina mikroorganismů způsobujících infekce dýchacích cest zahrnuje kmeny S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, H. influenzae, M. catarrhalis, N. meningitidis, B. pertussis, Enterobacteriaceae, anaerobes, Nocardia, Pseudomonas, C. psittaci, and C. diphtheriae, bez omezení na uvedené příklady.

Skupina infekcí močového traktu zahrnuje uretritidu, cystitidu, pyelonefritidu (zánět ledvin), asymptomatickou bakterurii, zánět močového měchýře, akutní uretrální syndrom a opakované infekce močového traktu, bez omezení na uvedené příklady.

Skupina mikroorganismů způsobujících infekce močového traktu zahrnuje kmeny E. coli, Próteus, Providentia,

Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Coag. neg.

Staphylococci, Enterococci a C. trachomatis, bez omezení na uvedené příklady.

···· · ·

Skupina kožních infekcí a infekcí ran zahrnuje erythrazmu, panarítium, impetigo, folikulitidu, erysipel, celulitidu a necrotizující fascitis, bez omezení na uvedené příklady.

Skupina mikroorganismů způsobujících kožní infekce a infekce ran zahrnuje kmeny Streptococci, Staphylococci,

P. aeruginosa, P. acnes, Clostridia, anaerobes, B. fragilis.

Skupina mikroorganismů způsobujících systemické infekce (bakteremie) zahrnuje kmeny Streptococci, Staphylococci, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Bacteroides sp., Neisseria, H. influenzae, Brucella, Lísteria a S. typhi, bez omezení na tyto příklady.

Skupina pohlavně přenosných nemocí bakteriálního původu zahrnuje adnexitidu, cervicitidu, chanchroidu, uretritidu, balanitidu, kapavku, lymphogranuloma venereum, syfilis a ingvinální granulom, bez omezení na tyto příklady.

Skupina mikroorganismů způsobujících pohlavně přenosné nemoci zahrnuje kmeny Chlamydia, N. gonorrhoeae, U. urealyticum, T. pallidium, G. vaginalis, H. ducreyi, C. granulomatis, Streptococci, Staphylococci a Enterobacteriae, bez omezení na tyto příklady.

« • ftftft · ft ft ft

•ft ftftft ····· ftftft ftft · • ·· ftft ·

Skupina gastrointestinálních infekcí bakteriálního původu zahrnuje infekce pocházející z potravy, kolitidu, enteritidu, žaludeční vředy, vřed na dvanáctníku, pankreatitidu, infekce žlučníku, choleru a tyfus, bez omezení na tyto příklady.

Skupina mikroorganismů způsobujících gastrointestinální infekce zahrnuje kmeny H. pylori, C. pylori, C. duodeni,

S. typhi, S. paratyphi, V. cholerae, anaerobes, Enterobacteriaceae, Staphylococci a Streptococci, bez omezení na tyto příklady.

Způsoby léčby pacientů

Heterocyklické sloučeniny zde popsaných obecných vzorců je možné podávat pacientovi, a to například za účelem léčby infekce, jako je bakteriální infekce. Heterocyklické sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné podávat například ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jako je fyziologický roztok, v kombinaci s jinými léčivy a/nebo spolu s vhodnými excipienty. Heterocyklické sloučeniny zde popsaných obecných vzorců mohou být podávány například injekcí, intravenózně, intraarteriálně, subdermálně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo subkutánně; nebo orálně, bukálně, nasálně, transmukosáině, topicky, v očním nebo ušním farmaceutickém přípravku nebo inhalačně, přičemž uvedená sloučenina se podává v dávce v rozmezí od přibližně 0,001 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti do přibližně 100 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti, výhodně v dávce od 10 miligramů/dávku do 5000 miligramů/dávku, která se podává každé 4 hodiny až každých 120 hodin, nebo podle požadavků konkrétního léčiva.

• β ««·· · * ♦ « ·« ·· • 9 9

4 444 • 4 9 4 4 • 9 9 9

44

9

4 4

4 9 4

9 4494

4 4

9

Jak je zkušenému odborníkovi zřejmé, může být třeba pacientovi podávat nižší nebo vyšší než shora popsané dávky sloučenin podle tohoto vynálezu. Konkrétní velikost dávky sloučeniny podle předmětného vynálezu a léčebné režimy pro konkrétního pacienta jsou závislé na různých faktorech, jejichž skupina zahrnuje účinnost konkrétně použité sloučeniny, věk pacienta, tělesnou hmotnost pacienta, celkový zdravotní stav pacienta, pohlaví pacienta, dietu pacienta, dobu podávání sloučeniny, rychlost vylučování sloučeniny, závažnost a průběh dané nemoci, daného stavu nebo symptomů, pacientovu dispozici k danému onemocnění, danému stavu nebo symptomům a posouzení ošetřujícího lékaře.

Po zlepšení pacientova stavu může být v případě nutnosti podávána udržovací dávka sloučeniny, kompozice nebo kombinace podle předmětného vynálezu. Později je možné v závislosti na symptomech snížit velikost dávky nebo frekvenci podávání dané sloučeniny nebo obojí, a to na požadovanou úroveň, která postačuje pro udržování zlepšeného stavu pacienta, a když uvedené symptomy ustoupí na požadovanou úroveň může být daná léčba úplně ukončena. Avšak u pacientů může být po opakovaném výskytu symptomů onemocnění třeba aplikovat dlouhodobou intermitentní léčbu.

V alternativním provedení se předmětný vynález týká způsobů léčení, prevence nebo tlumení symptomů nemoci u savce, který zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému savci podávají shora popsané farmaceutické kompozice a kombinace. Ve výhodném provedení je uvedeným savcem člověk. Pokud farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu zahrnuje jako aktivní složku pouze sloučeninu podle předmětného vynálezu, mohou uvedené « Λ ···« • · · · · · • · ··· · · · · ·· ·· · » · ··«·« * · · · · · · ·· ·* ·· r způsoby dále zahrnovat stupeň, ve kterém se uvedenému savci podává další terapeutické činidlo, jako jsou například makrolidová antibiotika (jejichž příkladem je klaritromycin), inhibitory protonové pumpy (jejichž příkladem je omeprazol), rifamyciny (jako je například rifampin), aminoglykosidy (jejichž příkladem je streptomycin, gentamycin, tobramycin), peniciliny (jako je například penicilín G, penicilín V, tikarcilin), inhibitory β-laktamasy, cefalosporiny (jako je například cefazolin, cefaklor, ceftazidim) a antimykobakteriální činidla (jako je například isoniazid, ethambutol).

Další vhodná činidla jsou uvedena ve statích a publikacích týkajících se infekčních onemocnění, jejichž skupina zahrnuje například publikaci Principles and Practice of Infectious Diseases, editoři G. L. Mandeli a spolupracovníci, 3. vydání, Churchhill Livingstone, New York, (1990). Uvedené další terapeutické činidlo může být savci podáno před, souběžně s nebo po podání farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu kteréhokoli obecného vzorce popsaného v tomto textu.

Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu zahrnují sloučeninu zde popsaných obecných vzorců nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl; další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující protirakovinové činidlo, antivirové činidlo, antifungální činidlo, antibiotikum; a farmaceuticky přijatelný nosič, pomocnou látku nebo vehikulum. Alternativní farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu zahrnují sloučeninu zde popsaných obecných vzorců nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl; a farmaceuticky přijatelný nosič, pomocnou látku nebo vehikulum. Uvedené kompozice mohou případně rovněž zahrnovat další terapeutická činidla, jejichž skupina zahrnuje například další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující protírá• · • · · • · · · ···· · · kovinové činidlo, antimikrobiálni činidlo, antivirové činidlo, antifungálni činidlo, inhibitor protonové pumpy a antibiotikum. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu obsahuji sloučeniny zde popsaných obecných vzorců a další terapeutická činidla, pokud jsou tato v nich přítomna, v množstvích, jež jsou účinná pro dosažení modulace mikrobiálních nebo bakteriálních hladin.

Výrazem „farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocná látka se rozumí nosič nebo pomocná látka, které mohou být podávány pacientovi spolu se sloučeninou podle tohoto vynálezu, přičemž nelikvidují farmakologický účinek sloučeniny podle tohoto vynálezu a nejsou toxické při podání v dávkách dostatečných pro dodání terapeuticky účinného množství dané sloučeniny podle tohoto vynálezu do organismu.

Skupina farmaceuticky přijatelných nosičů, pomocných látek a vehikul, které mohou být použity ve farmaceutických kompozicích podle tohoto vynálezu, zahrnuje měniče iontů, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitin, samoemulgační systémy pro dopravu léčiv (SEDDS), jako je d-a-tokoferolpolyethylenglykol 1000 sukcinát, povrchově aktivní látky používané ve farmaceutických dávkových formách, jako jsou produkty typu Tween nebo podobné polymerní matrice pro dopravu léčiv, sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin, pufrovací látky, jako jsou fosfáty, glycin, kyselinu sorbovou, sorbát draselný, směsi parciálních glyceridů nasycenných rostlinných mastných kyselin, vodu, soli neboli elektrolyty, jako je protamínsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidní oxid křemičitý, trikřemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, látky na bázi celulosy, póly• · · » * 9 9 « • · · · ·« ···· · · · · • · · · ethylenglykol, sodnou sůl karboxymethylcelulosy, polyakryláty, vosky, polyethylen-polyoxypropylenové blokové polymery, polyethylenglykol a lanolin, bez omezení na tyto příklady. Za účelem usnadnění dodávání sloučenin zde popsaných obecných vzorců do organismu je rovněž možné výhodně použít cyklodextriny, jako je α-, β- a γ-cyklodextrin, nebo jejich chemicky modifikované deriváty, jako jsou hydroxyalkylcyklodextriny, včetně 2- a 3-hydroxypropyl-3-cyklodextrinů.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu je možné podávat orálně, parenterálně, pomocí inhalačního spreje, topicky, rektálně, nasálně, bukálně, vaginálně nebo prostřednictvím implantovaného zásobníku, výhodně se pak farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu podává orálně nebo injekčně. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být vytvořeny ze sloučenin podle předmětného vynálezu v krystalické nebo nekrystalické formě. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jakékoli obvykle používané netoxické, farmaceuticky přijatelné nosiče, pomocné látky nebo vehikula.

V některých případech může být pH dané kompozice upraveno pomocí farmaceuticky přijatelných kyselin, bází nebo pufrů, a to za účelem zvýšení stability sloučeniny nebo její formy pro dodání do organismu obsažené v uvedené kompozici. Výraz „parenterální tak, jak je použit v tomto textu, v sobě zahrnuje subkutánní, intrakutánní, intravenózní, intramuskulární, intraartikulární, intraarteriální, intrasynoviální, intrasternální, intratekální, intralezionální a intrakraniální injekční nebo infúzní techniky.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou mít formu sterilního injikovatelného přípravku, jako je například • · · · · · sterilní injikovatelná vodná nebo olejnatá suspenze. Tyto suspenze je možné formulovat v souladu s postupy, které jsou v dané oblasti techniky známé a při kterých se používají vhodná dispergační nebo smáčecí činidla (jako je například činidlo Tween 80) a suspendační činidla. Uvedeným sterilním injikovatelným přípravkem může rovněž být sterilní injikovatelný roztok nebo suspenze v netoxickém, parenterálně přijatelném ředidle nebo rozpouštědle, jako je například sterilní roztok v 1,3-butandiolu. Mezi uvedená přijatelná vehikula a rozpouštědla, která je možné použít podle tohoto vynálezu, patří manitol, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Dále se jako rozpouštědlo nebo suspendační médium běžně používají sterilní netuhnoucí oleje. Za tímto účelem je možné použít jakýkoli nedráždivý netuhnoucí olej, včetně syntetických mono- a diglyceridu. Pro přípravu injikovatelných přípravků je možné použít mastné kyseliny, jako je kyselina olejová a její glyceridové deriváty, a rovněž tak přírodní farmaceuticky přijatelné oleje, jako je olivový olej nebo ricinový olej, a to zejména v jejich polyoxyethylovaných formách. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou rovněž obsahovat ředidlo nebo dispergační činidlo, kterým je alkohol s dlouhým řetězcem, nebo karboxymethylcelulosu nebo podobná dispergační činidla, která se běžně používají při formulování farmaceuticky přijatelných dávkových forem, jako jsou emulze a/nebo suspenze. Pro formulování kompozic podle tohoto vynálezu je možné použít i další běžně používané povrchově aktivní látky, jako jsou činidla typu Tween nebo Spán, a/nebo další podobná emulgační činidla nebo činidla pro zvýšení biologické dostupnosti, která se běžně používají při výrobě farmaceuticky přijatelných pevných, kapalných nebo jiných dávkových forem.

Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být podávány orálně v jakékoli orálně přijatelné dávkové formě, jejichž skupina zahrnuje kapsle, tablety, emulze a vodné suspenze, disperze a roztoky, bez omezení na uvedené příklady. V případě tablet pro orální použití patří mezi běžně používané nosiče laktosa a kukuřičný škrob. Do uvedených tablet se také obvykle přidávají lubrikační činidla, jako je stearát hořečnatý. Mezi vhodná ředidla pro použití v kapslích pro orální podávání patří laktosa a sušený kukuřičný škrob. Pokud se orálně podávají vodné suspenze a/nebo emulze, může být daná aktivní složka suspendována nebo rozpuštěna v olejové fázi a smíchána s emulgačními a/nebo suspendačními činidly. V případě potřeby mohou být do těchto farmaceutických kompozic přidána určitá sladící a/nebo chuťová a/nebo barvicí činidla.

Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu se mohou rovněž podávat ve formě rektálních čípků. Tento typ kompozic je možné připravit smícháním sloučeniny podle tohoto vynálezu s vhodným nedráždivým excipientem, jenž je pevný při teplotě místnosti, avšak který je kapalný při rektální teplotě, takže v rektu dochází k jeho rozpuštění a uvolnění daných aktivních složek. Skupina takovýchto materiálů zahrnuje kakaové máslo, včelí vosk a polyethylenglykoly, bez omezení na tyto příklady.

Topické podávání farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu je zvlášť vhodné pokud požadovaná léčba zahrnuje plochy nebo orgány snadno přístupné topickou aplikací. Pro topickou aplikaci na kůži by měla být farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu formulována ve formě vhodné masti obsahující aktivní složky suspendované nebo rozpuštěné v nosiči.

• · · · ·· · * • · · · • · ·

Skupina nosičů pro topické podávání sloučenin podle tohoto vynálezu zahrnuje minerální olej, kapalný petrolej, bílou vazelínu, propylenglykol, polyoxyethylenpolyoxypropylenovou sloučeninu, emulgační vosk a vodu, bez omezení na tento výčet. V alternativním případě je možné farmaceutickou kompozici podle tohoto vynálezu formulovat ve formě vhodného pleťového roztoku nebo krému obsahujícího aktivní sloučeninu suspendovanou nebo rozpuštěnou v nosiči spolu s vhodnými emulgačními činidly. Skupina vhodných nosičů zahrnuje minerální olej, monostearát sorbitanu, polysorbát 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a vodu. Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou být topicky aplikovány rovněž do spodní části intestinálního traktu, a to ve formě rektálních čípků nebo ve vhodné klystýrové formě. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i farmaceutické kompozice ve formě topických transdermálních náplastí.

Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu mohou být podávány ve formě nasálního aerosolu nebo inhalací. Tento typ kompozic se připravuje v souladu s postupy, které jsou v oboru formulování farmaceutických kompozic dobře známé, přičemž mohou být připraveny ve formě roztoků ve fyziologickém roztoku s použitím benzylalkoholu nebo jiných vhodných konzervačních látek, látek podporujících absorpci za účelem zvýšení biologické dostupnosti, fluoruhlovodíků a/nebo rozpouštěcích nebo dispergačních činidel, jež jsou v dané oblasti techniky známé.

Sloučeniny a kompozice podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro použití jako sterilizační činidla, antiseptika, pomocné • · · * ···· · · » · • ···· · · · · · · · ·».». • · · · · · · · ·

...........

látky (adjuvans) v obkladech ran (např. v bandážích) a jako pomocné látky při metodách čištění ran (žaludeční sondy atd.).

Při monoterapii a/nebo kombinační terapii za účelem prevence a léčby mikrobiálně zprostředkovaného onemocnění se vhodné používají dávky antimikrobiálních sloučenin popsaných v tomto textu v rozmezí od přibližně 0,01 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti a den do přibližně 100 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti a den, v alternativním případě se používají dávky v rozmezí od přibližně 0,5 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti a den do přibližně 75 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti a den (např. od přibližně 10 miligramů/dávku do 5000 miligramů/dávku). Obvykle se farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu podávají přibližně jednou až přibližně šestkrát denně nebo, v alternativním případě, ve formě kontinuální infúze. Uvedené podávání je možné použít jakožto trvalou nebo akutní terapii. Množství aktivní složky, které může být zkombinováno s nosičovými materiály za vzniku jediné dávkové formy, se mění podle léčeného subjektu a konkrétního režimu podávání. Typická farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu obsahuje od přibližně 5 hmotnostních procent do přibližně 95 hmotnostních procent aktivní sloučeniny. V alternativním případě obsahují uvedené farmaceutické kompozice od přibližně 20 procent do přibližně 80 procent aktivní sloučeniny. Pokud sloučeniny podle tohoto vynálezu zahrnují kombinaci sloučeniny kteréhokoli ze zde popsaných obecných vzorců a jednoho nebo více dalších terapeutických nebo profylaktických činidel, měla by každá z těchto složek, tj. sloučenina podle tohoto vynálezu a uvedené další činidlo, být obvykle přítomna v dávce odpovídající přibližně 10 až 100 procentům, výhodněji přibližně 10 až 80 procentům dávky normálně podávané při monoterapeutickém léčebném režimu. Uvedená další činidla se mohou podávat odděleně od sloučenin podle tohoto vynálezu jakožto část vícedávkového léčebného režimu. V alternativím případě mohou uvedená činidla být částí jediné dávkové formy a mohou být smíchána se sloučeninami podle tohoto vynálezu v jediné farmaceutické kompozici.

Ostatní použití

V alternativním provedení mohou být inhibiční sloučeniny popsané v tomto textu použity jako platformy nebo základní stavební prvky, které je možné využít při technikách kombinatorické chemie pro přípravu derivátů sloučenin podle tohoto vynálezu a/nebo chemických knihoven složených ze sloučenin podle tohoto vynálezu. Uvedené deriváty nebo knihovny mají antimikrobiální účinky a jsou vhodné pro identifikaci a navrhování sloučenin s antimikrobiálním účinkem. Kombinatorické techniky vhodné pro využití ve spojení se sloučeninami popsanými v tomto textu jsou v dané oblasti techniky známé a byly popsány například v publikaci Obrecht,

D. a Villalgrodo, J. M., Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998), přičemž jejich skupina zahrnuje syntézní postup označovaný spojením „split and pool (tedy „rozštěp a smíchej) nebo „paralelní syntézu, syntézu na pevné fázi a v roztoku a kódovací techniky (viz. například publikace Czarnik, A. W., Curr. Opin. Chem. Bio., 1, 60, (1997)). Jedno z provedení předmětného vynálezu se tak týká způsobu použití sloučenin zde popsaných obecných vzorců pro přípravu derivátů nebo chemických knihoven, který zahrnuje 1) obstarání tělesa obsahujícího mnoho jímek;

4 4 4

2) přidání jedné nebo více sloučenin obecných vzorců popsaných v tomto textu do každé jímky; 3) přidání další alespoň jedné chemikálie do každé jímky; 4) izolaci vzniklého jednoho nebo více produktů z každé jímky. V alternativním provedení se tento vynález dále týká způsobu použití sloučenin zde popsaných obecných vzorců pro přípravu derivátů nebo chemických knihoven, který zahrnuje 1) přípravu jedné nebo více sloučenin zde popsaných obecných vzorců navázané/navázaných na pevný nosič; 2) reakci uvedené/uvedených jedné nebo více sloučenin zde popsaných obecných vzorců navázané/navázaných na pevný nosič s jednou nebo více dalšími chemikáliemi; 3) izolaci vzniklého jednoho nebo více produktů z uvedeného pevného nosiče. Při shora popsaných způsobech mohou být ke sloučeninám zde popsaných obecných vzorců nebo jejich derivátům navázány a/nebo z nich mohou být odštěpeny „visačky, tj. identifikátory nebo značící skupiny, a to za účelem usnadnění sledování, identifikace nebo izolace požadovaných produktů nebo jejich meziproduktů. Povaha takovýchto skupin je v daném oboru známá. Skupina chemikálií používaných při shora popsaných způsobech může zahrnovat například rozpouštědla, reakční činidla, katalyzátory, chránící skupiny a činidla pro odštěpení chránících skupin apod. Příklady takovýchto chemikálií jsou popsány v různých statích a monografiích týkajících se chemické syntézy a zavádění chránících skupin, které byly citovány v předcházejícím textu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jedno nebo více asymetrických center a mohou tak existovat ve formě racemátů a racemických směsí, ve formě jediného enantiomeru, jednotlivých diastereoizomerů a ve formě diastereoizomerních směsí. Všechny tyto izomerní formy uvedených sloučenin spadají *···

..........

do rozsahu tohoto vynálezu. Sloučeniny podle předmětného vynálezu mohou rovněž existovat ve více tautomerních formách, přičemž v těchto případech zahrnuje tento vynález všechny tautomerní formy sloučenin popsaných v tomto textu (tak např. alkylace kruhového systému může vést k alkylaci na několika místech, přičemž do rozsahu tohoto vynálezu spadají všechny takovéto reakční produkty). Sloučeniny podle předmětného vynálezu mohou rovněž existovat v cis- nebo trans- nebo E- nebo Z- izomerních formách dvojné vazby. Do rozsahu tohoto vynálezu tak opět spadají všechny izomerní formy takovýchto sloučenin. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají rovněž všechny krystalické formy zde popsaných sloučenin.

Předmět vynálezu bude dále popsán pomocí následujících příkladů. Uvedené příklady slouží jen pro ilustraci a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Údaje týkající se kapalinové chromatografie byly získány pomocí kapalinového chromatografu Hewlett-Packard (HP)

Series 1090, který byl připojen k detektoru s diodovým polem, přičemž vlastní chromatografie byla prováděna za následujících podmínek: kolona Restek Allure C-18; velikost částic 5 mikrometrů; délka kolony 150 milimetrů; průměr kolony 4,6 milimetru; průtok 1 mililitr/minutu; gradientově eluce směsí 95 procent vody (obsahující 0,1 hmotnostního procenta kyseliny trifluooctové (TFA))/5 procent acetonitrilu (obsahující 0,1 hmotnostního procenta kyseliny trifluooctové (TFA)) až 100 procent acetonitrilu (obsahujícího 0,1 hmotnostního procenta kyseliny trifluoroctové (TFA)), přičemž k uvedené • · ·<·*· • w ·· • · ··· • · · · • · · ·· • Φ * • · φ « · · · • » φφφ φφφ ·· « změně polarity došlo během 8 minut, s následnou 3minutovou izokratickou elucí kolony; detekční vlnová délka 254 nanometrů. Hmotnostní spektra byla měřena buď na zařízení Agilent 1100 LC/MS nebo na LC/MS systému Thermofinigan AQA/Gilson.

