KR20060134191A - 미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ｐｐｒ 델타 효능제의용도 - Google Patents

미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ｐｐｒ 델타 효능제의용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20060134191A
KR20060134191A KR1020067022955A KR20067022955A KR20060134191A KR 20060134191 A KR20060134191 A KR 20060134191A KR 1020067022955 A KR1020067022955 A KR 1020067022955A KR 20067022955 A KR20067022955 A KR 20067022955A KR 20060134191 A KR20060134191 A KR 20060134191A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
disease
myelin
cells
compound
formula
Prior art date
Application number
KR1020067022955A
Other languages
English (en)
Inventor
카렌 챈드로스
진 메릴
앤 미니치
란 리
올가 크호르코바
윈 류
Original Assignee
아벤티스 파마슈티칼스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아벤티스 파마슈티칼스 인크. filed Critical 아벤티스 파마슈티칼스 인크.
Publication of KR20060134191A publication Critical patent/KR20060134191A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/426—1,3-Thiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

PPAR 델타 효능제의 유효량으로 치료를 요하는 환자에서 미엘린 탈락 질환을 치료하는 방법을 설명한다. 이와 같은 방법에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 미엘린 탈락 질환은 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 펠리체우스-메르츠바하병, 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증, 길리안-바레 증후군 및 미엘린 형성 교세포가 손상되는 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 질환을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
미엘린 탈락 질환, ＰＰＲ 델타 효능제, 다발성 경화증, 길리안-바레 증후군

Description

미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ＰＰＲ 델타 효능제의 용도{Use of PPR delta agonists for treating demyelinating diseases}
본 발명은 다발성 경화증(MS) 및 다른 미엘린 탈락 질환(demyelinating disease)을 치료하기 위한 PPAR 델타 효능제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 MS 및 다른 미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 선택성 PPAR 델타 효능제인 특정 화합물의 용도에 관한 것이다.
퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체 (PPARs)는 핵 수용체 슈퍼패밀리의 서브패밀리로 구성된다. 상당히 밀접하게 연관된 세 가지 이소폼(isoforms)을 확인하였고, 클론하였으며, 통상적으로 PPAR알파, PPAR감마 및 PPAR델타로 공지되어 있다. 각 수용체 서브타입은 신호DNA 결합 도메인(DBD) 및 리간드-결합 도메인(LBD)을 가지며, 이들 두 도메인은 리간드 활성화된 유전자 발현에 필수적이다. PPAR은 레티노이드 X 수용체와 함께 이형이량체로서 결합한다. J. Berger 및 D. E. Miller, Ann. Rev. Med., 2002, 53, 409-435 참고.
PPAR델타(PPAR베타로도 알려짐)는 광범위한 포유류 조직에서 발현되나 이의 생물학적 기능 또는 수용체에 의해 조절되는 유전자의 전장 배열에 대한 정보는 거의 없다. 그러나, 최근에 이의 효능제들이 이상지혈증(dyslipidemia) 및 특정 피부 질환 치료에 유용할 수 있으며, 이의 길항제는 또한 골다공증 또는 직장암 치료에 유용할 수 있다는 것이 밝혀졌다(D. Sternbach, Annual Reports in Medicinal Chemistry에서, Volume 38, A. M. Doherty, 편집자, Elsevier Academic Press, 2003, 페이지 71-80).
PPAR델타는 CNS에서 상당한 정도로 발현되는 것으로 보이지만; 그러나, 이들 기능 대부분이 아직 밝혀지지 않고 있다. 그러나, 흥미로운 것은 PPAR델타가 설치류 희돌기교 세포(CNS의 주요 지질 생산 세포)에서 발현된다는 것이 밝혀졌다(J. Granneman, 등 J. Neurosci . Res ., 1998, 51, 563-573). 또한, PPAR델타 선택성 효능제가 희돌기교 세포 미엘린 유전자 발현을 상당히 증가시키며, 마우스 배양물에서 미엘린 수초(sheath) 직경을 상당히 증가시킨다는 것이 밝혀졌다 (I. Saluja 등 Glia, 2001, 33, 194-204).
미엘린 탈락 상태는 많은 신경 섬유를 덮고 있는 지질과 단백질의 다중 조밀한 층인 미엘린 손상으로 나타난다. 이들 층은 중추신경계(CNS)의 희돌기아교 세포(희돌기교세포) 와 말초 신경계(PNS)의 Schwann 세포가 제공한다. 다발성 경화증(MS)의 경우, CNS에서 미엘린 형성 세포인 희돌기교세포가 파괴되고, 축삭이 손상되어, 신경 활성이 심각하게 손상되고, 마비를 포함한 기능적 결손이 나타난다. 미엘린 탈락 질환을 가지는 환자에서, 미엘린 탈락은 비가역적인 것이 될 수 있으며, 이는 통상 축삭 변상(axonal degeneration)과 함께 나타나거나, 축삭변상 이후 에 나타날 수 있으며, 종종 세포 분해가 있다. 미엘린 탈락은 신경 손상 또는 미엘린 자체의 손상으로 인하여 발생되는데, 이는 비정상적인 면역 반응, 국소 손상, 허혈, 대사성 질환, 독성 물질, 또는 바이러스 감염으로 인한 것이 될 수 있다. (Prineas and McDonald, Demyelinating Diseases. In Greenfield's Neuropathology, 6. sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-811, Beers and Berkow, 편집자, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17. sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). 그러나, 새로 형성된 희돌기교세포 조상 세포는 미엘린 탈락 부위에도 존재하는 것으로 보아, 이들 조상세포들이 유도되어 분화를 하면서 희돌기교세포를 성숙하게 한다면 자체-복구 가능성도 있다고 볼 수 있다.
중추 미엘린 탈락(CNS 미엘린 탈락)는 몇 가지 상태에서 발생되는데, 그중 일부는 병인을 알수 없으며, 1차 미엘린 탈락 질환으로 알려지게 되었다. 이들중, 다발성 경화증(MS)이 가장 흔한 것이다. 다른 1차 미엘린 탈락 질환에는 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy) (ALD), 척추신경병증(adrenomyeloneuropathy), AIDS-공포성 척수병증(vacuolar myelopathy), HTLV-관련 척수병증(myelopathy), Leber의 유전 각막이양증(hereditary optic atrophy), 진행성 다소성 백질뇌병증(progressive multifocal leukoencephalopathy (PML)), 아급성 경화성 전뇌염(subacute sclerosing panencephalitis), 그리고 열대성 경직 하반신마비(tropical spastic paraparesis) 등이 포함된다. 또한, 급성 질환으로, 미엘린 탈락이 CNS에서 발생할 수 있는데, 예를 들면, 급성파종성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis (ADEM)) 및 급성 바이러스성 뇌염(acute viral encephalitis)이 포함된다. 더욱이, 원인 미상의 급성 척수 트랜젝션이 1개 이상의 인접한 흉곽 단편들에서 회백질 모두에 영향을 미치는 증상인 급성 횡단성 척수염이 또한 미엘린 탈락을 초래한다.
MS는 만성적, 파괴적, 신경 질환으로 대부분 젊은 층에 영향을 준다 MS 발병은 복잡한 과정으로 미엘린 및 희돌기교세포 뿐만 아니라 뇌 및 척수에서 축삭 손상을 야기시킨다(Prineas and McDonald, 미엘린 탈락 질환. In Greenfield's Neuropathology, 6.sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-811, Trapp 등, N. Engl. J. Med., 338:278-85, 1998). 조직병리학적으로, MS는 염증, CNS 조직에서 미엘린 탈락 침윤세포 플라크, 희돌기교세포 손실 및 병소 축삭 손상(Prineas and McDonald, Demyelinating diseases. In Greenfield's Neuropathology, 6.sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-811)을 특징으로 한다. 이 질환은 미엘린, 그리고 미엘린이 아닌 자체 항원에 대한 비정상적인 면역 반응에서 초래되는 것으로 간주하고 있다(Bar-Or 등, J. Neuroimmunol. 100:252-59, 1999, Hartung, H.-P., Current Opinion in Neurology, 8:191-99, 1995). 임상적으로, MS는 재발-이장성(relapsing-remitting)후에 나타나거나 또는 신체적 마비가 증가되면서 만성적으로 진행될 수 있다(Gold 등, Mol. Med. Today, 6:88-91, 2000). 일반적으로, MS 증상에는 둔각증, 언어 및 시각 교란 및 허약 등이 복합되어 결핍되는 것들이 포함된다.
다양한 미엘린 탈락 상태 치료를 위한 현재 치료법은 비용이 많이 들고, 전 조가 있으며, 부분적으로만 효과가 있고, 종종 원치 않은 부차적인 효과를 초래할 수도 있다. 코르티코스테로이드(매일 60-100 mg 경구 프레디니손, 2-3주간 점점 작게 또는 정맥으로 매일 500-1000 mg, 3-5일간 메틸프레디니솔론)이 MS의 주요 치료약형이다. 이들은 질병 공격동안에 전조 기간을 짧게 하기는 하지만, 장기간의 무능력에 대해서는 효과가 없다. 장기간 코르티코스테로이드 치료는 바람직하기 않으며, 골다공증, 궤양 및 당뇨병을 포함하는 여러 의학적 합병증을 일으킬 수 있다(Beers and Berkow, 편집자, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483).
재조합 사람 인터페론 베타(Betaseron and Avonex) 그리고, 공-중합체(Copaxon)를 이용한 면역 조절요법으로 MS의 재발 빈도를 약간 줄이거나 발생되는 장애를 지연시키는 것을 도울 수 있다(Beers and Berkow, 편집자, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). 인터페론-베타 및 공-중합체 두 가지 형태를 현재 MS의 치료 양식으로 이용하고 있지만, 이들 모두가 상당히 비싸다. 면역억제 약물(아자티오프린, 클라드리빈, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트)은 좀더 심각한 진행성에 유용하다. 그러나, 이들 약물들이 한결같이 유용한 것은 아니고, 심각한 독성 부작용이 있다. 몇 가지 약물들(예를 들면, 분량으로 매일 바클로펜 30-60 mg)은 척수 반사를 저해하여 경련을 감소시킬 수 있다. MS 환자에서 약물에 의해 유도되는 경련 감소는 환자를 심하게 약화시 켜, 환자가 결국 일을 할 수 없게 될 수 있기 때문에 주의 및 현명하게 이용해야 할 필요가 있다.
