CN1950690A - 对生物学粒子进行分类的装置以方法 - Google Patents

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Abstract

一种装置，对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：光检测部，检测出来自生物学粒子的光；摄影部，对流和从该流分离的液滴进行摄像；将由摄影部所拍摄的流图像作为基础，计算出从光检测器对来自生物学粒子的光进行检测的检测位置到流下端位置的距离，与流所包含的粒子的间隔，并利用这些距离和间隔计算出粒子从检测位置移动至下端位置的时间的机构；和在光检测器检测出来自生物学粒子的光之后，间隔所计算出的时间，将与生物学粒子的性质对应的极性的电荷施加给流的机构。这样，使对生物学粒子分类的装置构成简单，并提高了分类精度。

Description

对生物学粒子进行分类的装置以方法
技术领域
本发明涉及一种取得生物学粒子(例如细胞、染色体)的生物学信息、并基于所取得的生物学信息对粒子进行分类的装置和方法。本发明尤其涉及一种流量检查计量器与细胞分类器，其以层流状态使采用荧光色素等被染色的细胞或染色体流动，检测出对该流动照射激光等光而得到的信息光(杂光、荧光)，并将检测出的信息光中所包含的光学信息变换为电信号，来取得细胞或染色体的生物学信息，并且根据需要，基于该生物学信息而提取特定的细胞或染色体集团。
背景技术
伴随着生物工艺学(biotechnology)的发展，在医学与生物学等领域中广泛使用进行细胞与染色体等(以下称作“细胞”)的自动分析以及分类的流动式细胞分析装置(流量检查计量器)。该流动式细胞分析装置使作为分析对象的细胞粒子，在作为细胞排列机构的流路内以一列流动，对该流动而来的粒子照射激光，并检测出由粒子生成的信息光(前方杂光、荧光和侧方杂光)将其变换成电信号，基于这些电信号来对细胞进行分析，其能够对多数的细胞进行高速分析，并根据需要可以提取特定的细胞集团。
图16是用于说明一般的流量检查计量器的构成和其动作的模式图。在该图所示的流量检查计量器200中，位于容器中且包含细胞的悬浊液201与其他容器中的防护(sheath)液202一同由抽气机203导入到漏斗状的流动室(喷嘴)204。在流动室204的内部，形成了防护液202将悬浊液201包围成圆筒状的层流，即，使细胞沿着流槽(flow cell)的中心轴逐一正确流动的防护流。在流动室202的下部形成防护流的高速流，对该处照射从激光源205射出并由聚焦透镜206会聚的激光207。悬浊液201所包含的细胞大多被荧光染料或荧光标记单克隆抗体(モノクロナ一ル)等的荧光物质进行了荧光标识。因此，在细胞从激光207中经过时，会产生杂光和荧光。
杂光经过由聚焦透镜208和光线区域209构成的聚焦光学系统，被例如光敏二级管等检测器210检测出。另一方面，对于荧光而言，红色荧光被收集到由聚焦透镜211、半透半反镜212、聚焦透镜213、滤光器214构成的聚焦光学系统，由光检测器215检测出，另外，绿色荧光从半透半反镜212被收集到聚焦透镜216、滤光器217，由光检测器218检测出。通常，荧光的检测器215、218采用能够检测出微弱光的光电子增倍管。来自对杂光进行检测的检测器210、对红色荧光进行检测的光检测器215以及对绿色荧光进行检测的检测器218的信号，分别被输送到信号处理电路219，在这里通过对杂光和荧光的强度进行分析来进行细胞的同定。
如图17所示，信号处理电路219的同定结果被发送到充电部220。充电部220在被同定后的细胞到达防护流下端的分离点(break off point)221而形成包含所同定的细胞的液滴之前，即，在到达防护流线段的分离点221而形成液滴之前，基于同定结果对悬浊液201和防护液202施加规定极性的电荷。结果，在分离点221从防护流分离的液滴被赋与规定极性的电荷。带电荷的液滴，在配置于分离点221下方且被施加不同极性的电荷的一对电极222、223之间，被电吸引而偏向二者中的一方，由此，被分类到分别配置在电极222、223下方的搜集管224或225中。(例如参照专利文献1～4)
专利文献1：特开昭59-643号公报
专利文献2：特开昭59-184862号公报
专利文献3：特开昭60-195436号公报
专利文献4：特表平3-503808号公报
这样，在流量检查计量器中，所检测出的细胞的高度(level)(检测位置)与对所检测出的细胞赋与电荷的高度(level)(电荷位置)不同。因此，在启动流量检查计量器之前，需要正确测定从检测位置到电荷位置的距离，并将其作为装置的固有值而输入。可是，最佳的电荷位置会随着液体(悬浊液和防护液)的粘度与温度以及喷嘴的状态而变化，由此，存在着分类精度会降低的问题。另外，为了计测出从检测位置到电荷位置的距离而设置照相机，能够通过上下移动该照相机对从检测位置到电荷位置的距离进行检测，但是这样的作法需要设置对照相机进行升降的机构，因此，该方法会使作业变得极其繁杂。
发明内容
鉴于此，本发明的装置对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
光检测部，检测出来自上述生物学粒子的光；
摄影部，对上述流和从该流分离的液滴进行摄像；