¹H NMR spektra byla měřena na zařízení Bruker AC-300MHz. Střednětlaká mžiková chromatografie byla prováděna na systému Combiflash SglOOc od společnosti Isco, lne. Chromatografie na tenké vrstvě byla prováděna na plastových TLC platech EM Science silica gel 60 F₂54 · Teploty tání byly měřeny v otevřených kapilárách v zařízení Melttemp II. Pro detekci sloučenin na TLC platech bylo použito ultrafialové záření. Reakční činidla použitá při jednotlivých reakcích byla pořízena od společností Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) , Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA), Fluka Chemical Corp. (Milwaukee, WI, USA), Fisher Scientific (Pittsburg, PA, USA), TCI America (Portland, OR, USA), Transworld Chemicals, lne. (Rockville, MD, USA), Maybridge Chemical Ltd. (Londýn, Velká Británie) nebo od společnosti Lancaster Synthesis (Windham, NH, USA).

• · · · · · · • · · ···· · ··· ······ · · ··· · ···

Příklad 1

Syntéza inhibitorů ligasy

N7-Methyl-N7-(1-naftalen-l-ylpropyl)pyrimido[4,5-d]pyrimidin2,4,7-triamin

Sloučenina 1: K roztoku 4,25 gramu (27,2 milimolu) naftaldehydu ve 30 mililitrech suchého etheru bylo, který byl umístěn v ledové lázni, bylo pomalu přidáno 13 mililitrů (3 moly) roztoku ethylmagnesiumbromidu v etheru. Směs byla míchána dalších 30 minut při teplotě místnosti a následně rozložena 40 mililitry Imolární kyseliny chlorovodíkové. Organická vrstva byla promyta 20 mililitry vody, 2 x 20 mililitry nasyceného roztoku hydrogenuhličitanů sodného, 20 mililitry solanky a poté vysušena nad bezvodým síranem sodným. Odpařením této organické vrstvy byl získán surový produkt JL, který byl bez dalšího přečištění použit v následujícím reakčnim stupni.

Sloučenina 2: Surový produkt !_ byl rozpuštěn ve 30 mililitrech acetonu a ke vzniklé směsi, jež byla umístěna v ledové lázni, bylo pomalu přidáváno Joneovo činidlo až do trvale hnědého zabarvení reakční směsi. Roztok byl dále 15 minut míchán při teplotě místnosti a poté k němu bylo přidáno 5 mililitrů isopropylalkoholu. Po přidání 50 mililitrů ethylacetátu byla výsledná směs promyta 30 mililitry vody, x 30 mililitry nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, nasyceným roztokem chloridu sodného a organická vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným. Odpařením organických rozpouštědel byl získán olejovitý zbytek, který byl přečištěn chromatografií na sloupci silikagelu, čímž bylo získáno 4,01 gramu ketonu 2_.

Sloučenina 3: Ke směsi 4,01 gramu ketonu 2_ a 16,3 mililitru (2 moly) v methanolu bylo přidáno 1,61 gramu kyanoborohydridu sodného a 160 mililitrů chloridu zinečnatého. Vzniklá směs byla míchána přes noc při teplotě 50 °C a následně rozložena lmolární kyselinou chlorovodíkovou. Po odstranění většiny methanolu ve vakuu byl zbytkový roztok extrahován 2 x 15 mililitry dichlormethanu. Hodnota pH vodné vrstvy byla upravena pomocí 2molárního roztoku hydroxidu sodného na přibližně 9 a následně byl produkt extrahován 3 x 15 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly promyty nasyceným roztokem chloridu sodného a vysušeny nad bezvodým síranem sodným. Odpařením rozpouštědla bylo získáno 3,54 gramu sloučeniny ý.

Sloučenina 4: Směs 2,89 gramu (14,5 milimolu) pyrimidinu 11, 3,54 gramu (15 milimolů) sloučeniny 3 a 2,5 mililitru (18 milimolů) triethylaminu ve 25 mililitrech 2-methoxyethanolu byla 2 hodiny míchána při teplotě 80 °C. Výsledná směs

byla ochlazena na teplotu místnosti a odpařením rozpouštědla byl získán olejovitý zbytek. Tento zbytek byl rozpuštěn ve 30 mililitrech ethylacetátu a vzniklý roztok byl třikrát promyt vodou a vysušen nad bezvodým síranem sodným. Odpařením roztoku byl získán olejovitý zbytek, který byl přečištěn chromatografií na sloupci silikagelu, čímž bylo získáno 3,95 gramu produktu £ ve formě bílého prášku.

N7-Methyl-N7- (1-naftalen-l-ylpropyl) pyrimido [4,5-d] pyrimidin2,4,7-triamin

K roztoku 3,60 gramu sloučeniny 4_ ve 40 mililitrech 2-methoxyethanolu bylo přidáno 24 mililitrů lmolárního roztoku guanidinu v methanolu a 16 mililitrů l,5molárního roztoku CH₃ONa v methanolu. Směs byla 12 hodin míchána při teplotě 140 °C, přičemž během této doby z ní byl pomocí Dean-Starkova nástavce odstraňován methanol. Poté byla reakční směs ponechána zchladnout a odpařena ve vakuu, čímž byl získán olejovitý zbytek, jenž byl rozpuštěn ve 30 mililitrech methanolu. K uvedenému roztoku bylo pro vysrážení produktu přidáno 50 mililitrů vody. Vysrážený produkt byl následně přečištěn krystalizací z methanolu a překrystalovaný produkt byl třikrát míchán v methanolu. Tímto postupem bylo získáno 1,95 gramu produktu ve formě bílého prášku. Čistota tohoto produktu byla podle analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) vyšší než 99 procent.

N7-(1-Benzo[b]thiofen-3-ylethyl)-N7-methylpyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triamin

Směs 2,89 gramu (14,5 milimolů) pyrimidinu 11, 2,87 gramu (15 milimolů) methylaminu la a 2,5 mililitru (18 milimolů) triethylaminu ve 25 mililitrech 2-methoxyethanolu byla míchána 2 hodiny při teplotě 80 °C. Reakční směs byla ponechána zchladnout na teplotu místnosti a rozpouštědlo bylo odpařeno, čímž byl získán olejovitý zbytek. Uvedený zbytek byl rozpuštěn ve 30 mililitrech ethylacetátu a vzniklý roztok byl třikrát promyt vodou a vysušen nad bezvodým síranem sodným. Odpařením byl získán olejovitý zbytek, který byl přečištěn překrystalováním ze směsi ether/hexan. Bylo získáno 3,95 gramu produktu lb ve formě bílého prášku.

K roztoku 3,71 gramu sloučeniny la ve 40 mililitrech 2-methoxyethanolu bylo přidáno 24 mililitrů lmolárního roztoku guanidinu v methanolu s 16 mililitrů l,5molárního roztoku CH₃ONa v methanolu. Směs byla 12 hodin míchána při teplotě 140 °C, přičemž během této doby z ní byl pomocí Dean-Starkova nástavce odstraňován methanol. Poté byla reakční směs pone71 • · · · · · · · · · · ···· ·· ·· · · · · ··· chána zchladnout a odpařena ve vakuu, čímž byl získán olejovitý zbytek, jenž byl rozpuštěn ve 30 mililitrech methanolu. K uvedenému roztoku bylo pro vysrážení produktu přidáno 50 mililitrů vody. Vysrážený produkt byl následně přečištěn krystalizací z methanolu a překrystalovaný produkt byl třikrát míchán v methanolu. Tímto postupem bylo získáno 920 miligramů produktu ve formě bílého prášku. Čistota tohoto produktu byla podle analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) 98,52 procenta.

N7-Methyl-N7-[1-(4-methylnaftalen-l-yl)ethyl]pyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triamin

Pro přípravu N7-methyl-N7-[1-(4-methylnaftalen-lyl ) ethyl ] pyrimido [4 , 5-d] pyrimidin-2, 4 , 7-triaminu byl použit podobný postup jako pro přípravu N7-(1-benzo[b]thiofen-3ylethyl)-N7-methylpyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triaminu. Bylo získáno 860 miligramů konečného produktu ve formě bílého prášku, jehož čistota podle analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byla 98,80 procenta.

·· · » · · · · · · ··♦ · > · · · · · · ·· ·· ·· ·

Syntéza 7-amino-substituovaných pyrimidopyrimidinů (sloučenin obecného vzorce (IV))

Aminy obecného vzorce (II) byly připraveny reduktivní aminací 1-acetonaftenonu s odpovídajícími aminy (viz. schéma 2).

Schéma 2

o (IIC) « ·« ·· · « · · · · 9 · ·· · · · · · 9 9 9 9

9999 99 99 999 9 4999 fc 4 4 9 4 9 4 4

4 49 9 9 9 4 · (IIA) terč. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)ethyl] aminojethyl)karbamát

K roztoku 152 mikrolitrů (1 milimol) 1-acetonaftenonu ve 2 mililitrech acetonitrilu bylo přidáno 189 mikrolitrů (1,2 milimolu) terč. butyl-N-(2-aminoethyl)karbamátu, 126 miligramů (2 milimoly) NaBH₃CN a 136 miligramů (1 milimol) bezvodého chloridu zinečnatého. Reakční směs byla zahřívána v lékovce se šroubovým uzávěrem přes noc na teplotu 80 °C za neustálého míchání magnetickým míchadlem. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 2x5 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu s elucí 1. samotným dichlormethanem a 2. směsí dichlormethan/ methanol (10:0,1), čímž byl získán bílý voskovitý produkt, jehož množství odpovídalo výtěžku 77 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ^ΧΗ NMR; ¹³C NMR; MS (m/z) : 315 (MH⁺) .

(IIB) terč. butyl-N-(2—{[1-(1-naftyl)ethyl]aminoJpropyl)karbamát

K roztoku 152 mikrolitrů (1 milimol) 1-acetonaftenonu ve 2 mililitrech acetonitrilu bylo přidáno 209 mikrolitrů (1,2 milimolu) terč. butyl-N-(3-aminopropyl) karbamátu, 126 miligramů (2 milimoly) NaBH₃CN a 136 miligramů (1 milimol) bezvodého chloridu zinečnatého. Reakční směs byla zahřívána 70 hodin v lékovce se šroubovým uzávěrem na teplotu 80 °C za neustálého míchání magnetickým míchadlem. Vyloučená sraženina • · ····

• · · · · • · · · ·· ·· • · t • · * · • · · ····· • · · · ·« · byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 1x5 mililitry dichlormethanu. Organická vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu s elucí 1. směsí dichlormethan/methanol (10:0,1) a 2. směsí dichlormethan/methanol (10:1), čímž byl získán olejovitý produkt, jehož množství odpovídalo výtěžku 70 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ^XH NMR; ¹³C NMR; MS (m/z) : 329 (MH⁺) .

(IIC) terč. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)ethyl]aminojbutyl)karbamát

K roztoku 152 mikrolitrů (1 milimol) 1-acetonaftenonu ve 2 mililitrech acetonitrilu bylo přidáno 229 mikrolitrů (1,2 milimolu) N-Boc-1,4-diaminobutanu, 126 miligramů (2 milimoly) NaBH₃CN a 136 miligramů (1 milimol) bezvodého chloridu zinečnatého. Reakční směs byla zahřívána 55 hodin v lékovce se šroubovým uzávěrem na teplotu 80 °C za neustálého míchání magnetickým míchadlem. Vyloučená sraženina byla odfiltrována a filtrát byl odpařen. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 1x5 mililitry dichlormethanu. Organická vrstva byla vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu s elucí 1. směsí dichlormethan/methanol (10:0,1) a 2. směsí dichlormethan/methanol (10:1), čímž byl získán olejovitý produkt, jehož množství odpovídalo, výtěžku 80 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 343 (MH⁺) .

(IIIA) 4-amino-2-{ [4-aminoethyl) [l-naftyl)ethyl]amino}-5pyrimidinkarbonitril

Do lékovky se šroubovým uzávěrem bylo umístěno 199 miligramů (1 milimol) 4-amino-2-brompyrimidin-5-karbonitrilu,

377 miligramů (1,2 milimolu) terč. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)ethyl]amino)ethyl)karbamátu (IIA), 342 mikrolitrů (2 milimoly) N, N-díisopropylethylaminu (DIEA) a 2 mililitry 2-methoxyethanolu a tato směs byla 4 hodiny zahřívána na 150 °C. Z reakční směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 2x5 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn chromatografii na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol (10:0,1), čímž byl získán bílý amorfní produkt.