유사하게, 또 다른 심각한 미엘린 탈락 질환인 ALD의 현재 치료법은 상대적으로 비효과적이다. ALD의 증상에는 피질맹(cortical blindness), 피질척수관 기능이상(corticospinal tract dysfunction), 정신 황폐(mental deterioration) 그리고 마비가 포함된다. ALD 과정을 제어하는 치료법에는 골수 이식 및 식이요법 치료가 포함될 수 있지만(DiBiase 등, Ann . Ist . Super Sanita, 35:185-92, 1999), 냉혹한 신경 황폐가 반드시 발생되어 결국 사망에 이른다[Krivit 등, Curr . Opin . Hematol., 6:377-82, 1999, (Beers and Berkow, 편집자, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). EAE 및 EAN를 가진 동물을 교세포 이식 및 생장 인자를 이용하거나, 흡착 분자, 자가항체 및 사이토킨 저해를 통하여 일부 과정이 실현되어 왔다(Njenga and Rodriguez, Current Opinion in Neurology, 9:159-64, 1996). 그러나, 이들 치료법들 중 어느 것도 인체에 유익한 것은 없었으며, 일부 치료법은 상당한 신경외과적 중재를 요구하였다. 따라서, 다양한 미엘린 탈락 상태를 치료하는데, 원치않는 이차 효과 없이 좀더 효과적이며, 비용이 적게 들고, 비공격적인 방법이 필요하다.
본 발명은 미엘린 탈락 질환 치료를 위해 현재 면역 조절 요법을 상당히 증대시킨 소분자-활성화된 재생 방법을 이용한다.
선택적 PPAR 델타로 공지된 화합물은 당분야에 공지되어 있으며, 특히, WO 01/00603에서 설명하는 것과 같이 화학식 1의 화합물은 일반적으로 GW 501516로 공지되어 있다.
Figure 112006080147639-PCT00001
화학식 2의 화합물은 L165,041로도 공지되어 있는데, 유럽 특허 출원28063 및 W0 97/28149에서도 설명하고 있으며, 선택적 PPAR 델타 효능제로 확인되었다.
Figure 112006080147639-PCT00002
퍼옥시좀 증식체 활성화된 수용체 델타 (PPAR 델타) 효능제가 설치류 뇌로부터 예리하게 분리한 희돌기교세포 조상세포의 분화를 가속시키고, 미엘린 수초 직경 및 미엘린 유전자 발현을 모두 상당히 증가시키는 잠재능력으로 인하여, 희돌기교 조상세포에서 PPAR델타 경로를 활성화시키고, 미엘린 탈락 질환, 특히 MS에서 미엘린 수초를 미엘린 탈락된 축삭으로 복구시켜 신경 복구를 강화시키는 잠재능을 PPAR 델타 효능제가 가진다.
발명의 요약
따라서, 본 발명에 따르면, 다양한 미엘린 탈락 질환 예를 들면 다발성 경화증을 PPAR 델타 효능제로 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 따라 치료할 수 있는 질병에는 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 펠리체우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증, 길리안-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 및 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 미엘린 형성 교세포가 손상되는 질환을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 여기에서 설명하는 질환은 PPAR 델타 효능제의 치료학적 유효량을 이와 같은 치료를 요하는 환자에 투여함으로써 치료될 수 있다.
본 발명은 미엘린 탈락 질환 특히, 다발성 경화증 치료를 위한 화학식 1 및 2의 화합물의 용도에 관계한다.
화학식 1
Figure 112006080147639-PCT00003
화학식 2
Figure 112006080147639-PCT00004
본 발명은 다발성 경화증 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 화합물의 치료학적 유효량과, 화학식 1 및 2의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 복합하여 투여함으로써, 다발성 경화증을 치료하는 방법을 포함한다. 이들 질환을 치료하기 위해 현재 이용되는 화합물로는 인터페론(인터페론 베타 1-a, 베타 1-b, 알파2), 글래티라머 아세테이트 또는 코르티코스테로이드 예를 들면, 메틸프레디니솔론 및 프레디니손과 같은 경과조절약제(disease-modifying agent)다. 또한, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클라드리빈, 사이클로포스파미드 및 사이클로스포린과 같은 화학요법제도 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 비-독성 용매, 분산제, 부형제, 어쥬번트 또는 본 발명의 화합물과 혼합되어 약학 조성물 가령, 환자에 투여할 수 있는 제형 형성을 허용하는 다른 물질들을 의미한다. 이와 같은 담체의 예를 들면, 비경구 투여에 일반적으로 이용되는 약학적으로 허용되는 오일이 된다.
여기에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 염"은 의학용 제제를 만드는데 이용되는 본 발명 화합물의 염을 의미한다. 그러나, 본 발명 화합물의 제형 또는 약학 조성물을 만드는데 다른 염들도 이용할 수 있다. 본 발명 화합물의 적절한 약학적으로 허용되는 염에는 산 첨가염이 포함되는데, 예를 들면, 본 발명 화합물 용액을 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 메탄설폰산, 2-하이드록시 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 퓨마르산, 말레산, 하이드록시말레산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 글루타르산, 아세트산, 살리실산, 시나민산, 2-페녹시벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 벤조산, 옥살산, 구연산, 타르타르산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 탄산 또는 인산과 같은 약학적으로 허용되는 산 용액과 혼합하여 형성된다. 일수소 오르소포스페이트 나트륨, 황화수소칼륨과 같은 산 금속 염이 형성될 수도 있다. 또한 형성된 염은 모노 또는 디(di) 산 염이 되며, 수화된 형태로 존재하거나 또는 실질적으로 무수물로 존재할 수도 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 산 잔기를 가지고 있는 경우, 이의 적절한 약학적으로 허용되는 염에는 알칼리 금속 염 예를 들면, 나트륨염 또는 칼륨염, 알칼리 토금속 염 예를 들면, 칼슘 또는 마그네슘염, 그리고 적절한 유기 리간드와 함께 형성된 염 가령, 4가 암모늄염 등이 포함된다
여기에서 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"이란 나열된 질환 또는 상태 치료에 효과적인 화합물의 양을 말한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 비-독성 용매, 분산제, 부형제, 어쥬번트 또는 본 발명의 화합물과 혼합되어 약학 조성물 가령, 환자에 투여할 수 있는 제형 형성을 허용하는 다른 물질들을 의미한다. 이와 같은 담체의 예를 들면, 비경구 투여에 일반적으로 이용되는 약학적으로 허용되는 오일이 된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물 한 가지 또는 그 이상과 약학적으로 허용되는 담체로 구성된 약학 조성물을 제공한다. 적절하게는 이와 같은 조성물은 경구, 비-경구, 비강, 설하 또는 직장 투여 또는 흡입 또는 취입으로 투여하기에 적합한 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 또는 예정된 양의 에어로졸 또는 액체 스프레이, 드롭, 앰플, 자동 분사 장치 또는 좌약과 같은 단위 약형이 될 수 있다. 대안으로, 조성물은 1주일에 또는 한달에 한번씩 투여하기에 적합한 형태로 제공될 수 있는데, 예를 들면, 디카노에이트(decanoate) 염과 같은 활성 화합물의 불용성 염을 이용하여 근육 주사용 데포우(depot) 제제를 만들 수 있다. 활성 성분을 포함하는 부식성 폴리머를 이용할 수도 있다. 정제와 같은 고형 조성물을 만들기 위해서는 주요 활성 성분을 약학적 담체와 혼합하는데, 통상의 정제용 성분은 옥수수 전분, 락토즈, 자당, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아레이트 마그네슘, 인산이칼슘염 또는 검 및 다른 약학 희석제(가령 물)로 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염의 균질한 혼합물로 구성된 고형 예비 제형 조성물을 만든다. 예비 제형 조성물이 균질성을 가진다고 말할때, 활성 성분이 조성물에 골고루 분산되어 있기 때문에 조성물이 정제, 알약, 캡슐과 같은 단위 약형에 고르게 분배될 수 있다는 것을 말한다. 이와 같은 예비 고체 제형 조성물은 본 발명의 활성 성분을 약 0.1 내지 약 500 mg 포함하는 상기에서 언급된 유형의 약형으로 분배된다. 향이 가미된 단위 약형은 활성 성분을 1 내지 100 mg, 예를 들면 1, 2, 5, 10, 25, 50 또는 100 mg 함유한다. 신규한 조성물의 정제 또는 알약은 피복되거나 또는 장기간 작용을 할 수 있게 하는 약형으로 제공될 수 있도록 컴파운딩된다. 예를 들면, 정제 또는 알약은 내부 약형 및 외부 약형 성분으로 구성되는데, 외부 약형 성분은 내부 약형 위에 외피를 형성하게 된다. 두 성분이 장용층(enteric layer)에 의해 분리될 수 있고, 이와 같은 장용층은 위장에서 분해되는 것으로부터 보호하는 기능을 하여, 내부 성분이 십이지장으로 갈 수 있도록 도와주거나 방출을 지연시키는 역할을 한다. 다양한 물질이 이와 같은 장용층 또는 장용피에 사용되는데, 여러 가지 폴리머산 및 폴리머 산과 셀락, 세틸 알코올 및 셀룰로오즈 아세테이트와의 혼합물 등이 포함된다.
경구 또는 주사로 투여하기 위해 본 발명의 신규한 조성물이 결합될 수 있는 액체형에는 수용성 용액, 적절한 향이 가미된 시럽 또는 수용성 또는 오일 현탁액을 포함하고, 향이 가미된 에멸젼은 식용 오일 예를 들면, 목화씨 오일, 참깨 오일, 코코넛 오일 또는 땅콩 오일이 사용되며, 뿐만 아니라 엘릭시르(elixirs) 및 유사 약학 비이클이 사용될 수도 있다. 수용성 현탁액으로 사용될 수 있는 적절한 분산 또는 현탁제에는 합성 또는 천연 검 예를 들면, 트라가칸트, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로오즈 나트륨, 메틸셀룰로오즈, 폴리비닐-피롤리돈 또는 젤라틴이 포함된다.
