CN1950077A

CN1950077A - 利用过氧化物酶体增殖物激活受体－δ激动剂治疗多发性硬化和其他脱髓鞘病

Info

Publication number: CN1950077A
Application number: CNA2005800148506A
Authority: CN
Inventors: K·尚德罗斯; J·梅里尔; A·明尼克; 李岚; O·霍克瓦; 刘云
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-04-01
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2007-04-18
Also published as: KR20060134191A; RU2006138495A; WO2005097098A3; WO2005097098A2; US20070149580A1; JP2007530703A; CA2561159A1; SG138623A1; AU2005231358A1; ZA200607850B; MXPA06011218A; MA28561B1; IL178165A0; NO20064985L; BRPI0509540A; EP1737440A2

Abstract

本发明披露了通过用有效量的PPAR－δ激动剂治疗，治疗脱髓鞘病的方法。可用这种方法有效地治疗的脱髓鞘病包括但不限于多发性硬化、沙－马－图病、佩－梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、吉－巴综合征以及其中形成髓鞘的胶质细胞受到损害的病症，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤。

Description

利用过氧化物酶体增殖物激活受体-δ激动剂治疗多发性硬化和其他脱髓鞘病

发明领域

本发明涉及利用PPAR-δ激动剂来治疗多发性硬化(MS)和其他脱髓鞘病。本发明还涉及到利用某些为选择性PPAR-δ激动剂的化合物来治疗MS和其他脱髓鞘病。

发明背景

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)包含核受体超家族的亚家族。目前已经鉴定并克隆了三种密切相关的同种型，通常称为PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ。每个受体亚型具有一个特征DNA结合结构域(DBD)和一个配体结合结构域(LBD)，对于配体活化的基因表达来说，两者都是必要的。PPAR以异二聚体与类视黄醇X受体结合。参见J.Berger和D.E.Miller，Ann.Rev.Med.，2002，53，409-435。

PPAR-δ(亦称为PPAR-β)在广泛的哺乳动物组织中表达，但是，关于其生物功能或该受体所调控的全部基因的信息，却很少有阐述。不过，最近发现，激动剂对于治疗诸如血脂障碍和某些皮肤疾病可能有用，而拮抗剂对于治疗骨质疏松症或结肠直肠癌可能有用(D.Sternbach，inAnnual Reports in Medicinal Chemistry，Volume 38，A.M.Doherty，ed.，Elsevier Academic Press，2003 pp.71-80)。

PPAR-δ似乎在CNS中有相当大的表达；但是，其大多数功能尚待发现。不过，特别有意思的是发现PPAR-δ在啮齿类少突胶质细胞中表达，这是CNS的主要产脂细胞(J.Granneman，et al.，J.Neurosci. Res.，1998，51，563-573)。此外还发现，PPAR-δ选择性激动剂能够显著增加少突胶质髓鞘质基因的表达，并能够增加小鼠培养物中髓鞘直径(I.Saluja et al.，Glia，2001，33，194-204)。

脱髓鞘病表现为髓鞘质，即覆盖很多神经纤维的脂质和蛋白质的多重致密外层的丢失。这些外层是由中枢神经系统(CNS)的少突神经胶质和外周神经系统(PNS)的施旺细胞提供的。在多发性硬化(MS)中，CNS中生成髓鞘质的细胞——少突胶质细胞被破坏，轴突受到损伤，造成神经元活动严重受损和功能缺陷，包括麻痹(palegia)。在具有脱髓鞘状况的患者中，脱髓鞘可能是不可逆的；脱髓鞘通常伴有或随后会发生轴突退化，通常还出现细胞退化。脱髓鞘可因神经元损害或髓鞘本身受到损害而发生-无论是由于异常免疫反应、局部损伤、局部缺血、代谢紊乱、毒性物质或病毒感染所引起(Prineas和McDonald，Demyelinating Diseases(脱髓鞘病).In Greenfield′s Neuropathology，6.sup.th ed.(Edward Arnold：NewYork，1997)813-811，Beers和Berkow，eds.，The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(默克诊断治疗手册)，17.sup.th ed.(WhitehouseStation，N.J.：Merck Research Laboratories，1999)1299，1437，1473-76，1483)。但是，在脱髓鞘区普遍存在有新形成的少突胶质细胞祖细胞，表明如果这些祖细胞能够被诱导分化为成熟的少突胶质细胞，则有自修复的可能。

中枢脱髓鞘(中枢神经系统脱髓鞘)在多种疾病中发生，通常病因不明，这些疾病已经成为主要的脱髓鞘病。在这些疾病中，多发性硬化最为普遍。其它主要的脱髓鞘病包括肾上腺脑白质营养不良(ALD)、肾上腺脊髓神经病、AIDS-空泡性骨髓病、HTLV相关的骨髓病、莱伯遗传性视神经萎缩症、进行性多发脑白质病(PML)、亚急性硬化全脑炎和热带痉挛性轻截瘫。此外，还有一些急性病症可能出现中枢神经系统脱髓鞘，如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)和急性病毒性脑炎。另外，急性横贯性脊髓炎也可能导致脱髓鞘，急性横贯性脊髓炎是一种综合征，其中未知原因的急性脊髓横切影响到一个或多个相邻胸节中的灰质和白质。

多发性硬化是一种主要影响年轻成年人的慢性、破坏性的神经疾病。多发性硬化的病因是在大脑和脊髓中导致髓鞘和少突胶质细胞破坏以及轴突损害的复杂过程(Prineas和McDonald，Demyelinating Diseases(脱髓鞘病).In Greenfield′s Neuropathology，6.sup.th ed.(Edward Arnold：NewYork，1997)813-811，Trapp et al.，N.Engl.J.Med.，338：278-85，1998)。从组织病理学上来说，多发性硬化的特征是发炎、脱髓鞘斑块渗透中枢神经系统中的细胞、少突胶质细胞丢失以及局灶性轴突损伤(Prineas和McDonald，Demyelinating Diseases(脱髓鞘病).In Greenfield′sNeuropathology，6.sup.th ed.(Edward Arnold：New York，1997)813-811)。该疾病被认为是由免疫系统对髓鞘、以及可能非髓鞘、自身抗原的异常免疫反应造成的(Bar-Or et al.，J.Neuroimmunol.100：252-59，1999，Hartung，H.-P.，Current Opinion in Neurology，8：191-99，1995)。临床上来说，多发性硬化呈现一种复发-缓解的过程，或者说，即呈慢性进行性过程，身体残疾不断加重(Gold et al.，Mol.Med.Today，6：88-91，2000)。典型情况下，多发性硬化的症状包括共济失调、感觉失常(paresthesias)、语言和视觉紊乱，以及虚弱。