• · • · · ·

K uvedenému amorfnímu produktu byl přidán 1 mililitr studeného 50procentního roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu a vzniklá směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. Roztok byl odpařen, k surovému produktu byl přidán nasycený roztok uhličitanu sodného a směs byla extrahována 2x5 mililitry dichlormethanu. Organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Tímto postupem byl získán pevný bílý produkt, jehož množství odpovídalo výtěžku 36 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ^ΧΗ NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 333 (MH⁺) .

(IIIB) 4-amino-2-{[4-aminopropyI)[1-naftyl)ethyl]amino}-5pyrimidinkarbonitril

Do iékovky se šroubovým uzávěrem bylo umístěno 199 miligramů (1 milimol) 4-amino-2-brompyrimidin-5-karbonitrilu,

394 miligramů (1,2 milimolů) terč. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)ethyl] amino}propyl)karbamátu (IIB), 342 mikrolitrů (2 milimoly) N,N-diisopropylethylaminu (DIEA) a 2 mililitry 2-methoxyethanolu a tato směs byla 5 hodin zahřívána na 150 °C. Z reakční směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 2x5 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn chromatografii na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol (10:0,1), čímž byl získán bílý amorfní produkt.

• · • · · · · · • · · · · · · · · ······ β · ··· · • ···· · · · • ·· · · ·· ·

Κ uvedenému amorfnímu produktu byly přidány 2 mililitry studeného 50procentního roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu a vzniklá směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. Roztok byl odpařen, k surovému produktu byl přidán nasycený roztok uhličitanu sodného a směs byla extrahována 2x5 mililitry dichlormethanu. Organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Tímto postupem byl získán pevný bílý produkt, jehož množství odpovídalo výtěžku 66 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ^XH NMR; ¹³C NMR; MS (m/z) : 347 (MH⁺) .

(HIC) 4-amino-2-{ [4-aminobutyl) [1-naftyl)ethyl]amino}-5pyrimidinkarbonitril

Do lékovky se šroubovým uzávěrem bylo umístěno 199 miligramů (1 milimol) 4-amino-2-brompyrimidin-5-karbonitrilu,

410 miligramů (1,2 milimolu) terč. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)ethyl]amino}butyl)karbamátu (IIC), 342 mikrolitrů (2 milimoly) N, N-diisopropylethylaminu (DIEA) a 2 mililitry 2-methoxyethanolu a tato směs byla 4 hodiny zahřívána na 150 °C. Z reakční směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, získaný zbytek byl rozpuštěn ve 3 mililitrech 0,lmolární kyseliny chlorovodíkové a extrahován 2x5 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol (10:0,1), čímž byl získán bílý amorfní produkt.

K uvedenému amorfnímu produktu bylo přidáno 1,5 mililitru studeného 50procentního roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu a vzniklá směs byla míchána 1 hodinu při teplo78 φ · ► φ φ » φφφφ tě místnosti. Roztok byl odpařen, k surovému produktu byl přidán nasycený roztok uhličitanu sodného a směs byla extrahována 3x5 mililitry dichlormethanu. Organické vrstvy byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny. Tímto postupem byl získán pevný bílý produkt, jehož množství odpovídalo výtěžku 54 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ^XH NMR; ¹³C NMR; MS (m/z) : 361 (MH⁺) .

7-Substituované pyrimidopyrimidiny (sloučeniny obecného vzorce (IV)) byly připraveny kondenzací 2-substituovaných-2,4diamino-5-pyrimidinkarbonitrilů (sloučenin obecného vzorce (III)) a guanidinu (viz. schéma 4).

Schéma 4

• · · · · · · ·· · · · · · · · · · ···· ·· ·· · · · · ···· • · · · · · * · • · ···· ·· ·

Sloučenina IVC miligramů (0,26 milimolu) 4-amino-2-{[4-aminobutyl)[1naftyl) ethyl] amino}-5-pyrimidinkarbonitrilu (HIC) bylo rozpuštěno v 1,2 mililitru roztoku volné báze guanidinu (jejíž příprava je popsána níže) v 2-methoxyethanolu. Reakční směs byla míchána 1,5 hodiny při teplotě 150 °C v lékovce se šroubovým uzávěrem. Ze směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, ke zbytku byla přidána voda a po odfiltrování sraženiny byl surový produkt přečištěn chromatografii na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol/amoniak (2:1:0,1), čímž byl získán produkt ve formě pevné bílé látky, jehož množství odpovídalo výtěžku 42 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ¹H NMR; ¹³C NMR;

MS (m/z) : 403 (MH⁺) .

Sloučenina IVB miligramů (0,26 milimolu) 4-amino-2-{[4-aminopropyl) [1-naftyl)ethyl]amino}-5-pyrimidinkarbonitrilu (IIIB) bylo rozpuštěno v 1,3 mililitru roztoku volné báze guanidinu (jejíž příprava je popsána níže) v 2-methoxyethanolu. Reakční směs byla míchána 1,5 hodiny při teplotě 150 °C v lékovce se šroubovým uzávěrem. Ze směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, ke zbytku byla přidána voda a po odfiltrování sraženiny byl surový produkt přečištěn chromatografii na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol/amoniak (2:1:0,1), čímž byl získán produkt ve formě pevné bílé látky, jehož množství odpovídalo výtěžku.38 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ¹H NMR; ¹³C NMR;

MS (m/z) : 389 (MH⁺) .

• φ • φφφ · • · · φ φ · φ φ φφφ ···· ·· ·· Φ 41 Φ φ ΦΦΦΦ

Sloučenina IVA

100 miligramů (0,3 milimolu) 4-amino-2-{[4-aminoethyl) [1-naftyl)ethyl]amino}-5-pyrimidinkarbonitrilu (IIIA) bylo rozpuštěno v 1,4 mililitru roztoku volné báze guanidinu (jejíž příprava je popsána níže) v 2-methoxyethanolu. Reakční směs byla míchána 1,5 hodiny při teplotě 150 °C v lékovce se šroubovým uzávěrem. Ze směsi byl odpařen 2-methoxyethanol, ke zbytku byla přidána voda a po odfiltrování sraženiny byl surový produkt přečištěn chromatografií na silikagelu s elucí směsí dichlormethan/methanol/amoniak (2:1:0,1), čímž byl získán produkt ve formě pevné bílé látky, jehož množství odpovídalo výtěžku 46 procent. Strukturální charakteristika produktů byla provedena pomocí ''Ή NMR; ¹³C NMR;

MS (m/z) : 375 (MH⁺) .

Příprava roztoku volné báze guanidinu v 2-methoxyethanolu

V oddělené nádobě byl 1 gram (44 milimolů) kovového sodíku přidán k 30 mililitrům 2-methoxyethanolu a tato směs byla míchána v inertní atmosféře do rozpuštění sodíku.

V jiné nádobě byl připraven roztok 4,2 gramu (44 milimolů) hydrochloridu guanidinu ve 30 mililitrech 2-methoxyethanolu. K tomuto roztoku byl přidán uvedený roztok methoxyethoxidu sodného. Po přidání tohoto roztoku došlo k vytvoření bílé sraženiny, kterou byl chlorid sodný. Reakční směs byla míchána minut při teplotě 25 °C. Sraženina byla odfiltrována a roztok byl uchován v mrazáku a použit jakožto roztok volné báze guanidinu.

• · · ··· ··· • · · · ···· · ··· • ······ ·· · · · ·····

Kyselina 3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidin-2-yl) -(2ethoxynaftalen-l-ylmethyl) amino] -2-hydroxypropionová

Uvedená α-hydroxykarboxylová kyselina byla syntetizována několikastupňovým postupem, přičemž jako výchozí sloučenina sloužil isoserin a při syntéze byly použity metody a podmínky podobné těm, které jsou podrobně popsány v tomto textu. Enantiomerní alkoholy je možné syntetizovat stereoselektivně s použitím reakce 2-ethoxynaftylmethylaminu s estery kyseliny glycínové (epoxidem).

N-(2-Aminoethyl)-3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidin-2yl) -(2-ethoxynaftalen-l-ylmethyl)amino]-2-hydroxypropionamid

K roztoku 200 miligramů (0,445 milimolu) kyseliny 3-[(5,7 diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidin-2-yl)-(2-ethoxynaftalen-lylmethyl) amino] -2-hydroxypropionové ve 2 mililitrech suchého Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) bylo přidáno 249 miligramů (0,534 milimolu) činidla BroP. Směs byla 30 minut míchána a poté k ní bylo přidáno 126 miligramů (0,979 milimolu) diisopropylethylaminu (DIEA). Směs byla míchána dalších 20 minut a bylo k ní přidáno 53,5 miligramu (0,89 milimolu) ethylendiaminu. Poté byla reakční směs 16 hodin míchána při teplotě místnosti a přímo přečištěna preparativní vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, čímž bylo získáno 35 miligramů (16 procent) požadovaného produktu: MS (m/z) 492 (M+H).

Obecný postup reakce různých aminů s aromatickými ketony za redukčních podmínek

nh₂ch₃

2M v methanolu

NaCNBH₃ (62,84) ZnCI₂ (136,28)

Následující postup je založen na metodě popsané v publikaci J. Org. Chem., 1985, 50, 1927-1932.

K roztoku 1-acetylnaftalenu (1 ekvivalent, 1 milimol,

170 miligramů, 151 mikrolitrů) v methanolickém roztoku methylaminu (4 ekvivalenty, 4 milimoly, 2 mililitry 2molárního roztoku v methanolu) byl při teplotě místnosti přidán pevný kyanoborohydrid sodný (2 ekvivalenty, 2 milimoly, 126 miligramů) a bezvodý chlorid zinečnatý (1 ekvivalent, 1 milimol, 136 miligramů). Reakční směs byly zahřívány za neustálého míchání magnetickým míchadlem v otevřené zkumavce na teplotu 65 °C.

Průběh reakce byl monitorován buď chromatografii na tenké vrstvě (TLC) nebo vysokoúčínnou kapalinovou chromatografii (HPLC). Po 30 minutách reakce bylo možné v chromatogramu reakční směsi pozorovat několik píků. Pro srovnání byl použit autentický vzorek N-methyl-l-naftylethylaminu. Po uplynutí

4 4

4444 * 4 hodiny byla reakce hotova z více než 50 procent. Po 4 hodinách došlo k úplnému vymizení ketonu z reakční směsi a vzniklý produkt byl z více než 95 procent čistý, přičemž byl kontaminován méně než 5 procenty iminu, jenž byl meziproduktem reakce. Delší zahřívání reakční směsi by mohlo vést k získání produktu s vyšší čistotou. Doporučená reakční doba pro tento konkrétní keton činí alespoň 6 hodin, avšak reakční doba se může měnit podle povahy daného ketonu. Reakční směsi byly zpracovány obvyklým postupem a surové produkty byly přečištěny standardními laboratorními technikami.

O OH

Kyselina 3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidin-2-yl) -(2ethoxynaftalen-l-ylmethyl)amino]propionová

0 0 0000 · 000

0000 00 00 000 0 0000

0000 00 0 riH₂ +

NHBoc

terč. Butylester kyseliny {4-[ (5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidin-2-yl)-(2-ethoxynaftalen-l-ylmethyl)amino]butyl}karbamové

Suspenze 12,37 gramu (0,025 molu) substituovaného kyanoaminopyrimidinu, 7,16 gramu (0,075 molu) hydrochloridu guanidinu, 5,40 gramu (0,1 molu) pevného methoxidu sodného ve 150 mililitrech methoxyethanolu byla 48 hodin zahřívána na teplotu varu. Skončení reakce bylo určeno na základě monitorování vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Reakční směs byla ponechána zchladnout na teplotu místnosti a vylita do přebytku vody. Pevná látka byla izolována na filtru a vysušena ve vakuu, čímž bylo získáno 13,05 gramu surového produktu, který byl bez přečištění použit v dalším stupni.