여기에서 설명된 바와 같은 다양한 질병 상태 치료에서, 적절한 약량 수준은 하루에 약 0.01 내지 250 mg/kg, 적절하게는 약 0.05 내지 100 mg/kg, 그리고 특히 적절하게는 약 0.05 내지 20 mg/kg가 된다. 화합물은 하루에 1 내지 4회 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, hPPAR 델타 효능제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 환자의 미엘린 탈락 질환을 치료하는 방법을 설명한다.
이 구체예의 또 다른 한 측면에서, hPPAR 델타 효능제는 선택적 효능제다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 미엘린 탈락 질환은 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 펠리체우스-메르츠바하병, 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증, 길리안-바레 증후군 및 미엘린 형성 교세포가 손상되는 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 질환에서 선택된 방법을 설명한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 미엘린 탈락 질환이 다발성 경화증인 방법을 설명한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 효능제는 화학식 1과 화학식 2의 화합물에서 선택되는 것인 방법을 설명한다.
화학식 1
Figure 112006080147639-PCT00005
화학식 2
Figure 112006080147639-PCT00006
본 발명에서 설명하는 또 다른 구체예에서, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 펠리체우스-메르츠바하병, 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증 , 길리안-바레 증후군 및 미엘린 형성 교세포가 손상되는 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 질환을 치료하는 데 유효한 양의 화학식 1과 화학식 2의 화합물과 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 설명한다.
화학식 1
Figure 112006080147639-PCT00007
화학식 2
Figure 112006080147639-PCT00008
이 구체예의 추가 측면에서 다발성 경화증 치료에 유효한 양을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
도 1. 배양된 래트 희돌기교세포에서 PPAR 델타 효능제에 의한 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 면역반응성 강화를 설명한다.
도 2. 이 그래프에서는 화합물 1에 의한 배양된 래트 희돌기교세포에서 MBP mRNA의 강화를 설명한다.
도 3. 이 그래프에서는 화합물 2에 의한 배양된 래트 희돌기교세포에서 MBP mRNA의 강화를 설명한다.
도 4A. 전사 표식(transcriptional marker)에 대한 화합물 1의 효과를 설명 하는 것으로 배양된 래트 희돌기교세포에서 PPAR 델타 효능제 경로 활성화를 확인하는 것을 설명한다.
도 4B. 배양된 래트 희돌기교세포에서 PPAR 델타 효능제 경로 활성화를 확인하는 전사 표식에 대한 화합물 1의 효과를 설명하는 것으로, ADRP mRNA는 배양된 래트 희돌기교세포에서 상향 조절되었다.
도 5. 화합물 1에 의해 영향을 받은 사람의 희돌기교세포의 혼합 배양물에서 O4 면역 양성 세포 수가 증가되었다는 것을 보여준다.
도 6. 화합물 2에 의해 영향을 받은 사람의 희돌기교세포의 혼합 배양물에서 O4 면역 양성 세포 수가 증가되었다는 것을 보여준다
화합물 실시예:
화학식 1 (GW501516)의 화합물은 WO 01/00603에 공개된 방법으로 준비할 수 있다. 화학식 2 (L165,041)의 화합물은 W0 97/28149에 공개된 방법으로 준비할 수 있다.
생물학적 실시예 :
다음의 테스트 프로토콜을 이용하면 본 발명 화합물의 생물학적 성질들을 확인할 수 있다. 다음의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이다. 그러나, 이들은 임의 방법으로 본 발명을 제한시키고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 PPAR 델타 효능제가 미엘린 발현을 촉진시키고, 재생 공정을 강화 시키는 능력이 있는지에 대해 시험관 내(in vitro ) 및 생체 내(in vivo ) 방법으로 평가되었다.
최적의 핵 수용체 선택성 프로파일은 GAL4/루시퍼라제 리포터 검사를 이용하여 결정한다. 설치류 세포 검사에서는 화합물이 배양된 희돌기교세포 조상 세포의 분화를 지시, 가속화시켜 성숙한 희돌기교세포로 만드는 능력이 있는 지를 보여준다.
MS 치료에 효과를 제시하는 특정 생물학적 검사는 리소레시틴 유도된 미엘린 탈락 및 설치류에서 수행된 실험적 알레르기성 뇌척수염이다.
세포 PPAR 델타 검사에서 PPAR 효능제의 EC 50 값 측정:
원리
사람의 PPAR 델타에 결합하여 항진적인 방식으로 이를 활성화 시키는 물질의 능력은 안정적으로 형질감염된 HEK 세포주 (HEK= human embryo kidney)(여기에서는 PPAR 델타 리포터 세포주라고 함)를 이용하여 분석하였다. PPAR 델타 리포터 세포주 는 두 가지 유전 요소, 루시페라제 리포터 요소 (pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo) 및 PPAR 델타 융합 단백질(GR-GAL4-사람PPAR 델타-LBD)을 포함하는데, 이 융합 단백질은 PPAR 델타 리간드에 따라 루시페라제 리포터 요소의 발현을 중개한다. 안정적으로 그리고 구성적으로 발현된 융합 단백질 GR-GAL4-사람PPAR델타-LBD는 GAL4 단백질 부분을 경유하여, PPAR 델타 리포터 세포주의 세포핵에서 세포주 게놈에 안정적으로 결합된 루시페라제 리포터 요소의 5'-상류 GAL4 DNA 결합 모티프에 결합한다. 검사에 지방산-고갈된 태아 송아지 혈청(cs-FCS) 이 이용된 경우라면, PPAR 델타 리간드 없이 루시페라제 리포터 유전자는 거의 발현되지 않는다. PPAR 델타 리간드는 PPAR 델타 융합 단백질에 결합하여 이를 활성화시키고, 따라서 루시페라제 리포터 유전자 발현을 자극한다. 형성된 루시페라제는 적절한 기질을 통하여 화학적발광으로 감지할 수 있다.
PPAR 델타 리포터 세포주의 작제 :
안정적인 PPAR 델타 리포터 세포주 생산은 루시페라제 리포터 요소로 안정적으로 형질감염된 안정한 HEK-세포 클론에 근거한다. 이 단계는 "PPAR 알파 리포터 세포주의 작제" 단락에서 이미 설명한 바 있다. 두 번째 단계에서, PPAR 델타 융합 단백질(GR-GAL4-사람PPAR 델타-LBD)을 세포 클론에 안정적으로 도입시킨다. 이 목적을 위해서, 글루코코르티코이드 수용체의 N-말단 76아미노산을 코딩하는 cDNA (수탁 # P04150)를 이스트 전사 인자 GAL4(수탁 # P04386)의 아미노산 1-147을 인코드하는 cDNA 부분에 연결한다. 사람 PPAR 델타수용체 (아미노 acids S139-Y441; 수탁 # L07592)의 리간드-결합 도메인의cDNA를 GR-GAL4 구조체의 3'단부에 클론시킨다. 이와 같은 방식으로 작제된 융합 구조 (GR-GAL4-사람PPAR 델타-LBD)를 플라스미드 pcDNA3 (Invitrogen)에 다시 클론시켜, 사이토메갈로바이러스 프로모터를 이용하여 구성적으로 발현시킨다. 이 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 선형화시키고, 루시페라제 리포터 요소를 포함하는 상기 설명한 세포 클론에 안정적으로 형질감염시켰다. 루시페라제 리포터 요소를 포함하고, PPAR 델타 융합 단 백질(GR-GAL4-사람 PPAR 델타-LBD)를 구성적으로 발현시키는 결과의 PPAR 델타 리포터 세포주는 제오신(0.5mg/ml) 및 G418 (0.5mg/ml)를 이용한 선별을 통하여 분리하였다.
검사 과정 및 평가:
PPAR 델타 효능제의 활성은 하기에서 설명하는 3-일 검사를 통하여 결정된다:
첫째날
PPAR 델타 리포터 세포주를 DMEM (#41965-039, Invitrogen)에서 80% 합류되도록 배양한다, DMEM에는 다음의 추가물질이 혼합되어 있다: 10% cs-FCS (태아 송아지 혈청 #SH-30068.03, Hyclone), 0.5 mg/ml 제오신 (#R250-01, Invitrogen), 0.5 mg/ml G418 (#10131-027, Invitrogen), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (#15140-122, Invitrogen) 그리고 2 mM L-글루타민 (#25030-024, Invitrogen). 5% CO2 존재하에 37℃ 세포 배양기에서 표준 세포 배양 용기(# 353112, Becton Dickinson)에서 배양시킨다. 80%-합류된 세포를 15 ml PBS (#14190-094, Invitrogen)로 1회 세척하고, 37℃ 2분간 3 ml 트립신 용액 (#25300-054, Invitrogen)으로 처리하고, 상기 설명한 5 ml DMEM 를 취하여, 세포 계수기에서 계수한다. 500,000 cells/ml으로 희석한 후에, 35,000개 세포를 투명한 플라스틱으로 된 96웰 미량적정 플레이트 (#3610, Corning Costar)의 각 웰에 접종시킨다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 의 세포 배양기에서 24시간동안 배양시킨다.
둘째날
테스트하는 PPAR 델타 효능제를 DMSO에 10mM 농도로 용해시킨다. 이 원액을 DMEM (#41965-039, Invitrogen)으로 희석시키는데, DMEM은 5% cs-FCS (#SH-30068.03, Hyclone), 2 mM L-글루타민(#25030-024, Invitrogen) 및 전술한 항생제(제오신, G418, 페니실린 및 스트렙토마이신)이 혼합되어 있었다. 테스트 물질을 10 μM 내지 100 pM 범위의 11개 상이한 농도에서 테스트하였다. 좀더 강력한 화합물은 1 μM 내지 10pM 범위의 농도 또는 100 nM 내지 1 pM의 농도 범위에서 테스트한다.