当前多种脱髓鞘病的治疗通常费用昂贵、治标不治本、只有部分效果，且可能造成不希望的副作用。当前多发性硬化的主要形式的治疗方法是肾上腺皮质激素类治疗(口服强的松，60-100mg/天，在2-3周内逐渐降低，或静脉内注射甲基强的松龙3-5天，500-1000mg/天)。尽管这些治疗可能缩短犯病时症状出现的时间，但是，它们可能不能影响最终的长期残疾。长期使用肾上腺皮质激素类药物很难说是合理的治疗方法，而且会成造很多医学并发症，包括骨质疏松症、溃疡以及糖尿病(Beers和Berkow，eds.，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克诊断治疗手册)，17.sup.th ed.(Whitehouse Station，N.J.：Merck Research Laboratories，1999)1299，1437，1473-76，1483)。

采用重组人干扰素-β(Betaseron和Avonex)和共聚物(Copaxon)的免疫调节治疗稍微降低多发性硬化复发的频率，并可能有助于延缓最终的残疾(Beers and Berkow，eds.，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克诊断治疗手册)，17.sup.th ed.(Whitehouse Station，N.J.：Merck ResearchLaboratories，1999)1299，1437，1473-76，1483)。干扰素-β和共聚物的两种形式目前都用作多发性硬化的治疗形式，但是都极其昂贵。免疫抑制药物(硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺和甲氨蝶呤)则用于更严重的进行性形式。但是，这些药物疗效并不一致，并有显著的毒性副作用。有几种药物(如巴氯芬，30-60mg/天，分几次服用)通过抑制脊髓的反射可以减轻痉挛。但是，这些药物的使用必须小心谨慎，因为它们对多发性硬化患者所产生的药物诱导的减轻痉挛的作用通常会加重衰弱，从而使患者的残疾更加严重。

类似地，当前对另一种破坏性的脱髓鞘病ALD的治疗，相对来说，效果也不佳。ALD的症状可以包括皮质盲、皮质脊髓束功能障碍、精神颓废和痉挛状态。控制ALD病情发展的治疗方法可包括骨髓移植和饮食治疗(DiBiase et al.，Ann.Ist.Super Sanita，35：185-92，1999)，但是无情的神经学病情恶化无可避免地将会发生，并最终导致死亡[Krivit et al.，Curr.Opin.Hematol.，6：377-82，1999，(Beers and Berkow，eds.，The MerckManual of Diagnosis and Therapy(默克诊断治疗手册)，17.sup.th ed.(Whitehouse Station，N.J.：Merck Research Laboratories，1999)1299，1437，1473-76，1483)]。在患有EAE和EAN的动物的治疗方面，已经取得了一些进展，主要是通过神经胶质细胞移植和生长因子治疗，以及通过抑制黏着分子、自身抗体和细胞因子(Njenga和Rodriguez，Current Opinion inNeurology，9：159-64，1996。但是，这些治疗都没有证明对人有效，其中有些治疗需要进行广泛的神经外科干预。综上所述，很清楚的是，需要有更有效、更经济且更少侵入性的方法来治疗各种形式的脱髓鞘病症，同时又不会产生不希望的副作用。

本发明采用小分子激活的再生方法，显著地增强了现有的脱髓鞘病治疗的免疫调节疗法的效果。

选择性PPAR-δ化合物在本领域是众所周知的，尤其是WO 01/00603专利中所描述的通常称为GW 501516的式为(1)的化合物。

式为(2)的化合物也称为L165,041，已在欧洲专利申请28063和WO97/28149中披露，其中该化合物被鉴定为一种选择性的PPAR-δ激动剂。

由于过氧化物酶体增殖物激活受体-δ(PPAR-δ)激动剂具有加速从啮齿类大脑中急性分离出的少突胶质细胞祖细胞的分化以及显著地增加髓鞘直径和髓鞘基因表达的潜在能力，因此，PPAR-δ激动剂有可能激活少突胶质细胞祖细胞的PPAR-δ途径，并通过将脱髓鞘病，尤其是多发性硬化中髓鞘恢复成脱髓鞘的轴突而增强神经元的修复。

发明概述

因此，本发明提供了用PPAR-δ来治疗各种脱髓鞘病，尤其是多发性硬化的方法。一般来说，可按照本发明的实践来治疗的病症包括但不限于多发性硬化、沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、吉-巴综合征以及其中形成髓鞘的胶质细胞受到损害的病症，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤。此处披露的疾病可通过对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的PPAR-δ激动剂进行治疗。

本发明还涉及使用式为(I)和(II)的化合物来治疗脱髓鞘病，尤其是多发性硬化。

本发明还包括治疗患者多发性硬化的方法，该方法通过施用式(1)或(2)的化合物或其药学上可接受的盐和另一种已知对多发性硬化有疗效的化合物的治疗有效量的组合。当前用来治疗该疾病的化合物为疾病改善剂，如干扰素(干扰素-β-1a、β-1b和α-2)、醋酸格拉太咪尔(glatiramer acetate)或肾上腺皮质激素类药物，如甲基强的松龙和强的松。此外还有化学治疗剂，如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺和环孢菌素。

发明详述

本文中所用的“药学上可接受的载体”这一表述意指无毒的溶剂、分散剂、赋形剂、辅剂或其它与本发明的化合物混合以形成药物组合物，即能够施用于患者的剂型的物质。此类载体的一个实例是药学上可接受的油，其通常用于肠胃外施用。

本文中所用的术语“药学上可接受的盐”意指本发明化合物的盐可用于药物制备。但是，其它盐可以用于制备根据本发明的化合物及其药学上可接受的盐。本发明的化合物之适宜的药学上可接受的盐包括酸加成盐，其可通过混合本发明之化合物的溶液和药学上可接受的酸来制备，所述酸为如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、富马酸、马来酸、羟基马来酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、戊二酸、乙酸、水杨酸、肉桂酸、2-苯氧基苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、碳酸或磷酸。也可以形成酸性金属盐，如磷酸一氢钠和硫酸氢钾。另外，按此方法形成的盐可以单酸盐或二酸盐存在，亦可以水合盐或基本上无水的盐存在。此外，当本发明的化合物本身含有酸性部分时，则其适宜的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐，如钠盐或钾盐；碱土金属盐，如钙盐或镁盐；以及与适当的有机配体形成的盐，如季铵盐。

本文所用的术语“治疗有效量”意指能够有效地治疗所述疾病或状况的本发明化合物的量。

本文中所用的“药学上可接受的载体”这一表述意指无毒的溶剂、分散剂、赋形剂、辅剂或其它与本发明的化合物混合以形成药物组合物，即能够施用于患者的剂型之物质。此类载体的一个实例是药学上可接受的油，其通常用于肠胃外施用。