将由上述摄影部所拍摄的流图像作为基础，计算出从上述光检测器检测来自生物学粒子的光的检测位置到上述流下端位置的距离，和从上述流分离的液滴的间隔，并且，利用上述距离和间隔计算出上述粒子从检测位置移动至下端位置的时间的机构；和
在上述光检测器检测出来自生物学粒子的光之后，间隔上述计算出的时间，将与上述生物学粒子的性质对应的极性的电荷施加给上述流的机构。
另外，其他方式的装置基于生物学粒子的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
流路形成部，其形成隔开规定间隔配置了上述生物学粒子的液体流，并且喷射上述流而形成包含上述生物学粒子的液滴；
照明部，其对上述流所包含的生物学粒子进行照明；
检测部，其检测出从上述生物学粒子发出的光；
摄影部，其对上述流和从上述流分离的液滴进行拍摄；
从由上述摄影部所拍摄的流图像，计算出从上述光检测器检测光的检测位置到上述流下端位置的距离，和从上述流分离的液滴的间隔，并且，将上述距离和间隔作为基础，计算出上述流从检测位置移动至下端位置的时间的机构；
处理部，其从由上述检测部检测出的光得到上述生物学粒子的生物学信息；
在上述光检测器检测出光之后，延迟上述计算出的时间，基于由上述处理部得到的上述生物学粒子的生物学信息，向对应的上述生物学粒子赋与电荷的机构；和
利用对上述生物学粒子施加的电荷，使包含上述生物学粒子的液滴的滴落方向发生偏向的机构。
本发明其他方式的装置，对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，
包括：
光检测部，其对来自上述生物学粒子的光进行检测；
振动发生器，其对上述流施加振动；
摄影部，其对上述流和从该流分离的液滴进行拍摄；
利用由上述摄影部所拍摄的图像，检测出在流下端位置和最靠近其的液滴之间形成的小液滴的大小的机构；和
根据上述小液滴的大小控制上述振动发生器的振动大小的机构。
本发明对生物学粒子进行分类的方法包括：
形成包括上述生物学粒子的液体流的工序；
对上述流所包含的生物学粒子照射光的工序；
检测出来自上述生物学粒子的光的工序；
将上述检测出的光作为基础，取得上述生物学粒子的信息的工序；
对上述流和从该流分离的液滴进行摄像的工序；
从上述流的摄影图像，求出上述光的检测位置与上述流下端位置之间的距离以及上述流所包含的生物学粒子的间隔，并利用上述距离和间隔，计算出上述液体以及生物学粒子从上述检测位置移动至下端位置的时间的工序；
在检测出来自上述生物学粒子的光，经过上述计算出的时间之后，基于上述生物学粒子的信息对上述流注入电荷的工序；以及
以上述被注入的电荷为基础，对从上述流分离的液滴进行分类的工序。
本发明其他方式的方法，对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
检测出来自上述生物学粒子的光的工序；
对上述流赋予振动的工序；
对上述流和从该流分离的液滴进行摄影的工序；
利用上述所拍摄的图像，检测出在流下端位置和最靠近其的液滴之间形成的小液滴大小的工序；和
根据上述小液滴的大小控制上述振动大小的工序。
根据具备这样构成的装置和方法，可以固定摄像机构。因此，装置的构成变得简单。而且，提高了生物学粒子的分类精度。
附图说明
图1是表示本发明所涉及的装置的光学要素的图。
图2是表示本发明所涉及的装置的流体力学结构的侧视图。
图3是将图1所示的装置的检测流路和配置在其附近的光纤的一部分放大了的放大横剖面图。
图4是将图1所示的装置的检测流路和配置在其附近的光纤的一部分放大了的放大纵剖面图。
图5是图1所示的装置的电路图。
图6是表示防护流的放大正视图以及照相机的摄影图像的图。
图7是将对摄影图像进行数据处理之后的像素数表示于横轴的图。
图8是将附属(satellite)滴落物的像素数表示于横轴的图。
图9是λ检测处理的流程图。
图10是检测出分离点的流程图。
图11是检测出附属滴落物大小的流程图。
图12是表示向容器供给样品液和防护液的装置的图。
图13是样品液容器或者样品液容器的剖视图。
图14是表示检测装置中的分光滤光器的配置的图。
图15是表示检测装置中的分光滤光器的优选配置的图。
图16是表示得到生物学粒子的生物学性质的现有装置的立体图。
图17是用于说明生物学粒子的分类的图。
图中：1-装置，2-流路形成构件(流路块)，41-防护流，5-照明部，6-第一激光发生器，7-第二激光发生器，8-第一激光，9-光纤，11-聚焦透镜，12-第二激光，13-光纤，14-光束扩展器，15-聚焦透镜，21-第一检测部，22-聚焦透镜，23-光检测器，24-信号处理部，25-第二检测器，90-分类装置，110-液滴控制部，112-固定照相机，113-闪光灯，114-视频数字化仪，117-中央控制部，118-振动发生器驱动部，119-闪光灯驱动部，120-充电控制部，121-滴落延迟控制部，133-液滴，134-附属滴落物。
具体实施方式
下面，参照附图，对本发明所涉及的作为得到生物学粒子信息的装置的实施方式，即流量检查计量器进行说明。
(1)光学要素：
