MXPA06011218A - Uso de agonistas del receptor delta activado por el proliferador de peroxisoma para el tratamiento de esclerosis multiple y otras enfermedades de desmielinizacion. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para tratar enfermedades de desmielinizacion, en un paciente que necesita dicho tratamiento, con una cantidad eficaz de un agonista del PPAR delta; las enfermedades de desmielinizacion que se pueden tratar de forma eficaz con este metodo incluyen, aunque sin limitarse a ello, esclerosis multiple, enfermedad de Charcot-Maria-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis optica, adrenoleucodistrofia, sindrome de Guillian-Barre y trastornos en los que esta danadas las celulas gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la medula espinal, neuropatias y lesiones nerviosas.

Description

funciones biológicas o se ha puesto en claro muy poco sobre la gama completa de genes regulados por el receptor. No obstante, se ha descubierto recientemente que los agonistas pueden ser útiles para tratar enfermedades como la dislipidemia y determinadas enfermedades dermatológicas, mientras que los antagonistas pueden ser útiles para tratar la osteoporosis o el cáncer colorrectal (D. Stembach, en Annual Reports in Medicinal Chemistry, Volumen 38, A. M. Doherty, ed., Elsevier Academic Press, 2003 pp. 71-80). El PPARdelta parece expresarse significativamente en el SNC; sin embargo sigue sin descubrirse la mayor parte de su función en éste. Es de singular interés, no obstante, el descubrimiento de que el PPAR delta se expresaba en oligodendrocitos de roedores, las principales células productoras de lípidos del SNC (J. Granneman, et al., J. Neurosci. Res., 1998, 51 , 563-573). Además, también se encontró que un agonista selectivo del PPAR delta aumentaba significativamente la expresión génica de mielina oligodendroglial y el diámetro de la vaina de mielina en cultivos de ratón (I. Saluja et al., Glia, 2001 , 33, 194-204). Los estados de desmielinización se ponen de manifiesto por la pérdida de mielina, las múltiples capas densas de lípidos y proteína que cubren muchas fibras nerviosas. Estas capas se proporcionan por la oligodendroglia en el sistema nervioso central (SNC), y las células Schwann en el sistema nervioso periférico (SNP). En la esclerosis múltiple (EM), los oligodendrocitos, las células formadoras de mielina en el SNC, son destruidas, y los axones son dañados, lo que provoca una actividad neuronal intensamente deteriorada y un déficit funcional, incluyendo palegia. En pacientes con estados de desmielinización, la desmielinización puede ser irreversible; normalmente va acompañada o seguida de degeneración axonai, y a menudo de degeneración celular. La desmielinización se puede producir como consecuencia de daño neuronal o daño a la propia mielina, sea debido a respuestas inmunitarias aberrantes, lesión local, isquemia, trastornos metabólicos, agentes tóxicos o infeccionas víricas (Prineas and McDonald, Demyelinating Diseases. In Greenfield's Neuropathology, 6.sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-81 1 , Beers and Berkow, eds., The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). No obstante, las células progenitoras de oligodendrocitos están presentes en áreas de desmielinización, sugiriendo la posibilidad de una autorreparación, si se puede inducir a estas células a someterse a una diferenciación para madurar los oligodendrocitos. La desmielinización central (desmielinización del SNC) se produce en diferentes estados, a menudo de etiología indeterminada, que se han conocido como las enfermedades de desmielinización primarias. De éstas, la esclerosis múltiple es la más prevalente. Otras enfermedades de de desmielinización primarias incluyen adrenoleucodistrofia (ALD), adrenomieloneuropatía, mielopatía vacuolar asociada al sida, mielopatía asociada a HTLV, atrofia óptica hereditaria de Leber, leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), panencefalitis esclerosante subaguda y paraparesia espástica tropical. Además, hay estados agudos en los que se puede producir la desmielinización en el SNC, p. ej., en la encefalomielitis diseminada aguda (E DA) y encefalitis vírica aguda. Además, la mielitis transversa aguda, que es un síndrome en el que una transección aguda de la médula espinal de causa desconocida afecta tanto a la materia gris como a la blanca en uno o más segmentos torácicos adyacentes, puede dar como resultado la desmielinización. La EM es una enfermedad crónica, neurológica y devastadora que afecta en su mayoría a adultos jóvenes. La patogenia de la EM es un proceso complejo que conduce a la destrucción de la mielina y la oligodendroglia, como así también a daño axonal en el cerebro y en la médula espinal (Prineas and McDonald, Demyelinating Diseases. In Greenfield's Neuropathology, 6.sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-81 1 , Trapp et al., N. Engl. J. Med., 338:278-85, 1998). En términos histopatológicos, la EM se caracteriza por inflamación, placas desmielinización que infiltran las células del tejido del SNC, pérdida de oligodendroglia, y lesión axonal focal (Prineas and McDonald, Demyelinating Diseases. In Greenfield's Neuropathology, 6.sup.th ed. (Edward Arnold: New York, 1997) 813-8 ). Se cree que la enfermedad es consecuencia de respuestas inmunitarias aberrantes a la mielina, y posiblemente a los propios antígenos que no son mielina (Bar-Or et al., J. Neuroimmunol. 100:252-59, 1999, Hartung, H.-P., Current Opinión in Neurology, 8.?91-99, 1995). Clínicamente, la EM puede seguir a una recidiva-recaída, o puede tomar un curso crónicamente progresivo con aumento de la discapacidad física (Gold et al., Mol. Med. Today, 6:88-91 , 2000). Típicamente, los síntomas de la EM incluyen falta de coordinación, parestesias, trastornos del habla y la visión, y debilidad.