첫째날 접종된 PPAR 델타 리포터 세포주의 배지를 흡출에 의해 완전하게 제거하고, 배지 중의 희석된 테스트 물질을 바로 세포에 첨가한다. 물질의 희석 및 첨가는 로봇(Beckman FX)를 이용한다. 배지로 희석시킨 테스트 물질의 최종 부피는 96웰 미량적정 플레이트 웰당 100 μl이다. 용매의 세포 독성 영향을 피하기 위해 검사에서 DMSO 농도는 0.1 % v/v 미만으로 한다.
각 플레이트에는 표준 PPAR 델타 효능제를 충전하는데, 이 효능제 역시 유사하게 11가지 상이한 농도로 희석시키고, 이는 각 개별 플레이트에서 검사의 능력을 설명하기 위함니다. 검사 플레이트는 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양시킨다.
셋째날
테스트 물질로 처리된 PPAR 델타 리포터 세포를 배양기로부터 제거하고, 배지를 흡출한다. 96웰 미량적정 플레이트의 각 웰로 50 μl Bright Glo 시약(Promega사)을 피펫팅하여, 세포를 용해시켰다. 10분간 실온 암실에서 배양후에, 미량적정 플레이트의 조도를 조도계(Trilux ,Wallac사)에서 측정하였다. 미량적정 플레이트의 각 웰 측정 시간은 1초이다.
평가:
조도계에서 얻은 원시 데이터를 μ소프트 엑셀 파일로 옮긴다. PPAR 효능제의 약량-효과 플롯 및 EC50 값은 XL을 이용하여 계산한다. 제조업자가 명시한 프로그램으로 피팅한다(IDBS).
세포계 PPAR알파 검사에서 PPAR 효능제 EC 50 값 측정:
원리
사람의 PPAR 알파에 결합하여 항진적인 방식으로 이를 활성화 시키는 물질의 능력은 안정적으로 형질감염된 HEK 세포주 (HEK= human embryo kidney)(여기에서는 PPAR 알파 리포터 세포주라고 함)를 이용하여 분석하였다. 이는 두 가지 유전 요소, 루시페라제 리포터 요소 (pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo) 및 PPAR 알파 융합 단백 질(GR-GAL4-사람PPAR 델타-LBD)을 포함하는데, 이 융합 단백질은 PPAR 알파 리간드에 따라 루시페라제 리포터 요소의 발현을 중개한다. 안정적으로 그리고 구성적으로 발현된 융합 단백질 GR-GAL4-사람PPAR 알파-LBD는 GAL4 단백질 부분을 경유하여, PPAR 알파 리포터 세포주의 세포핵에서 세포주 게놈에 안정적으로 결합된 루시페라제 리포터 요소의 5'-상류 GAL4 DNA 결합 모티프에 결합한다. 검사에 지방산-고갈된 태아 송아지 혈청(cs-FCS) 이 이용된 경우라면, PPAR 알파 리간드없이 루시페라제 리포터 유전자의 발현은 매우 약하다. PPAR 알파 리간드는 PPAR 알파 융합 단백질에 결합하여 이를 활성화시키고, 따라서 루시페라제 리포터 유전자 발현을 자극한다. 형성된 루시페라제는 적절한 기질을 통하여 화학적 발광으로 감지할 수 있다.
PPAR 알파 리포터 세포주 작제:
PPAR 알파 리포터 세포주는 두 단계로 준비하였다. 첫째로, 루시퍼라제 리포터 요소를 작제하고, 안정적으로 HEK 세포로 형질감염시켰다. 이를 위해, 이스트 전사 인자 GAL4 (수탁 # AF264724)의 5개 결합 부위를 68 bp-길이의 최소 MMTV 프로모터 (수탁 # V01175)의 5'상류에 클론시켰다. 최소 MMTV 프로모터 부분에는 CCAAT 박스 및 TATA 요소가 포함되어, RNA 폴리메라제II에 의한 효과적인 전사가 가능하다. GAL4-MMTV 구조의 클로닝 및 서열화는 Sambrook J. 등. (Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 설명을 유추하여 실시하였다. 그 다음, 완전한 포티누스 피라리스(photinus pyralis) 유전자(수탁 # M15077)를 GAL4-MMTV의 3'하류에 클론시켰다. 서열화후에, 5개 GAL4 결합 부위로 구성된 루시퍼라제 리포터 요소, MMTV 프로모터 및 루시퍼라제 유전자를 제오신 저항성을 부여하는 플라스미드로 다시 클론시키면, 플라스미드pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo을 얻는다 Ausubel, F.M. 등, (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-3, John Wiley & Sons, Inc., 1995)의 설명에 준하여, 이 벡터를 HEK 세포로 형질감염시킨다. 제오신 함유 배지(0.5 mg/ml)를 이용하여, 루시퍼라제 유전자의 발현이 매우 낮은 적절한 안정적인 세포 클론을 선별하였다.
두 번째 단계에서, PPAR 알파 융합 단백질(GR-GAL4-사람PPAR 알파-LBD)을 세포 클론에 안정적으로 도입시킨다. 이 목적을 위해서, 글루코코르티코이드 수용체의 N-말단 76아미노산을 코딩하는 cDNA (수탁 # P04150)를 이스트 전사 인자 GAL4(수탁 # P04386)의 아미노산 1-147을 코딩하는 cDNA 부분에 연결한다. 사람 PPAR 알파 수용체 (아미노산 S167-Y468; 수탁 # S74349)의 리간드-결합 도메인의cDNA를 GR-GAL4 구조체의 3'단부에 클론시킨다. 이와 같은 방식으로 작제된 융합 구조 (GR-GAL4-사람PPAR 알파-LBD)를 플라스미드 pcDNA3 (Invitrogen)에 다시 클론시켜, 사이토메갈로바이러스 프로모터를 이용하여 구성적으로 발현시킨다. 이 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 선형화시키고, 루시페라제 리포터 요소를 포함하는 상기 설명한 세포 클론에 안정적으로 형질감염시켰다. 루시페라제 리포터 요소를 포함하고, PPAR 알파 융합 단백질(GR-GAL4-사람 PPAR 알파-LBD)를 구성적으로 발현시키는 최종 완성된 PPAR 알파 리포터 세포주는 제오신(0.5mg/ml) 및 G418 (0.5mg/ml)를 이용한 선별을 통하여 분리하였다.
검사 과정:
PPAR 알파 효능제의 활성은 하기에서 설명하는 3-일 검사를 통하여 결정된다:
첫째날
PPAR 알파 리포터 세포주를 DMEM (#41965-039, Invitrogen)에서 80% 합류되도록 배양하고, DMEM에는 다음의 추가물질이 혼합되어 있다: 10% cs-FCS (태아 송아지 혈청 #SH-30068.03, Hyclone), 0.5 mg/ml 제오신 (#R250-01, Invitrogen), 0.5 mg/ml G418 (#10131-027, Invitrogen), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (#15140-122, Invitrogen) 그리고 2 mM L-글루타민 (#25030-024, Invitrogen). 배양물을 5% CO2 존재하에 37℃ 세포 배양기에서 표준 세포 배양 용기(# 353112, Becton Dickinson)에서 배양시킨다. 80%-합류된 세포를 15 ml PBS (#14190-094, Invitrogen)로 1회 세척하고, 37℃ 2분간 3 ml 트립신 용액 (#25300-054, Invitrogen)으로 처리하고, 상기 설명한 5 ml의 DMEM 를 취하여, 세포 계수기에서 계수한다. 500,000 cells/ml으로 희석한 후에, 35,000개 세포를 투명한 플라스틱으로 된 96웰 미량 적정 플레이트 (#3610, Corning Costar)의 각 웰에 접종시킨다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 의 세포 배양기에서 24시간동안 배양시킨다.
둘째날
테스트 해야 하는 PPAR 알파효능제를 DMSO에 10mM 농도로 용해시킨다. 이 원액을 DMEM (#41965-039, Invitrogen)으로 희석시키는데, DMEM은 5% cs-FCS (#SH-30068.03, Hyclone), 2 mM L-글루타민(#25030-024, Invitrogen) 및 전술한 항생제(제오신, G418, 페니실린 및 스트렙토마이신)이 혼합되어 있었다. 테스트 물질을 10 μM 내지 100 pM 범위의 11개 상이한 농도에서 테스트하였다. 좀더 강력한 화합물은 1 μM 내지 10pM 범위의 농도 또는 100 nM 내지 1 pM의 농도 범위에서 테스트한다.
첫째날 접종된 PPAR 알파 리포터 세포주의 배지를 흡출에 의해 완전하게 제거하고, 배지로 희석된 테스트 물질을 바로 세포에 첨가한다. 물질의 희석 및 첨가는 로봇(Beckman FX)를 이용한다. 배지로 희석시킨 테스트 물질의 최종 부피는 96웰 미량 적정 플레이트 웰당 100 μl이다. 용매의 세포 독성 영향을 피하기 위해 검사에서 DMSO 농도는 0.1 % v/v 미만으로 한다.
각 플레이트에는 표준 PPAR 알파 효능제를 충전하는데, 이 효능제 역시 유사하게 11가지 상이한 농도로 희석시키고, 이는 각 개별 플레이트에서 검사의 능력을 설명하기 위함이다. 검사 플레이트는 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 배양기에서 배양시킨다.
셋째날
테스트 물질로 처리된 PPAR 알파 리포터 세포를 배양기로부터 제거하고, 배지를 흡출한다. 96웰 미량적정 플레이트의 각 웰로 50 μl Bright Glo 시약(Promega사)을 피펫팅하여, 세포를 용해시켰다. 10분간 실온 암실에서 배양후에, 미량적정 플레이트의 조도를 조도계(Trilux, Wallac사)에서 측정하였다. 미량적정 플레이트의 각 웰 측정 시간은 1초이다.
평가:
조도계에서 얻은 데이터를 μ소프트 엑셀 파일로 옮긴다. PPAR 효능제의 약량-효과 플롯 및 EC50 값은 XL을 이용하여 계산한다. 제조업자가 명시한 프로그램으로 피팅한다(IDBS).