图1表示流量检查计量器的光学要素。如该图所示，流量检查计量器1具有流路块(流路形成部)2(参照图2)，该流路块2形成了包含被荧光染料以及荧光抗体染色的生物学粒子(细胞或染色体)的液体(通常由包含细胞的悬浊液和防护液构成)所流过的微细流路。对在形成于流路块2的流路3中流过的防护流(流动)4照射光的照明部5，具备多个激励光源。这些多个光源优选利用产生不同波长激光的激光发生器。例如，在本实施方式中具备3个激励光源，作为第一光源使用产生波长为488nm的第一激光(氩激光)的第一激光发生器6A，作为第二光源使用产生波长为635nm的第二激光(氦氖激光)的第二激光发生器6B，作为第三光源使用产生波长为375nm的第三激光(紫外线激光)的第三激光发生器6C。
照明部5还具备：用于将从第一～第三激光发生器6A～6C射出的第一～第三激光8A～8C导入到防护流4的光纤9A～9C、光束扩展器10A～10C，从激光发生器6A～6C射出的激光经由光纤9A～9C由光束扩展器10A～10C调整之后，经由两个反射/透射镜11b、11c而被合成，由一个聚焦透镜12聚焦至防护流4。
在流路块2的相反侧形成有第一检测装置21，用于对在流路块2内的流路流过的粒子照射的光的前方杂光(信息光)进行检测。该第一检测装置21与参照图16而说明的现有流量检查计量器同样，具备聚焦透镜22、光检测器23，通过聚焦透镜22将来自细胞的前方杂光聚焦于光检测器23。光检测器23与信号处理部24连接，由光检测器23所检测出的信号被发送到信号处理部24进行处理。信号处理部24中的信号处理将在后面叙述。另一方面，对细胞的荧光和侧方杂光(信息光)进行检测的第二检测装置25，具备分别对第一激光8A～第三激光8C的荧光和侧方杂光进行检测的第一光纤26A～第三光纤26C，这些第一～第三光纤26A～26C的一端分别被固定在与第一～第三激光8A～8C的聚光高度对应的位置(参照图4)。第一～第三光纤26A～26C的另一端分别经由光纤连接器27A～27C与第一～第三分光器28A～28C光连接。
第一～第三分光器28A～28C，具备对从第一～第三光纤26A～26C输出的光进行分光的一个或多个分光滤光器(半透半反镜)30A～30C。这些多个分光滤光器30A～30C具有反射和透过分别预先确定的频率区域的波长的功能。另外，对于光行进方向而言，在分光滤光器30A～30C的下游侧配置有带通滤波器31A～31C，所述带通滤波器31A～31C用于从由各分光滤光器反射的光中选择性地仅透过特定波长区域的光。并且，与光的行进方向相关地，在多个带通滤波器31A～31C的下游侧设置有多个光检测器32A～32C(SSC，FL1～FL8)，用于检测出透过各带通滤波器之后的信息光(与侧方杂光和规定的荧光色素对应的荧光)。
根据如此构成的流量检查计量器1，由第一～第三激光发生器6A～6C生成的第一～第三激光8A～8C，经由光纤9A～9C、光束扩展器10A～10C、聚焦透镜12，由在流路块2的流路3内流过的防护流4导光，聚焦于粒子。此时，由于激光8A～8C具有不同的波长，所以，在如图所示那样由一个聚焦透镜12进行聚光的情况下，会产生因波长差而引起的轴上色像差。因此，在实施方式中，为了消除因该波长差而引起的轴上色像差，根据第一～第三激光8A～8C的波长，分别由光束扩展器10A～10C将原本应该是平行光的激光8A～8C稍微调整为非平行光，利用聚焦透镜12将调整后的激光聚焦于目标场所。
由防护流4搬送的生物学粒子被预先确定的多种荧光色素或荧光抗体染色。而且，在入射光的前方漫射的前方杂光被第一检测装置21的聚焦透镜22聚焦，入射到光检测器23，由该光检测器23读取前方杂光所包含的光信息，并变换成对应的电信号。从被第一激光8照射后的粒子发出的侧方杂光和荧光，分别由配置在入射光侧方的第二检测装置25的第一～第三光纤26A～26C接收。由光纤26A～26C接收的光经由光纤连接器27A～27C被发送至第一～第三分光器25A～25C，在这里由分光滤光器30A～30C分解成多种光之后，经由带通滤波器31A～31C由光检测器32A～32C进行检测。分光检测器32A～32C(SSC，FL1～FL8)仅检测出通过了带通滤波器31A～31C的不同波长区域的光。在如上所述由光检测器32A～32C所检测出的光，被变换成与该光所包含的信息对应的电信号后，被发送至信号处理部24进行处理，处理后的信号被用于粒子生物学性质的同定和后面所说明的分类处理。
(2)流体力学的要素：
对流量检查计量器的流体力学要素进行说明。图2是模式地表示流量检查计量器1的层流形成容器40和连接在该容器40下端部的流路块2的图。如该图所示，容器40大致同心具备：上部的大径圆筒部41、下部的小径圆筒部42、连接这些大径圆筒部41和小径圆筒部42的倾斜部43，并在内部形成有层流形成室44。容器40的上端部与防护液供给部45连接。在容器40的顶部固定有沿着容器40的中心轴而延伸的鞘管47，与供给部48连接的供给管49被插入于鞘管47，所述供给部48用于提供包含生物学粒子(细胞或染色体)的液体。以相对于鞘管47供给管49可以上下移动并且相对于鞘管47供给管49可以调整若干角度的方式，确定鞘管47的内径和供给管49的外径。因此，在鞘管47和供给管49之间存在间隙，但通过橡胶制的密封圈等适当密封构件(未图示)对该间隙进行了密封。
与容器40下端部连接的流路块2可以利用可透过光的材料，例如从由水晶、玻璃、熔融硅石或透明塑料构成的组中选择的材料制作，在与容器中心轴相同的轴上形成有微细的流路3。如图3所示，流路3具有长方形的截面，并以如下方式进行配置：即长边方向的壁面55、56朝向X方向，短边方向的壁面57、58朝向Y方向，第一～第三激光8A～8C从一方的短边方向壁面57入射，前方杂光59从相面对的另一方的短边方向壁面58射出，并且，荧光和侧方杂光60从一方的长边方向壁面56射出。