Los tratamientos actuales para los distintos estados de desmielinización por lo general son costosos, sintomáticos y solamente parcialmente eficaces, y pueden provocar efectos secundarios no deseados. Los corticoesteroides (prednisona oral en una dosis de 60-100 mg/día, disminuida progresivamente durante 2-3 semanas, o metilprednisolona intravenosa en una dosis de 500-1000 mg/día, durante 3-5 días) representan la forma principal de terapia para la EM. Si bien estas formas pueden acortar el período sintomático durante los ataques, no pueden modificar la discapacidad final en el largo plazo. El tratamiento con corticoesteroides a largo plazo muy pocas veces se justifica y puede provocar diversas complicaciones médicas que incluyen osteoporosis, úlceras y diabetes (Beers and Berkow, eds., The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). La terapia inmunomoduladora con interferón-.beta humano recombinante. (Betaseron y Avonex) y con co-polímero (Copaxon) reduce levemente la frecuencia de recidivas en la EM y puede ayudar a demorar la discapacidad final (Beers and Berkow, eds., The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). Ambas formas de interferón-.beta. y co-polímero se utilizan actualmente como modalidades de tratamiento para la EM, pero todas son excesivamente costosas. Los fármacos inmunosupresores (azatioprina, cladribina, ciclofosfamida y metotrexato) se utilizan para formas progresivas más intensas. No obstante, no son uniformemente beneficiosos y tienen efectos colaterales tóxicos importantes. Diversos fármacos (p. ej., baciofen en una dosis de 30-60 mg/día en administraciones separadas) pueden reducir la espasticidad, inhibiendo los reflejos de la médula espinal. Se requiere el uso cauteloso y juicioso, ya que la reducción de la espasticidad inducida por el fármaco en pacientes con EM a menudo exacerba la debilidad, incapacitando incluso más al paciente. De modo similar, el tratamiento actual para la ALD, otra enfermedad de desmielinización devastadora, es relativamente ineficaz. Los síntomas de la ALD pueden incluir ceguera cortical, disfunción del tracto corticoespinal, deterioro mental y espasticidad. La terapia para controlar el curso de la ALD puede incluir el trasplante de la médula ósea y el tratamiento con dieta (DiBiase et al., Ann. Ist. Super Sanita, 35:185-92, 1999), pero invariablemente se produce un deterioro neurológico inexorable, que finalmente conduce a la muerte [Krivit et al., Curr. Opin. Hemato , 6:377-82, 1999, (Beers and Berkow, eds., The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17.sup.th ed. (Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999) 1299, 1437, 1473-76, 1483). Se han producido ciertos avances en el tratamiento de animales con EAE y EAN, usando trasplantes de células gliales y factores de crecimiento, e inhibiendo las moléculas de adhesión, autoanticuerpos y citocinas (Njenga and Rodríguez, Current Opinión in Neurology, 9:159-64, 1996. No obstante, ninguno de estos tratamientos ha demostrado un beneficio para seres humanos, y algunos requieren una extensa intervención neuroquirúrgica. Por lo tanto, es claro que a partir de lo antedicho existe la necesidad de métodos más eficaces, más económicos y menos invasivos para tratar la amplia gama de estados de desmielinización, sin producir efectos secundarios no deseados. La presente invención abarca el uso de un planteamiento regenerativo activado por moléculas pequeñas para aumentar significativamente las terapias ¡nmunomoduladoras actuales para el tratamiento de trastornos de desmielinización. Los compuestos que se sabe son PPAR delta selectivos se conocen en la técnica, en particular, el compuesto de fórmula (1 ) en general conocido como GW 501516 descrito en el documento WO 01/00603. (1 ) El compuesto de fórmula (2), también conocido como L165,041 , ha sido descrito en la solicitud de patente europea 28063 y en el documento W0 97/28149, donde fue identificado como un agonista selectivo de PPAR delta. (2) Debido a la capacidad potencial de los agonistas del Receptor Delta Activado por el Proliferador de Peroxisoma (PPAR delta) para acelerar la diferenciación de células progenitoras de oligodendrocitos agudamente aisladas del cerebro de roedores y para aumentar significativamente el diámetro de la vaina de mielina y la expresión génica de mielina, existe el potencial de que los agonistas de PPAR delta activen la vía del PPAR delta en células progenitoras de oligodendrocitos y aumenten la reparación neuronal, restaurando la vaina de mielina para los axones desmielinizados en la enfermedad de desmielinización, particularmente la EM.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, de acuerdo con la práctica de la presente invención, se provee un método para tratar estados de enfermedad desmielinizantes con agonistas del PPAR delta, y en particular la esclerosis múltiple. En general, los estados de enfermedad que se pueden tratar de acuerdo con la práctica de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a ello, esclerosis múltiple, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia, síndrome de Guillian-Barre y trastornos en los que están dañadas las células gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la médula espinal, neuropatías y lesiones nerviosas. Las enfermedades descritas en la presente memoria se pueden tratar administrando a un paciente que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de PPAR delta.

