CS202517B2

CS202517B2 - Method of producing derivatives of 21-hydroxy-20-methyl-pregnane

Info

Publication number: CS202517B2
Application number: CS788574A
Authority: CS
Inventors: Alfred Weber; Mario Kennecke; Rudolf Mueller
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1977-12-19
Filing date: 1978-12-19
Publication date: 1981-01-30
Also published as: DE2757156A1; DK570578A; IE782486L; ATA904778A; JPS5581A; AT363625B; DD139859A5; IE47691B1; GB2010276B; JPS6350000B2; DK144708B; EP0002535A3; YU285578A; DE2861249D1; EP0002535B1; SU862830A3; DK144708C; GB2010276A; HU181505B; EP0002535A2

Description

(54) Způsob výroby derivátů 21-Ьу0гоху-20-те1Ьу1-ргедпапи

Předmětem vynálezu je způsob výroby derivátů 21-hydroxy~20-meehyl-pregnanu obecného vzorce I *-

(I) ve kterém vazba

.... značí jednoduchou vazbu nebo dvojnou vazbu, fereentací zoosterolů nebo · fytosterolů kulturou Mycooaaterium ·spec. NRRL B-3683 nebo NRRL B-3805 nebo jejími variantami a mutantami.

Je známé, že kultury Mycoobateritm spec. NRRL B-3683 a NRRL B-3805 mmaí schopnost tvořit ze zoosterolů nebo fytosterolů deriváty 21-hydroxy-20-meethl-pregnanu obecného vzorce I (.Apppied. Microbiology 21» 19*72, 72 ff. a Apppied and Eivironrnennal Microbiology 22, 1976, 310 ff.). Tyto sloučeniny se však tvoří pouze ve stopách nebo ve velmi malém výtěžku, takže známý způsob·je technicky téměř nepoužitelný.

202517 2

Způsobem podle vynálezu je možno dosáhnout význačné vyšších výtěžků derivátů 21-hydroxy-20-methyl~pregnenu obecného vzorce I, než způsobem známým.

Zoosteroly a fytosteroly vhodné pro fermentaci jsou například cholesterol·, stigmasterol, kammesstroo, brašsikasterol nebo sitosteroly, 3-acylsloučeniny - jako například . acstáty těchto sterol ne^bo 3-^^- Δ4-_>ttsrsi^dy, zíslcané z -těchto sterolů. Oppénauerovou oxidací , jako například 4-cholssten-3-sn, 4-sti^mastsn-3-sn, Á-sito^en^-on nebo 4-k8mpesten-3-sn.

Podle vynálezu .se fermentace provádí v příoomnoosi boritanových iontů nebo organických sloučenin boru. Vhodné sloučeniny boru jsou například kyselina booitá, meeaboritan sodný, tstrtbsrittn dvojsodný, mmeaboritan vápenatý nebo . t.ifeenylOoritto. Fsrmentace se výhodně provádí v 0,1 % až 0,5 % látek posilujících 0rritanové ionty.' Přidávání látek p^É^skyt^jzících ’ brгit(Olrvš ionty se výhodně provádí 10 až 30 hodin po začátku fe^e^ace.

Při přidávání látek pon^t^ících bořitanové ionty je třeba dbát na to, aby hodnota pH fermentační kultury byla ·obvyklým způsobem upravena na hodnotu mezi 6,0 a 8,0.

Jinak se fsrueohacr provádí za obvyklých podmínek. Mikroorganismy se kU-ti-vUj ve vhodném · ' živném prostředí za provzdušnování submmeaní kultury. Potom ss ks kul tímto přidá substrát (rozpuštěný vs vhodném rozpouštědle osbo výhodně emulgovaný) a fermentuje se až se dosáhne . maximéiání transformace a^t^b^s^rátu (asi 96 až 160 hoddn)'.