Φ φφφ φφφ φφ · φφφφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφ φ φφφφ φ φφφφ φφφ

Ν7-(4-Aminobutyl)-Ν7-(2-ethoxynaftalen-l-ylmethyl)pyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triamin gramů mono-Boc-chráněného meziproduktu bylo pomalu během 10 minut za intenzivního míchání přidáno k 75 mililitrům ledově studené kyseliny trifluoroctové. Skončení reakce bylo určeno na základě analýzy vzorku pomocí HPLC/MS. Reakční směs byla vylita do ledově studeného 5procentního roztoku ethoxidu sodného, čímž došlo k vysrážení produktu. Uvedený HPLC produkt byl izolován na filtru a vysušen, čímž bylo získáno 8,0 gramů pevného produktu: HPLC Rt = 2,882 minuty, čistota 99 procent, MS (m/z) 433 (pos).

0'

ZnCi

NaCNBH₃ θ. MeNH₂

Stupeň 1: reduktivní aminace

20,0 gramů (0,12 molu) uvedeného ketonu bylo rozpuštěno ve 100 mililitrech (přibližně 2 ekvivalenty) 2molárního methano86

«φ φ • φ φ • φφφ • ΦΦΦΦ· • φφφ φ φ · φ lického roztoku methylaminu. V jiné baňce, která byla ochlazena na teplotu 0 °C, bylo smícháno 8,3 gramu (0,5 ekvivalentu) chloridu zinečnatého a 7,7 gramu (1,0 ekvivalent) kyanoborohydridu sodného s přibližně 10 mililitry methanolu. Vzniklý Zn(CNBH₃)2 byl ponechán míchat přibližně 5 minut při teplotě 0 °C a následně přidán jakožto suspenze k uvedené směsi ketonu a aminu. Reakční směs byla zahřívána přes noc k mírnému varu, ponechána zchladnout na teplotu místnosti a odpařena do sucha. Získaný zbytek byl ponechán stát ve vysokém vakuu za účelem odstranění zbytků methylaminu.

Získaná pevná bílá látka byla triturována diethyleterem, avšak tato operace vedla k získání viskózního oleje. Lepších výsledků bylo dosaženo při trituraci diethyletherem s přídavkem dostatečného množství methanolu, které postačovalo k zabránění zolejovatění zpracovávaného materiálu. Uvedený materiál byl odfiltrován, promyt etherem a ponechán vyschnout. Chromatografií na tenké vrstvě (TLC) vzorku získané pevné látky vedle autentického vzorku poskytnutého ET bylo zjištěno, že obě sloučeniny mají stejnou mobilitu. Nicméně na základě hmotnostní bilance odpovídalo množství získaného produktu více než lOOprocentnímu výtěžku, na základě čehož bylo usouzeno, že izolovaný produkt obsahoval ještě anorganické soli.

Díky přítomnosti kontaminujících solí bylo v dalším stupni nejprve použito malé množství produktu, avšak nebyly pozorovány žádné zřejmé problémy. Uvedená aminokyselina byla proto použita bez dalšího přečištění.

• ·

9 9

999 i • ·

999

Stupeň 2: reakce s chlorpyrimidinem gramů (teoretický výtěžek činil 21,8 gramu) aminokyseliny z předcházejícího stupně bylo rozpuštěno v přibližně 50 mililitrech ethoxyethanolu. K tomuto roztoku bylo přidáno 17,0 gramů (0,9 ekvivalentu, vztaženo na keton) 4-amino-2chlorpyrimidin-5-karbonitrilu a 42 mililitrů (2,0 ekvivalenty) diisopropylethylaminu (DIEA) a reakční směs byla ponechána míchat přibližně 2 hodiny při teplotě 80 °C (teplota olejové lázně). Po uplynutí této doby nebyla TLC prokázána přítomnost výchozího chloridu v reakční směsi. Směs byla ponechána zchladnout na teplotu místnosti a zahuštěna na rotační odparce na objem přibližně 10 mililitrů. Získaná suspenze byla zředěna přibližně 400 mililitry vody a její pH bylo upraveno koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 5 až 6 (podle pH papírku), při kterém došlo k vyloučení světle žluté pevné látky. Směs byla ponechána stát přes noc při teplotě 0 °C, přefiltrována a filtrační koláč byl promyt přibližně 1 litrem vody a usušen na vzduchu. Překrystalováním ze směsi voda/ methanol bylo získáno přibližně 25 gramů (69 procent) požadovaného meziproduktu. TLC (CH2CI2 + 10 % CH3OH) Rf přibližně 0,1 Analýza TLC prokázala přítomnost rychleji se pohybující látky, nicméně její podíl byl natolik malý, že získaný produkt byl použit bez dalšího přečištění v následujícím reakčnim stupni.

Stupeň 3: cyklizační reakce

Pro zvýšení měřítka reakce byl jako rozpouštědlo použit ethoxyethanol, jenž umožnil zvýšit reakční teplotu na přibližně 135 °C. 16,0 gramů (54 milimolů) meziproduktu z předchozího stupně bylo rozpuštěno v přibližně 75 mililitrech ethoxy·· · «« ·· • · · • · · · · « * ·

• · · « • · · · ···· ·· ethanolu. K tomuto roztoku bylo přidáno 10,2 gramu (2,0 ekvivalenty) hydrochloridu guanidinu a 11,6 gramu (4,0 ekvivalenty) methoxidu sodného a reakční směs byla přivedena v argonové atmosféře k mírnému varu. Pro monitorování spotřeby výchozí sloučeniny byla použita chromatografie na tenké vrstvě (TLC). Po přibližně 30 hodinách byla reakční směs ponechána zchladnout, bylo do ní přidáno dalších 5,1 gramu (1,0 ekvivalent) hydrochloridu guanidinu a 2,9 gramu (1,0 ekvivalent) methoxidu sodného a směs byla přivedena zpět k varu. Podle chromatografie na tenké vrstvě (TLC) byla reakce skončena po přibližně 72 hodinách.

Reakční směs byla ponechána zchladnout a zahuštěna na rotační odparce na objem přibližně 20 mililitrů. Získaná suspenze byla zředěna přibližně 600 mililitry vody a pH směsi bylo upraveno koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 5 až 6. Vysrážený produkt byl ponechán usadit přes noc při teplotě 0 °C, odfiltrován a postupně promyt větším množstvím vody a větším množstvím methanolu (za účelem odstranění nezreagovaných výchozích sloučenin) a usušen na vzduchu. Bylo izolováno přibližně 13,5 gramu (přibližně 75 procent) produktu. Analýza vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií prokázala, že produkt obsahoval malé množství polární nečistoty, která byla stejná s nečistotou pozorovanou při stejné reakci provedené v malém měřítku. Uvedený produkt však mohl být použit bez dalšího přečištění.

gramů (18 milimolů) terč. butylesteru kyseliny [2- (4-amino-5-kyanopyrimidin-2-ylamino)ethyl]karbamové bylo rozpuštěno v 60 mililitrech směsi dichlormethan/kyselina trifluooctová (50:50, vyjádřeno v objemových dílech). Po přidání kapaliny k pevné látce byl pozorován bouřlivý vývoj plynů. Roztok byl následně 30 minut míchán v inertní atmosféře a po uplynutí této doby byl z reakční směsi odebrán vzorek pro provedení analýzy vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC), jež sloužila pro potvrzení, že došlo ke kvantitativnímu odštěpení chrániči skupiny. Jakmile bylo zjištěno, že došlo k úplnému odštěpení chránící skupiny, byl roztok ve vakuu odpařen do sucha.

V oddělené nádobě bylo 0,675 gramu kovového sodíku pomalu přidáno v inertní atmosféře k 30 mililitrům 2-methoxyethanolu a směs byla míchána až do rozpuštění sodíku. V jiné nádobě byl připraven roztok 2,645 gramu hydrochloridu guanidinu ve 30 mililitrech 2-methoxyethanolu. K tomuto roztoku byl přidán uvedený roztok methoxyethoxidu sodného. Po smíchání obou roztoku došlo k vyloučení bílé sraženiny chloridu sodného a vzniklá směs byla míchána 30 minut. Poté byl tento roztok přefiltrován • · ··· ····· v inertní atmosféře, přidán k surovému zbytku ze stupně 1 a výsledná směs byla intenzivně míchána. Během 15 minut došlo k vyloučení žluté sraženiny. Tato sraženina byla odfiltrována, čímž bylo izolováno 2,1 gramu (52 procent) N7-(2-aminoethyl)pyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triaminu.

NH.

4-Aminobutylamid kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinylmethyl]-N-methylamino)benzoové

K suspenzi 250 miligramů (0,73 milimolu) hemihydrochloridu kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinylmethyl]-N-methylamino)benzoové ve 20 mililitrech suchého N,N-dimethylformamidu (DMF) bylo přidáno 250 mikrolitrů (1,46 milimolu, 2 ekvivalenty)

N, N-diisopropylethylaminu a 225 mikrolitrů (1,46 milimolu, ekvivalenty) diethylkyanofosfonátu. Došlo k rychlému rozpuštění pevné látky a vzniklá reakční směs byla míchána 4 hodiny při teplotě místnosti. K roztoku bylo přidáno 367 mikrolitrů (3,65 milimolu, 5 ekvivalentů) 1,4-diaminobutanu a 250 mikrolitrů (1,46 milimolu, 2 ekvivalenty) N,N-diisopropylethylaminu a výsledný roztok byl míchán 45 minut při teplotě místnosti. Skončení reakce bylo ověřeno analýzou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) a k reakční směsi byl přidán pevný hydrogenuhličitan sodný. Poté bylo ze směsi ve vakuu odstraněno rozpouštědlo a získaný zbytek byl suspendován v malém množství methanolu. K suspenzi byl přidán zředěný roztok hydroxidu amonného a po následné filtraci, promytí filtračního koláče vodou a usušení bylo získáno 153 miligramů (53 procent)

požadovaného produktu: MS (m/z) 396 (M+H), HPLC Rt = 3,80 minuty .

o

4-Hydroxyfenylamid kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinylmethyl]-N-methylamino)benzoové

K suspenzi 100 miligramů (0,29 milimolu) hemihydrochloridu kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinylmethyl]-N-methylamino)benzoové v přibližně 6 mililitrech suchého N,N-dimethylformamidu (DMF) bylo přidáno 100 mikrolitrů (0,58 milimolu, ekvivalenty) N,N-diisopropylethylaminu a 90 mikrolitrů (0,58 milimolu, 2 ekvivalenty) diethylkyanofosfonátu. Došlo k rychlému rozpuštění pevné látky a vzniklá reakční směs byla míchána 3 až 4 hodiny při teplotě místnosti. Pro přípravu 4hydroxyfenylamidu bylo k roztoku přidáno 33 miligramů (0,30 milimolu, 1,05 ekvivalentu) p-aminofenolu a 100 mikrolitrů (0,58 milimolu, 2 ekvivalenty) N,N-diisopropylethylaminu a výsledný roztok byl míchán přes při teplotě místnosti. Skončení reakce bylo ověřeno analýzou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) a k reakční směsi byl přidán pevný hydrogenuhličitan sodný. Poté bylo ze směsi ve vakuu odstraněno rozpouštědlo a získaný zbytek byl suspendován v malém množství methanolu. K suspenzi byl přidán zředěný roztok hydroxidu amonného a po následné filtraci, promytí filtračního koláče zředěnou kyselinou octovou a usušení byl získán požadovaný produkt. Bylo získáno 77 miligramů (0,19 milimolu, ♦ · • # procent) produktu: MS (m/z) 415 (M-H), HPLC Rt = 4,66 minuty .

NH.