La presente invención también se refiere al uso de los compuestos de fórmula (I) y fórmula (II) para el tratamiento de enfermedades de desmielinización y, en particular, la esclerosis múltiple. (2) La presente invención también comprende un método para tratar la esclerosis múltiple en pacientes, administrando una combinación de un compuesto de fórmula (1) o fórmula (2) o su sal farmacéuticamente aceptable, con otro compuesto conocido como eficaz para el tratamiento de la esclerosis múltiple en cantidades terapéuticamente eficaces. Los compuestos que actualmente se utilizan para tratar la enfermedad son agentes modificadores de la enfermedad tales como los interferones (interferón beta 1-a, beta 1-b y alfa 2), acetato de glatirámero o corticoesteroides, tales como metilprednisolona y prednisona. Además, agentes quimioterapéuticos tales como metotrexato, azatioprina, cladribina ciclofosfamida y ciclosporina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se usa en esta memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un disolvente, dispersante, excipiente, adyuvante u otro material no tóxico, que se mezcla con el compuesto de la presente invención, con el fin de permitir la formación de una composición farmacéutica, es decir, una forma de dosificación que se pueda administrar al paciente. Un ejemplo de dicho vehículo es un aceite farmacéuticamente aceptable que se utiliza de forma típica para la administración parenteral. El término "sales farmacéuticamente aceptables", tal como se usa en la presente memoria, significa que las sales de los compuestos de la presente invención pueden usarse en preparaciones medicinales. Sin embargo, pueden resultar útiles otras sales en la preparación de los compuestos acordes con la invención, o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen sales de adición de ácido que se pueden formar, por ejemplo, mezclando una disolución del compuesto de acuerdo con la invención, con una disolución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido metansulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido mélico, ácido ascórbico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido acético, ácido salicílico, ácido cinámico, ácido 2-fenoxiacético, ácido hidroxibenzoico, ácido fenilacético, ácido benzoico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido carbónico o ácido fosfórico. También pueden formarse sales de metales ácidas, como monohidrógeno-ortofosfato de sodio e hidrógeno-sulfato de potasio. Además, las sales así formadas pueden estar presentes como sales de mono o di-ácido y pueden existir en forma hidratada o pueden ser sustancialmente anhidras. Además, cuando los compuestos de la invención tienen un resto ácido, sus sales farmacéuticamente aceptables adecuadas pueden incluir sales de metales alcalinos, por ejemplo sales de sodio o de potasio; sales de metal alcalinotérreo, por ejemplo, sales de calcio o magnesio; y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados, por ejemplo, sales de amonio cuaternarias. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se usa en la presente memoria, significa una cantidad del compuesto, que es eficaz para tratar la enfermedad o el trastorno mencionado. Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un disolvente, dispersante, excipiente, adyuvante u otro material no tóxico, que se mezcla con el compuesto de la presente invención, con el fin de permitir la formación de una composición farmacéutica, es decir, una forma de dosificación que se pueda administrar al paciente. Un ejemplo de dicho vehículo es un aceite farmacéuticamente aceptable que se utiliza de forma típica para la administración parenteral. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos de acuerdo con esta invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, estas composiciones están en formas de dosificaciones unitarias tales como comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, gránulos, disoluciones o suspensiones parenterales estériles, aerosoles o pulverizadores líquidos dosificados, gotas, ampollas, dispositivos de autoinyección o supositorios; para la administración oral, parenteral, intranasal, sublingual o rectal, o para la administración por inhalación o insuflación. Alternativamente, las composiciones pueden presentarse en una forma adecuada para la administración una vez semanal o una vez mensual; por ejemplo, una sal insoluble del compuesto activo, como la sal decanoato, puede adaptarse para proporcionar una preparación de depósito para la inyección intramuscular. Puede contemplarse un polímero erosionable que contiene el ingrediente activo. Para preparar composiciones sólidas como comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un vehículo farmacéutico, p.ej. ingredientes convencionales para formar comprimidos, tal como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, p.ej. agua, para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o su sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se indica que estas composiciones de preformulación son homogéneas, significa que el ingrediente activo está disperso de modo uniforme a través de la composición, de forma que la composición puede subdividirse con facilidad en formas de dosificación unitarias igualmente eficaces, como comprimidos, pildoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente, que contienen desde 0,1 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo de la presente invención. Las formas de dosificación unitaria aromatizadas contienen desde 1 a 100 mg, por ejemplo 1 , 2, 5, 10, 25, 50 ó 100 mg, del ingrediente activo. Los comprimidos o pildoras de la nueva composición pueden revestirse o componerse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que permita la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o pildora puede comprender un componente de dosificación interno y uno de dosificación externo, estando éste último en forma de una envuelta sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica, que actúa para resistir la disgregación en el estómago, y permite que el componente interno pase intacto hacia el duodeno, o sea liberado con retraso. Puede utilizarse una diversidad de materiales para estas capas o revestimientos entéricos, incluyendo dichos materiales una serie de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma de laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa. Las formas líquidas en las que las nuevas composiciones de esta memoria invención pueden incorporarse para su administración por vía oral o mediante inyección incluyen disoluciones acuosas, jarabes aromatizados de forma apropiada, suspensiones acuosas u oleosas, y emulsiones aromatizadas con aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares. Los agentes dispersantes o suspensores adecuados para las suspensiones acuosas incluyen gomas sintéticas y naturales como tragacanto, goma arábiga, alginato, dextrano, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o gelatina. En el tratamiento de los diversos estados patológicos como se describe en la presente memoria, un nivel de dosificación adecuado es desde aproximadamente 0,01 a 250 mg/kg diarios, preferiblemente desde aproximadamente 0,05 a 100 mg/kg diarios, y en especial desde aproximadamente 0,05 a 20 mg/kg diarios. Los compuestos pueden administrarse en un régimen de 1 a 4 veces diarias. En un aspecto de la presente invención, se describe un método para tratar enfermedades de desmielinización en un paciente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de hPPAR delta. En otro aspecto de la presente invención, el agonista de hPPAR delta es un agonista selectivo. En otro aspecto de esta modalidad se describe un método en el que la enfermedad de desmielinización se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia, síndrome de Guillian-Barre y trastornos en los que están dañadas las células gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la médula espinal, neuropatías y lesiones nerviosas. En otro aspecto de esta modalidad se describe un método en el que la enfermedad de desmielinización es la esclerosis múltiple. Incluso en otro aspecto de esta modalidad se describe el método en el que el agonista se selecciona del grupo que consiste en el compuesto de fórmula (1 ) y fórmula (2) (1 ) (2) Otra modalidad descrita en la presente invención consiste en una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el compuesto de fórmula (1) y fórmula (2) en una cantidad eficaz para tratar la esclerosis múltiple, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia, síndrome de Guillian-Barre y trastornos en los que están dañadas las células gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la médula espinal, neuropatías y lesiones nerviosas, en combinación con por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable (1 ) (2) En otro aspecto de esta modalidad se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz para tratar la esclerosis múltiple.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Ilustra el aumento de inmunorreactividad de la proteína básica de mielina (MBP) en cultivos de oligodendrocitos de rata por los agonistas del PPAR delta. Figura 2. Este gráfico muestra el aumento de ARNm de MBP en cultivos de oligodendrocitos de rata por el compuesto 1. Figura 3. Este gráfico muestra el aumento de ARNm de MBP en cultivos de oligodendrocitos de rata por el compuesto 2. Figura 4A. Ilustra el efecto del compuesto 1 en marcadores transcripcionales que confirman la activación de la vía agonista de PPAR delta en cultivos de oligodendrocitos de rata. Figura 4B. Ilustra también el efecto del compuesto 1 en marcadores transcripcionales que confirman la activación de la vía agonista de PPAR delta en cultivos de oligondendrocitos de rata, demostrando que el ARNm de ADRP aumenta en forma ascendente en cultivos de oligodendrocitos de rata. Figura 5. Muestra el incremento en la cantidad de células inmunopositivas 04 en cultivos mixtos de oligodendrocitos humanos efectuado por el compuesto . Figura 6. Muestra el incremento en la cantidad de células inmunopositivas 04 en cultivos mixtos de oligodendrocitos humanos efectuado por el compuesto 2.