本发明还提供包含一种或多种本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。这些组合物优选为单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、粒剂、无菌肠胃外溶液剂或混悬剂、定量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿剂、自动注射装置或栓剂；用于口腔、肠胃外、鼻内、舌下或直肠施用，或用于吸入或吹入施用。另外，组合物也可以每周或每月施用的适当形式提供，例如活性化合物的不溶盐，如癸酸盐，可加以改变而提供用于肌肉注射的长效制剂。可以设想含有活性成分的易蚀性聚合物。制备固体组合物如片剂时，主要的活性成份与药物载体混合，所述载体为诸如常用的压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶以及其它药物稀释剂，如水，以便形成固态处方(preformulation)组合物，其包含本发明之化合物或其药学上可接受的盐之均一混合物。当我们说这些处方药物组合为均一时，指的是其活性成分均匀地散布在组合物中，因此，该组合物可被容易地细分为同样有效的单位剂型，如片剂，丸剂和胶囊剂。这一固态处方组合物然后被细分成上述类型的单位剂型，其包含0.1到约500毫克本发明之活性成分。加味的单位剂型包含1到100毫克，如1、2、5、10、25、50或100毫克活性成分。该新颖组合物的片剂或丸剂可加以包衣或复合以便提供具有长效优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内剂量组分和外剂量组分，外剂量组分为内剂量组分上的包层形式。两种组分可由一层肠衣层分隔开来，肠衣层用于抵抗在胃中崩解，并使得内组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料都可用作此类肠衣层或包衣，包括许多聚合酸和聚合酸与虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。

可掺入本发明的新颖组合物以便通过口腔或注射施用的液体形式包括水性溶液、具有适当口味的糖浆剂、水性混悬剂或油混悬剂、带有食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的加味乳剂，以及酏剂和类似的药物载体。用于水性混悬剂的适当的分散或悬浮剂包括合成和天然树胶如黄芪胶、阿拉伯树胶、海藻酸盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯-吡咯烷酮或明胶。

在此处所述的多种疾病状态的治疗中，适当的剂量水平为每日约0.01到250mg/kg，优选每日约0.05到100mg/kg，尤其是每日约0.05到20mg/kg。该化合物的施用方式可为每日1到4次。

本发明的一个方面披露了治疗患者脱髓鞘病的方法，其包括对施用治疗有效量的hPPAR-δ激动剂。

在这一实施方案的另一个方面，hPPAR-δ激动剂是选择性激动剂。

在这一实施方案的又一个方面，披露了一种方法，其中所述脱髓鞘病选自：多发性硬化、沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良症、吉-巴综合征以及其中形成髓鞘质的神经胶质细胞受到损害的疾病，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤。

在本实施方案的另一个方面，披露了一种方法，其中脱髓鞘病为多发性硬化。

在本实施方案的再一个方面，披露了一种方法，其中激动剂选自式(1)和(2)的化合物。

本发明所披露的另一个实施方案是药物组合物，其包含选自式(1)和(2)的化合物的化合物与至少一种药学上可接受的载体组合，所述化合物的量可有效治疗多发性硬化、沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良症、吉-巴综合征以及其中形成髓鞘质的神经胶质细胞受到损害的疾病，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤。

在本实施方案的另一个方面，披露了用于治疗多发性硬化的治疗有效量的药物组合物。

附图简述

图1.图解PPAR-δ激动剂增强培养的大鼠少突胶质细胞中髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫反应性。

图2.本图例示化合物1对培养的大鼠少突胶质细胞中的MBP mRNA的增强。

图3.本图例示化合物2对培养的大鼠少突胶质细胞中的MBP mRNA的增强。

图4A.例示化合物1对转录标记物的作用，其证实了在培养的大鼠少突胶质细胞中，PPAR-δ激动剂途径的激活。

图4B.进一步例示化合物1对转录标记物的作用，其证实了在培养的大鼠少突胶质细胞中，PPAR-δ激动剂途径的激活，表明在培养的大鼠少突胶质细胞中，ADRP mRNA被上调。

图5.显示在混合培养的人少突胶质细胞中，化合物1所产生的O4免疫阳性细胞数目的增加。

图6.显示在混合培养的人少突胶质细胞中，化合物2所产生的O4免疫阳性细胞数目的增加。

化合物实例：

式(1)的化合物(GW501516)可按WO 01/00603专利公布的方法制备。式(2)的化合物(L165,041)可按WO 97/28149专利公布的方法制备。

生物学实例：

下面的测试程序用来确定本发明化合物的生物学性质。为了进一步阐明本发明，提供了如下实例。但是，这些实例不应该被理解成以任何方式限制本发明。

在体外和体内模型中，对本发明的PPAR-δ激动剂促进髓鞘表达和增强再生过程的能力进行了评估。

最佳核受体选择性特征是由GAL4/萤光素酶报道基因分析确定的。啮齿类细胞分析显示该化合物能够促使/加速培养的少突胶质细胞祖细胞分化成成熟的少突胶质细胞。

表明对多发性硬化治疗效果的特定生物学分析为在啮齿类动物中进行的溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘以及实验过敏性脑脊髓炎。

细胞PPAR-δ分析中PPAR激动剂的EC50值的测定

原理

利用稳定的转染HEK细胞系(HEK＝人胚胎肾)分析了结合到人PPAR-δ上并以激动方式激活它的物质之效力，HEK细胞系此处称为PPAR-δ报道细胞系。PPAR-δ报道细胞系包含两种遗传元件，萤光素酶报道元件(pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo)和PPAR-δ融合蛋白(GR-GAL4-人PPAR-δ-LBD)，其根据PPAR-δ配体介导萤光素酶报导元件的表达。稳定且组成性表达的融合蛋白GR-GAL4-人PPAR-δ-LBD通过GAL4蛋白质部分在PPAR-δ报道细胞系的细胞核中结合到稳定整合到细胞系基因组的萤光素酶报道元件GAL4 DNA的结合基序5′-上游。在本分析中，如果使用脂肪酸耗竭的胎牛血清(cs-FCS)，那么在没有PPAR-δ配体的情况下，萤光素酶报道基因仅有很少表达。PPAR-δ配体结合并激活PPAR-δ融合蛋白，从而刺激萤光素酶报道基因的表达。形成的萤光素酶可通过适当的底物用化学发光法进行检测。

PPAR-δ报道细胞系的构建：

稳定的PPAR-δ报道细胞系的产生基于利用萤光素酶报道元件稳定转染的稳定HEK-细胞克隆。这一步骤在上面的“PPAR-α报道细胞系的构建”已有说明。在第二步中，PPAR δ融合蛋白(GR-GAL4人PPAR δ-LBD)被稳定地引入这一细胞克隆。为此目的，将编码糖皮质激素受体(检索号P04150)的N-端76个氨基酸的cDNA连接到编码酵母的转录因子GAL4(检索号P04386)的氨基酸1-147的cDNA段。人PPAR δ受体(氨基酸S139-Y441；检索号L07592)的配体结合结构域的cDNA被克隆到这一GR-GAL4构建体的3′-端。这样制备的融合构建体(GR-GAL4-人PPAR-δ-LBD)然后重新克隆到质粒pcDNA3(Invitrogen)以便通过巨细胞病毒启动子能够进行组成性表达。利用限制性内切核酸酶将该质粒线性化，并将之稳定转染到前述包含萤光素酶报道元件的细胞克隆。所得到的包含萤光素酶报道元件并组成性表达PPAR-δ融合蛋白(GR-GAL4-人PPAR-δ-LBD)的PPAR-δ报道细胞系通过zeocin(0.5mg/ml)和G418(0.5mg/ml)的选择而分离。

