CZ137293A3 - Method of detecting malignant and pre-malignant changes in human cells - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká oboru biologie, zejména biologie rakoviny, zvláště pak způsobu detekce premaligních nebo maligních tkání.

Dosavadní stav techniky

Povrchové molekuly buněk, které se uplatňují při specifických interakcích mezi povrchem buňky a extracelulární matricí (ECM), se nazývají matriční receptory. Rozeznání matrice těmito receptory hraje důležitou úlohu při regulaci tvaru buněk, proliferaci a diferenciaci a je proto kritickým bodem normálního vývoje orgánů a zachovávání architektury tkáně. Známé matriční receptory zahrnují například skupinu transmembránových glykoproteinových receptorů, které mají společné strukturní a funkční vlastnosti a nazývají se integriny (Hyneš R. (1987) Cell 48: 549 až 554). Jedná se o 67-kDa glykoprotein, který se váže k lamininovému řetězci B1 (Graf a další (1987) Cell 48: 65: 989-996) a povrchové buněčné proteoglykany (PG), které v závislosti na složení glykosaminoglykanu (například heparansulfátu) mohou interagovat s různými molekulami matrice (Jalkanen M. (1987) Med. Biol. 65: 41 až 47).

Adheze, šíření, proliferace a diferenciace buněk jsou založeny na těsném kontaktu mezi povrchem buněk a obklopující extracelulární matricí (ECM). Selektivní použití interakce ligand-receptor může in vivo vytvořit různorodé specifické interakce buňka-matrice, kterých je zapotřebí pro vývin orgánů (Ekblom a další (1986) Ann. Rev.

Cell Biol 2: 27-47). 0 transformaci je známo, že mění odpověď buněk na ECM (Liotta L. (1986) Cancer Res. 46: 1-7), čímž vzniká možnost vzniku změn v expresi matričních receptorú maligními buňkami (Plantefaber a Hyneš (1989) Cell 56: 281-290; Cheresh a další (1989) Cell 57: 59-69). Tyto změny jsou ve značném rozsahu neznámé, ale mohou mít rozhodující úlohu při vzniku maligního chování různých typů buněk.

myši (Rapraeger 3632-3636;

Proteoglykan povrchových buněk z epitelových buněk prsní žlázy se skládá z lipofilní membránové domény a Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109) a z matricové interagující ektodomény, který obsahuje heparinsulfátové a chondroitinsulfátové řetězce (Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem 260: 11046-11052). Nedávné cDNA-klonování myšího a humánního syndekanu potvrdilo existenci těchto funkčních domén v jádrovém proteinu a tento buněčný proteoglykan (PG) byl označen názvem syndekan (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556; Mali a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Ektodoména syndekanu je rozeznána mAb 281-2 (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) a s vysokou afinitou se váže ke kolagenovým fibrilám typu I, III a V (Koda a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 8157-8162) a s nižší afinitou k doméně fibronektinu vázající C-terminální heparin (Saunders a Bernfield (1988) J. Cell. Biol. 106;

thrombospondinu (Sun a další (1989) J. Biol,

423-430), Chem. 264:

2885-2889) a tenascinu (Salmivirta a další (1991) J. Biol.

v tisku), domény k

Vazba ligandu povzbuzuje asociaci cytoskeletu, bohatému na aktin

Chem. 266: membránové (Rapraeger a další (1986) J. Cell Biol. 103: 2683-2696). Buňky epitelu však také mohou uvolnit ektodoménu z povrchu buněk proteolytickým rozštěpením jádrového proteinu, čímž dojde k oddělení ektodomény od membránové domény (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096; Weitzhandler a další (1988) J. Biol. Chem. 263: 6949-6952). Syndekan tedy může vázat cytoskelet epitelu k matrici, ale také uvolňovat asociaci epitelu s matricí. Těmito asociacemi může syndekan zprostředkovat organizaci matrice do buněčné organizace a ovlivňovat chování buněk. Jelikož syndekan interaguje hlavně se stromálními složkami, jako jsou kolagenové fibrily a fibronektin, může sloužit ke komunikaci mezi epitelovou a mesenchymální tkání. Tento typ komunikace má rozhodující význam při normální diferenciaci epitelu a tvorby orgánů.

Exprese syndekanu v průběhu vývoje a tvorby orgánů sleduje spíše morfogenetická a nikoliv histologická rozhraní (Thesleff a další (1988) Dev. Biol. 189: 565-572), což je znak, který rovněž podporuje aktivní roli syndekanu, jakožto matričního receptoru v průběhu vývoje. Syndekan byl lokalizován hlavně v různých epitelových buňkách (Hayashi a další (1987) J. Histotochem. Cytochem. 35: 1079-1088), ale vyskytuje se také na povrchu buněk plazmy (Sanderson a Bernfield (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 9562-9566). Syndekan se také vyskytuje v kondenzujícím mesenchymu v sousedství pučícího epitelu při tvorbě orgánů (Thesleff a další (1988) Dev. Biol. 189: 565-572). Ukázalo se, že jeho exprese v mesenchymu je regulována epitelovým kontaktem jednak v zubu (Vainio a další (1988)) a jednak v metanefrické ledvině (Vainio a další (1989)) a v obou těchto tkáních lze jeho expresi korelovat, jak co do prostoru, tak co do času, s morfogenezí těchto orgánů.

Podstata vynálezu

Úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce premaligních a maligních tkání prostřednictvím detekce ztráty syndekanu z těchto tkání.

Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce premaligních nebo maligních tkání prostřednictvím detekce přítomnosti syndekanu v tělesných tekutinách.

Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob, který by byl adaptovatelný zejména pro detekci maligních nebo premaligních tkání u člověka.

Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout biochemickou, imunohistologickou nebo molekulárně biologickou metodu stanovení exprese syndekanu nebo obsahu syndekanu v tkáních nebo tělesných tekutinách, za účelem zjištění maligních nebo premaligních transformací v buňkách.

Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob zjišťování hyperplastických změn v buňkách.

Ještě dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob detekce navržených hyperplastických změn v buňkách.

Ještě dalším úkolem vynálezu je vyvinout způsob detekce navržených morfologických změn v buňkách.

Úkolem vynálezu je také vyvinout způsob kvantitativního stanovení syndekanu v tkáních nebo tělesných tekutinách, za účelem stanovení indikátorové hodnoty.

Obecně lze shrnout, že podle nejširšího aspektu, je předmětem tohoto vynálezu způsob detekce potenciálně škodlivých transformací buněk organismu, jehož podstata spočívá v tom, že se stanoví indikátor obsahu syndekanu ze vzorku biologického materiálu organismu a stanovený indikátor obsahu syndekanu se porovná s referenčním indikátorem obsahu syndekanu z referenčního biologického materiálu, přednostně z materiálu stejného typu.

Způsob podle vynálezu je možno provádět různými metodami, které zahrnují biochemické, imunohistologické a molekulárně biologické typy metod. Způsob je sice aplikovatelný pro zjištění škodlivé transformace, jako je maligní nebo premaligní stav u mnoha druhů organismů, je však zejména adaptovatelný pro detekci škodlivých transformací v buňkách, zejména humánních buňkách. Transformace, které je možno stanovit, zahrnují premaligní a maligní transformace, včetně hyperplastických a morfologických změn.

Detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti syndekanu se může provádět v různých biologických materiálech pocházejících z organismu, jako jsou buňky, tkáně a tělesné tekutiny, z nichž lze, zejména v případě humánních biologických materiálů, jmenovat zvláště sérum, plazmu, moč, míšní mok nebo jiné tkáňové extrakty. Detekce obsahu syndekanu v biologických materiálech se může provádět za použití různých prostředků, jako například syndekan-specifických ligandů nebo biochemických determinantů, syndekan-specifických protilátek a syndekanových antimediátorových mRNA a cDNA nebo oligonukleotidů.

Další znaky a aspekty vynálezu a výhody, které vynález přináší, jsou zřejmé z následujícího podrobnějšího popisu, který se odkazuje na přiložený výkres.

Přehled obr, na výkrese

Na obr. 1A je graficky znázorněna závislost obsahu syndekanu na povrchu buněk na čase, která ilustruje ztrátu syndekanu v myších mammárních epitelových buňkách, transformovaných expozicí testosteronu.

Na obr. 1B je graficky znázorněna závislost exprese syndekanové mRNA na čase, která ilustruje ztrátu syndekanu v myších mammárních epitelových buňkách, transformovaných expozicí testosteronu.

Na obr. 2A až 2D jsou ilustrativní fotografie řezů biologického materiálu, tvořeného myší kůží, z nichž je zřejmý postup exprese syndekanu po expozici materiálu UV záření.

Na obr. 3A je ilustrativní fotografie ukazující suspenzi myších mammárních epitelových buněk, pěstovaných v monovrstvách, přičemž jedna vrstva byla transformována rasonkogenem.

Na obr. 3B je graficky znázorněn obsah syndekanu na povrchu buněk, v případě monovrstev, které jsou znázorněny na obr. 3A.

Předložený vynález je zčásti založen na poznatku, že detekce syndekanu je cenným diagnostickým kriteriem pro zjištění případných malignancí v biologických materiálech, jako jsou epitělové buňky. Jsou uvedeny příklady tří různých druhů experimentálně indukovaných transformací (hormonální indukce, UV-dráždění a onkogenová indukce) a ve všech těchto případech je zřejmý úbytek syndekanu. Detekce ztráty syndekanu je také cenná při jiných mechanismech, které vedou ke transformacím majícím za následek vznik nádorů a v důsledku toho se vynález neomezuje pouze na výše uvedené případy. Tak například detekce syndekanu může poskytnout cenné informace také při různých proliferačních stadiích tkání (například kůže, ledvin, mozku, plic a močového měchýře), které se později mohou zvrhnout do malignějšího stádia. Tyto tzv. premaligní stavy, které se často projevují jako dysplasie, jsou charakteristické různou úrovní syndekanu. Tato úroveň syndekanu představuje informaci, která je potřebná pro odhad vážnosti choroby, který je pak důležitý pro určení vhodného terapeutického postupu.

oblastí detekce syndekanu jsou také plazmě. Jejich analýza způsobem podle syndekan-specifických protilátek, jako FACS (fluorescent activated cell

Důležitou buňky cirkulující v vynálezu, za použití je například analýza sorter) poskytuje cenné informace o patofyziologickém stavu pacienta s lymphoma, myeloma, leukémií nebo jinými proliferativními stavy hernatopoietických buněk.

Je rovněž známo, že syndekan se uvolňuje z povrchu buněk (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096) a v případě určitých chorob může mít ztráta syndekanu z povrch buněk za následek, že se syndekan objeví v tělesných tekutinách. V souladu s jedním aspektem tohoto vynálezu má diagnostickou hodnotu měření obsahu syndekanu v séru, plazmě, moči, míšním moku nebo jiných tkáňových extraktech, za účelem zjištění, do jaké míry došlo k destrukci tkáně a ztrátě normální morfologie buněk ve studovaných tkáních.