세포 PPAR 감마 검사에서 PPAR 효능제의 EC 50 값 결정
세포계 PPAR 감마 검사 프로토콜
세포계 검사를 실시하기 위해, 루시퍼라제 검사를 다음과 같이 96웰 플레이트에서 실시하였다:
첫째날: 세포의 플레이팅:
ㆍPBS에서 80-90% 합류로 생장한 세포를 세척한다.
ㆍ2분간 트립신으로 처리한다.
ㆍ15ml 검사 배지 (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 5% 목탄/덱스트란 처리된 FBS, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0.5 mg/ml 제오신, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0.5mg/ml 제네티신, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% 페니실린/스트렙토마이신, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; 2 mM L-글루타민, Invitrogen, Cat.No. 25030-024; 7.5 μg/ml 블라티시딘 S HCl, Invitrogen, Cat.No. R210-01; 1 μg/ml 데옥시사이클린, Clontech, Cat.No. 8634-1) 를 첨가한다
ㆍ세포를 헤아린다
ㆍ검사 배지내 세포를 500,000 cells/ml로 희석시킨다
ㆍ웰당 세포 현탁액 100 μl 씩을 Corning plates의 깨끗한 바닥(웰당 50,000개 세포가 되도록)에 첨가한다
ㆍ37℃, 5% CO2에서 24시간 배양시킨다
둘째 날: 테스트 화합물 투약:
ㆍ테스트 화합물을 DMSO에 용해시켜, 10 mM 원액용액을 만든다.
ㆍ화합물을 검사 배지 (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 5% 목탄/덱스트란 처리된 FBS, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0.5 mg/ml 제오신, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0.5mg/ml 제네티신, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% 페니실린/스트렙토마이신, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; 2 mM L-글루타민, Invitrogen, Cat.No. 25030-024; 7.5 μg/ml 블라티시딘 S HCl, Invitrogen, Cat.No. R210-01; 1 μg/ml 데옥시사이클린, Clontech, Cat.No. 8634-1) 로 적절한 농도로 희석시킨다 (정규 FCS는 살고/자유 지방산은 PPAR 리간드 결합 도메인을 간섭한다).
ㆍ배지를 흡출시킨다(세포들은 이 단계에서 매우 민감하여, 세포가 배지에 의해 1분 이상 덮히지 않도록 주의한다)
ㆍ희석된 화합물을 96웰로 옮긴다(화합물을 포함하는 100 μl 배지)
ㆍ표준 화합물(가령, 로지글리타존) 및 DMSO 대조군(0,1 % DMSO)으로 대조군을 만든다
ㆍ37℃, 5% CO2에서 세포를 24시간 배양한다.
희석 단계 및 희석된 화합물의 첨가는 Beckman Biomek 2000 또는 Beckman FX 로봇을 이용한다.
셋째날: 세포 용해 및 루시퍼라제 활성 측정:
ㆍ세포로부터 배지를 흡출시킨다
ㆍ플레이트를 -20℃에서 얼린다(선택사항)
ㆍ플레이트를 30분간 녹인다(필요할 경우)
ㆍ50 μl Bright-Glo-루시퍼라제 검사 시약(Promega, Cat.No. E2650)을 첨가한다
ㆍ암실에서 10분간 배양한다
ㆍ웰당 2초간 발광을 측정한다 (Wallac Microbeta)
데이터 분석:
EC50 값 측정은 Microsoft Excel과 XLFit (IDBS에서 개발)로 피팅 알고리즘 #205을 이용하여 실시한다.
세포 사람 RXR 수용체 검사에서 EC 50 값 결정
세포계 RXR 검사 프로토콜
세포계 검사를 실시하기 위해, 루시퍼라제 검사를 다음과 같이 96웰 플레이트에서 실시하였다:
첫째날: 세포의 플레이팅:
ㆍPBS에서 80-90% 합류로 생장한 세포를 세척한다.
ㆍ2분간 트립신으로 처리한다.
ㆍ15ml 검사 배지 (DMEM w/o 페놀-레드, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 10% 목탄/덱스트란 처리된 FBS, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0.5 mg/ml 제오신, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0.5mg/ml 제네티신, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% 페니실린/스트렙토마이신, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; 2 mM L-글루타민, Invitrogen, Cat.No. 25030-024) 를 첨가한다
ㆍ세포를 헤아린다
ㆍ검사 배지내 세포를 175,000 cells/ml로 희석시킨다
ㆍ웰당 세포 현탁액 200 μl 씩을 Corning plates 의 깨끗한 바닥(웰당 35,000개 세포가 되도록)에 첨가한다
ㆍ37℃, 5% CO2에서 24시간 배양시킨다
둘째 날: 테스트 화합물 투약:
ㆍ테스트 화합물을 DMSO에 용해시켜, 10 mM 원액 용액을 만든다.
ㆍ화합물을 검사 배지 (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 21063-029; 5% 목탄/덱스트란 처리된 FBS, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0.5 mg/ml 제오신, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0.5mg/ml 제네티신, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% 페니실린/스트렙토마이신, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; 2 mM L-글루타민, Invitrogen, Cat.No. 25030-024) 로 적절한 농도로 희석시킨다 (정규 FCS는 살고 자유 지방산은 PPAR 리간드 결합 도메인을 간섭한다).
ㆍ배지를 흡출시킨다(세포들은 이 단계에서 매우 민감하여, 세포가 배지에 의해 1분 이상 덮히지 않도록 주의한다)
ㆍ희석된 화합물을 96웰로 옮긴다(화합물을 포함하는 100 μl 배지)
ㆍ표준 화합물(가령, RPR258134) 및 DMSO 대조군(0,1 % DMSO)으로 대조군을 만든다
ㆍ37℃, 5% CO2에서 세포를 24시간 배양한다.
희석 단계 및 희석된 화합물의 첨가는 Beckman Biomek 2000 또는 Beckman FX 로봇을 이용한다.
셋째날: 세포 용해 및 루시퍼라제 활성 측정:
ㆍ세포로부터 배지를 흡출시킨다
ㆍ플레이트를 -20℃에서 얼린다(선택사항)
ㆍ플레이트를 30분간 녹인다(필요할 경우)
ㆍ50 μl Bright-Glo-루시퍼라제 검사 시약(Promega, Cat.No. E2650)을 첨가한다
ㆍ암실에서 10분간 둔다
ㆍ웰당 2초간 발광을 측정한다 (Wallac Microbeta)
데이터 분석:
EC50 값 측정은 Microsoft 엑셀(Exel)과 XLFit (IDBS에서 개발)로 피팅 알고리즘 #205을 이용하여 실시한다.
표 1에서는 리포터 검사 결과를 보여준다. 이 결과에서, 화합물 1과 2는 PPAR 알파, 감마 및 RXR 활성이 낮은 선택적 PPAR 델타 활성 물질이라는 것을 보여준다.
Figure 112006080147639-PCT00009
래트 /마우스 희돌기교세포 배양
세포 준비:
1. 새로 태어난(2-3일) 마우스 또는 래트의 신피질로부터 1차 래트 희돌기교세포 선조세포(progenitor)를 얻어서, McCarthy 및 de Vellis (1980)에서 설명하는 원래 기술을 변형시켜, 성상 세포단층(astrocytic monolayer)으로부터 기계적 분리에 의해 미세아교세포를 제거하여, 농축시킨다.
2. 신생 래트 뇌로부터 뇌막을 제거하고, 조직을 기계적으로 해리시킨다. T75 플라스크상에 세포를 플레이트하고, 세포에 DMEM/F12 + 10% FBS를 공급한다.
3. 성상 세포 베드 층상에서 성장한 희돌기교세포를 원료 준비한 날로부터 14일간 쉐이킹 오프(shaking off) 방법을 이용하여 수득한다. 현탁액을 원심분리시키고, 생장인자(혈소판 유도된 생장인자-AA(PDGF), 섬유아세포 생장 인자-2(FGF)보충된 혈청이 없는 배지(SFM; DMEM 와 25 μg/ml 트랜스퍼링, 30 nM 트리요오도티로닌, 20 nM 하이드로코르티손, 20 nM 프로게스테론, 10 nM 바이오틴, 1x 미량원소, 30 nM 셀레니움, 1 μg/ml 푸트레신, 0.1% BSA, 5 U/ml PenStrep, 10 μg/ml 인슐린과 복합)에 세포 펠렛을 재현탁시킨다.
4. PDL-피복된 배양접시에 세포를 플레이트시키고, 37℃, 6-7% CO2에서 배양하였다.
5. 배지 성분은 매 48시간 마다 교체하여 원조 세포 상태로 세포를 유지시킨다.
스크리닝 검사를 위해 조상세포를 계대하여 세포 수를 증가시킴:
1. 배양물이 합류되면, 배양물을 PBS로 세척하고, 트립신을 첨가하고, 약 2-3분간 37℃에서 배양시킨다.
2. 세포 현탁액을 중화시키고, 900g에서 5분간 원심분리시킨다.
3. 세포 펠렛을 SFM + PDGF/FGF에 재현탁시킨다.
4. 세포에 매 48시간 마다 신선한 생장 인자를 공급하여 신속하게 조상 세포를 분화되도록 한다.
5. 세포는 실험 검사 전에 4-5회 계대한다.
6. 희돌기교세포 조상 세포가 연관된 모든 실험은 이와 같은 조건하에 지속적으로 유지되어 온 세포를 이용하여 실시하였다. 모든 세포의 95% 이상이 A2B5 면역양성이고, 2' 3'-고리 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제 II mRNA를 발현하였다.
7. 성숙한 희돌기교세포를 만들기 위해, 조상세포를 플레이트한 24 시간 IGF-I 보충된 또는 보충되지 않은 SFM로 전환시키고, 실험 검사전 7일간 이 상태에서 생장시켰다.