流路块2还如图3和图3放大表示那样，保持对荧光和侧方杂光进行检测的第一～第三光纤26A～26C。这些光纤26A～26C与通常的光纤同样，由导光的纤芯和被覆纤芯周围的包层构成。在与这些的中心轴正交的方向加工这些第1～第3光纤26A～26C的一个端面61A～61C，并与流路3的长边方向壁面56隔开规定的距离，向着与容器中心轴正交的水平方向(Y方向)而配置。
参照图2和图4，为了使从下端管口74喷出的液体分别分离成包含细胞的液滴，流路块2保持有在上下方向或半径方向提供振动的振动发生器89。优选振动发生器89在小径筒部的周围对称配置多个。而且，优选使用压电元件(PZT)作为振动发生器89。
如图4所示，流量检查计量器1还具备用于采取特定粒子集团的分类装置90。该分类装置90具有电荷注入电路91、电极驱动电路(电源电路)92。电荷注入电路91与注入电极93连接，所述注入电极93与从管口74喷射的液体接触。另外，电极驱动电路92，与在管口74的下方配置在从该管口74喷射的液体两侧的一对导电性电极板(偏向板)94、95连接。另外，注入电极93的设置位置没有限定，只要能够与在流路块2内的流路流过的液体接触即可。
(3)基本动作：
根据具备这样构成的流量检查计量器1，如图2所示，由防护液供给部45供给的防护液在容器40的内部朝向下方移动。按照防护液将容器的中心轴作为中心而在容器40的内部以层流状态移动的方式，确定单位时间的防护液的供给量。另一方面，由供给部48供给的悬浊液经由供给管49，以层流状态提供给流动的防护液的中心。由此，形成了防护液对悬浊液的周围进行包围的圆筒状层流，即，沿着容器40的中心轴逐一正确地流动粒子的防护流。然后，在容器40的倾斜部43处被加速之后，悬浊液和防护液被输送至小径筒部42，之后，进入流路块2由倾斜(taper)流路3再次加速，进入到流路3中。
如图3所示，通过流路3的粒子被第一～第三激光8A～8C照射，由此，产生了前方杂光和荧光及侧方杂光。前方杂光59从位于第一～第三激光8A～8C的延长线上的壁面58出射到流路块2的外部，被第一检测装置21检测。另一方面，基于第一～第三激光8A～8C的荧光及侧方杂光60分别被聚焦于第一～第三光纤26A～26C，被第二检测装置25检测。
如图4所示，通过了流路3的防护液从管口74被喷射。被喷射的防护液基于由振动发生器89施加于容器40的小径筒部42的振动，分别成为收容有粒子的液滴。尤其是在本实施方式中，由于振动发生器89被设置在容器40的小径圆筒42处，所以，振动发生器89所产生的振动能够高效地传递到层流混合液，良好地分离出液滴96。
从管口74喷出的防护液所含有的液滴，被充电为从电荷注入电路91施加到注入电极93的电压的正极性或负极性。施加于电极的电压的极性，根据由信号处理部24所检测出的粒子的生物学性质而确定。被充电的液滴96在通过电极板94a、95a之间时偏向，仅提取特定的粒子。
(4)控制电路：
图5表示信号处理部24和分类装置90的电路构成。如图所示，信号处理部24具备多个放大器101，从第一检测部21和第二检测部25的光检测器输出的信号(与前方杂光、侧方杂光、荧光对应的信号)分别被放大。被放大的信号在通过A/D变换器102从模拟信号变换为数值信号之后.被发送至存储器103进行存储。
如上所述，第二检测部中的三个光纤26A～26C，在流路3的流动方向配置于不同的位置。因此，由下游侧的光纤检测出从一个粒子发出的荧光及杂光的时刻，比由上游侧的光纤检测出从同一粒子发出的荧光及杂光的时刻慢规定时间。结果，对于一个粒子而言，从各光纤对放大器101输入信号的时间会产生规定时间的差。因此，在本实施方式中，放大器101与定时控制部104连接，基于考虑了上述规定时间延迟的时刻而从定时控制部发送的信号，与一个粒子相关联的信号被从多个放大器101同时输出。另外，从存储器103输出的数字信号在补偿电路105、放大电路106中被处理之后，输入到分类装置90，用于上述的液滴(粒子)分类处理。而且，从信号处理电路24输出的信号被输出到分类装置90，用于液滴控制以及分类控制。
分类装置90具有液滴控制部110和充电控制部120，这些液滴控制部110和充电控制部120与信号处理部24连接。
分类装置90与固定照相机(摄像部)112连接，所述固定照相机112用于对从管口74喷射的液体流动(防护流111)的下端部以及其周边区域进行摄影。在隔着防护流110而与固定照相机112相反的一侧固定有闪光灯113，其用于按照规定的周期向防护流111发光。
照相机112的输出与对照相机112的映像信号进行数字处理的视频数字化仪(视频俘获器)114连接，由照相机112拍摄的图像(映像信号)通过视频数字化仪114变换成数字信号。视频数字化仪114与在液滴控制部110中内置的存储部116连接，由照相机112拍摄的图像作为映像信息被存储于存储部116。与存储部116一同内置于液滴控制部110的中央控制部117与存储部116连接，以存储于存储部116的映像信息为基础进行以下说明的处理。中央控制部117与振动发生器驱动部118和闪光灯驱动部119连接，对驱动发生器89和闪光灯113的驱动进行控制。中央控制部117与滴落延迟控制部121连接，并且，滴落延迟控制部121与电荷注入电路91连接，所述滴落延迟控制部121用于对从粒子通过了检测位置的时刻，到粒子以包含于液滴的状态从防护流111分离之前的时间(延迟时间)进行控制。