Jak již bylo uvedeno výše, syndekan představuje proteoglykan povrchu buněk, který se skládá z kovalentně vázaných glykosaminoglykanových (GAG) řetězců a jádrového proteinu uloženého v membráně (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556). Řetězce GAG syndekanu náleží, jak známo, ke skupině heparansulfátu a chondroitinsulfátu (Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) a nejsou omezeny na syndekan. Jádrový protein syndekanu je jedinečný a definuje tuto molekulu jakožto člen ze souboru několika podobných povrchových buněčných proteoglykanů (Mali a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 6884-6889). Murinní (pocházející z hlodavců) syndekan byl původně izolován a ještě i nyní je obvykle detekován pomocí monoklonální protilátky (MnAb 281-2) proti jádrovému proteinu syndekanu (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984).

Za účelem dalšího vysvětlení vynálezu byla analyzována exprese syndekanu, ve vztahu k indukci maligního fenotypu u tří různých nezávislých biologických modelů, u nichž vždy došlo k maligní transformaci epitelových buněk. U všech těchto modelů byla současně s maligní transformací pozorována ztráta exprese syndekanu. Tyto výsledky byly získány při následujících modelových zkouškách, jejichž účelem je blíže ilustrovat tento vynález.

Při prvním modelu bylo použito buněčné linie mammárních nádorových buněk myši Shionogi 115 (S115). Tyto buňky představují vynikající model pro studie transformovaného fenotypu, protože vykazují odpověd na androgeny, která se projevuje zvýšením rychlosti jejich růstu (King a další (1976) J. Steroid Biochem. 7: 869-873) a změnou z epitelové na fibroblastickou morfologii (Yates a King (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Za přítomnosti androgenu vykazují buňky volnou adhezi ke spodní vrstvě schopnosti růst v suspenzi bez nepřítomnosti androgenu buňky a v suspenzi vůbec nerostou (Yates a King (1981) Cancer Res. 41: 258-262). Podstata této morfologické změny a nezávislosti na ukotvení je do značné míry neznáma, ačkoliv bylo navrženo několik mechanizmů, včetně změny cytoskeletální organizace (Couchman a další (1981) Cancer Res. 41: 263-269) a paracrinních mechanizmů (Darbre a King (1988) publikace Breast Cancer: Cellular and Molecular Biology, red. Μ. E. Lippman a R. B. Dickson, Academie Publishers, str. 307 až 341).

(substrátům) a nabývají zakotvení k matrici. Za těsně lnou k matrici

Buňky S115 ošetřené testosteronem vykazovaly silně RGDS-závislou vazbu k fibronektinu (FN), ale žádnou vazbu k doméně fibronektinu vázající heparin, což ukazuje, že exprimují molekuly typu integrinu. Namísto toho, buňky S115 pěstované bez testosteronu vykazovaly epitelovou morfologii a vazbu k doméně fibronektinu vázající heparin, což ukazuje, že došlo ke změně exprese syndekanu v buňkách S115, které byly ošetřeny hormonem. U buněk S115, které byly ošetřeny hormonem, došlo jak k poklesu množství ektodomény syndekanu vázající matrici (kvantitativně stanovenému radioimunostanovením a metodou Western blot), tak k poklesu množství syndekanové mRNA (2,6 kb). Přídavek antiandrogenního cyproteronacetátu ke kultivačnímu médiu měl opačný účinek než testosteron na syndekanovou mRNA. Inaktivace syndekanového genu a v důsledku toho potlačení exprese syndekanu, má vztah ke změněným adhezním vlastnostem, vymizení epitelového fenotypu a na druhé straně, objevení se fenotypu transformovaného typu u buněk S115, které byly ošetřeny hormonem.

Příklad výsledků získaných při výše uvedené zkoušce

1A a 1B. Na obr. 1A je uvedena reprezentace závislosti obsahu čase. Tato závislost v myších mammárních je znázorněn na obr srovnávací grafická povrchového buněčného syndekanu na ilustruje pokles obsahu syndekanu epitelových buňkách (S115), které byly transformovány expozicí testosteronu. Na obr. 1B je uvedena srovnávací grafická reprezentace závislosti obsahu synde kanové mRNA na čase. Tato závislost ilustruje pokles obsahu syndekanu v myších mammárních epitelových buňkách (S115), které byly transformovány expozicí testosteronu. Tyto reprezentace ukazují maligní chování a ztrátu exprese syndekanu, které jsou zřejmé u proteinu z obr. 1A a z hladiny mRNA z obr. 1B, po expozici. Z výše uvedeného vyplývá, že přídavek androgenu ke kulturám buněk S115 má za následek potlačení exprese syndekanu, k němuž dochází inaktivací syndekanového genu. Toto potlačení dobře koreluje s nabytím nezávislosti buněk na ukotvení a se ztrátou epitelového fenotypu a je tedy jedním z důvodů skutečnosti, že buňky S115 vykazují za přítomnosti androgenu transformované chování.

Při druhé modelové zkoušce byla studována imunoreaktivita syndekanu u lysých (hr/hr) myší, které byly exponovány ozařování UV-A a UV-B. Pozitivní zabarvení bylo pozorováno na povrchu normálních epidermálních buněk, jakož i v dermálních abortivních vlasových folikulárních cystách, které jsou charakteristické pro tento kmen myší. Také časná reakce na UV-ozařování, vykazující hyperplastickou epidermis s mírnou cellulární atypičností, byla pozitivní, i když došlo ke sníženému zabarvení povrchu epidermálních buněk. Vzorky s ostrou dysplasií vykazovaly slabé zabarvení ve vrstvě granulárních buněk, zatímco bazální vrstva buněk byla negativní. V papillomech a keratoacanthomech chodidla byla pozorována imunoreaktivita na syndekan, jak v benigních hyperplastických epidermálních buňkách, tak v proliferujících epidermálních buňkách rohovitých cyst. Maligní transformace, která byla vyjádřena jako tvorba karcinomů a sarkomů šupinovitých buněk byla vždy spojena se ztrátou syndekanového zabarvení. Tyto výsledky jsou v souladu s dřívějšími poznatky, že totiž při maligní transformaci pěstovaných epitelových buněk dochází k poklesu exprese syndekanu. Výsledky rovněž ukazují, jakou důležitou úlohu hraje syndekan při udržování normální architektury tkáně a při diferenciačním modelu kůže.

Příklady zabarvení u různých vzorků tohoto typu jsou uvedeny na obr. 2A až 2D. Tyto obr. představují ilustrativní fotografie řezů biologického materiálu, tvořeného myší kůží, z nichž je zřejmý postup exprese syndekanu po expozici materiálu UV záření. Na obr. 2A je znázorněna normální kůže a na obr. 2B a 2C jsou ilustrována různá stádia hyperplasie, přičemž z řezu na obr. 2C je zřejmá určitá maligní histologie. Tyto obr. ukazují, že premaligní hyperplasie, která je indukována UV zářením, je charakterizována postupnou ztrátou exprese syndekanu.

Z výše uvedeného je zřejmé, že epitelové buňky in vivo a uložené ve svém normálním prostředí ztrácejí v průběhu maligní transformace schopnost exprimovat syndekan, což opět ukazuje, že exprese syndekanu je nutná pro normální morfologii buněk a integritu tkáně a že lze korelovat pokles exprese syndekanu s vážností dysplasie a maligním charakterem epitelových buněk.

Při třetí modelové zkoušce bylo použito bodově mutovaného genu c-Ha-ras tranfsekované myší mammární epitelové buněčné linie. U těchto buněk NOG-8 ras je gen c-Ha-ras kontrolován promotorem MMTV-LTR a jeho expresi lze tedy regulovat dexamethasonem (Ciardiallo a další (1989). Když tyto buňky exprimovaly gen c-Ha-ras, vytvářely na misce s buněčnou kulturou ohniska a kolonie v suspenzi. Buňky NOG-8 ras pěstované v misce s buněčnou kulturou exprimovaly syndekan ve stejném množství jako normální buňky v subkonfluentním stavu. Exprese syndekanu však výrazně poklesla při transformaci fenotypu těchto buněk, t.j. na misce se vyskytovala ohniska nebo buňky rostly ve formě kolonií v suspenzi. Hladina syndekované mRNA však ve všech těchto různých kulturách zůstala na stejné úrovni. Je tedy regulace povrchového buněčného syndekanu u těchto buněk organizována posttranskripčně. Tyto výsledky ukazují, že společným úkazem je, že se v průběhu transformace snižuje exprese syndekanu, přičemž však způsob její regulace se bude u různých transformovaných buněk měnit podle jejich typu.

Příklad ztráty exprese syndekanu působením onkogenu je znázorněn na obr. 3A a 3B.

Na obr. 3A je ilustrativní fotografie ukazující suspenzi myších mammárních epitelových buněk, pěstovaných v monovrstvách, přičemž jedna vrstva byla transformována ras-onkogenem. Na obr. 3B je graficky znázorněn obsah syndekanu na povrchu buněk, v případě monovrstev, které jsou znázorněny na obr. 3A. Exprese syndekanu byla kvantitativně stanovena u všech epitelových buněk pěstovaných v monovrstvách a, b, c a f a po indukci ras v suspenzi d. Jak je zřejmé, z transformovaných myších epitelových buněk se ztrácí syndekan.

transformací diagnostický

Z výše uvedené zkoušky je také zřejmé, že se maligní transformace vyvolaná onkogenem rovněž projevila ve ztrátě syndekanu z povrchu epitelových buněk, což ukazuje, že ztráta syndekanu je společným znakem maligních a že detekce této ztráty představuje cenný prostředek pro stanovení transformací rakovinového typu a jejich prudkosti.

Existují tři přednostní postupy, jak stanovit obsah syndekanu způsobem podle tohoto vynálezu, t.j. postup biochemický, imunochemický a molekulárně biologický. První z těchto postupů je založen na biochemickém rozeznání syndekanu, který může být součástí jádrového proteinu nebo kovalentné vázaných řetězců GAG. Ukázalo se, že syndekan může vykazovat specifické řetězce GAG, udělovat specifické interakce (Elenius a Biol. Chem. 265: 17837-17943; Salmivirta a které mu mohou další (1990) J. další (1991) J.

Biol. Chem. 266: v tisku). Syndekan tedy může být detegován pomocí specifického ligandu pro syndekan. Při jiných vhodných metodách se však používá protilátek, které jsou specifické pro syndekan a cDNA, které jsou popsány dále.

Klonováním humáního syndekanu (Mali a další) 1990 J. Biol. Chem. 265: 6884-6889) nebo jeho izolací z humáních zdrojů, jako například humánní mammární buněčné linie HBL-100 (Elenius a další (1990) J. Biol. Chem. 265: 17837-17843) je možné vyrábět protilátky proti humánímu syndekanu. To se může provádět tak, že se zvířata imunizují, za účelem tvorby polyklonálních nebo monoklonálních protilátek nebo se buňky pěstují in vitro s izolovaným intaktním humáním syndekanem, jeho fragmenty, syntetickými peptidy nebo štěpnými proteiny předpovězenými humáním cDNA klonem, za účelem tvorby monoklonálních protilátek. Při praktickém provádění tohoto vynálezu se při stanovení obsahu syndekanu může používat konvečních technik molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantních DNA-technik a imunologických technik. Tyto techniky jsou podrobně vysvětleny v literatuře, viz například Current Protocols in Immunology (1990), Greene Publishing Associates a John Wiley & Sons, lne.

viz například model těchto metodách se

Za použití humánních syndekan-specifických protilátek se může studovat klasickými imunohistologickými metodami exprese syndekanu v tkáních, ilustrovaný na obr. 2A až 2D. Při specifického rozeznání dosáhne pomocí primární protilátky (polyklonální nebo monoklonální) ale sekundární detekční systém může používat fluorescenčních, enzymových nebo jiných konjugovaných sekundárních protilátek. Jako výsledek se získá imunohistologické zabarvení řezu tkáně pro patologické vyhodnocení. Tkáně lze také extrahovat, například močovinou nebo neutrálním detergentem, za účelem uvolnění syndekanu pro stanovení metodou Western blot nebo stanovení dot/slot) Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 105: 976-985; Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Při této technice, která je založena na použití kationtových pevných fází se může kvantitativně stanovit syndekan za použití izolovaného syndekanu, jako standardu. Této techniky lze také použít u tělesných tekutin. S těmito vzorky lze molární koncentrace syndekanu použít pro stanovení standardních hodnot obsahu syndekanu v různých tělesných tekutinách, jak je sérum, plazma, moč, míšní mok atd. Normální hladiny syndekanu lze zjistit z hodnot naměřených u zdravých dobrovolníků, přičemž tyto standardní hodnoty se potom porovnávají s hodnotami naměřenými u osob trpících různými chorobnými stavy.

Změny exprese syndekanu je také možno detegovat za použití syndekanové cDNA, jako je humánní syndekanová cDNA. Ačkoliv je syndekan mezi různými druhy dobře konzervován, strukturní rozdíly na úrovni nukleotidů jsou dostatečně velké, že to brání použití myšího syndekanu při detekci humánní syndekanové mRNA. Obvykle je možno hladinu mRNA daného genového produktu detegovat na základě specifické interakce negativní a pozitivní formy stejného nukleotidového řetězce, v tomto případě forem syndekanu. Přitom se může používat technik in šitu pro tkáňové vzorky, zkoušky ochrany mRNA pro izolovanou RNA nebo polymerace syndekan-specifických nukleotidových řetězců řízené primerem. Všechny tyto techniky jsou dobře vysvětleny v literatuře, jako například ve výše uvedené publikaci Current Protocols in Molecular Biology.

Specifické způsoby podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v následujících příkladech. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní chrakter a vynález se neomezuje na konkrétní provedení, která jsou v nich uvedena.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Lokalizace syndekanu v transformovaných epitelových buňkách

Zásobní buňky myšího mammárního tumoru Shionogi S115 se obvyklým způsobem kultivují v DMEM (Dulbecco-em modifikované Eagle-ovo médium), doplněném 5 % teplem inaktivovaného fetálního telecího séra (i-FCS), pyruvátem (1 mM) , glutaminem (1 mři), penicilinem (100 IU/ml), streptomycinem (100 μg/ml) a testosteronem (10 nm). Při studiích zahrnujících zpracování hormonem se používá růstového média doplněného 4 % fetálního telecího séra zpracovaného dextranovým aktivním uhlím (DC-FCS) s nebo bez 10 nm testosteronu a/nebo 1 μΜ cyproteronacetátu. Při experimentech se buňky nanesou na Nunc-ovu tkáňovou kulturu, umístěnou v miskách pro tkáňové kultury, při hustotě 10 000 buněk na cm². Pro počítání buněk se buňky lyžují v lOmM Hepes, 1,5mM chloridu hořečnatém s obsahem Zaboglobinu (Coulter Electronics, Ltd.) a uvolněná jádra se suspendují v Isotonu (Coulter) a nakonec spočítají v Coulterově počítači buněk.

Čtvrtý den se buňky S115 v intaktní kultuře obarví způsobem popsaným v Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984). Povrchový buněčný proteoglykan, syndekan, se imunolokalizuje krysí monoklonální protilátkou 281-2 proti jádrovému proteinu proteoglykanu (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-974) a vybarvení se kontrolují pomocí další IgG_2a monoklonální protilátky Mel-14, která je specifická pro lymfocytový receptor (lymphocyte homing receptor) (Gallatin a další (1981) Nátuře 304: 30-34). Detekce imobilizovaných protilátek se provedde králičím protikrysím FITC-konjugátem (Janssen Biochimica).

Příklad II

Detekce pozměněné exprese syndekanu při epitelových buněk vyvolané hormonem transformaci

Pro kavantitativní stanovení syndekanu na povrchu buněk S115 se buněčné monovrstvy několikrát promyjí chladným PBS a ektodoména molekuly se uvolní hovězím pankreatickým trypsinem (Sigma, typ III; 20 μg/ml) 10-minutovou inkubací na ledu, způsobem popsaným v Rapraeger a Bernfield (1983) J. Biol. Chem. 258: 3632-3636; (1985) J. Biol. Chem. 260:

4103-4109). Po inaktivaci trypsinu inhibitorem trypsinu (100 μg/ml) se buňky odstředí, oddělí se supernatant pro kvantitativní stanovení ektodomény a buňky se suspendují v Isotonu, za účelem jejich spočítání. Monoklonální protilátka 281-2 se joduje radioaktivním jodem oxidační metodou pomocí chloraminu-T (Stáhli a další (1983) Meth. Enzymol. 92: 242-253) do dosažení specifické aktivity

14,1.10 cpm/ug. Při zkoušce se v zařízení se štěrbinou (Minif old-slot Apparatus, Schleicher & Schuell) na kationtovou nylonovou membránu (Zeta-Probe, BioRad) nanese supernatant z 2xl0⁵ buněk a přečištěný kontrolní syndekan z buněk NMuMG, způsobem popsaným dříve (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096). Membrána se vyjme ze štěrbinového zařízení a inkubuje 1 místnosti v PBS, doplněném 10 % FCS, membrány. Potom se provede inkubace přes noc při 4 °C v PBS s obsahem 1251-značeného 281-2 (10 000 cpm/ml). Po pětinásobném promytí filtru PBS se provede expozice na film Kodak X-Omat, za účelem vizualizace vázané látky 281-2. Pro kvantitativní stanovení se každá štěribna analýzuje (LKB se hodinu při teplotě za účelem blokování laserovým densitometrem densitometer) a porovná z buněk NMuMG.

Ultroscan XL enhanced laser známým množstvím syndekanu

Ektodomény uvolněné trpysinem z buněk Sil5 se vysrážejí ethanolem a frakcionují na gradientovém (4 až 10 %) gelu SDS-PAGE (0'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-40021. Po elektroforéze se vzorky transformují na membránu Zeta-Probe pomocí elektroblotovacího zařízení 2005 Transphor Apparatus (LKB), způsobem popsaným výše (Jalkanen a další (1985) J. Cell Biol. 101: 976-984; Rapraeger a další (1985) J. Biol. Chem. 260: 11046-11052) a membrána se exponuje 1251-značené látce 281-2, způsobem uvedeným výše. Opět i zde je možno použít pro srovnání izolované syndekanové ektodomény z buněk NMuMG.

Příklad III

Detekce pozměněné exprese syndekanového genu v transformovaných epiteových buňkách

Za použití 4M isothiokyanátu guanidinu a peletizace pomocí chloridu česného (viz Chirgwin a další (1979) Biochem. 18: 5294-5299) se izoluje celková RNA. Alikvoty RNA o hmotnosti 15 μg se frakcionují na agarosovém gelu s formaldehydem (1 %) a přenesou na membránu Gene Screen Plus. Provede se hybridizace s insertem cDNA próby PM-4 pro syndekan, značeným multi-primem (Amersham) (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556), za podmínek navržených výrobcem membrány (New England Nuclear). Imobilizovaná próba se vizualizuje expozicí membrány na film Kodak X-Omat při 70 °C a kvantifikace 2,6 kb mRNA se provede densitometrickou analýzou, popsanou výše. Exprese syndekanové mRNA se koreluje s ribosomální RNA způsobem popsaným v Denis a další (1988) Nucl. Acid Res. 16: 2354-2359. Specifičnost potlačení syndekanu se dále studuje na stejných vzorcích, u nichž se zjišůuje poměr glyceraldehyd 3-fosfát-dehydrogenasy (GAPDH) (Fort a další (1985) Nucl. Acid Res. 13: 1431-1442 a myšího alfa-aktinu (Minty a další (1981) J. Biol. Chem. 256: 1008-1014).

Hybridizace cRNA in sítu u parafinových řezů se provádí způsobem popsaným v Wilkinson a další (1989) Developm. 105: 131-136. 535bp fragment Sac I-Kpn

I z částečného cDNA klonu pro myší syndekan (PM-4) (Saunders a další (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556) se subklonuje (Vainio a další (1991) Development, v tisku) do riboprobového pGEM-4Z vektoru (Promega, Madison, WI). Klonovaný plasmid obsahující insert se linearizuje enzymem Eco RI nebo Hind III a vyrobí se a negatvní nebo pozitivní transkripty se vyrobí z komplementárních řetězců pomocí jednak T7- a jednak SP6-polymerasy, za přítomnosti ³⁵S-UTP (Amersham, Willshire, Velká Británie). Maximální délka transkriptů se alkalickou hydrolýzou sníží na hodnotu pod 200 bp a frakce s nejvyšší specifickou aktivitou se shromáždí, vysráží a rozpustí v hybridizačním pufru. Předem upravené preparáty se hybridizují přes noc při 50 °C a nespecificky vázaná próba se odstraní (pomocí důkladného promytí a zpracování ribonukleasou A) a výše uvedeným postupem se pořídí autoradiografie (Wilkinson a další (1989) Development 105: 131-136).

Příklad IV

Detekce pozměněné exprese syndekanu v tkáňových řezech odebraných z nádoru

U samců světle pigmentované lysé myši kmene hr/hr C3H/Tif (Bomholdgaard, Dánsko) se vyvolají nádory tím, že se zvířata ozáří ultrafialovým zářením UV-A a UV-B, způsobem popsaným v Talve a další (1990) Photodermatol. Photoimmunol. Photomed 7: 109-115. V průběhu doby pozorování (12 měsíců) se vyskytne celkem 83 papilomú, 2 keratocanthomy, 4 skvamocelulární karacinomy, 1 kombinovaný karcinosarkom a 11 sarkomů, přičemž zvýšená tvorba nádorů je spojena s vysokou intenzitou záření UV-A (582 J/cm²) plus vysokou intenzitou záření UV-B (erythemálně účinná = EE) (1,0 J/cm²) plus vysokou intenzitou UV-B (EE) (0,8 J/cm²) (78/28 nádorů). Vzorky se odeberou ze všech větších pozorovatelných nádorů, stejně tak jako z normálně vyhlížející kůže exponované UV zářením. Část vzorků se fixuje v 10% tlumeném formalinu, uloží do parafinu a vyrobí se řezy, které se obvyklým způsobem obarví hematoxylinem a eosinem. Zbytek vzorků se zmrazí v kapalném dusíku a nařeže. Léze se klasifikují podle standardních histopatologických kriterií. Pro vizualizaci podkladových membrán, jakož i Herovic-ova, Weigert-ova, Masson-ova trichromu a Gomori-ho skvrn u typu kolagenu, jakož i jiných skvrn se v některých případech použije Schiffova barvení kyselinou jodistou (PAS) a podle potřeby se provede elektronová mikroskopická analýza.

Pro imunohistochemickou lokalizaci syndekanu se použije krysí monoklonální protilátky 281-2. Tato protilátka je specifická pro jádrový protein myší syndekanové ektodomény (18). Pro detekci imobilizované látky 281-2 se použije techniky s avidinbiotin-imunoperoxidasou, která je popsána v Hsu a další (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577-580). Po deparafinizaci a rehydrataci tkáňových řezů se aktivita endogenní peroxidasy zablokuje inkubací preparátů ve 100% methanolu obsahujícím 3 % peroxidu vodíku po dobu 30 minut. Potom se řezy inkubují s 2% normálním kozím sérem (Vector Laboratories lne., Burlingame, CA) v Tris-tlumeném solném roztoku, pH 7,4 (TBS) po dobu 30 minut při teplotě místnosti, aby se minimalizovalo nespecifické barvení. Řezy se pokryjí primární protilátkou 281-2 při koncentraci proteinu 2 μg/ml v BSA-TBS o koncentraci 10 g/1, načež se provede inkubace přes noc při 4 °C. Potom se preparáty po dobu 30 nakonec inkubují s biotinylovaným kozím protikrysím IgG (Jackson’s Immunoresearch Laboratories, lne., West Baltimore, Pennsylvania) při ředění 1:1000 v 1% BSA-TBS minut při teplotě místnosti a s avidinbiotin-peroxidasovým komplexem (souprava Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA) po dobu 30 minut pří teplotě místnosti. Po promytí se aktivita peroxidasy demonstruje inkubací preparátů s 0,5 mg/ml 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochloridem (DAB, Polysciences, lne., Northhampton, Velká Británie) v TBS s obsahem 0,68 mg/ml imidazolu a 0,01 % peroxidu vodíku po dobu 5 minut v temnu. Preparáty se slabě protiobarví Mayer-ovým hematoxylinem a uloží do media Depex Mounting Medium (BDH Limited Pool, Velká Británie). Mezi všemi stupni se preparáty třikrát promyjí Tris-tlumeným solným roztokem (TBS). U kontrolních řezů se používá normálního krysího IgG (Sigma, St. Louis, MO) o koncentraci 2 μg/ml. Také se obarví několik zmrazených řezů z tumoru každého typu, přičemž se dosáhne stejné imunoreaktivity jako u tkáňových řezů, které jsou uloženy v parafinu. Změny koncentrace primární protilátky a inkubační doby významně nezmění profil barvení.

Příklad V

Detekce pozměněné exprese syndekanu při transformaci indukované ras-onkogenem

Buňky NOG-8 představují subklon normální epitelové buněčné linie myší mléčné žlázy NMuMG. Buňky NOG-8 ras jsou linií buněk NOG-8, která byla transfekována plasmidem obsahujícím glukokortikoidem indukovatelný promotor MMTV-LTR, vázaný k místu mutovaného genu c-Ha-ras. Buňky se nechají růst v kultivačním mediu RPMI 1640 (Gibco), doplněném 5 % fetálního telecího séra, zpracovaného 5% dextranovým uhlím (DCC-FCS), glutaminem, penicilinem (100 IU/ml) a streptomycinem (100 μg/ml). U těchto buněk se může exprese genu c-Ha-ras maximálně indukovat přídavkem dexamethasonu (1 μΜ) (Sigma) ke kultivačnímu médiu. Pro odstranění přídavných steroidů ze séra se použije zpracování DCC, které může ovlivnit expresi transfekovaného genu. U suspenzních kultur se bakteriologické misky pokryjí 1% agarem (Sigma) v RPMI-1640, aby se zabránilo možné adhezi buněk k substrátu. Buňky se naočkují v hustotě 1 x 10⁵/ml. Počet buněk se stanoví po trypsinaci za použití Coulterova počítače (Coulter Electronics, Hialeah, FL). PM-4 je cDNA próba pro syndekan, původně klonovaná Saunders-em a dalšími (1989) J. Cell Biol. 108: 1547-1556. Detekuje 2 pásy, 2,6 kB a 3,4 kB z normálních myších mammárních buněk.

Při výrobě RNA se misky pro buněčné kultury 2 x promyjí ledově chladným fosfátovým pufrem tlumeným solným roztokem (PBS) a potom se solubilizují v 4M pufru GIT (4M isothiokyanát guanidinu v 5mM citranu sodném (pH 7,0), 0,lM β-merkaptoethanolu a 0,5% N-laurylsarkosinu). Extrakce celkové RNA se provede densitometrickou centrifugací pomocí chloridu česného (viz Chirgwin a další (1979) Biochem. 18: 5294-5299). Pro analýzu Northern Blot se vzorky RNA separují elektroforézou na 1% formaldehydovém agarosovém gelu. Tyto gely se blotováním přenesou na hybridizačni membránu GeneScreen. Filtry se předhybr.idizují v 1M chloridu sodném, 1% dodecylsulfátu sodném, 10% x v Denhardt-ově roztoku, 100μg/ml dextransuflátu, 5 lososí spermové DNA a 50% formamidu při 42 °C. Pro hybridizaci se přidá multiprimem značená PM-4 nebo BS-9 próba. Používá se izotopu P 32 (Amersham). Filtry se promyjí při 65 °C, v případě

PM-4 a při 60 °C, v případě BS-9 ve 2x SSC, 1% dodecylsulfátu sodném a autografují na film Kodak X-Omat nebo Fuji X-ray.