分析程序和评估：

PPAR-δ激动剂的活性通过下面所述的三天分析来测定：

第1天

PPAR-δ报道细胞系在与以下添加物混合后的DMEM(#41965-039，Invitrogen)培养液中培养到80％汇合：10％cs-FCS(胎牛血清；#SH-30068.03，Hyclone)、0.5mg/ml zeocin(#R250-01，Invitrogen)、0.5mg/mlG418(#10131-027，Invitrogen)、1％青霉素-链霉素溶液(#15140-122，Invitrogen)以及2mM L-谷氨酰胺(#25030-024，Invitrogen)。标准细胞培养瓶(#353112，Becton Dickinson)置于一台37℃细胞培养箱中，在5％CO₂存在的情况下进行培养。用15ml PBS(#14190-094，Invitrogen)洗涤80％-汇合的细胞，并用3ml胰蛋白酶溶液(#25300-054，Invitrogen)在37℃下处理2分钟，收集在5ml所述DMEM中，并在细胞计数器上计数。稀释到500,000细胞/ml后，在一个带有透明塑料底的96孔微量滴定板(#3610，Corning Costar)的每孔中接种35,000个细胞。微量滴定板在5％CO₂气氛中于37℃下在细胞培养箱中培养24小时。

第2天

待测试的PPAR-δ激动剂溶解于DMSO，浓度为10mM。该贮存液用混合有5％cs-FCS(#SH-30068.03，Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(#25030-024，Invitrogen)及前述抗生素(zeocin、G418、青霉素和链霉素)的DMEM(#41965-039，Invitrogen)中稀释。

以11种不同的浓度对测试物质进行了测试，浓度范围为从10μM到100pM。效力更强的化合物的测试浓度范围为从1μM到10pM，或在100nM到1pM之间。

第一天接种的PPAR-δ报道细胞系的培养液用抽吸法去除，在培养中稀释的测试物质立即加到细胞中。稀释和加入物质是利用机器人(BeckmanFX)进行的。培养液稀释的测试物质的最终体积为96孔微量滴定板的每孔100μl。本分析中的DMSO浓度低于0.1％v/v以避免溶剂的细胞毒性效应。

每个板加入了以11种不同浓度同样稀释的标准PPAR-δ激动剂，以阐明每个板中分析的功能。分析板在5％CO₂气氛中于37℃温度下在培养箱中培养24小时。

第3天

从培养箱中取出用测试物质处理过的PPAR-δ报道细胞，并用抽吸法除去培养基。向96孔微量滴定板的每孔中移入50μl的Bright Glo试剂(购自Promega)，使细胞裂解。在室温黑暗条件下培养10分钟后，在Wallac公司的Trilux发光计中对微量滴定板进行测量。微量滴定板每孔测量时间为1秒。

评估：

发光计的原始数据转到Microsoft Excel文件中。利用制造商(IDBS)指定的XL.Fit程序计算了PPAR激动剂的剂量-效应图和EC50值。

细胞PPAR-α分析中PPAR激动剂的EC₅₀值的测定

原理

利用稳定的转染HEK细胞系(HEK＝人胚胎肾)分析了结合到人PPAR-α上并以激动方式激活它的物质之效力，HEK细胞系此处称为PPAR-α报道细胞系。它包含两种遗传元件，萤光素酶报道元件(pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo)和PPAR-α融合蛋白(GR-GAL4-人PPAR-α-LBD)，其根据PPAR-α配体介导萤光素酶报导元件的表达。稳定且组成性表达的融合蛋白GR-GAL4-人PPAR-α-LBD通过GAL4蛋白质部分在PPAR-α报道细胞系的细胞核中结合到稳定整合到细胞系基因组的萤光素酶报道元件GAL4 DNA的结合基序5′-上游。在本分析中，如果使用脂肪酸耗竭的胎牛血清(cs-FCS)，那么在没有PPAR-α配体的情况下，萤光素酶报道基因仅有弱表达。PPAR-α配体结合并激活PPAR-α融合蛋白，从而刺激萤光素酶报道基因的表达。形成的萤光素酶可通过适当的底物用化学发光法进行检测。

PPAR-α报道细胞系的构建：

PPAR-α报道细胞系分两个阶段制备。首先构建萤光素酶报道元件，并稳定转染入HEK细胞。为此目的，在68bp长的最小MMTV启动子(检索号V01175)的5′-上游克隆了酵母转录因子GAL4(检索号AF264724)的5个结合位点。最小MMTV启动子部分包含一个CCAAT盒和一个TATA元件，以便能够由RNA聚合酶II有效转录。GAL4-MMTV构建体的克隆和序列测定类似于Sambrook J.et.al.(Molecular cloning(分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法。然后，在GAL4-MMTV元件的3′-下游克隆了完整的北美萤火虫(Photinus pyralis)基因(检索号M15077)。序列测定之后，由5个GAL4结合点、MMTV启动子和萤光素酶基因组成的萤光素酶报道元件被重新克隆到质粒中，该质粒提供zeocin抗性以获得质粒pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo。这一载体按照Ausubel，F.M.et al.的陈述(Current protocols in molecular biology，Vol.1-3，John Wiley & Sons，Inc.，1995)转染到HEK细胞中。利用含有zeocin(0.5mg/ml)的培养基来选择适当稳定的细胞克隆，其显示萤光素酶基因很低的基础表达。

在第二步中，将PPAR-α融合蛋白(GR-GAL4-人PPAR-α-LBD)引入所述稳定的细胞克隆中。为此目的，将编码糖皮质激素受体(检索号P04150)的N-端76个氨基酸的cDNA最初连接到编码酵母的转录因子GAL4(检索号P04386)的氨基酸1-147的cDNA段。人PPAR-α受体(氨基酸S167-Y468；检索号S74349)的配体结合结构域的cDNA被克隆到这一GR-GAL4构建体的3′-端点。这样制备的融合构建体(GR-GAL4-人PPAR-α-LBD)然后重新克隆到质粒pcDNA3(Invitrogen)以便通过巨细胞病毒启动子进行组成性表达。利用限制性内切核酸酶将该质粒线性化，并将之转染到前述包含萤光素酶报道元件的细胞克隆。所完成的包含萤光素酶报道元件并组成性表达PPAR-α融合蛋白(GR-GAL4-人PPAR-α-LBD)的PPAR-α报道细胞系通过zeocin(0.5mg/ml)和G418(0.5mg/ml)的选择而分离。