Vhodná rozpouštědla t.ubotrátu jsou například mediáno o, ethanol, glykrlmononethhУlSher, dimethylfooraamid osOo <3101^1^8^^x1^. Ernulgace s^l^s^s^t^^átu . ss může dosáhnout nappíkltd tím, že ss subosrát v uikrroisováoé formě osOo rozpuštěný v rozpouštědle mísiteOném s vodou (jako v mmthiaiolu, ethanolu,. acetonu, glykolmenommehyyetheru, dimethylformtmidu osOo diueShyУsslfoxidu) ža silné turbulence ™ζ]ί^1.ί ve vodě (výhodně ve vychlazené), která obsahuje obvyklé emmlgační prostředky. Vhodné prostředky jsou ог^о^шО emulgátory, jako ntppíklad adukty ethylenoxidu osOo . estery mastných kyselin s polyglykoly. Jako vhodné smulgátory jsou pHklatoě jmenovka v Schodě obvyklá siráčedla Tegio(^R\ . T^at^, Teee^ a S^pao^^R\ a

. Ernulgacs subos-rátů u fe2mrotacr často umožňuje zvýšené prosazení subosrátu a tím zvýšení koncentrace subas-rátu. Je však . samozřejmě také možné u způsobu podle vynálezu pouUívat jiné metody ks zvýšení ·prosazení .subosrátu·, jak jsou odborníkům v oboru ferusntαcs jistě známá. '

Oppimmání koncentrace subosrátu, doba přidávání subosrátu a doba feгueohace jsou závislé na struktuře použitého substrátu. Tyto veličiny se uuus, jak je to př mikrobiologických ttriridoích transformací všeobecně potřebné, zjišťovat v jrdootliééu případě po- . kušně, jak je to pro odborníka běžoé.

Dalšího zvýšení· prodUktů způsobu je možno dosáhnout obvyklým způsobsm provedenou selekcí osOo mUscí myc^kte^í Species.

Tak ss například mohou Mycobatteriím spec. NRRL B-3805 - účelně po · ošetření mutagsny - rozlít oa desky· krevního egaru a obdrží se jednotlivé kolonie rozdílného uorfolrgickšhr vzhledu. Izol^j-li ss tyto jedno o, li vé kolonie a zkoUš-lVM oa jejich schopnost vytvářet deriváty .21-hydioxyl20-uethyl-prβgnαou obecného vzorce I, zjistí se, žs zejména mezi selektivními kmeny, které tvoří kulaté kolonie, jsou často kmeny, které tvoří deriváty 21-hydroxyl20-uethyl-pregntnl v 1,5 až 3oátr0ně vyšším · výtěžku .osž kmen o^elek-lAvovaný. *

Deriváty 21lhydioxyl20luethyl-pregntou obecného vzorce I jsou csnoé meziprodukty k syntéze farmtkologicky účinných staroi-dů. Tak je například možné tyto sloučeniny oxidovat oa rddeoVddtící kyseliny piegnιan20-kαiboxylovš obecného vzorce lil · které se mohou způsobem popsaným H. Ruschigem .a . kol. (Chem. Ber. 88, 1955, 883 ff) převádět v rddeoVddtjcí deriváty pregnano3,20idic)ou vzorce IV.

(Y = vodík nebo 17* -hydroxy)

Sloučeniny takto získané se jak známo vyznačují gestagenní účinností a jsou mimo to cennými meziprodukty к syntéze početných farmakologicky účinných steroidů.

Dále uvedené příklady slouží к bližšímu vysvětlení vynálezu.

Přikladl

a) Dvoulitrová Erlenmayerova baňka s 500 ml sterilního živného prostředí obsahujícího % kvasnicového extraktu

0,45 % hydrogenfosforečnanu dvoj sodného

0,34 % dihydrogenfosforečnanu draselného

0,2 % Tágetu ^R02 -

- upraveného na pH 6,7 - se zaočkuje suspenzí suché kultury Mycobacterium spec. NRRL B-3805 a 3 dny se třepe při 30 °C 190 otáčkami pro minutu.

b) 22 g sitosterolu se s 4,4 g Teginu^ a 430 ml vody při 95 °C emulguje s Ultra- ( rT