Pro kvantifikaci exprese syndekanu na povrchu buněk se buňky v kultivační misce 3x promyjí ledově chladným PBS. Potom se misky inkubují v 0,5mM draselné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny (K-EDTA) v PBS po dobu 10 minut při +4°C. Přidá se trypsin (Sigma, T-8128) do konečné koncentrace 20 ug/ml a provede se 10-timinutová inkubace při +4 °C. Trypsin uvolní syndekanovou ektodoménu do media (Rapraeger a Bernfield (1985) J. Biol. Chem. 260: 4103-4109). Buňky se seškrabou gumovou stěrkou nebo se kolonie suspendují a přidá se inhibitor trypsinu (Sigma, T-9128) až do koncentrace 100 μg/ml. Buňky se odstředí (5 minut, 100 x g) supernatant se shromáždí a buňky se spočítají v Coulter-ově počítači. Buňky v suspenzi se shromáždí ve zkumavce a kolonie se nechají 5 minut sedimentovat, načež se odstraní supernatant, podobné jako u kultur v Petriho miskách. Kolonie se 3x promyjí ledově chladným PBS a potom se na né působí trypsinem.

Vhodné množství suernatantu, které odpovídá počtu 2x10buněk se blotováním nanese na kationtovou nylonovou membránu (Zeta Probe, Βίο-Rad). Membrána se předinkubuje v inkubačním pufru (10% fetální telecí sérum, lmM azid sodný, PBS) 1 hodinu při teplotě místnosti. K iknubačnímu pufru se v konečné koncentraci 10000 cpm/ml radioaktivně značená (metodou pomocí chloraminu-T) látka MnAb 281-2 (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096), která rozeznává ektodoménu syndekanu a směs se inkubuje přes noc při 4 °C. Filtr se 10 minut promývá PBS při teplotě místnosti. Promývání se opakuje lOx a potom se filtr autoradiografuje na rentgenografický film. Autografie se analyzují densitometrem GelScan XL Ultroscan Densitometer (LKB) pomocí software GelScan SL 2400 (LKB) a standardizují izolovanou ektodoménou (Jalkanen a další (1987) J. Cell Biol. 105: 3087-3096).

Souhrnně lze konstatovat, že se vynález hodí pro detekci potenciálně škodlivých transformací, která se provádí prostřednictvím stanovení exprese syndekanu nebo jeho obsahu, například jeho hladiny v tkáních nebo různých tělesných tekutinách, postup lze provádět biochemicky, imunohistochemicky a molekulárně biologicky, například za použití syndekan-specifických ligandů, protilátek (polyklonálních nebo monoklonálních) a cDNA. Způsob je speciálně zaměřen na maligní změny epitelových buněk, u nichž se projevuje v průběhu maligní transformace silný pokles exprese syndekanu. Do rozsahu postupu spadá také ^J analýza exprese syndekanu při hyperplasii a v tomto případě má význam pro odhad vážnosti tohoto premaligního stavu. Analýzy exprese syndekanu jsou obzvláště užitečné při klasifikaci různých premaligních proliferativních stadií dysplasií.

' ^/372-7

Λ

Claims (18)

1. - 24 PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob detekce maligních a premaligních změn v humánních buňkách, vyznačující se tím, že se

   a) stanoví obsah syndekanu v buňkách, který je přítomen v první tekutině nebo vzorku tkáně vyšetřovaného člověka, přičemž první vzorek se odebírá z tekutiny nebo tkáně, u níž je podezření ne obsah maligních buněk, premaligních buněk, hyperplastických buněk nebo buněk, vykazujících morfologickou změnu ve srovnání s jejich normálním stavem;

   b) obsah syndekanu stanovený ve stupni a) se druhého vzorku bioporovná s úrovní syndekanu, získanou z logického materiálu, přičemž druhý vzorek biologického materiálu představuje tekutinu nebo tkáň stejného typu, jakého je první vzorek biologického materiálu, přičemž však tento druhý vzorek pochází z buněk, které jsou normální nebo méně transformované než buňky ve stupni a); a

   c) stanoví se přítomnost maligních nebo premaligních změn na základě přítomnosti menšího množství syndekanu v prvním vzorku ve srovnání s druhým vzorkem biologického materiálu.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že změnou je maligní transformace.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že změnou je premaligní transformace.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že změnou je hyperplasie.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že změnou je morfologická změna.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví zjištěním hladiny syndekanového proteinu.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se t í m, že hladina syndekanového proteinu se stanoví za použití protilátky, která rozeznává syndekanový protein.
8. 8. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví zjištěním hladiny syndekanové mRNA.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že obsah syndekanu v prvním vzorku se stanoví postupem, kterým se zjišťuje množství syndekanové ektodomény v tomto vzorku.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že se před stanovením uvolní syndekanová ektodoména prvního vzorku z povrchu buněk.
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se pro stanovení obsahu syndekanu v prvním vzorku použije humánní syndekan-specifické protilátky.
12. 12. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se pro stanovení obsahu syndekanové mRNA v prvním vzorku použije humánní syndekanové pozitivní mRNA.
13. 13. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že se pro stanovení obsahu syndekanové mRNA v prvním vzorku použije syndekanového pozitivní oligonukleotidu.
14. 14. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že biologickým materiálem je tělesná tekutina.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že tělesnou tekutinou je plazma.
16. 16. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že tělesnou tekutinou je sérum.
17. 17. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že tělesnou tekutinou je moč.
18. 18. Způsob podle nároku 14, vyznačuj ící se t í m, že tělesnou tekutinou je míšní mok.

    MP-1033-93-HO λ' Ίΐ fZ - Ί

    Obr. ΙΑ Obr. 1Β ε 6 'λ s ϋ

    X i

    42>ΤΖ-^ιί