闪光灯113的发光周期t被固定为与施加于振动发生器89的信号的周期，即振动发生器89的振动周期相同，该周期t与形成液滴的周期完全一致。因此，由固定照相机112所拍摄的防护流111具有图6所示的固定形状。
其中，防护流111的流速v由下述公式(1)提供。
【公式1】
v≌L/T             (1)
L：从激光聚焦位置(检测位置)LIP(Laser Intercept Point)到防护流下端位置(分离点)BP(Break off Point)的距离
T：粒子从检测位置LIP移动到下端位置BP的时间
另外，粒子的移动速度(液滴的滴落速度)可以使用闪光灯113的发光周期，由下述公式(2)表示。
【公式2】
v≌λ/t                    (2)
λ：液滴的间隔
t：闪光灯的发光周期
由公式(1)、(2)可导出下述公式(3)。
【公式3】
L/T＝λ/t       (3)
另外，公式(3)可以变形为下述的公式(4)。
【公式4】
T/f＝L/λ     (4)
公式(4)中的(T/t)是将粒子从检测位置LIP移动到分离点BP的时间(T)除以闪光灯发光周期(t)，与从检测位置LIP到分离点BP之间应该存在的粒子数对应，在下面的说明中，根据需要将其称作“滴落延迟DD”。其中，滴落延迟DD不是整数，而是包含小数点以下的值的数。因此，通过采用滴落延迟DD，公式(4)可以变形为下述公式(5)。
【公式5】
DD＝L/λ      (5)
图6对照表示照相机112的拍摄区域，由四方框130所包围的区域131是被摄影的图像。如上所述，由于振动发生器89的振荡频率与闪光灯113的发光频率完全一致，所以，由照相机112拍摄的防护流以及从该防护流分离的液滴的图像，只要其他的原因(例如对振动发生器89施加的脉冲电压)不发生变化，就会停留为图示的状态。而且，如图所示，由照相机112拍摄的是包含分离点BP的防护流111的一部分，为了在后述说明的图像处理中获得规定的分辨率，而没有包含检测位置LIP。
从分离点BP到摄影图像上端132的距离LB，例如可以沿着防护流111在其附近配置适当的刻度或对此替代的基准尺寸物，通过与所拍摄的图像大小(像素数)进行对比来进行计测。
从图像上端132到检测位置LIP的距离LBO，可以基于以下所说明的计算过程1～3来计算。这些计算过程由中央控制部117自动执行。
计算过程1：
计算过程1，是对粒子从检测位置LIP移动到分离点BP的时间T进行计算的过程。在该计算过程1中，以充分隔开粒子间隔的状态使粒子流动，一边使延迟时间Δt’变化，一边对注入电极93注入规定极性(正极性或负极性)的电荷，对偏向于目标方向的粒子数进行计数。偏向于目标方向的粒子数最多的状态是延迟时间Δt’与移动时间T一致的状态，如果电荷注入时刻从该状态发生偏离，则电荷无法恰当地注入，不偏向于目标方向。因此，如果使延迟时间Δt’变化，则可得到高斯分布状态的时间延迟(Δt’)-粒子数(被计数的粒子数)特性(未图示)，与高斯分布的峰值对应的时间延迟Δt’(peak)相当于移动时间T，中央控制部117计算出时间延迟Δt’(peak)，将其作为移动时间T存储于存储部116。
计算过程2：
计算过程2是对从检测位置LIP到分离点BP之间可能存在或存在的多个粒子的粒子间平均距离(这相当于液滴的间隔)λ进行计算的过程，参照图6，与从防护流111形成的液滴133对应，在防护流111中隔开一定的间隔交互地形成大径部分和小径部分，粒子间距离与防护流的大径部分(或小径部分)的间隔对应。因此，中央控制部117对图像数据进行二值化，由背景的图像区别防护流111。对由照相机112拍摄的防护流111的摄影图像二值化而得到的图像数据的编辑结果如图7所示。该图7，横轴表示摄影图像上下方向的各高速[y(i)]，纵轴表示横方向的像素数[x(i)]。而且，图中所示的Y(1)··Y(4)··表示各大径部的最大径部分(峰值)的高度，峰值间距离(平均距离)表示为间隔λ。
具体而言，在计算过程2中如图9的流程图所示，中央控制部117将后述处理所必须的数据(i：Y轴方向的列号、I：峰值号、F1：标志)初始化(1001)，对i+1列所包含的防护流的像素数和i列所包含的防护流的像素数进行比较(1002)。在i+1列的像素数x(i+1)比i列的像素数x(i)大的情况下(像素数具有增加倾向的情况)，将标志F1设定为1(1003)，并将其与列号i相加(1004)。另一方面，在i+1列的像素数x(i+1)比i列的像素数x(i)小的情况下(像素数具有减少倾向的情况)，判断标志F1是否为1(1005)。即，在判断步骤1002、1005中，判断到列号i为止具有增加倾向的像素数，是否从列号i+1起向减少倾向转化了。然后，判断像素数x(i)是否超过了阈值x(th1)(参照图7)(1006)，如果超过了阈值x(th1)，则将列号i赋与给Y(I)而存储(1007)，更新峰值号I(1008)，将标志F1设定为“0”(1009)，判断i+1是否达到最终列号n(1010)。在i+1没有达到最终列号n的情况下，对列号进行加一处理(count up)(1004)，并执行判断步骤1002。然后，在i+1达到最终行号n时，以如上所述求取的峰值号Y(I)[Y(1)··Y(4)··]为基准，计算出峰值间的平均距离，即间隔λ(1011)。另外，阈值x(th1)是用于对大径部和以下所说明的附属滴落物(小液滴)进行区别的数值，被设定成比通常所形成的附属滴落物的大小以及其像素数大的值。
计算过程3：
计算过程3是使用中央控制部117所计算出的时间T和间隔λ等，计算出距离LBO过程。具体而言，在该计算过程3中，使用将上述公式(4)进行下述变化而得到的公式(6)，来计算距离LBO。
【公式6】
T/t＝(LB+LBO)/λ
LB+LBO＝(T/t)·λ
LBO＝(T/t)·λ-LB       (6)
如上所述，公式(5)所包含的时间T、间隔λ以及距离LB被如上所述进行计算，闪光灯发光周期t为已知。因此，使用这些被计算出的各个数值来计算距离LBO。而且，使用所计算出的距离LBO、LB可以计算出距离L。
中央控制部117将如上所述而确定的距离L和间隔λ带入公式(5)，确定滴落延迟DD。所确定的滴落延迟DD由滴落延迟控制部121存储到存储部116作为基准值DD，用于后面所说明的滴落延迟调整控制。
(5)分类控制：
在粒子的分类控制中，液滴控制部110与充电控制部120从信号处理部24接收对检测器已经检测出粒子这一信息进行表示的信号(检测信号)。若接收到检测信号，则液滴控制部110驱动滴落延迟控制部121，在经过与所存储的滴落延迟DD对应的延迟时间T之后，启动电荷注入电路91，将电荷注入到液体。被注入的电荷的极性，基于从信号处理电路24输出的信号由电荷控制电路120决定。然后，由电荷控制电路120所决定的极性的电荷从电荷注入电路91向液体注入。因此，在电荷注入之后立即从防护流111分离的液滴(包含所被检测的粒子的液滴)，被注入与关于粒子检测出的生物学性质相对应的极性的电荷，在从电极板94、95之间通过之际发生偏向，被采取到对应的容器(未图示)。
(6)反馈控制(滴落延迟控制)：
在流量检查计量器1中所使用的防护液的粘度根据环境(例如温度)而变化。如果防护液的粘度发生变化，则分离点BP会上下移动，使得形成液滴的定时发生变化。因此，液滴控制部110利用照相机112的图像，计算出从分离点BP到摄影图像上端的距离LB *。该计算如上所述，通过沿着防护流111在其附近配置适当的刻度或替代其的基准尺寸物，能够以由照相机112所拍摄的基准尺寸物的大小(像素数)为基准进行计测。具体而言如图10所示，液滴控制部110将列号设定为“1”(1011)，判断该列号的像素数x(i)是否为“0”(1012)。在像素数x(i)不是“0”的情况下，更新列号i(1013)，进行同样的判断处理(1012)。如果判断为像素数x(i)是“0”，则将其列号i设定为YBP(参照图8)，根据该YBP的值与基准尺寸物的尺寸，通过比例计算来算出LB *。
接着，液滴控制部110以从照相机112得到的图像为基准，计算出间隔λ*。计算粒子间距离的方法与上述的计算过程2同样。
然后，液滴控制部110以所计算的距离LB *和间隔λ*为基础，根据将公式(5)变形的下述公式(7)计算出新的滴落延迟DD*。
【公式7】
DD*＝(LB *+LBO)/λ*        (7)
然后，基于如上所述计算出的新的滴落延迟DD*，液滴控制部110对将电荷注入液体的定时(时间延迟Δt)进行调整。另外，由于从公式(7)可知，LB *+LBO是具有长度单位的固定值，所以，即使改变形成液滴的频率与防护液的供给压力，也可以如上所述正确地求出间隔λ*，由此，可正确地求取滴落延迟DD*。结果，能够高精度地维持分类。
(7)反馈控制(电压控制)：
如图6所示，当液滴133从防护液111分离之际，在分离后的液滴133和与防护液111连接未分离的液滴133之间，产生不包含粒子的微小液滴的附属滴落物134。在附图中，附属滴落物134表示为从液滴133分离而独立的理想状态，优选为以该独立的理想状态将电荷注入到防护流111。因此，液滴控制部110一边从对照相机112所拍摄的图像进行了处理的二值图像数据中检测出附属滴落物134的状态，一边控制对振动发生器89所施加的电压，从而调整振动发生器89所产生的振动大小，以便使如图6所示得到附属滴落物134独立的状态。
具体而言，如图11的流程图所示，液滴控制部110将上述分离点BP的列号YBP提供给列号i，并且，将标志F2设定为“1”(1021)。接着，对列号i进行递加(increment)处理(1022)，判断比分离点BP位于下面的各列号i的像素数x(i)是否超过规定阈值x(th2)(参照图8)(1023)。在像素数x(i)没超过规定阈值x(th2)的情况下，判断标志F2是否为“0”(1027)，如果标志F2不为“0”，则对列号i进行递加处理(1022)。如上所述，分离点BP是像素数x(i)成为“0”的点。因此，如图8所示，在与分离点BP连续的多个列号中，由于像素数x(i)没有超过阈值x(th2)，所以，反复执行步骤1022→1023→1027。
但是，如果判断为像素数x(i)超过了规定阈值x(th2)(1023)，则判断标志F2是否为“1”(1024)，如果标志F2为初始状态(标志F2＝1)，则将此时的列号i设定为附属滴落物上端列号YS1(1025)，将标志F切换为“0”(1026)。一旦判断为像素数x(i)超过阈值x(th2)，则该状态被暂时维持(参照图8)。因此，在像素数x(i)超过阈值x(th2)的期间，反复执行步骤1022→1023→1024。如果列号i成为附属滴落物下端部附近的列号，则像素数x(i)变为阈值x(th2)以下(1023)。结果，从处理1022进入处理1027，判断标志F2是否被设定为“0”。此时，标志F被设定为“0”(1026)。因此，将列号i设定为附属滴落物下端列号YS2(1028)。而且，从附属滴落物下端列号YS2减去附属滴落物上端列号YS1，计算出从附属滴落物上端到附属滴落物下端的像素数YS(1029)。然后，液滴控制部110由像素数YS计算出附属滴落物134的长度。接着，液滴控制部110对计算出的附属滴落物134的长度YS和所存储的基准长度Yref进行比较，调整由驱动部118对振动发生器89施加的电压，将附属滴落物134的长度维持恒定。另外，也可以替代附属滴落物134的长度，根据下述公式(8)计算出图8所示的图像面积(大小)A，按照在液滴控制部110中将该面积A维持恒定的方式进行控制。
【公式8】
A = Σ YS 1 YS 2 x ( i ) - - - ( 8 )
这样，由于在流量检查计量器1中基于由照相机112所拍摄的图像对振动发生器89施加的电压进行反馈控制，因此在一定位置稳定自动地形成理想形状的防护流。而且，由于利用由照相机112所拍摄的图像调整滴落延迟DD(延迟时间Δt)，所以，粒子被正确地分类。
(8)悬浊液/防护液供给部：
图12详细表示了防护液供给部45和供给部48。如图所示，防护液供给部45具备防护液容器140，该防护液容器140中收容有防护液141。该防护液容器140连接有两根导管142、143。导光142的一端与防护液141的上部密闭空间连接，另一端与压力源144连接。另外，导管143的一端浸入到防护液141，另一端与缓冲容器145连接。缓冲容器145是容量远比防护液容器140的容量小的容器，收容有从防护液容器140经由导管143供给的防护液141。缓冲容器145还经由其它的导管146与容器40连接。如图所示，导管143、146的一端浸渍在缓冲容器145所收容的防护液141中。
供给部48具备样品容器148，其用于收容作为生物学粒子(细胞或染色体)的样品液147。样品容器148与一端和供给管49连接的样品导管149连接，该样品导管149的另一端浸渍于样品液143。导管150的一端与收容在样品容器148的样品液147的上部密闭空间连接。导管150的另一端与压力调整部151连接，并且，压力调整部151经由其他的导管152与压力源153连接。而且，压力调整部151与缓冲容器145的上部密闭空间通过导管154连接。
按照以上的结构，在防护液供给部45中，收容于防护液容器140的防护液141基于从压力源144通过导管142施加的压力P10而被加压，通过导管143以压力P11供给到缓冲容器145。另外，缓冲容器145的防护液141基于从防护液容器140供给的防护液141的压力P11，通过导管146以压力P12被供给到容器40。另一方面，在供给部48中，从压力源153提供的压力P20在压力调整部151中被调整，调整后的压力P21被施加在样品容器148的上部密闭空间。结果，样品容器148的样品液147以规定的压力P22经由导管149被供给到鞘管49。此时，从鞘管49喷射的样品液147的压力P22，需要使得提供给容器40的样品液147不因防护液141而被扰乱地径直流动。因此，样品液147的压力P22被设定为比防护液141的压力P12仅大规定压力ΔP。
具体而言，在实施方式中，防护液供给部45中的导管142、143、146的管内压力P10、P11、P12大致相同。另一方面，在供给部48中，连接于压力调整部151下游侧的两根导管150、149的管内压力大致相同。而且，压力调整部151将通过导管154提供的缓冲容器145的内部压力P12’(该压力与压力P11、P12大致相同)作为基准，将施加了其所必要的压力差ΔP的压力设为从压力调整部151输出的压力P21。
并且，在实施方式中，防护液容器145和缓冲容器148的容积被设定为防护液容器140的大约1/10～大约1/1000，优选为大约1/500。因此，即使由于防护液141被消耗而使得防护液容器145的水平面下降，与没有缓冲容器145的情况相比，也可以稳定地确保提供给容器40的防护液141和样品液147的压差。
(9)容器：
优选防护液供给部45的防护液容器145和供给部48的样品容器148的至少任意一方采用图13所示的容器。图13所示的容器155由外侧容器156和内侧容器157构成。外侧容器156由金属或塑料等刚性比较高的材料形成。内侧容器157可以由玻璃等材料形成。外侧容器156由能够收容内侧容器157的容器主体158、和能够拆装自如且密封地安装于容器主体158的上端口部的封盖159构成。将封盖159安装于容器主体158的机构优选采用通常的螺纹构造。另外，为了对封盖159和容器主体158之间进行密封，如图所示，优选在二者之间配置密封圈160。为了将液体(防护液或样品液)提供给内侧容器157或对被收容的液体进行加压，封盖159具有多个导管插入孔161、162，插入在导管插入孔161、162的导管163、164的周围由橡胶等的弹性环状构件165、166密封。如果将这样构成的容器用作防护液供给容器145或样品容器148，则即使对由刚性比较高的材料形成的外侧容器156所围成的内部空间施加压力，使得由通常容易破裂的玻璃等材料形成的内部容器157产生龟裂的情况下，外侧容器156的压力也可以维持为规定的值，因此可以稳定地供给样品液。另外，在将容器155用作样品容器的情况下，为了防止了样品液所包含的生物学粒子凝聚而固定，需要周期性施振并搅拌粒子。该情况下，由于外侧容器156由刚性高的材料形成，所以，即使施加周期性的振动也不会发生破裂。另外，在实施方式中于封盖159上设置了孔161、162，并将导管163、164插入到这些孔中，但也能够以贯通的状态将导管固定于封盖159，在封盖贯通导管的两端(封盖的内侧和外侧)连接不同的导管。
(10)分光滤光器的配置：
在流量检查计量器1中，检测装置25的分光滤光器30A～30C通常使用分色镜。该分色镜一般具有反射率比透过率大的特性。例如，反射率R大约为0.9，透过率大约为0.8。因此，例如如图14所示，如果将三个分光滤光器167、168、169串联配置，由检测器FL1～FL4检测各分光滤光器167、168、169的透过光，并将透过分光滤光器的光向下游侧传输，则在将输入到检测装置25的光强度设为1的情况下，由最后的分光滤光器169反射的光强度和透过该分光滤光器169的光强度分别减少至0.576(＝0.8×0.8×0.9)、0.512(＝0.8×0.8×0.8)。与之相对，如图15所示，如果将分光滤光器167、168、169的反射光传输到下游侧，则由最后的分光滤光器169反射的光强度和透过该分光滤光器169的光强度分别为0.729(＝0.9×0.9×0.9)、0.648(＝0.9×0.9×0.8)，与图14所示的装置相比，减少了光的强度降低，因此，提高了检测装置25的检测灵敏度。

Claims (5)

1、一种装置，对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
光检测部，其对来自所述生物学粒子的光进行检测；
摄影部，其对所述流和从该流分离的液滴进行摄像；
基于由所述摄影部所拍摄的流图像，计算出从所述光检测器检测出来自生物学粒子的光的检测位置到所述流下端位置的距离，与从所述流分离的液滴的间隔，并且，利用所述距离和间隔计算出所述粒子从检测位置移动至下端位置的时间的机构；以及
在所述光检测器检测出来自生物学粒子的光之后，间隔所述计算出的时间，将与所述生物学粒子的性质对应的极性的电荷施加给所述流的机构。
2、一种装置，基于生物学粒子的生物学信息对该生物学粒子进行分类，包括：
流路形成部，其形成液体流，所述液体流隔开规定间隔配置了所述生物学粒子，并且，喷射所述流，而形成包含所述生物学粒子的液滴；
照明部，其对所述流包含的生物学粒子进行照明；
检测部，其对从所述生物学粒子发出的光进行检测；
摄影部，其对所述流和从所述流分离的液滴进行摄像；
从由所述摄影部摄影的流图像，计算出从所述光检测器检测出光的检测位置到所述流下端位置的距离，与从所述流分离的液滴的间隔，并且基于所述距离和间隔，计算出所述流从检测位置移动至下端位置的时间的机构；
处理部，其从由所述检测部检测出的光得到所述生物学粒子的生物学信息；
在所述光检测器检测出光之后，包含所述计算出的时间延迟地基于由所述处理部得到的所述生物学粒子的生物学信息，向对应的所述生物学粒子赋予电荷的机构；和
利用对所述生物学粒子施加的电荷，使包含所述生物学粒子的液滴的滴落方向发生偏向的机构。
3、一种装置，对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
光检测部，其对来自所述生物学粒子的光进行检测；
振动发生器，其对所述流施加振动；
摄影部，其对所述流和从该流分离的液滴进行摄像；
利用由所述摄影部拍摄的图像，对在流下端位置和最靠近其的液滴之间形成的小液滴大小进行检测的机构；以及
根据所述小液滴的大小控制所述振动发生器的振动大小的机构。
4、一种方法，其中对生物学粒子进行分类，包括：
形成包括所述生物学粒子的液体流的工序；
对所述流所包含的生物学粒子照射光的工序；
对来自所述生物学粒子的光进行检测工序；
基于所述检测出的光，取得所述生物学粒子的信息的工序；
对所述流和从该流分离的液滴进行摄像的工序；
从所述流的摄影图像，求出所述光的检测位置与所述流的下端位置之间的距离以及所述流所包含的生物学粒子的间隔，并利用所述距离和间隔，计算出所述液体以及生物学粒子从所述检测位置移动至下端位置的时间的工序；
在从检测出来自所述生物学粒子的光开始经过所述计算出的时间之后，基于所述生物学粒子的信息对所述流注入电荷的工序；和
根据所述被注入的电荷，对从所述流分离的液滴进行分类的工序。
5、一种方法，其中对包含生物学粒子的液体流照射光，检测出来自该生物学粒子的光，由此取得该生物学粒子的生物学信息，并基于所取得的生物学信息对生物学粒子进行分类，包括：
对来自所述生物学粒子的光进行检测的工序；
对所述流赋予振动的工序；
对所述流和从该流分离的液滴进行摄像的工序；
利用所述所拍摄的图像，对在流下端位置和最靠近其的液滴之间形成的小液滴大小进行检测的工序；和
根据所述小液滴的大小控制所述振动大小的工序。
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