-Turraxenr ^} (firmy Jahnke a Kunkel) 25 minut a potom se doplní vodou na 513 g· Emulse se sterilisuje 20 minut při 120 °C.

c) Erlenmayerova baňka obsahu 500 ml se 65 ml sterilního živného prostředí s obsahem g kukuřičného extraktu

0,3 g hydrogenfosforečnanu dvojamonného

0,25 g Tagatu^(R)02

- upraveno na pH 6,5 - se zaočkuje 5 ml násadní kultury Mycobacterium spec. Potom se přidá 28 ml suspenze vyrobené podle 1b) (to odpovídá 1,2 g sitosterolu) a po 24 hodinách 4 ml 4% vodného roztoku tetraboritanu sodného a za třepání se fermentuje dalších 120 hodin při 30 °C.

Po provedené fermentaci se kulturová břečka dvakrát extrahuje vždy 1.00 ml ethylenchloridu. Ke spojeným ethylench.loridovým extraktům se pak přidá 11 g aktivního uhlí a filtruje se přes skládaný filtr. Filtrát se pak při 40 °C zahustí v rotační' odparce a chromatografuje se na kysličníku hlinitém. Po chromatografii se získá 135 mg 21-hydroxy-20-methyl-4-pregnen-3-onu o teplotě tání 140 až 141 °C (z ethylacetátu).

Prcv^ádíM se reakce za stejných podmínek, · ale bez přídavku roztoku tetraboritenu sodného, ' tak se obdrží 45 mg 21-hydro2Qr-20-míthhl-4-pregnen-3-onu. Příklad 2

a) Jak popsáno v příkladu 1 b) připraví se z 22 g 4-cholesten-3-onu 513 g emuuze.

b) Za podmínek příkladu 1 c) se kultivuje 70 ml kultury Miobaaterium spec. NRRL

B-3805, přidá se 28 ml emulze 4-cholesten-3-onu a po 24 hodinách 4 ml 4% vodného roztoku tetraboritanu sodného a·za třepání se fermentuje dalších 120 hodin při 30 °C. Fermentační násada se zpracuje jak popsáno v příkladu 1 c) a obdrží se 95 mg 21-hidroxy-20-1^^^1-4-pregnen^-onu o teplotě tání 142 až 144 °C. ,

Pr^vád-li se-reakce za stejných podmínek, ale bez přídavku roztoku tetraboritarnu sodného, obdrží se 40 mg 21-h1dгobχ-20-míthh1-4-prtgnen-3-bnu.

Příklad 3 ml sitosterolové emulze připravené podle příkladu 1 b) se fermentuje, jak popsáno v příkladu 1 c), 70 · ml kultury Mioobcteriím spec. NRRL B-3805, přičemž se vodného roztoku tetraboritanu sodného použije přídavek 6 ml 4% suspenze meeabbbitanu vápenatého ve vodě.

Po·zpracování fermentační násady, jak popsáno v příkladu 1 o), se získá 120 mg 21-hydrox1-20-metlhyl-4-pregntn-3-onu o teplotě tání 141 ai 143 °C.· · ,

Příklad 4' , . ' ml sitosterolové emuuze, jak popsáno v příkladu 1 · c)·, sefermentuje 70 ml kultury . Mioobateriím spec. NRRL B-3805, , přičemž se místo vodného roztoku tetraboritanu sodného použije přídavek 5 ml 4% roztoku triferyl. bořit anu.

. Po zpracování feríentační násady, jak popsáno v příkladu .1 c), · se·získá 125 mg 21-hydrbxy-20-míe]!hfl“4-pregntn-3-bnu o teplotě tání 142 · ai 143 °C.