N-Benzyl [2,4-diamino-6-pteridinylmethyl] -N-methylamin

V 15mililitrové lékovce se šroubovým uzávěrem, která byl opatřena magnetickým míchadlem, bylo rozpuštěno 245,5 miligramu (261 mikrolitrů, 2,02 milimolu) N-methylbenzylaminu, tj pětinásobný přebytek, ve 4 mililitrech Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) . K roztoku bylo přidáno 100 miligramů (0,405 milimolu)

2,4-diamino-6-chlormethylpterinu a směs byla dobře promíchána Reakční směs byla míchána 4 hodiny při teplotě 60 °C. Analýza vzorku reakční směsi vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií prokázala absenci výchozího derivátu pterinu. Ze směsi bylo při sníženém tlaku a teplotě 60 °C odstraněno rozpouštědlo. Získaná směs byla promyta 2 x 15 mililitry ethanolu, rozpouštědlo bylo odstraněno v proudu dusíku a získaný produkt byl 18 hodin sušen ve vysokém vakuu. Byla provedena měření NMR a MS a získaná data potvrdila strukturu a čistotu produktu.

NH.

NH.

Cl

N' • · · · ·· · · · • · · ··· · · · ··· · ···· · · · · • ······ · · ··· · · · · · • · · · · · ··« • · · · ♦ · ·· ·» ·

Ν- (a-Methyl-4-methylbenzyl) [2,4-diamino-6-pteridinylmethyl]-Ν methylamin

V 15mililitrové lékovce se šroubovým uzávěrem, která byl, opatřena magnetickým míchadlem, bylo rozpuštěno 272 miligramů (298 mikrolitrů, 2,02 milimolů) S-(+)-a—4-dimethylbenzylaminu tj . pětinásobný přebytek, ve 4 mililitrech Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF). K roztoku bylo přidáno 100 miligramů (0,405 mili molu) 2,4-diamino-6-chlormethylpterinu a směs byla dobře promíchána. Reakční směs byla míchána 4 hodiny při teplotě 60 °C. Analýza vzorku reakční směsi vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií prokázala absenci výchozího derivátu pterinu. Ze směsi bylo při sníženém tlaku a teplotě 60 °C odstraněno rozpouštědlo. Získaná směs byla promyta 2 x 15 mililitry ethanolu, rozpouštědlo bylo odstraněno v proudu dusíku a získaný produkt byl 18 hodin sušen ve vysokém vakuu. Výsledky analytické HPLC, měření ’Ή NMR a MS byly v souladu s předpokládanou strukturou produktu, přičemž čistota získaného produktu byla vysoká.

Příklad 2

Stanovení Ki D-Ala-D-Ala ligasy

Syntetické analogy z příkladu 1 byly v den hromadného testování rozpuštěny dimethylsulfoxidu (DMSO), přičemž byly připraveny lOOmilimolární roztoky jednotlivých analogů a v případě potřeby byly pro rozpuštění použity míchadlo typu vortex a sonikace. Roztoky byly až do skončení hromadného testování uchovávány při teplotě místnosti.

• · · · · · ··· • · · · ···· · · · · « ···· · · · · · β · · ···· • · ·······

V den testování byl připraven čerstvý zásobní roztok NADH (který byl získán od společnosti Sigma), a to rozpuštěním 32 mikromolů NADH ve 3,2 mililitru dvakrát destilované vody. Roztok NADH byl uchováván na ledu. Zásobní roztoky obsahující 50 mM fosfoenolpyruvátu (PEP, od společnosti Sigma), 500 μΜ HERMES, 30 mM adenosintrifosfátu (ATP, od společnosti Sigma), 200 mM D-alaninu (od společnosti Sigma) a 4x základní pufr (tj. 400 mM Hepes, 40 mM chloridu hořečnatého a 40 mM chloridu draselného) byly rovněž skladovány na ledu. Zásobní roztok pyruvátkinasy/laktátdehydrogenasy (PK/LDH) byl rovněž získán od společnosti Sigma.

Tabulka konečných koncentrací, jež byly závislé na typu hromadného testování

Typ hromadného testu	Ki analogů Konečná koncentrace v enzymové směsi	Procento inhibice analogů Konečná koncentrace v enzymové směsi	Ki a mechanismus inhibice analogů Konečná koncentrace v enzymové směsi
Základní pufr 4x	lx	lx	lx
NADH 10 mM	500 μΜ	500 μΜ	500 μΜ
PEP 50 mM	2 mM	2 mM	2 mM
	0, 02 ml/ml	0,02 ml/ml	0,02 ml/ml
Směs PK/LDH	zásobního	zásobního	zásobního
	roztoku enzymu	roztoku enzymu	roztoku enzymu
HERMES 500 μΜ	200 nM	400 až 600 nM	200 nM

• · • ·

Typ hromadného testu	Ki analogů Konečná koncentrace v substrátové směsi	Procento inhibice analogů Konečná koncentrace v substrátové směsi	Ki a mechanismus inhibice analogů Konečná koncentrace v substrátové směsi
Roztok	A	Hromadný test	A	B	C
ATP 30 mM	4 mM	20 μΜ	4 mM	4 mM	100 μΜ
D-Ala 200 mM	2 mM	64 mM	2 mM	64 mM	64 mM
Základní pufr lx	lx	lx	lx	lx	lx

Příklad 3

Stanovení Ki analogů

Pro každou sérii testovaných sloučenin byla použita dvě 96jímková plata, která byla označena jako inhibitorové, respektive enzymové plato. Testovaným sloučeninám odpovídaly v jednotlivých platech řady jímek A-G. Adenosinu (získanému od společnosti Sigma), jenž byl rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (DMSO) a který byl použit pro srovnání, odpovídaly v jednotlivých platech řady jímek H.

Enzymový roztok byl ponechán vytemperovat na teplotu 25 °C.

Zředěné roztoky byly připraveny v inhibitorovém platu, a to následujícím postupem: 50 mikrolitrů dimethylsulfoxidu (DMSO) bylo přidáno do každé jímky ve sloupcích 1 až 11 v • 4

4 4 4 4 4 ··· ··· · 4 4·· · ··· • 4444 4 4 4 4 4 · 4 4 4444

4 444· 444

4·4 4 44 44 44 4 řadách A až G inhibitorového plata. Do každé jímky ve sloupcích 1 až 11 v řadě H bylo přidáno 50 mikrolitrů dimethylsulfoxidu (DMSO). Do jímek ve sloupci 12 v řadách A až G bylo přidáno vždy 100 mikrolitrů roztoku testované sloučeniny o koncentraci 100 mM (tj. roztok první testované sloučeniny byl přidán do jímek ve sloupci A, roztok druhé testované sloučeniny byl přidán do jímek ve sloupci B atd.). Do jímky ve sloupci 12 v řadě H bylo přidáno 100 mikrolitrů roztoku adenosinu o koncentraci 100 mM.

V každé řadě bylo 50 mikrolitrů roztoku testované slouče niny přeneseno z jímky ve sloupci 12 do jímky ve sloupci 11, čímž došlo k promíchání tohoto roztoku s dimethylsulfoxidem (DMSO). Poté bylo v každé řadě 50 mikrolitrů roztoku z jímky ve sloupci 11 přeneseno do jímky ve sloupci 10, 50 mikrolitrů roztoku z jímky ve sloupci 10 bylo přeneseno do jímky ve sloupci 9 a tak dále až k jímce ve sloupci 2. Do jímek ve sloupci 1 nebyl přenesen žádný roztok. Při tomto sériovém ředění byly použity vícekanálové pipetory.

Do každé jímky enzymového plata bylo přidáno 120 mikrolitrů enzymového roztoku. Roztoky substrátu byly ponechány ohřát na teplotu 25 °C.

Analogy podle tohoto vynálezu a enzymy byly následně inkubovány při teplotě 25 °C. Protože reakce byly iniciovány po sloupcích, bylo přidávání analogů prováděno rovněž po sloupcích. V čase t = 0 minut bylo po 5 mikrolitrech roztoků analogů v jímkách ve sloupcích 1 až 4 inhibitorového plata přidáno do odpovídajících jímek enzymového plata. V čase t = minuty bylo po 5 mikrolitrech roztoků analogů v jímkách ve • · • * · ·· · · · · · · ··· ···· ♦ · · · · · · · ···· • · · · · · · · • · * · · · · · sloupcích 5 až 8 inhibitorového plata přidáno do odpovídajících jímek enzymového plata. V čase t = 8 minut bylo po mikrolitrech roztoků analogů v jímkách ve sloupcích 9 až 12 inhibitorového plata přidáno do odpovídajících jímek enzymového plata. Inhibitorové plato bylo následně zmraženo.

V čase t - 18 až 19 minut byl odebrán roztok substrátu a přenesen při teplotě 25 °C do UV/Vis spektrometru Spectromax®.

V čase t = 20 minut bylo během 30 sekund do každé jímky ve sloupcích 1 až 4 přidáno 125 mikrolitrů roztoku substrátu a byla měřena absorbance vzniklých směsí při vlnové délce 340 nanometrů. V čase t = 24 minut a t = 28 minut byl tento postup zopakován pro jímky ve sloupcích 5 až 8, respektive 9 až 12 .

Koncentrace sloučenin podle tohoto vynálezu v jímkách ve sloupcích 1 až 12 tak byly 0 μΜ, 1,9 μΜ, 3,9 μΜ, 7,8 μΜ,

15,6 μΜ, 31,2 μΜ, 62,5 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ, 1 mM, respektive 2 mM.

Hodnoty snížení absorbance byly vynásobeny -4,06 za účelem převedení jednotek mOD/min na nM/s (OD = ÁLM; λ = 6200 1/Mcm;

L = 0,66 centimetru; mOD/s = 6200 x 0,66 (mM/s) x 60;

(mOD/s) x 4,06 = nM/s); získaný výsledek byl vynásoben -1, protože absorbance NADH klesá se vzrůstajícím množstvím vznikajícího produktu).

Pomocí programu Kaleidograph® byly sestrojeny grafy závislosti rychlosti reakce na koncentraci inhibitoru a hodnoty Ki byly stanoveny poté, co byly na základě zjištěných údajů sestrojeny rovnice křivek uvedených závislostí.

• 444 • · · 4 • · · · · 4 • · 4 4 · · ·

4·· · • · · 4 44 44 44 4 • ·

Většinu z výše popsaných stupňů bylo alternativně možné provést pomocí automatizovaného zařízení pro manipulaci s kapalinami SciClone. Těmito stupni jsou konkrétně: přidávání enzymové směsi na enzymové plato, dávkování 50 mikrolitrů DMSO do jímek ve sloupcích 1 až 11 v řadách A až H inhibitorového plata, sériové ředění roztoků analogů a srovnávacího roztoku adenosinu na inhibitorovém platu, přidávání analogových inhibitorů z inhibitorového plata na enzymové plato, přidávání substrátu na enzymové plato.

Příklad 4

Procento inhibice analogů podle tohoto vynálezu

Byl zopakován výše popsaný testovací postup s tou výjimkou, že inhibitorová plata byla připravena tak, že jímky obsahovaly 5mM roztoky inhibitorů (oproti sériově zředěným roztokům při předcházejícím testu), takže konečná koncentrace inhibitoru ve výsledné reakční směsi byla 100 μΜ. Aktivita enzymu v přítomnosti dimethylsulfoxidu (DMSO) byla použita jakožto lOOprocentní srovnávací aktivita.

Přesné koncentrace jsou udány ve shora uvedené tabulce.

Φ Φ · φφφ· · φφφ φφφφ · · φ φ · · φ · φφφφ φ φφφφ φφ φ

Příklad 5

Stanovení hodnot Ki a mechanismu inhibice analogů podle tohoto vynálezu

Byl zopakován shora popsaný testovací postup, přičemž byly použity tři různé substrátové roztoky, a to každý na jiném enzymovém platu. Konečné koncentrace v reakčních směsích byly následující: (A) 2 mM ATP a 1 mM D-alaninu; (B) 2 mM ATP a 32 mM D-alaninu; a (C) 50 μΜ ATP a 32 mM D-alaninu. Pro všechna tři enzymová plata bylo použito stejné inhibitorové plato. Pro srovnání byl při testu použit adenosin (od společnosti Sigma) a cykloserin (od společnosti Sigma). Přesné koncentrace jsou udány ve shora uvedené tabulce.