8. 대안으로, 농축된 래트 Central Glia-4 (CG4) 조상 세포주를 이용할 수 있는데, 이들 세포주는 기본 배지(DMEM, 2 mM 글루타민, 1mM 피루베이트 나트륨, 바이오틴 (40 nM), 인슐린(1 μM) 및 N1)에 30% 조건화 배지(B-104 신경아세포종 세포주가 보충된 것에서 유지된다. 분화를 유도하기 위해, CG4 세포를 기본배지에1% 태아 송아지 혈청(2일 후에 제거함) 및 인슐린(500 nM)이 보충된 것으로 옮긴다. A2B5 및 MBP 면역반응성을 이용하여, 각각 미완 배양물 및 성숙 배양물에서 >95% 농축(enrichment)을 확인하였다.
래트 /마우스 배양 화합물 처리:
1. PDL 피복된 24-웰 플레이트에 웰당 10,000 내지 15,000 세포를 넣고, 미토겐 (10 ng/ml) 존재하에 세포를 하룻밤 동안 배양시킨다.
2. 미토겐 존재하에:
a. 다음날, 오래된 배지를 제거하고, 새로운 배지(미토겐 포함)에 화합물을 첨가한다
b. 화합물 약량 반응 평가는 6개 상이한 농도(10μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM)에서 실시한다;
c. 각 화합물 농도를 삼중 웰로 반복한다.
3. 미토겐 없이:
a. 다음 날, 오래된 배지를 제거하고, 새로운 배지(미토겐 없음)에 화합물을 첨가한다.
b. 화합물 약량 반응 평가는 6개 농도(10μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM)에서 실시한다;
c. 각 화합물 농도를 삼중 웰로 반복한다.
4. 실험 검사에 이용하기 전에 7일간 처리된 세포를 배양한다.
사람 희돌기교세포 배양물
세포 준비:
1. E19.5-E22 사람 배아 피질에서 수득한 사람 신경구(neurospheres)를 조상세포 배지[(DMEM/F12+100 μg/ml 트랜스퍼링, 30 nM 트리요오드티로닌, 20 nM 하이드로코르티손, 20 nM 프로게스테론, 10 nM 바이오틴, 1x 미량원소, 30 nM 셀레니움, 60 μM 푸트레신, 0.1% BSA, 5 U/ml PenStrep, 25 μg/ml 인슐린과 복합)에 PDGF 및 FGF가 보충된 것]에 2주간 배양시켰다.
2. 신경구를 20 U/ml 파파인을 이용하여 37℃에서 30-50분간 해리시켰다.
3. 세포를 PDL 피복된 배양 접시상에 PDGF/FGF 를 포함하는 조상 세포 배지에서 웰당 50,000-100,000개 세포의 밀도로 플레이트시키고, 37℃, 5-6% CO2에서 배양시켰다.
4. 배지 및 생장 인자들은 매 48시간 마다 교체한다.
사람 배양 화합물 처리:
1. 플레이트후 24 내지 48 시간 후 오래된 배지를 제거하고, 새로운 배지(미토겐 함유)에 화합물을 첨가한다.
2. 화합물 약량 반응 평가는 3-6개 상이한 농도 (10μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM)에서 실시한다.
3. 각 화합물 농도를 삼중 웰로 반복한다.
5. 실험 검사에 사용하기 전에 처리된 세포를 7일간 배양한다.
래트/마우스/사람 희돌기교 세포 특이적 면역 착색:
화합물 노출 후에, 희돌기교세포-특이적인 항체를 이용하여 화합물이 희돌기교 세포를 분화 촉진 또는 가속시키는 능력을 평가한다(예를 들면, 화합물 처리된 것과 처리안된 배양물간에 시간에 따른 O4, O1, 또는 미엘린 염기성 단백질 면역반응성).
1. 세포를 폴리-D-리신 처리된4-웰 챔버 슬라이드상에 5x103 내지 20x103 세포/웰로 플레이트시키고, 상기에서 설명하는 것과 같이 생장시켰다. PDGF 및 FGF없이 시험관 내(in vitro) 에서 몇일 측정하여, 세포 분화도를 증가시키면서 희돌기교 세포 집단을 연속 착색한다.
2. 37℃에서 30분간 라이브 착색(live staining)을 이용하여 특이적인 세포 표면 마커를 발현(A2B5, O4, O1을 포함)시키는 상태에서 희돌기교 세포를 감지한다.
3. 연속하여, 세포를 4% 파라포름알데히드에 10분간 실온에서 고정시킨다.
4. 고정 착색 과정을 이용하여 특정 마커 (미엘린 염기성 단백질, MBP를 포함)를 발현시키는 희돌기교세포 상태를 감지한다.
5. PBS로 헹군다.
6. 1X PBS 에서 희석시킨 0.1% 트리톤/0.01% NaAz로 10분간 실온에서 침투시킨다.
7. 항체 희석 완충액(0.1% 트리톤-X 100, 1% IgG-없는 소 혈청 알부민; 항체를 희석시키는데도 이용)에 5-10% 염소 혈청으로 15분간 실온에서 차단시킨다.
8. 항체 희석 완충액으로 희석시킨 1차 항체를 첨가한다.
9. 4℃에서 가볍게 흔들면서 하룻밤 동안 배양한다.
10. 그 다음 날, 실온에서 PBS 1X 5분간 세척시키고, 이어서3X 15분간 세척한다.
11. 적절한 2차 항체와 함께 45분간 실온에서 배양시킨다.
12. 세포 핵을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 15분간 실온에서 착색한다.
13. PBS로 몇 차례 세척하고, 형광 현미경을 이용하여 평가한다.
14. 다음의 조건을 시간에 따라 그리고 상이한 화합물 약량에 따라 비교한다: PDGF/FGF 단독, SFM 단독, SFM-IGF1 단독, PDGF/FGF 및 화합물, SFM 및 화합물.
래트 /마우스/사람 브로모데옥시우리딘 ( BrdU ) 면역착색:
화합물들이 세포 증식을 촉진시키지 않는다는 것을 확인하기 위해.
1. 희돌기교세포 조상세포에 10 μM BrdU를 20시간 동안 라벨링시키고, 70% 에탄올 또는 4% 파라포름알데히드로 고정시킨다.
2. 세포를 연속하여 바이오티닐화된 마우스 항-BrdU 및 스트렙타아비딘-퍼옥시다제와 함께 배양시키고, 세 번의 간기에 PBS로 세척한다.
3. BrdU 면역반응성의 발색 확인을 DAB로 인화하고, 총 세포 수를 계수기-착색 헤모토크실린으로 평가한다.
4. BrdU 면역 양성 세포를 두 명의 다른 관찰자에 의해 계수시킨다.
래트 /마우스/사람 배양물 이미지 분석: 형광 현미경을 이용하여 화합물 노출후에 희돌기교세포 분화 정도를 정량화한다. 이 검사에서는 선택성 효능제가 희돌기교세포 분화를 가속/촉진시킨다는 것을 설명한다.
1. 수동 세포 카운팅: 각 실험 조건에서 무작위로 4부분을 선택하여, 각 부분에서 500-600개 세포를 계수한다. MBP (또는 O4) 면역 양성 세포 (미엘린 수초 유무에 관계없이 세포를 포함하는 성숙 과정)와 DAPI 양성 세포 (전체 세포 수) 백분율을 대조군 및 약물 처리된 군에서 비교하였다.
2. 자동화된 세포 카운팅: 형광 현미경을 이용하여 화합물에 노출된 후에 희돌기교세포 분화 정도를 정량화시켰다. 웰당 6개 부분을 무작위로 선별하여, 전체 군중에 분화되는 희돌기교세포수를 평가하였다(~8 내지 15x103 세포가 웰당 계수된다). 면역형광 이미지는 Zeiss AxioVision 디지털 이미징 시스템+ 동일한 현미경에 연결된Zeiss AxioCam HRc cooled CCD 카메라를 이용하여 얻는다. 모든 현미경 이미지 변수는 세포 면역 형광 강도 분석을 위해 이미지를 수득할 수 있도록 설정하였다. MBP 양성 (분화된) 세포와 전체 세포 (DAPI 핵 착색된)의 백분율을 대조군과 약물-처리된 군에서 비교하였다. 세포 자동 형광은 이미징 조건하에서 감지되지 않았다.
a) 3. 사람 희돌기교세포 분화 검사: O4 면역양성 세포/웰 (양극성 및 다극성)의 전체 수를 수작업으로 계수한다.
래트 희돌기교세포 배양물을 이용한 결과를 도1에 나타내었고, 사람 희돌기교세포 혼합 배양물을 이용한 결과를 도 5와 6에 나타내었다. 그 결과에서 볼 수 있는 것과 같이, PPAR 델타 효능제는 마우스와 사람 희돌기교세포 분화를 강화 또는 촉진시킨다(처리안된 대조군과 비교하였을 때 미엘린 염기성 단백질 발현이 증가되었기 때문에). 이와 같은 새로운 발견으로, 화합물 1과 화합물 2 그리고 선택적 PPAR 델타 효능제는 일반적으로 MS 및 다른 미엘린 탈락 질환을 포함하는 질병이 있거나 또는 손상된 CNS 에서 희돌기교세포 분화 및 생체 내(in vivo)에서 미엘린 형성을 강화, 가속 또는 촉진시킬 수 있다.
래트 /마우스/사람 정량적 폴리메라제 연쇄 반응( PCR ): 화합물이 PPAR 델타 경로 활성화시키고, 희돌기교세포 성숙을 어느 정도유도하는지를 평가하기 위함(mRNA 수준 변화).
1. 총 RNA를 TriZol 시약을 이용하여 배양된 희돌기교세포로부터 추출한다.
2. 연속하여, mRNA를 RNase-없는 DNase로 처리하고, 다시 정제하고, 그 다음 RT 반응(Clontech Advantage RT for PCR Kit)을 이용하여 cDNA 주형으로 전환시킨다.
3. PPAR 델타 경로 부재 전사 발현(pathway member transcript expression)을 Sybr Green PCR Master Mix을 이용하여 정량화시킨다.
4. Taqman 2X PCR Master Mix 에 재현탁시킨18S 리보좀성 RNA 프라이머/프로브 혼합물(186 bp 생성물)을 내부 대조군으로 이용한다.
5. 정량적 PCR은 실시간 TaqmanTM 기술(Gibson, 등 1996)을 이용하여, 모델 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 실시한다.