分析程序：

PPAR-α激动剂的活性通过下面所述的三天分析来测定：

第1天

PPAR-α报道细胞系在与以下添加物混合后的DMEM(#41965-039，Invitrogen)培养液中培养到80％汇合：10％cs-FCS(胎牛血清；#SH-30068.03，Hyclone)、0.5mg/ml zeocin(#R250-01，Invitrogen)、0.5mg/mlG418(#10131-027，Invitrogen)、1％青霉素-链霉素溶液(#15140-122，Invitrogen)以及2mM L-谷氨酰胺(#25030-024，Invitrogen)。标准细胞培养瓶(#353112，Becton Dickinson)置于一台37℃细胞培养箱中，在5％CO₂存在的情况下进行培养。用15ml PBS(#14190-094，Invitrogen)洗涤80％-汇合的细胞，并用3ml胰蛋白酶溶液(#25300-054，Invitrogen)在37℃下处理2分钟，收集在5ml所述DMEM中，并在细胞计数器上计数。稀释到500,000细胞/ml后，在一个带有透明塑料底的96孔微量滴定板(#3610，Corning Costar)的每孔中接种35,000个细胞。微量滴定板在5％CO₂气氛中于37℃下在细胞培养箱中培养24小时。

第2天

待测试的PPAR-α激动剂溶解于DMSO，浓度为10mM。该贮存液用混合有5％cs-FCS(#SH-30068.03，Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(#25030-024，Invitrogen)及前述抗生素(zeocin、G418、青霉素和链霉素)的DMEM(#41965-039，Invitrogen)中稀释。

第一天接种的PPAR-α报道细胞系的培养液用抽吸法去除，在培养中稀释的测试物质立即加到细胞中。稀释和加入物质是利用机器人(BeckmanFX)进行的。培养液稀释的测试物质的最终体积为96孔微量滴定板的每孔100μl。本分析中的DMSO浓度低于0.1％v/v以避免溶剂的细胞毒性效应。

每个板加入了以11种不同浓度同样稀释的标准PPAR-α激动剂，以阐明每个板中分析的功能。分析板在5％CO₂气氛中于37℃温度下在培养箱中培养24小时。

第3天

从培养箱中取出用测试物质处理过的PPAR-α报道细胞，并用抽吸法除去培养基。向96孔微量滴定板的每孔中移入50μl的Bright Glo试剂(购自Promega)，使细胞裂解。在室温黑暗条件下培养10分钟后，在Wallac公司的Trilux发光计中对微量滴定板进行测量。微量滴定板每孔测量时间为1秒。

评估：

细胞PPAR-γ分析中PPAR激动剂的EC50值的测定

基于细胞的PPAR-γ分析方案

为了进行基于细胞的分析，在96孔培养板上按如下方式进行了萤光素酶分析：

第1天：细胞涂布：

·用PBS洗涤培养到80-90％汇合的细胞一次

·胰蛋白酶消化2分钟

·加入15ml分析培养基(DMEM，Invitrogen，目录号41965-039；5％木炭/葡聚糖处理的FBS，Hyclone，目录号SH30068；0.5mg/mlZeocin，Invitrogen，目录号46-0072；0.5mg/ml遗传霉素，Invitrogen，目录号10131-027；1％青霉素/链霉素，Invitrogen，目录号15140-122；2mM L-谷氨酰胺，Invitrogen，目录号25030-024；7.5μg/ml杀稻瘟菌素S盐酸盐，Invitrogen，目录号R210-01；1μg/ml盐酸多西环素，Clontech，目录号8634-1)。

·计数细胞

·用分析培养基将细胞稀释到500,000细胞/ml。

·在透明底Corning培养板的每孔中加入100μl细胞悬浮液(得到50,000细胞/孔)

·在37℃和5％CO₂气氛中培养24小时

第2天：用测试化合物给药：

·将测试化合物溶于DMSO中以制备10mM贮存液

·用分析培养基(DMEM，Invitrogen，目录号41965-039；5％木炭/葡聚糖处理的FBS，Hyclone，目录号SH30068；0.5mg/ml Zeocin，Invitrogen，目录号46-0072；0.5mg/ml遗传霉素，Invitrogen，目录号10131-027；1％青霉素/链霉素，Invitrogen，目录号15140-122；2mM L-谷氨酰胺，Invitrogen，目录号25030-024；7.5μg/ml杀稻瘟菌素S盐酸盐，Invitrogen，目录号R210-01；1μg/ml盐酸多西环素，Clontech，目录号8634-1)将化合物稀释到适当的浓度(常规FCS含有干扰PPAR-配体结合结构域的游离脂肪酸)。

·抽吸除去培养基(细胞在这一步很敏感，确保细胞没有培养基覆盖的时间不超过1分钟)

·将稀释的化合物转移到96孔中(100μl包括化合物的培养基)

·用标准化合物(如罗格列酮)制备对照样品，以及DMSO对照(0.1％DMSO)

·在37℃和5％CO₂气氛中培养细胞24小时

稀释步骤和稀释化合物的添加是用Beckman Biomek 2000或Beckman FX机器人完成的。

第3天：细胞溶解和萤光素酶活性的测定：

·抽吸除去细胞中的培养基

·将培养板冷冻于-20℃(可选项)

·培养板解冻30分钟(如必要)

·加入50μl Bright-Glo-萤光素酶分析试剂(Promega目录号E2650)

·在黑暗中培养10分钟

·每孔测量发光2秒(Wallac Microbeta)

数据分析：

EC50数值是用Microsoft Excel与XLFit(IDBS开发)结合，用拟合算法#205确定的。

细胞人RXR受体分析中EC50值的测定

基于细胞的RXR分析方案

第1天：细胞的铺板

·用PBS洗涤培养到80-90％汇合的细胞一次

·胰蛋白酶消化2分钟

·加入15ml培养基(DMEM，Invitrogen，目录号41965-039；10％木炭/葡聚糖处理的FBS，Hyclone，目录号SH30068；0.5mg/ml Zeocin，Invitrogen，目录号46-0072；0.5mg/ml遗传霉素，Invitrogen，目录号10131-027；1％青霉素/链霉素，Invitrogen，目录号15140-122；2mM L-谷氨酰胺，Invitrogen，目录号25030-024)

·计数细胞

·用培养基将细胞稀释到175,000细胞/ml。

·在透明底Corning培养板的每孔中加入200μl细胞悬浮液(得到35,000细胞/孔)

·在37℃和5％CO₂气氛中培养24小时

第2天：用测试化合物给药：

·将测试化合物溶于DMSO中以制备10mM贮存液

·用分析培养基(DMEM w/o酚红，Invitrogen，目录号21063-029；5％木炭/葡聚糖处理的FBS，Hyclone，目录号SH30068；0.5mg/mlZeocin，Invitrogen，目录号46-0072；0.5mg/ml遗传霉素，Invitrogen，目录号10131-027；1％青霉素/链霉素，Invitrogen，目录号15140-122；2mM L-谷氨酰胺，Invitrogen，目录号25030-024)将化合物稀释到适当的浓度(常规FCS含有干扰PPAR配体结合结构域的游离脂肪酸)。

·将稀释的化合物转移到96孔中(100μl包括化合物的培养基)

·用标准化合物(如RPR258134)制备对照，以及DMSO对照(0.1％DMSO)

·在37℃和5％CO₂气氛中培养细胞24小时

第3天：细胞溶解和萤光素酶活性的测定

·抽吸除去细胞中的培养基

·将培养板冷冻于-20℃(可选项)

·培养板解冻30分钟(如必要)