Ejemplos de compuestos: El compuesto de fórmula (1 ) (GW501516) se puede preparar tal como se publica en el documento WO 01/00603. El compuesto de fórmula (2) (L165,041 ) se puede preparar tal como se describe en el documento WO 97/28149. Ejemplos biológicos: Los siguientes protocolos de ensayo se usan para evaluar las propiedades biológicas de los compuestos de esta invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar adicionalmente la invención. Sin embargo, no deben considerarse limitantes de la invención de ninguna manera. Se evalúa la capacidad de los agonistas del PPAR delta de la presente invención en modelos in vitro e in vivo para promover la expresión de mielina y aumentar los procesos regenerativos. El perfil de selectividad del receptor nuclear óptimo se determina mediante ensayos del indicador de luciferasa/GAL4. Un ensayo de células de roedores muestra la capacidad del compuesto para dirigir/acelerar la diferenciación de células progenitoras de oligodendrocitos cultivadas para madurar los oligodendrocitos. Los ensayos biológicos específicos que sugieren eficacia en el tratamiento de la EM son desmielinización inducida por lisolecitina y encefaiomielitis alérgica experimental en roedores. Determinación de valores de CE50 de los agonistas de PPAR en el ensayo de PPAR delta celular Principio La potencia de las sustancias, que se unen al PPAR delta humano y lo activan en un modo agonista, se analiza usando una línea celular HEK transfectada estable (HEK= riñon embrionario humano) que aquí se denomina línea celular de indicador de PPAR delta. Contiene dos elementos genéticos, un elemento indicador de luciferasa (pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo) y una proteína de fusión de PPAR delta (GR-GAL4-PPAR delta humano-LBD), que media en la expresión del elemento indicador de luciferasa que depende de un ligando del PPAR delta. La proteína de fusión GR-GAL4-PPAR delta humano-LBD expresada constitutiva y establemente, se une en el núcleo celular de la línea celular de indicador de PPAR delta por la parte de la proteína GAL4 a los patrones de unión del ADN de GAL4, 5' corriente arriba del elemento indicador de luciferasa que es integrado establemente en el genoma de la línea celular. En ausencia de un ligando de PPAR delta sólo hay una expresión débil del gen indicador de luciferasa, si en el ensayo se usa suero de ternero fetal con reducción de ácidos grasos (cs-FCS). Los ligandos del PPAR delta se unen y activan la proteína de fusión de PPAR delta, y así estimulan la expresión del gen indicador de luciferasa. La luciferasa que se forma se puede detectar por quimiluminiscencia mediante un sustrato adecuado. Construcción de la línea celular de indicador de PPAR delta: La producción de la línea celular de indicador de PPAR delta estable se basa en un clon de células HEK estables que se transfectó establemente con un elemento indicador de luciferasa. Esta etapa ya fue descrita en la sección "construcción de la línea celular de indicador de PPAR alfa". En una segunda etapa, la proteína de fusión de PPAR delta (GR-GAL4-PPAR delta humano-LBD) se introdujo establemente en este clon celular. Para este propósito, el ADNc que codifica los 76 aminoácidos N-terminales del receptor de glucocorticoides (n° de acceso # P04150) se unió a la sección de ADNc que codifica los aminoácidos 1-147 del factor de transcripción de levadura GAL4 (n° de acceso # P04386). El ADNc del dominio de unión del ligando del receptor PPAR delta humano (aminoácidos S139-Y441 n° de acceso # L07592) se clonó en el extremo 3' de esta construcción GR-GAL4. La construcción de fusión preparada de esta forma (GR-GAL4-PPAR delta humano-LBD) se volvió a clonar en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen) con el fin de permitir la expresión constitutiva en él mediante el promotor de citomegalovirus. Este plásmido se linealizó con una endonucleasa de restricción y se transfectó establemente en el clon celular previamente descrito que contenía el elemento indicador de luciferasa. La línea celular del receptor PPAR delta acabada que contiene un elemento indicador de luciferasa y expresa constitutivamente la proteína de fusión de PPAR delta (GR-GAL4-PPAR delta- humano-LBD) se aisló por selección con zeocina (0,5 mg/ml) y G418 (0,5 mg/ml). Procedimiento de ensayo y evaluación: La actividad de los agonistas de PPAR delta se determina en un ensayo de 3 días, que se describe a continuación: Día 1 La línea celular de indicador de PPAR delta se cultiva hasta 80% de confluencia en DMEM (#° 41965-039, Invitrogen) que se mezcla con las siguientes adiciones: cs-FCS al 10% (suero de ternero fetal; #SH-30068.03, Hyclone), 0,5 mg/ml zeocina (#R250-01 , Invitrogen), 0,5 mg/ml G418 (#10131-027, Invitrogen), disolución al 1 % penicilina-estreptomicina (#15140-122, Invitrogen) y L-glutamina 2 mM (#25030-024, Invitrogen). El cultivo se lleva a cabo en botellas de cultivo celular patrón (# 353 12, Becton Dickinson) en un incubador de cultivo celular a 37°C en presencia de C02 al 5%. Las células 80% confluentes se lavan una vez con 15 mi de PBS (#14190-094, Invitrogen), se tratan con 3 mi de disolución de tripsina (#25300-054, Invitrogen) a 37°C durante 2 min, se