Příklad 5. '

o)Za podmínek příkladu 1 a) se kultivuje Myooaateriím spec. NRRL Β-36Θ3.

b) K 65 ml živného prostředí popsaného v příkladu 1 o) se přidá 5 íL násadní kiltury Му^аНе^^ spec. NRRL B-3683. Potom se dá 28 ml kuLtury do emulze titbtttrblu popsané v příkladu 1 b) o po 24 hodinách se přidají 4 ml 4% roztoku tttrabbritcnu sodného o fermentuje se dalších 120 hodin. ^eгmtltι^<^l^:- násada se zpracuje, jak popsáno v příkladu 1 č), a obdrží se 90 mg 2-1-h1íг<»QУ20-míthhУ-114-prtgnaditn-3-onu o teplotě tání 180 až 182 °C (z tth1lccetdtu acetonu).

Příklad 6 ’ · ml násadní kultury Myooaateriím spec. NRRL B-3805 -vyrobené podle příkladu 1 a) - se bdítřt(lujt při 4 000 otáčkách za minutu.

^l· ' v

Takto získaná bakteriální hmctai se pak dvakrát promuje solným roztckem puffroviným na pH 6, který obsahuje 0,5 % chloridu sodného, 0,012 % ^гсш hořečnatého (hep^<tch1drtd^чt) a 1,36 % dih1drbgenibsfortčnanu draselného, suspenduje ·se ve 40 ml tohoto solného roztoku a přidá se · 10 ml · 0,5% 1-mítty1--зnitrb-1-nitobSbgucnidinu.

Suspenze bakterií se hodinu inkubuje při 30 °C, bakterie se odstředí, dvakrát se promývá výše jmenovaným solným roztokem a rozlije sena desky krevního agaru (výrobní firma Oxoid Ltd., Londýn). Ze vzniklých jednotlivých kolonií se vždy volí ty, které tvoří kulaté kolonie a z těchto se vždy připraví násadní kultury, jak popsáno v příkladu 1 a). Násadní kultury vždy slouží к provádění fermentace popsané v příkladu 1 c), s následujícím výsledpregnen-3-onu s přídavkem tetraboritanu sodného kem:

Počet testovaných selektivních kmenů

Výtěžek 2'1 -hydroxy-20-methyl-4bez přídavku tetraboritanu sodného

19 '	0 -	200 mg	—
8	201 -	400 mg	—
94	401 -	600 mg	—
35	601 - 800 mg	—
7	801 - 1	1 000 mg	1 550 - 2	1 00 mg
0	1 001 - 1	1 020 mg	—
6	1 021. - 1	1 040 mg	1 900 - 3	000 mg
1	1 041;.- 1	1 060 mg	2 900	mg
	(150 mg)
. 0	1 061 -	1 080 mg	... _
1	1 081 - 2 000 mg	3 450	mg
	(195 mg)

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby derivátů 21-hydroxy-20-methyl-přegnanu obecného vzorce I ve kterém značí vazba ..... jednoduchou vazbu nebo dvojnou vazbu, fermentací zoosterolů nebo kulturou Mycobacterium spec. NRRL B-3683 nebo NRRL В 3805 nebo jejími variantami nebo mutantami, vyznačený tím, že se fermentace provádí při hodnotě pH 6,0 až 8,0 v přítomnosti boritanových iontů nebo organických sloučenin boru.

205517
2. Způsob podle bpdu 1, obecného.vzorce II ' vyznačený tím, že se fermentuje Zoosterol nebo fytosterol (II) ve.kterém značí vazby .... jednoduché vazby nebo dvojné vazby, X oxoskupinu - nebo atom vodíku, atom vodíku, methylovou, skupinu nebo ethylovou skupinu.
3. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačený tím, že se jako látka po Bytující boritiniové ionty použije kysseina orthobooitá, metaboritá, kyselina polybooitá nebo jejich soli s alkalickými kovy nebo 8 kovy alkalických ze^n. '
4. Způsob podle bodů - 1 až 3, vyznačený tím, .že se jako organická sloučenina boru použije
5. Způsob . podle bodu 3, vyznačený tím, že se pro. litr kuLtury Mcorbateri^m spec, použije 1 až 5 g látky - pos^yt^ící bořit trnové ionty.
6. Způsob podle bodu 5, vyznačený . tím, že se látka p^t^J^k^yt^ující bořit trnové ionty přidá 10 až 30 hodin po začátku fermentace.