6. 그 결과들은 Sequence Detection Systems 소프트웨어 버전 1.91을 이용하여 분석한다.
이들 검사 결과들은 도 2, 3, 4A, 4B에 나타내었다. 이들 결과에서, PPAR 델타 선택적 효능제가 PPAR 델타 수용체에 결합하여, 희돌기교세포에서 PPAR 델타 경로를 직접적으로 활성화시키고, 생체 내에서도 유사하게 작용할 것이라는 것을 알 수 있다.
래트 ELISA 검사: 화합물이 PPAR 델타 경로 활성화를 유도하는지 그리고 희돌기교세포 성숙화를 어느 정도 유도하는지(단백질 수준 변화)를 평가하기 위해.
1. 플레이트를 PBS로 세척하고, 얼음 위에 둔다. 200μl 얼음으로 냉각시킨 용해 완충액 (트리스 50mM, pH7.4, MgCl2 2mM, EDTA 1mM, 베타-멀캅토에탄올 5mM, Nonidet P-40 1%, 프로테아제 저해 칵테일 (Roche), 각 웰에 1개 정제/50 ml)을 각 웰에 첨가한다.
2. 세포를 피펫을 이용하여 아래 위로 피펫팅하여 용해시키고, 2000 rpm, 40C, 5분간 플레이트를 스핀시킨다. 상청액을 사용 준비한다.
3. 표준, 대조군 및 샘플을 웰로 50 μl씩 피펫한다.
4. 각 웰에 50μl의 MBP 검사 완충액을 피펫한다.
5. 실온에서 2시간 동안 오비탈 미세 플레이트 쉐이커 상에서500-700 rpm으로 교반시키면서 웰을 배양시킨다.
6. 각 웰에 100μl의 MBP 항체-바이오틴 공액체를 첨가한다.
7. 실온에서 1시간 동안 오비탈 미세 플레이트 쉐이커 상에서 500-700 rpm으로 교반시키면서 웰을 배양시킨다.
8. 세척 용액으로 웰을 5회 씻어내고, 흡수 재질 위에 플레이트를 뒤집어 놓고 블랏 건조시킨다.
9. 스트렙타아비딘-효소 공액체를 1:50 비율로 MBP Elisa 검사 완충액으로 희석시킨다 (검사직전에 희석시켜야 한다).
10. 각 웰에 100 μl 스트렙타아비딘-효소 공액체 용액을 첨가한다.
11. 실온에서 30분 동안 오비탈 미세 플레이트 쉐이커 상에서 500-700 rpm으로 교반시키면서 웰을 배양시킨다.
12. 세척용액으로 웰을 5회 씻어내고, 흡수 재질 위에 플레이트를 뒤집어 놓고 블랏 건조시킨다.
13. 각 웰에 100 μl TMB 크로모겐 용액을 첨가한다.
14. 실온에서 10-20분 동안 오비탈 미세 플레이트 쉐이커 상에서 500-700 rpm으로 교반시키면서 웰을 배양시킨다. 직사광에 노출시키는 것을 피한다.
15. 각 웰에 100 μl 의 정지 용액을 첨가한다.
16. 450nM에 세트된 미세 플레이트 판독기를 이용하여 30분 이내에 웰내 용액의 흡수도를 판독한다.
도 1 내지 6에서 볼 수 있는 것과 같이 일반적인 상기 결과에서, PPAR 델타 효능제는 미토겐 존재하에서도 희돌기교 세포 분화를 촉진시키고, 이는 세포를 유사분열적 활성을 정상적으로 유지하게 하고, 세포 분화를 저해시킨다. 따라서, 손상되거나 또는 질환이 있는 CNS에서, 선택적 PPAR 델타 효능제는 희돌기교세포 조상세포를 분할하여, 미엘린 단백질을 발현하게 하고, 미엘린 탈락된 또는 하이포미엘린화된 축삭을 수초화(ensheath)시킬 것으로 기대한다.
콘셉 모델(Concept Model)의 생체 내(In Vivo) 증명
국소 병소: (화합물이 미엘린 일체성을 보호하는지 또는 미엘린 재형성 속도를 가속 또는 강화시키는지를 평가하기 위해 이용)
1. 7주령의 래트에게 음식 및 물을 자유롭게 이용할 수 있게 하고, 실험에 이용하기 최소한 4일간 순응화시킨다.
2. 외과술 전에 각 동물의 체중을 잰다. 그 다음 래트를 케타민(100 mg/ml)과 실라진(20 mg/ml)(1.8 : 1 비율)로 마취시킨다. 래트에 0.15ml/180g 체중의 마취 용액을 i.p.로 주사후에 외과술을 실시한다. IACUC 규정에 따라 무균 상태를 이용하여 외과술을 받도록 동물을 준비한다. 모든 외과수술 기구들은 증기살균시킨다. 귀 사이에 털을 깍고, 베타딘으로 문지르고, 멸균 염수를 붇고, 최종적으로 미리 포장된 멸균 알코올 면봉으로 닦는다.
3. 외과술을 위해, 래트 머리를 고정시키기 위해 고안된 작은 동물 정위(stereotaxic) 기구내 배 표면이 닿도록 래트를 누인다. 인시져 막대(incisor bar)를 항상 3.9 mm에 고정시켜, SD 래트의 평편한 두개골 위치를 얻게 한다.
4. 양 귀사이에 두개골 위의 미리 면도해 놓은 피부에 절개를 한다.
5. 람다로부터AP 1.8, ML 3.1 좌표 위치 뼈상에 작은 구멍(직경0.75mm)을 뚫는다.
6. 뼈를 제거하고, 래트에 2μl 브롬화에티디움, 리소레시틴, 또는 SIN-1를 우측 소뇌각(caudal cerebellar peduncle), DV 7.1 mm에 2분 간격으로 Hamilton μl 주사기 및 바늘로 주사한다. 또 다른 주사는 척수, 뇌량(corpus callosum) 또는 백질로 주사한다.
7. 바늘은 연속 2분간 그 위치에 둔다.
8. 바늘을 빼낸 후 절개부를 봉한다.
9. 각 래트의 뒷 다리로 0.003mg 부프레노르핀을 i.m. 주사놓는다.
10. 래트는 의식을 찾을 때 까지 따뜻한 컵보드상에 둔다. 시간이 되면 우리로 되돌려 보낸다. 래트들이 서로 봉합된 부분을 물어뜯지 않도록 우리당 2마리 이상의 래트가 있지 않도록 한다.
11. 마우스를 이용하여 유사한 과정을 실시한다.
래트의 실험적 알레르기성 뇌척수염( 래트 EAE ) 질환 모델:
실험적인 알레르기성 뇌척수염(EAE)은 전체 척수 균질물 또는 성분(미엘린 염기성 단백질)으로 감작화된 후 질병에 걸리기 쉬운 동물에서 발생되는 신경계에서 T-세포 매개된 자가 면역 신경 질환이다. EAE 설치류 모델은 MS 환자에서 관찰되는 뇌 및 척수의 염증 연구를 위한 적절한 도구가 된다. 설치류에서 전체 척수 또는 척수 성분 예를 들면, 미엘린 염기성 단백질을 주사하면 T-임파세포 활성화에 근거하여 자가 면역 반응을 유도한다. 임상적 질환은 일반적으로 접종후 8-10일경에 분명해지는데, 보행장애 및 꼬리 이완부터 완전한 마비 및 사망에 이르기까지 광범위한 거동성 이상으로 관찰된다. 체중 감소가 일반적으로 나타난다. 생존하는 동물의 경우에는 자발적 회복이 일어나고, 대부분의 운동 신경은 다양한 정도로 회복된다. 종, 알레르겐, 이용되는 방법에 따라 EAE 모델에 의해 테스트되는 동물은 단일(급성EAE) 또는 몇 가지 공격(만성적으로 재발하는 EAE)를 경험할 수도 있다. 몇 가지 치료 과정을 이용할 수도 있다: 약물 및 치료 선택은 면역화시키기 전에, 증상이 없는 시기 동안 또는 임상 질환 과정에서 투여될 수 있다.
동물:
암컷 Lewis 래트, 160-220g (Charles River)
항원:
전체 기니아피그 척수(Harlan Biosciences).
완전한 프로인트 어쥬번트 H37 Ra [1mg/ml 미코박테리움 튜베르클로시스 H37 Ra] (Difco).
추가 항원:
미코박테리움 튜베르클로시스 (Difco).
보르데텔라 페르투시스 [열을 이용하여 치사] (Difco).
항원 준비: (약 720 마리 동물용):
1. 냉동된 기니아 피그 척수 5g을 계량한다.
2. 5g의 척수를 밑둥근 원심분리 튜브내 5ml의 0.9% 염용액(1g/ml)에 넣는다
3. 조직이 완전하게 분쇄될 때까지(약 5분) Tissue-tech를 이용하여 얼음위에서 균질화시킨다.
4. 200 mg의 미코박테리움 튜베르클로시스 (완전한 프로인트 어쥬번트 H37 Ra ml당 20mg)가 보충된 10 ml의 완전한 프로인트 어쥬번트 H37를 첨가한다.
5. 튜브로부터 18게이지 에멸젼 바늘이 고정된 10ml 주사기로 균질물/어쥬번트를 흡인하여 추출한다.
6. 바늘을 통하여 물질이 연속적으로 통과하는 것이 곤란할 때 까지 두개의 30ml 유리 주사기 안에서 에멸젼화시킨다(약 5분 {오일 상과 수성 상 간에 분리되지 않아야 한다.
7. 즉시 사용하거나 필요할 때 까지 얼음에 둔다(30분을 초과하지 않는다)(얼리지 않는다).
프로토콜
1. 암컷 Lewis 래트 (Charles River)들은 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하고, 실험에 사용하기 최소 3일 전까지 적응해야 한다.
2. 160g 내지 220g 체중의 래트에 우선 5% 이소플루란(Aerrane, Fort Dodge), 30% O2, 70% N2O으로 2-5분간 유도한다.