absorben en 5 mi del DMEM descrito y se cuentan en un contador de células. Después de diluir a 500.000 células/ mi, se siembran 35.000 células en cada pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocilios con una base de plástico transparente (n° 3610, Corning Costar). Las placas se incuban en el incubador de cultivo celular a 37°C y con C02 al 5% durante 24 h. Día 2 Los agonistas de PPAR delta que se van a ensayar se disuelven en DMSO con una concentración 10 mM. Esta disolución madre se diluye en D E (#41965-039, Invitrogen) que se mezcla con 5% cs-FCS (#SH-30068.03, Hyclone), L-glutamina 2 mM (#25030-024, Invitrogen) y los antibióticos previamente descritos (zeocina, G418, penicilina y estreptomicina). Las sustancias de ensayo se ensayan con 11 concentraciones diferentes en el intervalo de 10 µ a 100 pM. Los compuestos más potentes se ensayan con concentraciones en el intervalo de 1 µ? a 10 pM o entre 100 nM y 1 pM. El medio de la línea de células con el indicador de PPAR delta sembrada el día 1 se elimina completamente por aspiración, y a las células se les añaden inmediatamente las sustancias de ensayo diluidas en medio. La dilución y adición de las sustancias se lleva a cabo mediante un robot (Beckman FX). El volumen final de las sustancias de ensayo diluidas en medio es 100 µ? por pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocilios. La concentración de DMSO en el ensayo es menor que 0,1 % en vol/vol con el fin de evitar efectos citotóxicos del disolvente. Cada placa se cargó con un agonista de PPAR delta patrón, que se diluyó igualmente en 11 concentraciones diferentes, con el fin de demostrar el funcionamiento del ensayo en cada placa individual. Las placas de ensayo se incuban en un incubador a 37°C y CO2 al 5% durante 24 h. Día 3 Las células con el indicador de PPAR delta tratadas con las sustancias de ensayo se sacan del incubador y se aspira el medio. Las células se lisan pipeteando 50 pl de reactivo Bright Glo (de Promega) en cada pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocilios. Después de incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, las placas de microvaloración se miden en el luminómetro (Trilux de Wallac). El tiempo de medición para cada pocilio de la placa de microvaloración es 1 segundo. Evaluación: Los datos sin procesar del luminómetro se transfieren a un fichero de Microsoft Excel. Se calculan las gráficas del efecto de la dosis y los valores CE50 de los agonistas del PPAR, usando el programa XL.Fit como especifica el fabricante (IDBS). Determinación de valores de CEsn de los agonistas de PPAR en el ensayo de PPAR alfa celular Principio La potencia de las sustancias, que se unen al PPAR alfa humano y lo activan en un modo agonista, se analiza usando una línea celular HEK transfectada estable (HEK= riñon embrionario humano) que aquí se denomina línea celular de indicador de PPAR alfa. Contiene dos elementos genéticos, un elemento indicador de luciferasa (pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo) y una proteína de fusión de PPAR alfa (GR-GAL4-PPAR alfa humano-LBD), que media en la expresión del elemento indicador de luciferasa que depende de un ligando del PPAR alfa. La proteína de fusión GR-GAL4-PPAR alfa humano-LBD expresada constitutiva y establemente, se une en el núcleo celular de la línea celular de indicador de PPAR alfa por la parte de la proteína GAL4 a los patrones de unión dei ADN de GAL4, 5' corriente arriba del elemento indicador de luciferasa que es integrado establemente en el genoma de la línea celular. En ausencia de un ligando de PPAR alfa sólo hay una expresión débil del gen indicador de luciferasa, si en el ensayo se usa suero de ternero fetal con reducción de ácidos grasos (cs-FCS). Los ligandos del PPAR alfa se unen y activan la proteína de fusión de PPAR delta, y así estimulan la expresión del gen indicador de luciferasa. La luciferasa que se forma se puede detectar por quimiluminiscencia mediante un sustrato adecuado. Construcción de la línea celular de indicador de PPAR alfa: La línea celular de indicador de PPAR alfa se preparó en dos etapas. Primero, se construyó el elemento indicador de luciferasa y se transfectó establemente en células HEK. Para este propósito, se clonaron cinco sitios de unión del factor de transcripción de levadura GAL4 (n° de acceso # AF264724) 5' corriente arriba de un promotor mínimo de MMTV de 68 pb de longitud (n° de acceso # V01 175). La sección promotora mínima de MMTV contiene una caja CCAAT y un elemento TATA con el fin de permitir una transcripción eficaz por la RNA-polimerasa II. La clonación y secuenciación de la construcción de GAL4-MMTV se produce de forma análoga a la descrita por Sambrook J. et. al. (Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Después se clonó el gen de Photinus pyralis (n° de acceso # M15077) 3' corriente abajo del elemento GAL4-MMTV. Después de la secuenciación, el elemento indicador de luciferasa que consistía en cinco sitios de unión de GAL4, promotor de MMTV y gen de luciferasa, se volvió a clonar en un plásmido que confiere resistencia a la zeocina con el fin de obtener el plásmido pdeltaM-GAL4-Luc-Zeo. Este vector se transfectó en células HEK de acuerdo con lo expuesto por Ausubel, F.M. et al. (Current protocols in molecular bioiogy, Vol. 1-3, John Wiley & Sons, Inc., 1995). Después se utilizó medio que contenía zeocina (0,5 mg/ml) para seleccionar un clon de célula estable adecuado que presentó muy poca expresión basal del gen de luciferasa. En una segunda etapa, la proteína de fusión de PPAR alfa (GR- GAL4-PPAR alfa humano-LBD) se introdujo establemente en el clon descrito. Para este propósito, inicialmente el ADNc que codifica los 76 aminoácidos N-terminales del receptor de glucocorticoides (n° de acceso # P04150) se unió a la sección de ADNc que codifica los aminoácidos 1-147 del factor de transcripción de levadura GAL4 (n° de acceso # P04386). El ADNc del dominio de unión del ligando del receptor PPAR alfa humano (aminoácidos S 67- Y468; n° de acceso # S74349) se clonó en el extremo 3' de esta construcción GR-GAL4. La construcción de fusión preparada de esta forma (GR-GAL4-PPAR alfa humano-LBD) se volvió a clonar en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen) con el fin de permitir la expresión constitutiva en él mediante el promotor de citomegalovirus. Este plásmido se linealizó con una endonucleasa de restricción y se transfectó establemente en el clon celular previamente descrito que contenía ei elemento indicador de luciferasa. La línea celular del receptor PPAR alfa acabada que contiene un elemento indicador de luciferasa y expresa constitutivamente la proteína de fusión de PPAR alfa (GR-GAL4-PPAR alfa-humano-LBD) se aisló por selección con zeocina (0,5 mg/ml) y G418 (0,5 mg/ml).

Procedimiento de ensayo: La actividad de los agonistas de PPAR alfa se determina en un ensayo de 3 días, que se describe a continuación: Día 1 La línea celular de indicador de PPAR alfa se cultiva hasta 80% de confluencia en DMEM (# 41965-039, Invitrogen) que se mezcla con las siguientes adiciones: cs-FCS al 10% (suero de ternero fetal; #SH-30068.03, Hyclone), 0,5 mg/ml zeocina (#R250-01 , Invitrogen), 0,5 mg/ml G418 (#10131-027, Invitrogen), disolución al 1 % penicilina-estreptomicina (#15140-122, Invitrogen) y L-glutamina 2 mM (#25030-024, Invitrogen). El cultivo se lleva a cabo en frascos de cultivo celular patrón (# 353112, Becton Dickinson) en un incubador de cultivo celular a 37°C en presencia de CO2 al 5%. Las células 80% confluentes se lavan una vez con 15 mi de PBS (#14190-094, Invitrogen), se tratan con 3 mi de disolución de tripsina (#25300-054, Invitrogen) a 37°C durante 2 min, se absorben en 5 mi del DMEM descrito y se cuentan en un contador de células. Después de diluir a 500.000 células/ mi, se siembran 35.000 células en cada pocilio de una placa de microvaloración de 96 pocilios con una base de plástico transparente (n° 3610, Corning Costar). Las placas se incuban en el incubador de cultivo celular a 37°C y con C02 al 5% durante 24 h. Día 2 Los agonistas de PPAR alfa que se van a ensayar se disuelven en DMSO con una concentración 10 mM. Esta disolución madre se diluye en DMEM (#41965-039, Invitrogen) que se mezcla con 5% cs-FCS (#SH-30068.03, Hyclone), L-glutamina 2 mM (#25030-024, Invitrogen) y los antibióticos previamente descritos (zeocina, G418, penicilina y estreptomicina). Las sustancias de ensayo se ensayan con 11 concentraciones diferentes en el intervalo de 10 µ? a 100 pM. Los compuestos más potentes se ensayan con concentraciones en el intervalo de 1 µ? a 10 pM o entre 100 nM y 1 pM. El medio de la línea de células con el indicador de PPAR alfa sembrada el día 1 se elimina completamente por aspiración, y a las células se les añaden inmediatamente las sustancias de ensayo diluidas en medio. La dilución y adición de las sustancias se lleva a cabo mediante un robot (Beckman FX). El volumen final de las sustancias de ensayo diluidas en medio es 100 pl por pocilio de una placa de rnicrovaloración de 96 pocilios. La concentración de DMSO en el ensayo es menor que 0,1 % en vol/vol con el fin de evitar efectos citotóxicos del disolvente. Cada placa se cargó con un agonista de PPAR alfa patrón, que se diluyó igualmente en 1 concentraciones diferentes, con el fin de demostrar el funcionamiento del ensayo en cada placa individual. Las placas de ensayo se incuban en un incubador a 37°C y C02 al 5% durante 24 h. Día 3 Las células con el indicador de PPAR alfa tratadas con las sustancias de ensayo se sacan del incubador y se aspira el medio. Las células se lisan pipeteando 50 pl de reactivo Bright Glo (de Promega) en cada pocilio de una placa de rnicrovaloración de 96 pocilios. Después de incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos, las placas de microvaloración se miden en el luminómetro (Trilux de Wallac). El tiempo de medición para cada pocilio de la placa de microvaloración es 1 segundo. Evaluación: Los datos sin procesar del luminómetro se transfieren a un fichero de Microsoft Excel. Se calculan las gráficas del efecto de la dosis y los valores CE50 de los agonistas del PPAR, usando el programa XL.Fit como especifica el fabricante (IDBS). Determinación de valores de CE50 de los agonistas de PPAR en el ensayo de PPAR gamma celular Protocolo de ensayo de PPAR gamma celular Para realizar los ensayos celulares se lleva a cabo un ensayo de luciferasa en placas de 96 pocilios de la siguiente manera: Día 1 : Preparación de las células en las placas: • Las células lavadas se desarrollan hasta 80-90% de confluencia una vez en PBS • Se las sumerge en tripsina durante 2 min • Se añaden 15 mi de medio de ensayo (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 5% FBS tratado con Dextrano/Carbón, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0,5 mg/ml Zeocina, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0,5mg/ml Geneticina, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1 % Penicilina/Estreptomicina, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; L- Glutamina 2 mM, Invitrogen, Cat.No. 25030-024; 7,5 g/ml Blasticidin S HCI, Invitrogen, Cat.No. R210-01 ; 1 Mg/ml Doxiciclina, Clontech, Cat.No. 8634-1) Se cuentan las células Se diluyen las células en medio de ensayo hasta 500.000 células/ml Se dispensan 100 µ? de suspensión celular por pocilio en placas Corning de fondo claro (se producen 50.000 células/pocilio) Se incuba durante 24 h a 37°C, 5% C02 Día 2: Administración de los compuestos de ensayo: Se disuelven los compuestos de ensayo en DIVISO para formar una disolución madre 10 mM Se diluye el compuesto hasta una concentración adecuada en el medio de ensayo (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 5% FBS tratado con Dextrano/Carbón, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0,5 mg/ml Zeocina, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0,5mg/ml Geneticina, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1 % Penicilina/Estreptomicina, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; L-Glutamina 2m , Invitrogen, Cat.No. 25030-024; 7,5 pg/ml Blasticidin S HCI, Invitrogen, Cat.No. R210-01 ; 1 Mg/ml Doxiciclina, Clontech, Cat.No. 8634-1) (El FCS regular hospeda ácidos grasos libres que interfieren con los dominios de unión del ligando del PPAR). Se aspira el medio (las células son bastante sensibles en esta etapa; es necesario asegurarse que las células no pasen más de 1 min sin estar cubiertas por el medio) • Se transfieren los compuestos a 96 pocilios (100 µ? de medio que incluye el compuesto) • Se efectúan los controles con el compuesto patrón (p. ej., Rosiglitazon) como también con un control DMSO (0,1 % DIVISO) • Las células se incuban durante 24 h a 37°C a C02 al 5%. Las etapas de dilución y adición de los compuestos diluidos se realizan usando un robot Beckman Biomek 2000 o Beckman FX robot. Día 3: Lisis celular y medición de la actividad de luciferasa: • Se aspira el medio de las células • Se congelan las placas a -20°C (opcional) » Se descongelan las placas durante 30 min (si es necesario) • Se añaden 50 µ? de Reactivo de Ensayo Bright-Glo-Luciferasa (Promega, Cat.No. E2650) • Se incuba durante 10 min en la oscuridad • Se mide la luminiscencia 2 seg por pocilio (Wallac Microbeta) Análisis de datos: La determinación de los valores de CE50 se realiza con Microsoft Exel combinado con XLFit (desarrollado por IDBS), usando el algoritmo de ajuste #205. Determinación de los valores de CE50 en el ensayo del receptor RXR humano celular Protocolo de ensayo de RXR celular Para realizar los ensayos celulares se lleva a cabo un ensayo de luciferasa en placas de 96 pocilios de la siguiente manera: Día 1 : Preparación de las células en las placas • Las células lavadas se desarrollan hasta 80-90% de confluencia una vez en PBS • Se las sumerge en tripsina durante 2 min • Se añaden 15 mi de medio de cultivo (DMEM, Invitrogen, Cat.No. 41965-039; 10% FBS tratado con Dextrano/Carbón, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0,5 mg/ml Zeocina, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0,5mg/ml Geneticina, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% Penicilina/Estreptomicina, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; L- Glutamina 2mM, Invitrogen, Cat.No. 25030-024) • Se cuentan las células • Se diluyen las células en medio de ensayo hasta 175.000 células/ml • Se dispensan 200 µ? de suspensión celular por pocilio en placas Corning de fondo claro (se producen 35.000 células/pocilio) • Se incuba durante 24 h a 37°C, 5% C02 Día 2: Administración de los compuestos de ensayo • Se disuelven los compuestos de ensayo en DMSO para formar una disolución madre 10 mM • Se diluye el compuesto hasta una concentración adecuada en el medio de ensayo (DMEM sin rojo fenol, Invitrogen, Cat.No. 21063- 029; 5% FBS tratado con Dextrano/Carbón, Hyclone, Cat.No. SH30068; 0,5 mg/ml Zeocina, Invitrogen, Cat.No. 46-0072; 0,5mg/ml Geneticina, Invitrogen, Cat.No. 10131-027; 1% Penicilina/Estreptomicina, Invitrogen, Cat.No. 15140-122; L-Glutamina 2m , Invitrogen, Cat.No. 25030-024) (El FCS regular hospeda ácidos grasos libres que interfieren con los dominios de unión del ligando del PPAR). • Se aspira el medio (las células son bastante sensibles en esta etapa; es necesario asegurarse que las células no pasen más de 1 min sin estar cubiertas por el medio) • Se transfieren los compuestos a 96 pocilios (100 pl de medio que incluye el compuesto) • Se efectúan los controles con el compuesto patrón (p. ej., RPR258134) como también con un control D SO (0,1 % DIVISO) • Las células se incuban durante 24 h a 37°C, CO2 al 5%. Las etapas de dilución y adición