·加入50μl Bright-Glo-萤光素酶分析试剂(Promega目录号E2650)

·在黑暗中培养10分钟

·每孔测量发光2秒(Wallac Microbeta)

数据分析

表1显示了报道基因分析的结果。结果表明，化合物1和2为选择性PPAR-δ激活剂，PPAR-α、γ和RXR活性很低。

表1 报道基因分析

化合物	人PPAR-δEC₅₀(μM)	小鼠PPAR-δEC₅₀(μM)	人PPAR-αEC₅₀(μM)	人PPAR-γEC₅₀(μM)	人PPAR RXR¹EC₅₀(μM)
化合物	人PPAR-δEC₅₀(μM)	小鼠PPAR-δEC₅₀(μM)	人PPAR-αEC₅₀(μM)	人PPAR-γEC₅₀(μM)	人PPAR RXR¹EC₅₀(μM)	1	＜0.00457(29x)^*	7.84x)^，6(2x)^，4(2x)^*	1.3	3.97(3.1x)^*	无增加
2	0.039(27x)^*	1(2x)^*	1.1	1.1(4.3x)^*	无增加	1	＜0.00457(29x)^*	7.84x)^，6(2x)^，4(2x)^*	1.3	3.97(3.1x)^*	无增加

^*数值代表相对于基线萤光素酶活性增加的倍数。¹类视黄醇X受体

大鼠/小鼠少突胶质细胞培养物

细胞的制备：

1.从新生(出生后2-3天)大鼠或小鼠的新皮层获取原代大鼠少突胶质细胞祖细胞，除去小胶质后，利用McCarthy和de Vellis(1980)所描述的方法加以改变后，从星形细胞单层机械分离后，加以富集。

2.从新生大鼠大脑中除去脑膜，并以机械方式使组织分离开来。将细胞涂布于T75瓶上，并用DMEM/F12+10％FBS喂饲细胞。

3.在原来制备日期14天后，利用抖落法收集在星形细胞底层上生长的少突胶质细胞。离心悬浮液，并将细胞离心饼重新悬浮在无血清的培养基(SFM；组合25μg/ml转铁蛋白(transferring)、30nM三碘甲状腺氨酸、20nM氢化可的松、20nM黄体酮、10nM生物素、1x痕量元素、30nM硒、1μg/ml腐胺、0.1％BSA，5U/ml PenStrep，10μg/ml胰岛素的DMEM)中，并补充以下生长因子：血小板衍生生长因子-AA(PDGF)和成纤维细胞生长因子-2(FGF)。

4.将细胞接种在涂有PDL的培养皿上，并在37℃、6-7％CO₂气氛中培养。

5.每48个小时更换培养基组分，以便使细胞保持在祖细胞状态。

祖细胞传代以增加供筛选分析的细胞数：

1.培养物汇合后，用PBS淋洗培养物，加入胰蛋白酶并在37℃培养～2-3分钟。

2.中和并在900g离心细胞悬浮液5分钟。

3.将细胞离心饼重新悬浮在SFM+PDGF/FGF中。

4.每48个小时对细胞喂饲新鲜生长因子，以保持富集快速分裂的祖细胞。

5.在实验分析之前，细胞传代不超过4-5次。

6.所有涉及少突胶质细胞祖细胞的实验都是用持续维持在这些条件下的细胞进行的。95％以上的细胞为A2B5免疫阳性并表达2′3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶II mRNA。

7.为了产生成熟的少突胶质细胞，接种后24小时，祖细胞被转移到补充或不补充IGF-I的SFM，并在实验分析之前7天在这些条件下生长。

8.另外，可使用富集的大鼠中枢神经胶质-4(CG4)祖细胞系，该祖细胞系保持在基础培养基(DMEM，含有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、生物素(40nM)、胰岛素(1μM)以及N1)中，并补充得自B-104成神经细胞瘤细胞系的30％条件培养基。为了诱导细胞分化，将CG4细胞转移到含有1％胎牛血清(两天后除去)和胰岛素(500nM)的基础培养基。A2B5和MBP免疫反应性分别用来确认未成熟和成熟培养物的富集＞95％。

大鼠/小鼠培养物化合物处理：

1.在PDL包被的24孔板中加入10,000-15,000细胞/孔，在促分裂原(10ng/ml)存在下培养过夜。

2.在促分裂原存在的情况下：

a.第二天，除去原来的培养基，并将化合物加到新鲜的(带有促分裂原)培养基中。

b.在6种不同浓度(10μM、1μM、100nM、10nM、1nM以及0.1nM)下进行化合物剂量反应评价；

c.对每种化合物浓度进行一式三份的孔。

3.在促分裂原不存在的情况下：

a.第二天，除去旧的培养基，并将化合物加到新鲜的(不带有促分裂原)培养基中。

b.在6种浓度(10μM、1μM、100nM、10nM、1nM以及0.1nM)下进行化合物剂量反应评价；

c.对每种化合物浓度进行一式三份的孔。

4.在用于实验分析之前，将处理过的细胞培养7天。

人少突胶质细胞培养物

细胞的制备：

1.从E19.5-E22人胚胎皮质收集的人神经球在祖细胞培养基中培养2个星期，所述培养基含有100μg/ml转铁蛋白(transferring)、30nM三碘甲状腺氨酸、20nM氢化可的松、20nM黄体酮、10nM生物素、1x痕量元素、30nM硒、60uM腐胺、0.1％BSA，5U/ml PenStrep、25μg/ml胰岛素)并补充有PDGF和FGF。

2.神经球用20U/ml木瓜蛋白酶在37℃下分解30-50分钟。

3.细胞接种到包被PDL的培养皿上，在含有PDGF/FGF的祖细胞培养基中的密度为50,000-100,000细胞/孔，在37℃下和5-6％CO₂气氛中培养。

4.每48个小时补充培养基和生长因子。

人培养物化合物处理：

1.涂布后24到48小时，除去原来的培养基，并将化合物加到新鲜的(带有促分裂原)培养基中。

2.在3-6种不同浓度(10μM、1μM、100nM、10nM、1nM以及0.1nM)下进行化合物剂量反应评价

3.对每种化合物浓度进行一式三份的孔。

4.在用于实验分析之前，将处理过的细胞培养7天。

大鼠/小鼠/人少突胶质细胞特异免疫染色：

在接触化合物后，少突胶质细胞特异的抗体用来评估化合物加速/促进少突胶质细胞分化的能力(例如，化合物处理过的和未处理的培养物之间O4、O1或髓鞘碱性蛋白随时间的免疫反应性)。

1.细胞以5×10³到20×10³个细胞/孔接种到用聚-D-赖氨酸处理过的4孔腔式载玻片上，并按上面介绍的方法生长。根据在体外没有PDGF和FGF的天数，对少突胶质细胞群按逐渐增加的细胞分化程度进行顺序染色。

2.利用在37℃下对活细胞染色30分钟来检测少突胶质细胞期特异的细胞表面标记物的表达(包括A2B5、O4和O1)。

3.其后，在室温下用4％多聚甲醛固定细胞10分钟。

4.固定染色程序用来检测少突胶质细胞期特异的标记物的表达(包括髓鞘碱性蛋白MBP)。

5.用PBS淋洗。

6.在室温下，用1XPBS稀释的0.1％Triton/0.01％NaAz透化10分钟。

7.在室温下，用溶于抗体稀释缓冲液(0.1％Triton-X 100和1％无IgG的牛血清白蛋白；也用来稀释抗体)的5-10％山羊血清封闭15分钟。

8.加入用抗体稀释缓冲液稀释的一级抗体。

9.在4℃下轻微摇动温育过夜。

10.第二天，在室温下用PBS 1X淋洗5分钟，接着用3X PBS淋洗，每次15分钟。

11.在室温下用适当的二级抗体温育45分钟。

12.在室温下，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核染色15分钟。

13.用PBS淋洗几次，并用荧光显微镜进行评估。

14.对以下条件按时间变化以及不同的化合物剂量进行了比较：仅PDGF/FGF、仅SFM、仅SFM-IGF1、PDGF/FGF和化合物、SFM和化合物。

大鼠/小鼠/人溴脱氧尿苷(BrdU)免疫染色：

以确认化合物不会促进细胞增殖。

1.用10μM BrdU对少突胶质细胞祖细胞标记20小时，然后用70％乙醇或4％多聚甲醛固定。

2.细胞用生物素化的小鼠抗-BrdU和链霉抗生物素蛋白-过氧化酶连续温育，中间用PBS洗涤三次。

3.用DAB对BrdU免疫反应性进行比色显色，并用计数器-染色苏木精进行评估。

4.BrdU免疫阳性细胞由两个独立的观察者进行计数。

大鼠/小鼠/人培养物图像分析：用荧光显微镜对接触化合物后的少突胶质细胞分化程度进行定量。这一分析表明选择性激动剂加速/促进少突胶质细胞的分化。

1.人工细胞计数：对每个实验条件随机选择四个视野，每个视野的细胞计数为500-600个细胞。针对对照组和药物处理组，比较了MBP(或O4)免疫阳性细胞(带有或不带有髓鞘片、具有成熟过程的细胞)相对于DAPI阳性细胞(总细胞数)的百分比。

2.自动细胞计数：用荧光显微镜对接触化合物后的少突胶质细胞分化程度进行定量。随机选择六个视野/孔来评估总群体中正分化的少突胶质细胞数目(每孔细胞计数为～8到15×10³个细胞)。利用一台装有ZeissAxioCam HRc冷却的CCD照相机的Zeiss AxioVision数字成像系统获得了免疫荧光图像，所述照相机连接同一显微镜。设定了所有显微成像参数以获得图像来进行细胞免疫荧光强度分析。比较了对照组和药物处理组中MBP阳性(分化的)细胞相对于总细胞(DAPI核染色)的百分比。在该成像参数下，未能检测到细胞自发荧光。

a)3.人少突胶质细胞分化分析：人工计数每孔O4免疫阳性细胞总数(双极和多极)。

使用大鼠少突胶质细胞培养物的结果示于图1，使用人少突胶质细胞混合培养物的结果示于图5和图6。结果中，化合物处理组的髓鞘碱性蛋白表达高于未处理的对照组，表明PPAR-δ激动剂增强或加速了大鼠和人少突胶质细胞的分化。这一新的发现表明，化合物1和化合物2以及一般的选择性PPAR-δ激动剂将会增强、加速或刺激患病的或受损的中枢神经系统(包括多发性硬化和其他脱髓鞘病)中少突胶质细胞的分化以及体内髓鞘的生成。

大鼠/小鼠/人定量聚合酶链式反应(PCR)：评估化合物诱导的PPAR-δ途径激活以及少突胶质细胞成熟的程度(mRNA水平的变化)

1.利用TriZol试剂从培养的少突胶质细胞中提取了总RNA。

2.接着，用不含RNase的DNase处理mRNA并重新纯化，然后用RT反应(Clontech Advantage RT for PCR Kit)转化成cDNA模板。

3.利用Sybr Green PCR Master Mix对PPAR-δ途径成员的转录表达进行定量。

4.利用悬浮在Taqman 2X PCR Master Mix的18S核醣体RNA引物/探针混合物(186bp产品)作为内部对照。

5.利用实时Taqman^TM技术(Gibson，et al.，1996)进行定量PCR，所用仪器为7700型序列检测系统(Sequence Detector System)(AppliedBiosystems，Foster City，CA)。

6.结果用序列检测系统(Sequence Detector System)软件1.91版进行分析。

这些分析的结果示于图2、3、4A和4B。结果表明，PPAR-δ选择性激动剂结合PPAR-δ受体并直接激活少突胶质细胞中的PPAR-δ途径，这在体内应该类似地作用。

大鼠酶联免疫吸附测定(ELISA)分析：评估化合物诱导的PPAR-δ途径激活以及少突胶质细胞成熟的程度(蛋白质水平的变化)

1.分析板用PBS清洗，并保持在冰上。加入200μl冰预冷的的老的裂解缓冲液(Tris 50mM，pH7.4，MgCl₂ 2mM，EDTA 1mM，β-巯基乙醇5mM，Nonidet P-401％，蛋白酶抑制剂混合液(Roche)：1片/50ml)到每孔中。

2.利用移液管上下吹打溶解细胞，在4℃和2000转/分钟(rpm)条件下将板离心5分钟。上清液已经可以使用。

3.移取50μl标准品、对照和样品到孔中。

4.向每个孔中加入50μl MBP分析缓冲液。

5.室温下温育孔，在轨道微平板振动器上以500-700rpm摇动2小时。

6.向每个孔中加入100ul MBP抗体-生物素缀合物。

7.室温下温育孔，在轨道微平板振动器上以500-700rpm摇动1小时。

8.用清洗液洗涤5次。将培养板翻转放在吸水材料上印迹干燥。

9.用MBP Elisa测定缓冲液将链霉抗生物素蛋白-酶缀合物浓度按1∶50稀释。(必须在分析中现稀释现用)。

10.向每孔中加入100μl链霉抗生物素蛋白-酶缀合物溶液。

11.室温下温育孔，在轨道微平板振动器上以500-700rpm摇动30分钟。

12.用清洗液洗涤5次。将培养板翻转放在吸水材料上印迹干燥。

13.向每个孔中加入100μl TMB色原液(TMB ChromogenSolution)。

14.室温下温育孔，在轨道微平板振动器上以500-700rpm摇动10-20分钟。避免直接暴露在阳光下。

15.向每个孔中加入100μl反应终止液。

16.用设定在450nM的微孔板读数器在30分钟内读出孔中溶液的吸光度。

上面的一般结果以及图1-6中所示的结果表明，PPAR-δ激动剂甚至在促分裂原存在的情况下也能促进少突胶质细胞的分化，促分裂原通常使细胞保持有丝分裂活性并抑制细胞分化。因此，可以预期，在受伤或患病的中枢神经系统中，选择性PPAR-δ激动剂将引起正分裂的少突胶质细胞祖细胞表达髓鞘蛋白，并给脱髓鞘或髓鞘不健全(hypomyelinated)的轴突覆以髓鞘。