3. 그 다음 래트를 순환하는 물 히터 블랭킷 (Gaymar) (복부가 위쪽으로)상에 두고, 코에 콘을 씌워서 마취 가스를 자발적으로 흡입하도록 하고, 이소플루란을 2%로 줄인다.
4. 뒷발 아래에 항원 또는 정상 염수 용액으로 된 2가지 피하 주사(각 0.1 ml)를 놓는다.
5. 코에 씌운 콘을 제거하고, 체중을 재고, 번호를 매긴다.
6. 마취로부터 래트들이 깨어나도록 한 다음 개별 우리에 넣는다.
7. EAE 유도 징후(아래 기준 참고)에 대해 매일 동물을 모니터한다.
단계: 0 정상
단계: 1 비정상, 꼬리 이완
단계: 2 약하지만 한 쪽 또는 두 쪽 뒷다리가 분명히 약해짐
단계: 3 한 쪽 또는 두 쪽 뒷다리가 심각하게 약해짐 또는 약한 수족장애
단계: 4 심각한 마비 및 최소한의 뒷다리 움직임
단계: 5 뒷다리 움직임이 없음, 마비
단계: 6 자발적인 움직임이 없고, 호흡이 곤란한 빈사상태. 앞다리 움직임이 증가, 뇨 및 변 실금이 일어날 수 있음
단계:7 사망
치료는 면역화후 10일째에 시작한다. 이 모델에서 질병 증상은 접종 후 일반적으로 10-11일에 나타나는데, 이 시점이 급성MS 증상의 개시 상태로 보인다. 치료 개시 지연은 약물을 접종시기 또는 심지어 접종 전에 투여하는 전통적으로 이용되는 프로토콜보다도 더 밀접하게 임상 상태를 모방하는 것으로 판단된다. (Teitelbaum D. 등 Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 3842-3847 및 Brod S. A., 등 Ann Neurol 2000; 47: 127-131).

Claims (7)

  1. 치료학적 유효량의 hPPAR 델타 효능제를 투여함을 포함하여, 환자의 미엘린 탈락 질환을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, hPPAR 델타 효능제가 선택적 효능제인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미엘린 탈락 질환이 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 펠리체우스-메르츠바하병(Pelizaeus Merzbacher disease), 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증, 길리안-바레 증후군(Guillian-Barre syndrome), 및 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 미엘린 형성 교세포가 손상되는 질환으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 미엘린 탈락 질환이 다발성 경화증인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 효능제가 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 구성된 군에서 선택되는 방법.
    화학식 1
    Figure 112006080147639-PCT00010
    화학식 2
    Figure 112006080147639-PCT00011
  6. 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스병, 펠리체우스-메르츠바하병, 뇌척수염, 시신경척수염, 부신백질이영양증, 길리안-바레 증후군, 및 척수 손상, 신경병증 및 신경 손상을 포함하는 미엘린 형성 교세포가 손상되는 질환으로 구성된 미엘린 탈락 질환을 치료하는 데 유효한 양의 화학식 1의 화합물과 화학식 2의 화합물로 구성된 군에서 선택된 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
    화학식 1
    Figure 112006080147639-PCT00012
    화학식 2
    Figure 112006080147639-PCT00013
  7. 제6항에 있어서, 다발성 경화증을 치료하는 데 유효한 양을 포함하는 약학 조성물.
KR1020067022955A 2004-04-01 2005-03-29 미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ｐｐｒ 델타 효능제의용도 KR20060134191A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55853304P 2004-04-01 2004-04-01
US60/558,533 2004-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060134191A true KR20060134191A (ko) 2006-12-27

Family

ID=34977094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067022955A KR20060134191A (ko) 2004-04-01 2005-03-29 미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ｐｐｒ 델타 효능제의용도

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20070149580A1 (ko)
EP (1) EP1737440A2 (ko)
JP (1) JP2007530703A (ko)
KR (1) KR20060134191A (ko)
CN (1) CN1950077A (ko)
AU (1) AU2005231358A1 (ko)
BR (1) BRPI0509540A (ko)
CA (1) CA2561159A1 (ko)
IL (1) IL178165A0 (ko)
MA (1) MA28561B1 (ko)
MX (1) MXPA06011218A (ko)
NO (1) NO20064985L (ko)
RU (1) RU2006138495A (ko)
SG (1) SG138623A1 (ko)
WO (1) WO2005097098A2 (ko)
ZA (1) ZA200607850B (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE486055T1 (de) 2004-05-05 2010-11-15 High Point Pharmaceuticals Llc Neue verbindungen, ihre herstellung und verwendung
JP4981662B2 (ja) 2004-05-05 2012-07-25 ハイ・ポイント・ファーマスーティカルズ、エルエルシー 新規の化合物、その製法と使用
RU2412935C2 (ru) 2005-06-30 2011-02-27 Хай Пойнт Фармасьютикалс, ЛЛС Феноксиуксусные кислоты в качестве активаторов дельта рецепторов ppar
US8148389B2 (en) * 2005-11-28 2012-04-03 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical comprising PPAR agonist
EP2386540A1 (en) 2005-12-22 2011-11-16 High Point Pharmaceuticals, LLC Novel compounds, their preparation and use
WO2007101864A2 (en) 2006-03-09 2007-09-13 High Point Pharmaceuticals, Llc Compounds that modulate ppar activity, their preparation and use
WO2010000353A1 (en) 2008-06-09 2010-01-07 Sanofi-Aventis Sulfonamides with heterocycle and oxadiazolone headgroup, processes for their preparation and their use as pharmaceuticals
EP2288604B1 (en) 2008-06-09 2014-01-08 Sanofi Annelated n-heterocyclic sulfonamides with oxadiazolone headgroup, processes for their preparation and their use as pharmaceuticals
CN102639700A (zh) 2009-09-30 2012-08-15 哈佛大学校长及研究员协会 通过调节自噬增强基因产物调节自噬的方法
CA2784652A1 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Sanofi Animal model expressing luciferase under control of the myelin basic protein promoter (mbp-luci) and use of the model for bioluminescence in vivo imaging
WO2012112933A1 (en) * 2011-02-18 2012-08-23 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
CA2923422C (en) 2013-09-09 2021-09-07 Vtv Therapeutics Llc Use of a ppar-delta agonist for treating muscle atrophy
WO2023147309A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Reneo Pharmaceuticals, Inc. Use of ppar-delta agonists in the treatment of disease

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1856997A (en) * 1996-02-02 1997-08-22 Merck & Co., Inc. Method for raising hdl cholesterol levels
GB9914977D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
AU2001288271A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-25 Harrihar A. Pershadsingh Methods for treating inflammatory diseases
GB0024362D0 (en) * 2000-10-05 2000-11-22 Glaxo Group Ltd Medicaments
GB0024361D0 (en) * 2000-10-05 2000-11-22 Glaxo Group Ltd Medicaments
US20050020654A1 (en) * 2003-03-15 2005-01-27 Pershadsingh Harrihar A. Novel PPAR agonists, pharmaceutical compositions and uses thereof
EP1637161A4 (en) * 2003-04-22 2007-06-27 Astellas Pharma Inc MEANS FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE ILLNESSES OF THE BRAIN WITH PPAR [delta] AGONIST

Also Published As

Publication number Publication date
RU2006138495A (ru) 2008-05-10
WO2005097098A3 (en) 2005-12-22
WO2005097098A2 (en) 2005-10-20
CN1950077A (zh) 2007-04-18
US20070149580A1 (en) 2007-06-28
JP2007530703A (ja) 2007-11-01
CA2561159A1 (en) 2005-10-20
SG138623A1 (en) 2008-01-28
AU2005231358A1 (en) 2005-10-20
ZA200607850B (en) 2008-10-29
MXPA06011218A (es) 2007-01-16
MA28561B1 (fr) 2007-04-03
IL178165A0 (en) 2008-03-20
NO20064985L (no) 2006-10-31
BRPI0509540A (pt) 2007-09-18
EP1737440A2 (en) 2007-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20060134191A (ko) 미엘린 탈락 질환을 치료하기 위한 ｐｐｒ 델타 효능제의용도
JP2010528016A (ja) 細胞を刺激するための方法および組成物
US20150011610A1 (en) Method for enhancing remyelination using gli1 inhibitors
Jana et al. Gemfibrozil, a lipid-lowering drug, increases myelin genes in human oligodendrocytes via peroxisome proliferator-activated receptor-β
Yao et al. In vitro and in vivo induction and activation of nNOS by LPS in oligodendrocytes
Yang et al. Resistance of interleukin-6 to the extracellular inhibitory environment promotes axonal regeneration and functional recovery following spinal cord injury
US20190269675A1 (en) Treatment of parkinson's disease and other conditions caused or mediated by senescent astrocytes using small molecule senolytic agents
US11779565B2 (en) Small organic molecules for use in the treatment of neuroinflammatory disorders
US9028810B2 (en) Composition for inducing migration of neural stem cells containing periostin as effective ingredient
US20030082802A1 (en) Method for neural stem cell differentiation using 5ht1a agonists
US20040092010A1 (en) Method of proliferating and inducing brain stem cells to differentiate to neurons
US20170196839A1 (en) Neurodegenerative diseases and methods of modeling
Jana et al. IL‐12 p40 homodimer, the so‐called biologically inactive molecule, induces nitric oxide synthase in microglia via IL‐12Rβ1
CN113874020A (zh) 使用曲美替尼和标志物治疗神经退化性疾病的给药方法和剂量方案
US20090155223A1 (en) Cell-based compositions and methods for treating conditions of the nervous system
CA2844587A1 (en) Oligodendrocyte differentiation
Jana et al. Induction of IL-2 by interleukin-12 p40 homodimer and IL-12, but not IL-23, in microglia and macrophages: Implications for multiple sclerosis
WO2017081033A1 (en) Cell differentiation or reprogramming using fezf2 and lmo4
US20240316014A1 (en) Method for treating demyelinating conditions
US20210186903A1 (en) Treatment for demyelinating disease
Meng et al. PPAR-γ Agonist Promotes Proliferation of Neural Stem Cells Via Mitophagy Inhibition

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid