CN102792145B - 计算流式细胞仪的液滴延迟时间的系统和方法 - Google Patents

Abstract

一种计算流式细胞仪的液流中的液滴延迟时间的方法。在一个实施例中，该方法包括通过基于液流的图像测量液流的宽度来确定宽度标绘图，和基于宽度标绘图设置液滴延迟时间的步骤。在另一个方面中，本发明涉及用于自动地计算液滴延迟时间的流式细胞仪系统。在一个实施例中，流式细胞仪系统包括用于基于液流的图像确定宽度标绘图的单元；和用于基于宽度标绘图计算液滴延迟时间的单元。

Description

计算流式细胞仪的液滴延迟时间的系统和方法

背景技术

优先权声明

这个专利申请要求在2010年3月9日提交的第61/311,956号美国临时专利申请的优先权，其全部通过引用被结合在此。

技术领域

本发明涉及用于流式细胞仪的系统和方法。更具体地说，本发明涉及用于计算流式细胞仪中的液滴延迟时间的系统和方法。

背景技术

在流式细胞仪的领域中，液力集中技术被用于分离和排列液流之内的分析物颗粒。当从流式细胞仪的喷嘴释放液流时，振荡器干扰该液流。该干扰导致小滴包含单个分析物颗粒。就在从液流脱离之前，小滴可以被电力地充电，而且来自脱离点的下游电场可用于偏转和分类该带电颗粒。作为这个过程的一部分，必需确定系统的“液滴延迟时间”（即，在当所关心的颗粒被识别时到当包含所关心的颗粒的小滴到达充电位置（或“脱离点”）时之间的时间）。因而，所关心的小滴可以在不影响相邻小滴的情况下被充电。

商业的流式细胞仪典型地使用试验上的、反复的、试错法方案来确定液滴延迟时间。例如，在用户（或自动的程序）循环通过液滴延迟时间设置的范围的同时，荧光小珠可以穿过流式细胞仪。当用户（或自动的程序）发现导致荧光小珠的最佳分类的液滴延迟时间设置时，这种液滴延迟时间被设置为操作的液滴延迟时间，并且被用于样品运行。然而，因为荧光小珠可能污染流式细胞仪，所以并不希望使用荧光小珠来确定液滴延迟时间。进一步，需要的是避免使用反复的、试错法操作的系统和方法，反复的、试错法操作消耗时间并且可能缺乏液滴延迟时间计算的必需的精确度。

在此呈现的系统和方法运作以解决现有技术中所看到的一些问题。注意，在此呈现的系统和方法不仅仅使以前的人工处理自动化。通过艰苦的设计、测试和最佳化，已经开发了在此呈现的系统和方法。在这些系统和方法的开发中，认识和专注于实现必要精确度的挑战。因而，在此呈现的系统和方法提供了比现有技术系统显著高的准确度。

发明内容

本发明涉及一种计算流式细胞仪的液流中的液滴延迟时间的方法。在一个实施例中，该方法包括通过基于液流的图像测量液流的宽度来确定宽度标绘图、和基于宽度标绘图设置液滴延迟时间的步骤。

在另一个实施例中，计算流式细胞仪的液流中的液滴延迟时间的方法包括：识别相对于参考框架的激光位置；确定脱离点；和通过以下步骤计算液滴延迟时间：设置频闪相位，使所述液流成像，通过基于所述液流的所述图像测量所述液流的宽度来确定宽度标绘图，确定所述宽度标绘图中的峰值，计算激光截获点的相位，和响应于所述宽度标绘图中的所述峰值、相对于小滴生成波的所述激光截获点的相位和电荷相位，设置液滴延迟时间。在一个实施例中，所述方法包括使宽度标绘图平滑。在另一个实施例中，该方法包括：计算所述宽度标绘图的导数和记录所述导数的多个零相交，其中每个零相交指示平滑的宽度标绘图中的峰值。

在又一个实施例中，所述脱离点是最短的脱离点。在仍然又一个实施例中，使所述液流成像的所述步骤包含沿着所述液流的长度运行摄影机，同时获得所述液流的多个图像的步骤；并且将所述多个图像拼接在一起以形成单个图像的步骤。在另一个实施例中，所述频闪相位被设置为所述电荷相位加上180°。在仍然另一个实施例中，同样响应于偏差校正因数来设置所述液滴延迟时间。在又一个实施例中，所述偏差校正因数等于线性函数aX+b，其中，X是从喷嘴到脱离的时间，并且参数“a”和“b”从系统响应的试验性测量所确定。在另一个实施例中，使用离散傅里叶分析来执行所述宽度标绘图的所述平滑。在一个实施例中，当所述摄影机在所述液流的所述顶部周围时，驱动电压从操作值被增加，并且随着所述摄影机朝向所述脱离点被向下驱动时，所述驱动电压被减少到操作值。在另一个实施例中，液滴延迟时间的所述计算被用于确定所关心的分析物什么时候已经到达所述液流的所述脱离点。

在另一个方面中，本发明涉及用于自动地计算液滴延迟时间的流式细胞仪系统。在一个实施例中，流式细胞仪系统包括用于基于液流的图像来确定宽度标绘图的单元和用于基于宽度标绘图计算液滴延迟时间的单元。在另一个实施例中，该流式细胞仪系统包括用于获得液流的图像的单元；用于基于所述液流的图像来确定宽度标绘图的单元；用于确定所述宽度标绘图中的峰值的单元；和用于基于确定的峰值来计算液滴延迟时间的单元。在一个实施例中，该系统包括使宽度标绘图平滑的单元。在另一个实施例中，系统包括用于计算宽度标绘图上的导数的单元；和用于确定宽度标绘图上的零相交的单元。在又一个实施例中，获得所述液流的图像的所述单元包含获得所述液流的多个图像，并且该细胞仪系统进一步包含用于拼接所述液流的所述多个图像以形成所述液流的一个完整的图像的单元。

在另一个实施例中，该系统包括适合于获得液流的图像的摄影机；和处理器，适合于基于液流的图像确定宽度标绘图，以及适合于基于所述宽度标绘图计算液滴延迟时间。在仍然又一个实施例中，该系统包括：安装在精确度校准的、可移动的摄影机载物台上的摄影机，所述摄影机适合于获得液流的多个图像；和处理器，适合于拼接所述液流的所述多个图像以形成所述液流的一个完整的图像，基于所述液流的所述一个完整的图像来确定宽度标绘图，使所述宽度标绘图平滑，计算所述平滑的宽度标绘图上的导数，确定所述平滑的宽度标绘图上的零相交，和基于所述确定的零相交计算液滴延迟时间。

附图说明

在此结合的附图形成说明书的一部分，并且图解用于计算液滴延迟时间的流式细胞仪系统和方法的实施例。附图与描述一起进一步用来解释在此描述的系统和方法的原理，并且使相关领域的技术人员能够制造和使用在此描述的系统和方法。在附图中，同样的参考数字表示相同的或功能类似的元件。

图1是现有技术的流式细胞仪系统的示意图。

图2是根据本发明的实施例的流式细胞仪系统的示意图。

图3是从多个图像制备的拼接图像，该多个图像从流式细胞仪中的摄影机中取得拼接。

图4是从拼接图像测量的实例宽度标绘图，该拼接图像诸如是图3中所示的图像。

图5A显示图4的原始宽度标绘图和过滤的（平滑的）宽度标绘图。该原始宽度标绘图已经被偏移60以允许在没有重叠的情况下显示两个标绘图。

图5B是图5A的标绘图的特写镜头，显示靠近喷嘴的数据被重叠以显示原始的和过滤的（平滑的）数据两者。

图6显示充电窗口（底部）如何处于振荡器循环（顶部）的指定相位。

图7是显示在此呈现的方法的高层流程图。

图8是显示找到激光位置的方法的流程图。

图9A是显示执行初始化扫描的方法的流程图。

图9B是显示9A中所示的方法的子方案的流程图。

图9C是显示9A中所示的方法的子方案的流程图。

图10A是显示执行校准扫描的方法的流程图。

图10B概述了根据本发明的一个实施例的确定液滴延迟时间的步骤。

图10C是根据本发明的一个实施例的捕获和拼接全部液流图像的子方案。

图10D是根据本发明的一个实施例的计算宽度标绘图的峰值和谷值的子方案。

图10E是根据本发明的一个实施例的计算液滴延迟时间的子方案。

具体实施方式

用于计算液滴延迟时间的系统和方法的以下详细说明涉及图解示范性实施例的附图。除非另作说明，所有的实施例和实例应当被认为是预示的实例。其它实施例是可能的。在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对在此描述的实施例进行变形。因此，以下详细说明并不是意味着进行限制。此外，对本领域的技术人员而言，显而易见的是，如下所述的系统和方法可以在硬件、软件和/或固件的许多不同的实施例中被实施。任何描述的实际的硬件、软件和/或固件并不意味着进行限制。

图1是现有技术的流式细胞仪系统的示意图，如以上通过引用结合的第5,643,796号美国专利中教导的。呈现图1以显示流式细胞仪系统的基本部分，可以在本发明的系统和方法中采用该基本部分。然而，同样呈现图1以显示采用反复的、试错法处理以计算液滴延迟时间的系统，该系统不同于本发明的系统和方法。

具体地，图1显示具有喷嘴系统42的小滴流式细胞仪，管嘴系统42又包括喷嘴容器2。引入喷嘴容积3之内的是来自鞘液贮存器5的通过鞘液端口4的鞘液。分析物颗粒通过物质引入端口9从物质贮存器8被引入鞘液之内。鞘液与它带走的分析物颗粒一起被液力集中，以便单个分析物颗粒以单行取向排齐，并且从喷嘴出口6被排放到自由下落区域7中。

为了形成规则的小滴，振荡器10适合于引起鞘液之内的压力波或鞘液的实际的移动。振荡器10受交流电压电源22控制。由于鞘液之内的振荡，液流12被定期干扰以形成小滴13。每个小滴13在液流12中的时候被分析，以了解小滴13是否包含所关心的分析物。

如图1所示，安置物质特性传感器62以传感就在自由小滴形成之前（即，在小滴从液流脱离的点）从液流12之内的分析物发生的发射。由物质特性传感器62传感的信号被诸如分析设备15的处理器处理。然后小滴13可以通过包括分类设备16的部件被表征。如所示的，分类设备16生成静电场以使充电的小滴偏斜，而未充电的小滴不偏斜。通过分析设备15与电极72的内部连接，可以实现与另一个小滴相对的一个小滴的差别充电。因为分析设备15可以从物质特性传感器62获得它的信息，所以电极72可以响应物质特性传感器62。电极72可以被安置在喷嘴容积3之内，以便引起在鞘液上的充电。因此，鞘液可以响应电极72。电荷可以被传输到液流12的末端，以便在形式小滴的一刹那间，那个小滴可以被充电。然后电极72可以被迅速地中性化，以使形式的下一个小滴不会被无意地充电。用这种方式，当小滴13穿过分类设备16时，一些单个小滴——也就是包含或没有包含如由分析设备15确定的希望物质的那些小滴——将被偏斜。如此，偏斜的小滴可以被聚集在样品聚集容器82中，而没有偏斜的小滴可以传到排放贮池81。经过电极72作用的液流12的充电的适当时刻需要准确地利用小滴形成时间延迟（或“液滴延迟时间”）估计；具体地，在物质特性传感器62和分析设备15实际上已经确定液流12中的小滴13是否包含希望分析物之后形成小滴需要花费时间量。

为了确定最佳液滴延迟时间，图1的系统采用自动的小滴采样器73，该小滴采样器73对由分类设备16分类的小滴进行采样。自动的小滴采样器73具有位于可移动的浅盘74上或由可移动的浅盘74支撑的多个聚集区域75。通过移动可移动的浅盘74，不同的容器75可以被顺序安置在自由下落区域7中，从而可以聚集小滴。重要地，可移动的浅盘74可以响应步进电动机76，以使各种容器75可以单独地和递增地安置在自由下落区域7中。因此，贯穿一个单次采样事件，可以取得许多不同的样本。

在图1的系统中，小滴形成时间延迟调整器80与自动的小滴采样器73配合，以优化时间延迟。通过生成自动的物质最大化单元——实质上，自动地提供信息以允许分类物质的最大化的任何部件、软件或线路，来实现该最佳化。物质最大化单元可以包括增量控制器77，一种运作以自动地调整在控制电极72中的由分析设备15实际上施加的各种时间延迟的装置。通过增量控制器77，随着每个不同的容器75位于自由下落区域7之内，由分析设备15施加到电极72的时间延迟可以在增加的量中变化。因此，每个容器75可以代表不同的时间延迟量。然后这些结果可以用来实现最佳的（或更佳的）液滴形成时间延迟估计。

在这样的自动的配置中，细胞计数器79得到允许时间延迟调整器80改变在处理期间的实际时间延迟的信息。用这种方式，不同的时间延迟量可以被自动地采用和测试，以了解哪个得到最大计数。

如将由本领域的技术人员所领会的，尽管图1的系统是自动系统的事实，但是这种系统通过反复的、试错法方案来确定最佳时间延迟。

图2是根据本发明的实施例的流式细胞仪系统200的示意图。如同其他流式细胞仪系统一样，流式细胞仪200包括喷嘴系统242、振荡器210和探询室外壳209。

在探询室外壳209之内，一个以上的激光源208发出一个以上的激光束，该一个以上的激光束在激光截获点250与液流207相交。检测器（未显示）被用于检测来自液流207中的分析物颗粒的发射。然后分析系统（未显示）判定与激光截获点250相交的分析物颗粒是否是所关心的分析物。这种分析典型地是基于分析物颗粒的荧光、侧向散射或前向散射。

如在典型的流式细胞仪中，振荡器210干扰液流207以形成小滴213。在本发明的方法中，振荡器210用作计算液滴延迟时间的参考频率和参考相位。虽然图解的是被连接到喷嘴系统242的底部，当然，振荡器可以被附接到喷嘴系统242上的其他位置。当所关心的分析物与激光截获点250相交时和当所关心的分析物到达脱离点214时之间的时间是“液滴延迟时间”，“液滴延迟时间”典型地在相对于振荡器210的频率的周期中被涉及。典型地，系统具有大约400微秒来判定与激光截获点250相交的分析物颗粒是否是所关心的分析物。

对于本发明的系统，独特的是，流式细胞仪200包括精确度校准的、可移动的摄影机载物台。在一个实施例中，可移动的摄影机载物台是滚珠丝杆线性运动载物台201。安装在载物台201上的是摄影机202。典型地，摄影机202是高倍放大物镜摄影机。在操作中，摄影机202沿着载物台201的轨道移动，并且利用诸如光学编码器203的载物台位置测量能力来测量摄影位置。摄影机202的移动由诸如伺服马达204的精密马达或驱动机构驱驶。

如以下进一步解释的，摄影机202被精确地驱动沿轨道203向下，以便获得液流207的多个高分辨率图像。具体地，摄影机202被递增地驱动沿轨道203向下，在每个增量获得图像。然后使用数字图像处理算法将图像拼接在一起。在替换的实施例中，可以采用广角透镜摄影机来获得整个液流207的图像（或多个图像）。如以下将充分理解的，现有技术系统使用反复的、试错法方案来确定液滴延迟时间，而本发明的系统和方法基于液流207的拼接图像来计算液滴延迟时间。实质上，在此呈现的方法处理拼接图像以识别激光截获点250和脱离点214之间的小滴的数目、峰值和/或周期。在识别这两点之间的小滴的数目、峰值和/或周期之后，该系统可以通过补偿影响液滴延迟时间的变量来准确地预测液滴延迟时间。因而，本发明的系统和方法不需要荧光小珠或试验的、反复的方案。

图7是显示在此呈现的方法的高层的流程图。图7的方法包括四个主要子方法，也就是：用于精确地找到流式细胞仪的激光位置的方法800；执行初始化扫描的方法900；执行校准扫描的方法1000，在方法1000中，计算液滴延迟时间；以及用于保持液滴延迟时间的方法1100。用于保持液滴延迟时间的方法1100对于本领域的那些技术人员而言是已知的，与本发明无关，因此在这个说明书中不详细论述。

图8是显示用于精确地找到流式细胞仪的激光位置的方法800的流程图。典型地，一旦组装流式细胞仪，用户并不在乎激光在物理空间中位于什么地方。用户典型地仅仅关心激光与液流正确地对准。然而，对于根据这个发明的计算液滴延迟时间的方法，激光与液流的截获点的准确位置是重要的，因为在计算液滴延迟时间中，该位置是可变的。参考图2的流式细胞仪200，首先通过将摄影机202移动到行程的顶部（即，液流207离开喷嘴242的地方），方法800在步骤802开始。在行程的顶部，摄影机202的精确位置是已知的。摄影机202在行程顶部的位置用作所有随后的计算的基准点。在步骤804中，激光遮板的状态被保留，因此只有所关心的激光被打开。在步骤806中，设置摄影机202的辉度、对比度和/或曝光度以用于激光观察。在步骤808中，取得激光的快照，并且图像被处理成为二进制图像。在步骤810中，激光的质心被测量作为图像像素的函数。利用取得的激光质心的测量，激光与液流的截获点相对于摄影机载物台的准确位置是已知的。

图9A是显示执行初始化扫描的方法900的流程图。方法900包括在频率范围之中扫描振荡器10以确定最短的小滴脱离的步骤902；确认激光焦点位置和大小是有效的（或貌似合理的）的步骤904；和以微米每像素的方式来校准像素大小的步骤906。

图9B是显示9A中所示的方法900的子方案步骤902的流程图。子方案步骤902可以被编程为处理器，该处理器用于确定离开流式细胞仪喷嘴的液流的最短的小滴脱离。通常，在这个子方案中做的是以特定的频率设置振荡器210（图2），并且通过摄影机202扫描液流207以确定液滴213在什么地方从液流214脱离。一旦找到这个位置214，通过特定的增量改变振荡器频率，并且再次通过摄影机扫描液流。重复这个处理，直至脱离点停止朝向喷嘴移动并且开始移动远离喷嘴。导致脱离到喷嘴的最近的位置的点的频率是最佳频率。然后以这个最佳频率持续振荡器频率，并且以较好的分辨率再次扫描液流，直至刚刚开始脱离的点214（图3）被确定。

更详细地，在步骤911中，该程序设置用于振荡器频率扫描的上下振荡器驱动频率界限。在步骤913中，摄影机被移动到喷嘴位置以下。在步骤915中，扫描步长最初被设置为1200Hz。在替换的实施例中，扫描步长可以被设置为替换的频率。在步骤917中，在存储器中初始化第一液滴分离的位置的分位点列表，以便记录惯例扫描的最短的70%的子扫描以及下一个较高质扫描的最短的75%的子扫描。在步骤919中，程序询问是否所有的扫描都完成了。如果它们是，那么程序结束。否则，该程序进行到步骤921，在此，该程序利用摄影机遍及振荡器频率范围中的每个频率扫描液流，并且记录在每个频率增量的脱离位置。这个系列的步骤产生一系列测量，该一系列测量形成关于脱离点最接近喷嘴的点的分布。这个分布将被分成分位点以及废弃的上下分位点。

通过步骤921A-921G中概述的方案来执行步骤921。具体地，当频率小于上限时921A，扫描继续。在每个设置的振荡器频率，在步骤921B中，移动摄影机直至第一脱体液滴可见。然后，在921C中，通过使所有的可见液滴的中心之间的距离平均，来计算脱体液滴之间的平均距离（称为液滴波长）。在步骤921D中，通过从第一脱体液滴的中心减去一个平均液滴波长，来计算最后附接液滴的位置。在步骤921E中，通过从当前的摄影机马达位置减去最后附接的液滴的质心来计算脱离位置。在步骤921F中，记录振荡器频率以及脱离位置。在步骤921G中，振荡器频率被增加，而且方案返回到步骤921A。

然后，子方案步骤921移动到步骤923，在此，扫描的脱离位置被分类，并且保存在脱离点的分布中的指定分位点以上的那些位置。在步骤925中，扫描步长被增加一半。在步骤927中，分位点索引被增加到存储器中。在步骤929中，上下频率界限被设置以使用较好的步长再扫描保存的列表。

图9C是显示9A中所示的方法的子方案步骤906的流程图。在子方案906中，测量和校准图像的微米每像素。在步骤930中，微米每像素被设置为默认值（基于光学设计标称值）。然后步骤932、934和936重复三次。在步骤932中，设置摄影机的位置，使顶部液滴在屏幕较低的25%中。在步骤934中，摄影机被向下移动已知距离（在马达位置坐标中）。在一个实施例中，移动的距离对应于显示屏幕的大约50%（在图像行中）。在步骤936中，测量顶部液滴的屏幕上的新位置，并且减去初始位置以确定响应指令马达移动（以微米）而移动的图像行的数目。在重复步骤932、934和936之后，微米每像素被设置为等于三个测量值的中值。

图10A是显示执行校准扫描的方法的流程图。然后，通常，脱离点的位置不仅受振荡器的频率的影响，而且还受驱动频率的振幅的影响。结果，进行振荡器振幅中的一系列变化，并且确定该变化对图像的重复性的影响。同样，改变类似的图像的闪控（strobing）频闪，并且确定频闪变化对图像的重复性的影响。这些步骤一起被称为液滴延迟时间维持。步骤1010（频闪扫描以优化用于液滴延迟时间维持的图片）和步骤1020（振幅扫描以测量用于液滴延迟时间维持的液流响应）是与设置的液滴延迟时间（步骤1100）的维持(maintenance)有关的步骤，是技术领域中已知的，并且因此不在此详细论述。

步骤1030提供用于确定液滴延迟时间的示范性算法。图10B概述了根据本发明的一个实施例的确定液滴延迟时间的步骤。在步骤1040中，频闪相位（相对于液滴波长中的峰值，施加摄影机频闪的位置）被设置为电荷相位（相对于水滴波长中的峰值，出现对液流施加电荷的位置）加上180°。实际上，电荷相位典型的被设置为稍微偏离参考相位（即，振荡器驱动频率的相位）。在步骤1050中，可移动的摄影机被用于捕获液流的多个图像，处理单元被用于拼接多个图像以形成完整的液流图像。

图10C步骤1050的子方案，概述根据本发明的一个实施例的捕获和拼接完整的液流图像的步骤。图3显示示范性的拼接图像，从根据本发明的流式细胞仪中的摄影机取得的多个图像制备该拼接图像。参考图2的流式细胞仪200，摄影机202被移动到原位（即，液流207的顶部），步骤1051，在此取得第一图像，步骤1052。在步骤1053中，存储的背景图像对于该位置被减去。在步骤1054中，摄影机202沿着载物台201向下移动大约一个全屏幕，但是留下规定量的重叠（例如，图像的10%）。然后取得随后的图像。重复这个处理（步骤1056）直至摄影机202仅仅使小滴213成像（即，摄影机202已经移动过脱离点214并且在马达行程的底部）。

靠近液流207的顶部的图像可能具有不明显的宽度识别标志，可能使峰值信息的提取复杂化。由于这个缘故，当利用振荡器的低驱动振幅设置操作时，在获得最初几个图像的同时，增加一个实施例中的液滴驱动电压设置。增加液滴驱动电压具有增加液流干扰的振幅的影响，但是并不使小滴位置移位。因而，液滴计数仍然是一致的。然而，在将摄影机向下移动到非常远离液流之前，驱动电压应当被减少到它的操作设置，因为驱动电压设置将改变小滴的绝对脱离。

在一个实施例中，设置有通过执行以下程序获得流式细胞仪液流的多个图像的单元，以下程序以C++编程语言写成：

当然，以上计算机程序以及在此呈现的任何其他计算机程序仅仅是示范性的。以相同的或其他编程语言的其他逻辑可用于实现相同的目的。

然后该方法移动到步骤1057，在此，通过使部分与具有最高相关的像素值的位置重叠来拼接该图像，如以下进一步论述的。使用数字图像处理算法将多个图像拼接在一起。典型地，该图像很难对准。垂直对准是马达移动的精密度、摄影机载物台的一致性（摄影机指向）以及对于微米每像素的估计值的函数。水平对准是马达行程和液流垂直对准的函数，并且趋向离开几十像素。

为了找到最佳图像匹配，聚集在第一相位中的每一图像立即向上与先前图像配合，以找到像素空间中的最佳对准。为了实现该配合，底部图像相对于上面的图像被移动，以找到关于配合的最佳位置（在顶部图像像素空间中）。在对于两个图像通用的相关窗口中采样图像。在一个实施例中，设置有通过执行以下程序拼接流式细胞仪液流的多个图像的单元，以下程序以C++编程语言写成，其中，在以下算法中：(dr)是行搜索空间的1/2宽度，并且（dc）是用于图像相关的1/2列搜索空间；选择行偏离和行深度的值，因此图像可以向下和向左移动，而没有使第二图像的相关窗口离开第一图像；通过连续的展开每个行扫描线，像素定制的函数将图像的矩形域（由[rowbegin，rowend，colbegin，colend]定义）转换成为矢量。

当然，以上计算机程序以及在此呈现的任何其他计算机程序仅仅是示范性的。以相同的或其他编程语言的其他逻辑可用于实现相同的目的。

依据图像的第一处理，图像常常被失配。例如，利用400×1280像素图像，以及10%重叠，预测底部图像将配合像素偏移g=（0,1152）。对于保持固定在第二图像空间的方框之内的所有的像素，两个图像的像素被视为两个大的矢量（vt和vb），具有像素颜色定义的入口（通过行和列展开）。通过计算（和标准化）两个矢量的点积来确定相关系数，c=(vt，vb）\（|vt||vb|）。这个系数（0≤c≤1）确定两个图像对于给定的偏移g对准得有多好。当两个图像完全相同时，配合是最大的。

系数g在给定的相关窗口之内移动，并且最佳偏移被用作用于这两个图像的拼接偏移。这个处理继续向下的液流直至所有的图像与上面的一个相关。随着处理继续，相对于第一图像，保持拼接偏移，以便将整个序列放置成为单个图像（通过简单地从相对顶部图像空间复制像素）。在此图像重叠，两组像素被平均，允许肉眼检查图像以确定拼接的质量。

由于液流图像的周期的本质，初始估计必须足够良好，以使它在正确的像素偏移的液滴波长的一半之内。否则，在正确的一个前后，给定的波形可能潜在地与波匹配，从而从系统插入或删除一个周期。

在图像被拼接在一起之后，如图3所示，在图像中的每条线的液流的宽度被提取成为宽度标绘图（图4），该宽度标绘图用于检测液流宽度图像的峰值和谷值。图10D是根据本发明的一个实施例的计算宽度标绘图的峰值和谷值的子方案。

图4是从拼接图像测量的实例宽度标绘图，拼接图像诸如是图3中所示的图像。假定颗粒的速度紧密地依赖波速，这些峰值的计数允许推测颗粒从探询（或激光截获点250）穿到脱离点214所使用的时间量，从而允许计算液滴延迟时间。

在一个实施例中，拼接图像经由标准处理（直方图均衡化、高斯平滑、以及逐行平均值门限）被转换为黑白色。然后所得到的黑白图像被转换成为液流宽度标绘图，其中，白色代表背景群体并且黑色代表液流群体。在一个实施例中，设置有通过执行以下程序将拼接图像转换成为黑白图像的单元，以下程序以C++编程语言写成：

当然，以上计算机程序以及在此呈现的任何其他计算机程序仅仅是示范性的。以相同的或其他编程语言的其他逻辑可用于实现相同的目的。

因为宽度标绘图从单色图像取得，所以它相当地嘈杂。特别地，靠近喷嘴，振荡器在液流上的振幅低，宽度标绘图的噪声比不是很好。从行到行，门限算法导致一些像素被分配给错误的种类（假阳性或假阴性）导致噪声严重的信号。尝试找到关于这个信号的峰值和谷值将是很难的。因而，在一个实施例中，执行傅里叶分析以过滤宽度标绘图以便提取相关的信号特性（主信号的峰值和谷值）。具体地，执行用于频域过滤的傅里叶分析以过滤（或平整）宽度标绘图。在傅里叶域中的过滤允许保留选择的频率和丢弃经由空间域信号的傅里叶变换的其他频率，将简单的窗口函数应用到频域信号，接着通过反向傅里叶变换回到空间域。这种傅里叶分析在图10D中被概述。

预处理对于有效地使用窗口函数过滤离散信号是有用的。在步骤1081中，宽度标绘图被修整以去除宽度标绘图的喷嘴区域（即，宽度标绘图的左边缘）。快速离散傅里叶变换的有效实施在长度是二的偶数幂的数据上操作。在步骤1082中，从它的具有零点原始长度填补初始数据到二的下一个较高幂的长度。如果没有注意，从信号值到填充值的突然转换将引进阶段函数到数据，并且将导致转换数据的吉布斯振铃。为了利用尽可能平滑的转换来填充数据，从左边缘延伸数据，因为在行零点的测量数据会聚（到左面）到等于液流的平均宽度的DC偏移。在一个实施例中，设置有通过执行以下程序填充宽度标绘图的单元，以下程序以C++编程语言写成：

当然，以上计算机程序以及在此呈现的任何其他计算机程序仅仅是示范性的。以相同的或其他编程语言的其他逻辑可用于实现相同的目的。

在步骤1083中，在宽度标绘图上执行离散傅里叶变换。虽然图10D的流程图图解了傅里叶变换和汉娜过滤分析的使用，但是替换的过滤技术可以被设计以实现相同的目的。然后，执行开窗以过滤数据。最简单的过滤窗口是矩形窗口-零用于停止的频率，一用于通过的频率。虽然这个窗口产生反变换信号中的振铃，但是可能难以解决a)相对强度完全不同的信号，或b）频率非常接近的信号。代替矩形窗口，替换的实施例使用通常使用的称为汉娜窗口的适度的窗口函数。在步骤1084中，汉娜过滤窗口被生成并且在小滴波长的中心。汉娜窗口（以下提供的函数）与矩形窗口相比减少频谱泄漏，但是仍然具有用于低带宽信号的类似宽度标绘图的良好的敏感性：

选择汉娜窗口的中心频率以匹配傅里叶变换的数据上的第一峰值的频率。汉娜窗口的宽度可以被相当任意地选择，以包含用于给定的喷嘴尺寸（例如，70微米喷嘴）的大部分第一峰值信息，同时排除频率数据中的二次的和较高次的峰值。过滤的左边缘截止值和右边缘截止值在峰值和截止频率周围是对称的，截止频率的量值小于峰值的量值的大约10%。过滤窗口的宽度可以被参数化以处理其他喷嘴和液流信息。

在步骤1085中，通过将过滤窗口与频域填补数据相乘来过滤数据。然后，在步骤1086中，利用逆变换函数，频域数据被转换回到空间域。图5A显示图4的原始宽度标绘图和过滤的（平滑的）宽度标绘图。原始宽度标绘图已经垂直地偏移以允许两个标绘图没有重叠地显示。图5B是图5A的标绘图的特写镜头，显示靠近喷嘴的数据被重叠以显示原始的和过滤的（平滑的）数据两者。总的说来，过滤的数据具有轨迹非常接近于初始数据的峰值和谷值，但是具有平滑的变形，该平滑的变形允许计算峰值的位置。

在过滤峰值数据之后，在步骤1087中，计算过滤的数据（通过简单的差分）的导数，并且在步骤1088中识别零相交。通过选择从左到右减少的零相交来识别峰值。在喷嘴处，因为最后的波形或两个波形可能由于喷嘴的存在而不正常地形成，所以执行外推法。在一个实施例中，设置有通过执行以下程序来找到峰值的单元，以下程序以C++编程语言写成：

当然，以上计算机程序以及在此呈现的任何其他计算机程序仅仅是示范性的。以相同的或其他编程语言的其他逻辑可用于实现相同的目的。

图10E是根据本发明的一个实施例的计算液滴延迟时间的子方案。如下概述计算液滴延迟时间的方法。在步骤1092中，通过测量截获点之前的宽度标绘图峰值的位置和截获点之后的宽度标绘图峰值，计算激光截获点相对于振荡器频率的相位。然后，相位被设置为等于从先前峰值测量的激光截获点的峰值之间的波长的一部分。在步骤1094中，询问系统以识别小滴液流电荷脉冲的相位偏移。电荷相位典型地偏离参考驱动频率以说明电荷脉冲的上升时间。在步骤1096中，通过将液滴延迟时间设置为等于过滤的宽度数据中的峰值的数目，加上相对于小滴生成波的激光截获点的相位，减去电荷相位，加上偏差成分，来计算液滴延迟时间。基于以下提供的描述，将进一步理解步骤1092、1094和1096的方案。

在一个实施例中，用于计算液滴延迟时间的方法说明相位变量，诸如振荡器的相位、电荷电极、频闪系统、摄影机图像和/或激光。具体地，为了获得液滴延迟时间的小数部分，调和系统之内的各种相位变量。如现有技术系统中的，当使用小珠以试验性地确定液滴延迟时间时，这些变量可能被忽视，但是应当在本发明的预测方法中被说明。

通过移动电荷相位窗口直至获得干净的分类液流来选择适当的电荷相位。这个处理有效地对准液滴驱动时钟和电荷之间的偏移以优化小滴电荷。关键实现的是小滴电荷脉冲可以仅仅以小心设置的次数出现，也就是每个液滴驱动周期一次。图6显示电荷窗口（底部）如何处于振荡器周期（顶部）的指定相位。

实际上，对于事件的基本生存周期是：1）在激光截获点分配时间戳；2）添加液滴延迟时间；和3）对选择的小滴充电。具体地，在激光探询的时刻，高精度的时间戳被添加到事件。时间戳被载入软件，该软件推测颗粒将结束的最终液滴。用于这个的公式是：液滴=（截获时间+液滴延迟时间）除以（液滴驱动周期），其中除以是整数除法（去掉余数）。通过选择液滴延迟时间，在时间（确切地一个周期长）中的移动窗口和液滴数量之间生成映射。时间中的每个随后的窗口将映射随后的液滴。

改变液滴延迟时间的小数部分的影响是在被预测为到达液滴中的事件的时候滑动窗口。当小数部分的计算错误时，系统实际上不正确地预测“在前液滴（pre－drop）”，而且属于这些时间的事件映射到一个以上的小滴，或映射到除了希望的小滴之外的小滴。

相对于激光相位，对于在相对于液滴驱动周期的零频闪相位取得的图片，用于图解激光相位的影响的非常简单的起点是考虑当激光截获点在两个峰值之间的谷值时的情形频闪。基本假设（未必总是绝对真实的）是集中在小滴峰值周围的这种区域最终紧缩（当它向下游移动时）以形成小滴（即，“在前液滴”）。

考虑到假定的颗粒在一瞬间经过激光。它的时间戳将标记时间间隔的开始，想要该时间间隔的开始以映射特别液滴。在“在前液滴”的顶部处的颗粒将在一个周期稍后经过激光，所以希望安排液滴延迟时间，以使时间中的整个间隔映射（在除以操作之下）到相同的液滴。这个布置是液滴延迟时间的小数部分的本质。在这种颗粒上的时间戳将具有是液滴驱动周期的完整的整数倍数的时间戳。在除以操作之下，周期之内的接着的全部时间将丢失它们的余数，并且映射与这个第一颗粒相同的液滴。

小数的液滴延迟时间的初步引入是说明当激光并不准确地在零相位的“在前液滴”的开始时的情形。例如，如果激光被取代，则在液流中的凸出部分的中心。如果激光集中在液流的凸出部分之间的波谷上，那么所有的颗粒将在1/2周期冲击这个激光，比它们打算的要早。为了说明激光位置中的这个转移，在一个实施例中，通过人为增加1/2周期到ADC时间来说明移位：

液滴=（﹛截获时间+1/2周期}+液滴延迟时间）除以（液滴驱动周期）

然而，实际上，并不可能将给定的ADC时间戳改变为事件。反而，增加的结合性被用于将这个小数偏移吸收成为液滴延迟时间：

液滴=（截获时间+﹛1/2周期+液滴延迟时间}）除以（液滴驱动周期）

因而，延迟具有小数成分。如果激光处于其它的小数偏移（除1/2之外），那么继续相同的进程。当然，在给定的周期之内，一个以上的颗粒将完全不可能经过激光。然而，以上的进程仍然采用，因为最后附接的小滴的计数每个周期被增加一个。

相对于电荷相位，因为小滴将在周期期间在一些（未知的）相位干净地脱落，所以可能的是，（根据电荷相位）为了分类而被充电的实际的液滴可以是在零相位仍然被连接在图像中的一个液滴，或下一个较高的液滴（用于稍后电荷相位）。为了使图像处理能够清楚地检测是哪个情形，正好在电荷相位取得图像。如此，可以检测哪个液滴被选择用于充电。在通过相应的小数的相位，在稍后相位处获得图像有效地移动激光到“在前液滴”之上。为了补偿这个有效移动，通过减去小数的移动，该算法有效地移动激光后退，并且最终的液滴延迟时间推测是：

液滴延迟时间=﹛小数激光偏移+整数液滴延迟时间-小数电荷相位}，在此，该图像正好在电荷相位被闪控。

最终的适应可以有助于试验性观察的偏差。对于替换的喷嘴尺寸，可能存在偏差。这种偏差可以是试验性确定的并且可以被推导为代数函数，以便说明偏差（偏差=aX+b）。例如，对于70微米喷嘴的偏差例如被设置为函数：

-0.015465X+0.891189，其中，X=0.1（脱离微米-电荷/360*最后的波长微米）/平均速度。

这个变量基本上是在微米的10s中从喷嘴到脱离的时间（大致在100kHz的周期）。

本发明的宽度和范围不应当被任何以上描述的示范性实施例所限制，而是应当仅仅根据以下权利要求书和它们的等同物来限定。

Claims (12)

1.一种计算流式细胞仪的液流中的液滴延迟时间的方法，其特征在于，包括：

(a)识别相对于参考框架的激光位置；

(b)确定脱离点；和

(c)通过以下步骤计算所述液滴延迟时间

1)将频闪相位设置为电荷相位加上180°，

2)对所述液流进行成像，

3)通过基于所述液流的所述图像测量所述液流的宽度来确定宽度标绘图，

4)确定所述宽度标绘图中的峰值；

5)通过测量截获点之前的宽度标绘图峰值的位置和截获点之后的宽度标绘图峰值，计算相对于小滴生成波的激光截获点的相位，和

6)将所述液滴延迟时间设置为等于所述宽度标绘图中的所述峰值的数目，加上所述激光截获点的所述相位，减去所述电荷相位，加上偏差成分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含平滑所述宽度标绘图的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述宽度标绘图中的所述峰值的所述步骤包含计算所述宽度标绘图的导数和记录所述导数的多个零相交的步骤，其中每个零相交指示被平滑的宽度标绘图中的峰值。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱离点是最短的脱离点。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述液流进行成像的所述步骤包含沿着所述液流的长度运行摄影机，同时获得所述液流的多个图像的步骤；并且将所述多个图像拼接在一起以形成单个图像的步骤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同样响应于偏差校正因数来设置所述液滴延迟时间。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述偏差校正因数等于线性函数aX+b，其中，X是从喷嘴到脱离的时间，并且参数“a”和“b”是从系统响应的试验性测量所确定的。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，使用离散傅里叶分析来执行所述宽度标绘图的所述平滑。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述摄影机在所述液流的顶部周围时，驱动电压从操作值被增加，并且随着所述摄影机朝向所述脱离点被向下驱动时，所述驱动电压被减少到操作值。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液滴延迟时间的计算被用于确定所关心的分析物什么时候已经到达所述液流的所述脱离点。

11.一种用于自动地计算液滴延迟时间的流式细胞仪系统，其特征在于，包括：

适合于获得液流的图像的摄影机；和

处理器，用于基于所述液流的所述图像确定宽度标绘图，

确定所述宽度标绘图中的峰值，

通过测量截获点之前的宽度标绘图峰值的位置和截获点之后的宽度标绘图峰值，计算激光截获点相对于小滴生成波的相位，和

计算液滴延迟时间，其中所述液滴延迟时间等于所述宽度标绘图中确定的峰值的数目，加上所述激光截获点的所述相位，减去电荷相位，加上偏差成分。

12.一种用于自动地计算液滴延迟时间的流式细胞仪系统，其特征在于，包括：

安装在精确度校准的、可移动的摄影机载物台上的摄影机，所述摄影机适合于获得液流的多个图像；和

处理器，用于

拼接所述液流的所述多个图像以形成所述液流的一个完整的图像，

基于所述液流的所述一个完整的图像来确定宽度标绘图，

平滑所述宽度标绘图，

计算所述平滑的宽度标绘图上的导数，

确定所述平滑的宽度标绘图上的零相交，和

基于确定的零相交来计算液滴延迟时间，

其中，基于确定的零相交来识别所述宽度标绘图中的峰值，

通过将电荷相位加上180°来设置频闪相位，并通过测量截获点之前的宽度标绘图峰值的位置和截获点之后的宽度标绘图峰值，计算激光截获点的相位，

通过将所述液滴延迟时间设置为等于所述宽度标绘图中的所述峰值的数目加上相对于小滴生成波的所述激光截获点的所述相位，减去所述电荷相位，加上偏差成分，来计算所述液滴延迟时间。