概念模型的体内证据

局灶性损伤：(用来评估化合物是否保护髓鞘的完整性或加速/促进再髓鞘化的速度)

1.在用于实验之前，让7周龄的大鼠随意摄取食物和水，并最少适应4天。

2.手术前，每只动物称重。然后用1.8∶1的氯胺酮(100mg/ml)：甲苯噻嗪(20mg/ml)溶液麻醉大鼠。1.手术程序前，用上述麻醉液按0.15ml/180g体重腹膜内注射大鼠。按照IACUC指南，使用无菌条件对大鼠进行手术准备。所有手术器具均用高压灭菌。剪去两耳之间的毛，完后用聚维酮碘擦洗这一部位，并用无菌盐水冲洗，最后用预包装的无菌酒精棉签擦拭。

3.手术程序中，大鼠的腹部表面放置在一个小的动物立体定位仪器上，以便保持头部固定不动。门齿杆始终设置在-3.9mm，因为这一设定已证明能够使SD大鼠的脑壳处于扁平位置。

4.在预先剃去毛的脑壳上两耳之间的皮肤上切一切口。

5.在AP-1.8，ML-3.1(从λ)坐标处的骨头上钻一小孔(直径0.75mm)。

6.除去骨头，然后在2分钟内用哈密顿(Hamilton)微升针筒和针头在大鼠的右小脑下脚处DV-7.1mm注入2μl溴化乙锭、溶血卵磷脂或SIN-1。另外，也可注射到脊髓、胼胝体或皮质中。

7.其后2分钟，针头保留在原位。

8.取出针头后，将切口缝合。

9.在每只大鼠的一只后腿上肌内注射0.003mg丁丙诺啡。

10.将大鼠放在温暖的硬纸箱中，直到苏醒过来。这时候，则将大鼠放回其原来的笼子里。每个笼子里放不超过两只大鼠，因它们会把彼此的缝合线拉出来。

11.对小鼠也进行了类似的程序。

大鼠实验性变应性脑脊髓炎(Rat EAE)疾病模型：

实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是一种T-细胞介导的神经系统自体免疫疾病，在容易发生此种疾病的动物中，经过全脊髓匀浆或一种组分(髓鞘碱性蛋白)的致敏，可形成此种疾病。EAE啮齿类模型对于在MS患者中观察到的大脑和脊髓炎症的研究是合适的工具。在啮齿动物中，注射全脊髓或脊髓组分，如髓鞘碱性蛋白可引起基于T-淋巴细胞活化的自身免疫反应。在接种后8-10天，临床疾病变得通常明显，观察到的广泛行为异常，从轻微步态异常、尾巴弛缓到完全瘫痪和死亡。典型情况下，也会出现体重减轻。在活下来的动物中，出现自发恢复，并伴有多数运动功能不同程度的恢复。取决于物种、变应原以及所用的方法，EAE模型测试的动物可以经历一次(急性EAE)或几次(慢性复发性EAE)发作。有几种治疗方法可采用：选择的药物或治疗可在免疫前、无症状期期间或临床疾病期间施用。

动物：

雌性Lewis大鼠，160-220g(Charles River)

抗原：

豚鼠全脊髓(Harlan Biosciences)。

弗氏完全佐剂H37Ra[1mg/ml结核分支杆菌(MycobacteriumTuberculosis)H37Ra](Difco)。

其他抗原：

结核分支杆菌(Difco)。

百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)[加热杀灭](Difco)。

抗原制备：(供约720只动物用)：

1.称取5克冷冻豚鼠脊髓。

2.加入5克脊髓到圆底离心管中的5ml 0.9％盐水(1g/ml)中。

3.在冰上用Tissue-tech匀浆，直到组织完全破坏(约5分钟)。

4.加入10ml补充有200mg结核分支杆菌的弗氏完全佐剂H37 Ra(20mg/ml弗氏完全佐剂H37 Ra)。

5.用装有18号乳化针头的10ml针筒将匀浆/佐剂从离心管中吸出。

6.在两个30ml玻璃针筒之间进行乳化，直到材料难以继续通过针头穿过材料为止。(约5分钟{不得出现油相和水相分离})。

7.立即使用或保持在冰上待用(不超过30分钟)(不要冷冻)。

方案

1.让雌性Lewis大鼠(Charles River)自由摄取食物和水，在用于实验之前，至少要适应3天。

2.体重为160和220克的大鼠最初用5％异氟烷(Aerrane，FortDodge)、30％O₂、70％N₂O诱导2-5分钟。

3.大鼠然后被放到一个循环水加热毯(Gaymar)上(脊背朝上)，并放到鼻锥体(nose cone)中自发呼吸麻醉气体。异氟烷降到2％。

4.在后爪的腹侧表面两次皮下注射(每次0.1ml)抗原或生理盐水。

5.从鼻锥体中取出大鼠，称重并编号。

6.让大鼠从麻醉中醒来并放到单独的笼子里。

7.每天观察大鼠，看有无EAE诱导的迹象(见下面的标准)

0期正常

1期异常步态和尾巴弛缓

2期后腿有一条或两条轻微但确定的软弱

3期后腿有一条或两条严重软弱或轻度共济失调

4期严重轻截瘫，后退很少活动

5期后腿不动及下身麻痹

6期无自发活动的濒死状态，呼吸受阻。

可能有更大程度累及前腿，可能会出现大小便失禁

7期死亡

免疫后第10天开始治疗。由于这一模型的疾病症状通常是在接种后10-11出现，这一时间点可被认为是代表MS急性发作的初始阶段。我们的判断是，这种治疗开始的延迟比常规方案更接近地模拟了临床情况，其中在常规方案中，在接种时、甚至接种前施用药物(Teitelbaum D.et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1999；96：3842-3847 and Brod S.A.，et al.，Ann Neurol2000；47：127-131)。

Claims

1.治疗患者脱髓鞘病的方法，该方法包括施用治疗有效量的hPPAR-δ激动剂。

2.权利要求1所述的方法，其中hPPAR-δ激动剂为选择性激动剂。

3.权利要求1所述的方法，其中所述脱髓鞘病选自：多发性硬化、沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、吉-巴综合征以及其中形成髓鞘的胶质细胞受到损害的病症，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤。

4.权利要求3所述的方法，其中所述脱髓鞘病为多发性硬化。

5.权利要求1所述的方法，其中所述激动剂选自式(1)和式(2)的化合物

6.药物组合物，其包含选自式(1)和式(2)的化合物的化合物与至少一种药学上可接受的载体的组合，所述化合物的量可有效治疗多发性硬化、沙-马-图病、佩-梅病、脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、吉-巴综合征以及其中形成髓鞘的胶质细胞受到损害的病症，包括脊髓损伤、神经病和神经损伤

7.权利要求6所述的药物组合物，其包含有效治疗多发性硬化的量。