Příklad 6

Mikrozřeďovací test antimikrobiálního účinku

Byly připraveny zásobní roztoky testovaných sloučenin v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) o koncentraci 5 miligramů/mililitr. Poté byly připraveny pracovní roztoky v živné půdě Múller-Hinton (MHB) o výchozí koncentraci 64 mikrogramů/mililitr (tj. byl připraven roztok 25,6 mikrolitrů zásobního roztoku v 974,4 mikrolitrech MHB = roztok testované sloučeniny o koncentraci 128 mikrogramů/mililitr, který byl při níže popsaném procesu zředěn ekvivalentním objemem bakteriálního inokula).

Bakteriální inokula byla připravena vždy z přes noc inkubované kultury (tj. čerstvé kolonie pěstované na agarovém • · • · • · · ·

100 ·« · · · · · · • · · · ··«« · » ······ 9 ·· · · · β • · · · ♦ · · · ··* · 99 99 99 9 platu v 5 mililitrech MHB; kmen H. influenzae byl pěstován v MHB s přídavkem kvasného extraktu, hematinu a NAD), která byla odstřeďována 2x5 minut rychlostí 3000 otáček/minutu (v případě kmenů S. pneumoniae a H. influenzae 2 x 10 minut rychlostí 3000 otáček za minutu) a dispergována v 5 mililitrech čerstvého média MHB, takže získaná bakteriální suspenze se ředila tak, aby v každé jímce mikroplata bylo získáno

100 jednotek tvořících kolonii (CFU) (konečný objem směsi činil 100 mikrolitrů).

Uvedené jímky mikroplata byly následně plněny 50 mikrolitry dvojnásobně zředěného roztoku testované sloučeniny, přičemž výchozí koncentrace testované sloučeniny byla 64 mikrogramů/mililitr. Jímky ve sloupcích 2 až 12 byly plněny 50 mikrolitry bakteriálního inokula (konečný objem směsi v každé jímce činil 100 mikrolitrů/jímku). Plata byla inkubována 18 až 24 hodin při teplotě 37 °C (kmen S. pneumoniae byl inkubován v atmosféře obohacené oxidem uhličitým).

Poté byla pomocí přístroje TECAN SpectroFluor Plus® měřena optická hustota obsahu jednotlivých jímek při vlnové délce 590 nanometrů (OD590) a minimální inhibiční koncentrace (MIC) byla definována jakožto koncentrace, při které docházelo k 90procentní inhibici růstu bakterií.

101 • 0 00 00 00 0 ·· · · · 0 0 0 0

0 0 0 0 · 00 · 0 0 0 • ···· 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 • 0 0 0 0 0 0 0 0

00 0 · · · 0 00 0

Příklad 7

Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) pomocí overexprese kmene E. coli

Postup popsaný v příkladu 5 byl zopakován s následujícími módi f i kacemi:

Jako médium byla použita živná půda luria (LB) s přídavkem antibiotik (20 miligramů/litr chloramfenikolu pro vektory pBAD, 100 miligramů/litr ampicilinu pro vektory pTAC pro plasmidovou selekci) nebo M9 minimální médium s D-manitolem jakožto zdrojem uhlíku.

Bakterie, které byly použity pro inokulum v LB, byly připraveny takto: kultura získaná kultivací přes noc byla zředěna v poměru 1:50 čerstvým médiem LB a inkubována na třepačce při 250 otáčkách za minutu a teplotě 37 °C. Po dosažení stádia mid-log (OD₆oo = 0,5 až 1,0, po přibližně 3 hodinách) byl do směsi přidán operonový regulátor (glukosa, arabinosa nebo IPTG) a bakterie byly inkubovány další 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodin byla znovu změřena hodnota OD₆₀oz· která sloužila pro odhad počtu bakterií a kultura byla zředěna médiem LB (antibiotika - chloramfenikol nebo ampicilin a regulátory byly přidány v dvojnásobných koncentracích).

Konečné inokulum obsahovalo přibližně 10 000 CFU/jímku.

Bakterie, které byly použity pro inokulum v M9 minimálním médiu, byly připraveny takto: kultura získaná kultivací přes noc byla odstřeďována 2x5 minut rychlostí 3000 otáček/minutu, promyta médiem M9, zředěna v poměru 1:50 M9 minimálním · 0 •000 0 0

102

0* médiem a ponechána 14 hodin inkubovat při teplotě 37 °C (OD₆₀₀ přibližně 500). Do směsi byl přidán operonový regulátor a bakterie byly inkubovány další 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodin byla znovu změřena hodnota Οϋβοο, která sloužila pro odhad počtu bakterií a kultura byla zředěna médiem M9 minimálním médiem (antibiotika - chloramfenikol nebo ampicilin a regulátory byly přidány v dvojnásobných koncentracích). Konečné inokulum obsahovalo přibližně 10 000 CFU/jímku.

Optická hustota byla kvůli pomalejšímu růstu bakterií v minimálním médiu odečítána po 24 a 48 hodinách.

Příklad 8

Protokol počítačového modelování použitého pro predikci inhibičního účinku vybraných analogů na ligasu

Virtuální knihovna 7-substituovaných pteridinů byla vygenerována kombinací chlormethylpteridinového jádra, které je zobrazeno vlevo na níže uvedeném schématu, se souborem komerčně dostupných aminů, a to podle následujícího reakčního schématu:

Soubor 1500 komerčně dostupných aminů byl vybrán ze seznamu Available Chemicals Directory (ACD, MDL) na základě těchto kritérií:

103 *· ·· ·· · ♦ · · · 9 · • · ··· · · · · • · · · ··· · · ·· • · · · · · · ·· ·· ·· · molekulová hmotnost aminu < 300;

amin neobsahuje žádné reaktivní nebo toxické funkční skupiny;

amin má obecné vlastnosti připomínající léčivo;

amin je dostupný od známých a spolehlivých dodavatelů.

Odpovídající deriváty pteridinu byly vygenerovány pomocí modulu pro stavbu analogů implementovaného do programu Cerius2 (MSI) . U vygenerovaných analogů byla pomocí programu Catalyst (MSI) provedena konformační studie a celkem 32 000 konformerů (tj . asi 20 konformerů na jednu molekulu) bylo pomocí programu EUDOC (Mayo Clinic) vloženo do aktivního místa D-Ala-D-Ala ligasy. Konformace uvedeného aktivního místa, jež byla použita při tomto vkládání byla odvozena z rentgenově zjištěné krystalografické struktury komplexu mezi enzymem, ADP a fosfinátovým inhibitorem (který byl získán z proteinové databanky, pdb kód: 2dln) s přesmykem a minimalizací konformace postranního řetězce lysinu 215.

Ze zjištěných výsledků byl následně pro každou molekulu vybrán „nejlépe vázající konformer. Odpovídající orientace v uvedeném aktivním místě byla znovu skórována pomocí souboru skórovacích funkcí implementovaných v programu CSCORE (Tripos) . Zjištěné výsledky byly seřazeny na základě skóre shodnosti, přičemž jako sekundární kritérium byla použita funkce Chemscore. Byl vybrán soubor 7 6 sloučenin s nej lepším skóre a tyto sloučeniny byly znovu vkládány pomocí programu FlexX (Tripos) do aktivního místa, přičemž byla použita stejná konformace aktivního místa uvedeného enzymu. Výsledky tohoto vkládání byly znovu skórovány programem CSCORE. Konečný výběr

104

• · · · r · ···· • · · • · · « • · ··· · • · · « · e sloučenin byl založen na shodě mezi výsledky získanými pomocí uvedených dvou programů pro vkládání analogů do aktivního místa enzymů. Predikované hodnoty Ki, které byly vypočteny programem Chemscore na základě výsledků získaných při použití programu FlexX, se pohybovaly v rozmezí od 0,1 μΜ do 10 μΜ.

Uvedené výpočty byly prováděny na počítači SGI Octane (2 x 250 MHz CPU, 512 MB RAM), na počítači SGI 02 (270 MHz CPU, 128 MB RAM) a na klastru deseti počítačů SGI Indigo2 (195 MHz CPU, 512 MB RAM).

Ačkoli byl předmětný vynález popsán ve spojení s jeho podrobným popisem, je třeba výše uvedený popis chápat jen jako ilustrativní a nijak neomezující rozsah předmětného vynálezu, který je definován následujícími patentovými nároky. Další aspekty, výhody a modifikace vyplývající nebo provedené na základě předcházejícího textu spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • · · · · · • ···· · ··· • ·· ··· · · · · · • · · · · · · ·· ·· ·· * T<od?^„_S3>

   1. Sloučenina obecného vzorce kde

   A a B jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom dusíku a skupinu CR⁷, kde R⁷ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

   R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce -NR⁵R⁶, kde

   R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě představují atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu;

   R³ je vybraná ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylovou skupinu, aminoskupinu, hydroxylovou skupinu, alkoxylovou skupinu a alkylaminoskupinu;

   R⁴ představuje uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

   s tou podmínkou, že • 4 • · • 4

   106

   4 4 · ····

   444444 44 pokud obě skupiny A a B představují atomy dusíku a obě skupiny R⁵ a R⁵ představují atomy vodíku, potom skupina R⁴ nepředstavuje skupinu -NH₂, skupinu -N(H)(methyl), skupinu -N(H)(butyl), skupinu -N(H)(hexyl), skupinu -N(H) (fenyl), skupinu -N(H) (benzyl), skupinu -N(Η) (NH₂) , skupinu -N (H) (CH₂CH₂OH) , skupinu -N (CH₂CH₂OH) 2, fenylovou skupinu, N-piperadinylovou skupinu nebo skupinu

   -S(ethyl);

   pokud skupina A představuje skupinu CH, skupina B představuje atom dusíku a obě skupiny R⁵ a R⁶ představují atomy vodíku, potom skupina R⁴ nepředstavuje methylovou skupinu, isobutylovou skupinu, fenylovou skupinu, 4-methylfenylovou skupinu, 4-chlorfenylovou skupinu, 4-bromfenylovou skupinu, 2-(2,5-dimethoxyfenyl)ethylovou skupinu nebo skupinu -CH(OCH₃)₂; a pokud obě skupiny A a B představují skupiny CH, potom skupina R⁴ představuje aminoskupinu, kterou není skupina -NH₂, (3,4-dichlorfenyl)methylaminoskupina nebo (3,4-dichlorfenyl)methyleniminoskupina.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, ve které skupina R⁴ představuje substituovanou nebo nesubstituovanou, lineární, rozvětvenou nebo cyklickou alkylovou, alkenylovou, alkinylovou, arylovou, aralkylovou nebo alkarylovou skupinu.

   Sloučenina podle nároku 1, ve které obě skupiny R⁵ a R⁶ představují atomy vodíku.

   ♦ · • · · · · · ··· · ···· • ······ ·· • · · · · • ·· · ·· ··

   107 • · ·
3. 4. Sloučenina podle nároku 1, ve které skupina R⁴ obsahuje alespoň jednu arylovou skupinu.
4. 5. Sloučenina podle nároku 4, ve které je skupina R⁴ vybraná ze souboru zahrnujícího skupiny kde

   R^{8 12} jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny.

   108

   Sloučenina podle nároku 4, kterou je sloučenina obecného vzorce

   R¹ kde • · · · ·

   ΦΦΦΦ · ·· · φ φ φ φ · · · · · • · · · φ ·

   I Φ Φ Φ · ·

   R² R³

   N
5. 8-16 jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupiny.

   8. Sloučenina podle nároku 7, ve které skupina R^{8 9} představuje atom vodíku nebo methylovou skupinu.

   109 • · ·· ·· ··· ··· · · · ··· • · · · · ··· · · · · • ···· · · · · · · · · ···· • · ···· ··· • ·· · · · · · · · ·

   Sloučenina podle nároku 8, obecného vzorce kterou je sloučenina

   R¹⁴ R¹³

   10.

   kde n j e 1, 2, 3 nebo 4; a

   R¹⁷ představuje skupinu obecného vzorce -NR¹⁸R¹⁹, ve které R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupiny.

   Sloučenina podle nároku 9, ve které je skupina R¹⁷ vybraná ze souboru zahrnujícího skupiny

   110 • · · · · · ··· · · · · · · • · · · · · · · · ··· • ···· · · ·· ··· · ·*· • · ···· · · · • ·· · * · ·· · · ·

   11. Sloučenina podle nároku 7, ve které skupina R⁸ představuje skupinu obecného vzorce - (CH₂) _nNR¹⁸R¹⁹, kde n jel, 2, 3 nebo 4; a

   R¹⁸ a R¹⁹ jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupiny.

   12. Sloučenina podle nároku 4, ve které je skupina

   R⁴ vybraná ze souboru zahrnujícího -CH₂0-arylovou

   111 • · 0 · · · 0 • · · 0 0 * · 0 00* • 000 0 0 00 000 0 0000 • 0000 0·· »0 0000 00 0

   13.

   14.

   15.

   skupinu, -CH₂S-arylovou skupinu, -CH=CH-arylovou skupinu a NH(CH₂-aryl)ovou skupinu.

   Sloučenina podle nároku 1, kterou je sloučenina obecného vzorce kde

   R²⁰ je vybraná ze skupiny zahrnující atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslíkobsahující funkční skupinu.

   Sloučenina podle nároku 1, ve které je skupina R⁴ vybraná ze souboru zahrnujícího skupinu -N(CH3)R²¹, skupinu -N (CH2CH3) R²¹, skupinu -N (CH (CH3) ₂) R²¹ a skupinu -N (benzyl) R²¹, ve kterých skupina R²¹ představuje uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu.

   Sloučenina podle nároku 1, ve které je skupina R⁴ vybraná ze souboru zahrnujícího skupinu -CH2NH2, skupinu -NHCH2CH2NR²²R²³ a skupinu -CH2NHC (=0) R²², ve kterých jsou skupiny R²² a R²³ nezávisle na sobě vybrané ze souboru

   112 zahrnujícího atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny.

   16.

   17.

   18.

   • · 4 4 4 · 4 • · · · 4 · · · 4 4 4

   44·· 4 · · 4 444 4 ····

   4 · · 4 4 4·· • 4 · · · · · · ·

   Sloučenina podle nároku 15, ve které skupina R²² představuje atom vodíku a skupina R²³ představuje skupinu -C(=O)R²⁴, ve které skupina R²⁴ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslíkobsahuj ící funkční skupinu.

   Sloučenina podle nároku 1, kterou je sloučenina obecného vzorce nr²⁵r²⁶ kde

   R²⁵ a R²⁶ jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny.

   Sloučenina podle nároku 17, ve které R²⁵ představuje atom vodíku, alkylovou skupinu, hydroxyalkylovou skupinu nebo aralkylovou skupinu; a R²⁶ představuje haloalkylovou skupinu, hydroxylovou skupinu, skupinu C (=0) NR²⁷R²⁸, skupinu C(=O)OR²⁷ nebo skupinu NR²⁷R²⁸, ve které jsou skupiny R²⁷ a R²⁸ nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny.

   113 • · · ·· ·· * • · · · · · · • · · ···· · · · · ······ · · 9 4 4 4 494 4

   4 9 4 4 9 9 4 9
6. 9 4 9 4 4 9 4 4 4

   19.

   Sloučenina podle nároku 17, ve které R²⁶ představuje skupinu -C(H) (aryl) (R²⁹) , ve které skupina R²⁹ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslik-obsahující funkční skupinu.

   20.

   21.

   22.

   Sloučenina podle nároku 19, ve které skupina R²⁹ obsahuje alespoň jednu acylovou skupinu.

   Sloučenina podle nároku 19, ve které arylovou skupinou je naftylová skupina nebo benzothiofenylovou skupina.

   Sloučenina podle nároku 19, ve ktere skupina R obsahuje α-hydroxykarboxylátovou skupinu.

   23.

   Sloučenina obecného vzorce ,N kde

   R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce -NR⁵R⁶, ve které každá ze skupin R⁵ a R⁶ představuje nezávisle atom vodíku nebo uhlíkobsahující funkční skupinu; a • ·» *· • · · ♦ ftft · ftftftft ftftft* · · ftft · • ftftftft ft ftft ftft

   114

   R⁴ je aminoskupina, kterou není skupina -NH₂ nebo

   24.

   • ft · • ftft • ftftft ft ftft··· • ftft skupina

   Způsob inhibice D-Ala-D-Ala ligasy, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení D-Ala-D-Ala ligasy působení sloučeniny obecného vzorce (I) nebo obecného vzorce (II) kde

   A a B mohou nezávisle na sobě představovat atom dusíku nebo skupinu CR⁷, kde

   R⁷ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

   R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce -NR⁵R⁶, kde

   R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě představují atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu; a

   R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny; s

   115

   4· ·· · • · * · · · » • · · · 444 4 · 4 ·

   MM · · 44 444 4 444

   4 4444 44 4

   4 · · ·· · · ·

   25.

   26.

   27.

   tou podmínkou, že obě skupiny R³ a R⁴ nepředstavují atomy vodíku.

   Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že obě skupiny R¹ a R² představují skupiny -NH₂.

   Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že skupina R³ představuje atom vodíku.

   Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že skupiny R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, -O-alkylovou skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu -O-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -O-alkyl-OH, skupinu -NR⁷R⁸, skupinu -NR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-alkyl-COOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu

   -CONR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu -CONR⁷-alkyl-OH, -S-alkylovou skupinu, skupinu -S-alkyl-COOH, skupinu -S-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -S-alkyl-OH, -O-arylovou skupinu, skupinu -O-aryl-COOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -O-aryl-OH, -S-arylovou skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -S-aryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷-aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-aryl-COOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH nebo skupinu -CH2NR⁵C6H₄COOH; s tou podmínkou, že skupiny R³ a R⁴ nemohou simultánně představovat shodné rozvětvené nebo lineární alkylové skupiny;

   ·· ·0 00 • · · 0· • 0 00« 0 0 0 0 * ·· 0 0 0 00000

   0 0 0 0 0 · 0 • 0 • •00 0

   116

   28.

   skupiny R¹ a R² jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku, skupinu -NH2 a skupinu -NR^UR¹², přičemž alespoň jedna ze skupin R¹ a R² představuje skupinu -NH2;

   skupina R⁵ představuje nižší alkylovou skupinu, atom vodíku nebo skupinu -CH2NR^loC6H4CONHR⁶; kde R⁶ je vybraná ze souboru zahrnujícího -alkylovou skupinu, skupinu -alkyl-COOH, skupinu -alkyl-NH2 a skupinu -alkyl-OH;

   skupiny R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího lineární alkylovou skupinu, rozvětvenou alkylovou skupinu, arylovou skupinu a acylovou skupinu, které mohou být případně substituované jednou nebo více funkčními skupinami na bázi kyslíku, dusíku, síry nebo halogenu; a skupina A je vybraná ze souboru zahrnujícího atom dusíku nebo skupina CH.

   Způsob léčení pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému pacientovi podává účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I) nebo obecného vzorce (II)

   R1 N B R4 (II) kde » · · ···· · ·

   117 • · · • · · · · • · 9 9 9

   9 9 9 9 9 9 9 9

   29.

   30.

   31.

   A a B mohou nezávisle na sobě představovat atom dusíku nebo skupinu CR⁷, kde

   R⁷ představuje atom vodíku nebo uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupinu;

   R¹ a R² jsou stejné nebo rozdílné skupiny obecného vzorce -NR⁵R⁶, kde

   R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě představují atom vodíku nebo uhlík-obsahující funkční skupinu; a

   R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího atom vodíku a uhlík-, dusík-, síru-, halogen- a/nebo kyslík-obsahující funkční skupiny; s tou podmínkou, že obě skupiny R³ a R⁴ nepředstavují atomy vodíku.

   Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že obě skupiny R¹ a R² představují skupiny -NH₂.

   Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že skupina R³ představuje atom vodíku.

   Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že skupiny R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, -0-alkylovou skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu -O-alkyi-NR⁷R⁸, skupinu -O-alkyl-OH, skupinu -NR⁷R⁸, skupinu -NR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-alkyl-COOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu

   -CONR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu • φ · φ • · φφφφ • « · ·· φ

   118

   -CONR⁷-alkyl-OH, -S-alkylovou skupinu, skupinu

   -S-alkyl-COOH, skupinu -S-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu

   -S-alkyl-OH, -O-arylovou skupinu, skupinu -O-aryl-COOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -O-aryl-OH, -S-arylovou skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -S-aryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷-aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-aryl-COOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH nebo skupinu -CH₂NR⁵C6H4COOH; s tou podmínkou, že skupiny R³ a R⁴ nemohou simultánně představovat shodné rozvětvené nebo lineární alkylové skupiny;

   skupiny R¹ a R² jsou nezávisle na sobě vybrané ze skupiny zahrnující atom vodíku, skupinu -NH2 a skupinu -NR^UR¹², přičemž alespoň jedna ze skupin R¹ a R² představuje skupinu -NH2;

   skupina R⁵ představuje nižší alkylovou skupinu, atom vodíku nebo skupinu -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; kde R⁶ je vybraná ze souboru zahrnujícího -alkylovou skupinu, skupinu -alkyl-COOH, skupinu -alkyl-NH₂ a skupinu -alkyl-OH;

   skupiny R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vybrané ze souboru zahrnujícího lineární alkylovou skupinu, rozvětvenou alkylovou skupinu, arylovou skupinu a acylovou skupinu, které mohou být případně substituova· né jednou nebo více funkčními skupinami na bázi kyslíku, dusíku, síry nebo halogenu; a • Φ φ • * φ · · φ φφφ ··· · ΦΦΦΦ φ φφφ * ··’· φ · φφ φφφ φ φφφ • φ ΦΦΦΦ φφφ

   32 .

   33.

   34.

   35.

   skupina A je vybraná ze souboru zahrnujícího atom dusíku nebo skupina CH.

   Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu 1 v kombinaci s excipientem vhodným pro podávání subjektu.

   Způsob léčení subjektu s mikrobiální infekcí, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň, ve kterém se uvedenému subjektu podává účinné množství farmaceutické kompozice podle nároku 32.

   Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedeným subjektem je živočich.

   Způsob inhibice bakteriálního růstu v neživoucích systémech, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování uvedeného systému s takovým množstvím sloučeniny podle nároku 1, které je účinné pro inhibici bakteriálního růstu.

   36.

   Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená D-Ala-D-Ala ligasa zahrnuje sekvenci, jež je alespoň z 90 procent identická se sekvencí D-Ala-D-Ala ligasy z kmene vybraného ze skupiny zahrnující následující druhy bakterií: Escherichia coli, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Thiobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Buchnera • · · ···· · ·

   120 aphidícola, Bacillus halodurans, Geobacter sulfurreducens, Rickettsia prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus thermophile, Thermotoga maritima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae,

   Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp. , Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Legionella pneumophila, Leuconostoc mesenteroides, Borrelia burgdorferi,

   Treponema pallidum, Vibrio cholerae, and Helicobacter pylori.

   37. Způsob přípravy sloučeniny podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje reakci kteréhokoli z meziproduktů popsaných v tomto textu s jedním nebo více chemickými činidly v jednom nebo více stupních, za vzniku sloučeniny podle nároku 1.

   38. Produkt připravitelný způsobem podle nároku 37.