de los compuestos diluidos se realizan usando un robot Beckman Biomek 2000 o Beckman FX robot. Día 3: Lisis celular y medición de la actividad de lucíferasa • Se aspira el medio de las células • Se congelan las placas a -20°C (opcional) • Se descongelan las placas durante 30 min (si es necesario) • Se añaden 50 µ? de Reactivo de Ensayo Bright-Glo-Luciferasa (Promega, Cat.No. E2650) • Se incuba durante 10 min en la oscuridad • Se mide la luminiscencia 2 seg por pocilio (Wallac Microbeta) Análisis de datos La determinación de los valores de CE50 se realiza con Microsoft Exel combinado con XLFit (desarrollado por IDBS), usando el algoritmo de ajuste #205. La Tabla 1 muestra los resultados de los ensayos del indicador. Los resultados demuestran que los compuestos 1 y 2 son activadores selectivos de PPAR delta con baja actividad de PPAR alfa, gamma y RXR. Tabla 1 Ensayos de indicador *EI valor representa el incremento en veces en comparación con la actividad de luciferasa basal. 1Receptor X retinoideo Cultivos de oliqodendrocitos de RATAS/RATONES Preparación de las células: 1. Se obtienen oligodendrocitos primarios de rata, a través de la neocorteza de ratas o ratones recién nacidos (2-3 días después del nacimiento) y se enriquecen, después de la extirpación de las células microgliales, por separación mecánica de la monocapa astrocítica usando una modificación de la técnica originalmente descrita por McCarthy y de Vellis (1980). 2. Se extirpan las meninges del cerebro de rata neonatal y se disocia el tejido mecánicamente. Se disponen las células en placas con matraces T75 y se alimentan las células con DMEM/F12 + 10% FBS. 3. Se recogen los oligodendrocitos que se desarrollan en la capa del lecho de astrocitos por el método de agitación durante catorce días después de la fecha de prep original. Se centrifuga la suspensión y se resuspende el sedimento celular en medio libre de suero (SFM; DMEM combinado con 25 pg/ml transferencia, triyodotrionina 30 nM, hidrocortisona 20 nM, progesterona 20 nM, biotina 10 nM, 1x oligoelementos, selenio 30 nM, 1 pg/ml putrescina, 0,1 % BSA, 5 U/ml PenStrep, 10 pg/ml insulina) enriquecido con los siguientes factores de crecimiento: Factor de crecimiento: Factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF). 4. Se colocan las células en placas recubiertas con PDL y se incuban a 37°C con C02 al 6-7%. 5. Los componentes del medio se reemplazan cada 48 h para mantener las células en un estado progenitor.. Se realiza el pasaje de células progenitoras para aumentar la cantidad de células para los ensayos: 1. Cuando el cultivo es confluente, se enjuagua el cultivo con PBS, se añade tripsina y se incuba durante -2-3 min a 37°C. 2. Se neutraliza y centrifuga la suspensión celular a 900g durante 5 min. 3. Se resuspende el sedimento celular en SFM + PDGF/FGF. 4. Se alimentan las células con factores de crecimiento frescos cada 48 horas para mantener enriquecido a fin de dividir rápidamente las células progenitoras. 5. El pasaje de las células se realiza no más de 4-5 veces antes de los ensayos experimentales. 6. Todos los experimentos que incluyen células progenitoras de oligodendrocitos se llevaron a cabo usando células que se mantuvieron continuamente bajo estas condiciones. Más de 95% de todas las células fueron A2B5 inmunopositivas y expresaron 2' 3'-nucleótido cíclico 3' -fosfodiesterasa II mRNA. 7. Para generar oligodendrocitos maduros, 24 h después de disponerse en placas, las células progenitoras se pasaron a SFM enriquecido con o sin IGF-I y se desarrollaron bajo estas condiciones durante 7 días antes de los ensayos experimentales. 8. Alternativamente, se puede utilizar la línea celular progenitora Central Glia-4 (CG4) enriquecida de rata, que se mantiene en un medio base (DMEM, con glutamina 2 mM, piruvato sódico 1mM, biotina (40 nM), insulina (1 µ?) y N1 ) enriquecido con 30% medio condicionado a partir de la línea celular de neuroblastoma B-104. Para inducir la diferenciación, las células CG4 se pasan al medio base con 1 % de suero de ternero fetal (que se elimina después de 2 días) e insulina (500 nM).Se utiliza la inmunorreactividad de A2B5 y MBP para confirmar un enriquecimiento >95% en cultivos inmaduros y maduros, respectivamente. Tratamiento con el compuesto de cultivo de Rata/Ratón: 1. Se disponen 10.000 - 15.000 células /pocilio en placas de 24 pocilios recubiertas con PDL y se cultivan las células en presencia de mitógeno (10 ng/ml) durante toda la noche. 2. En presencia de mitógeno: a. Al día siguiente se elimina el medio usado y se añaden compuestos en medio nuevo (con mitógeno) b. Las evaluaciones de la dosis y el efecto del compuesto se llevaron a cabo con 6 concentraciones (10 µ?, 1 µ?, 100 nM, 10 nM, 1 nM y 0,1 nM); c. Se preparan pocilios por triplicado para cada concentración del compuesto. 3. En ausencia de mitógeno: a. Al día siguiente se elimina el medio usado y se añaden compuestos en medio nuevo (sin mitógeno) b. Las evaluaciones de la dosis y el efecto del compuesto se llevaron a cabo con 6 concentraciones (10 µ?, 1 µ?, 100 nM, 10 nM, 1 nM y 0,1 nM); c. Se preparan pocilios por triplicado para cada concentración del compuesto. 4. Se cultivan las células tratadas durante 7 días antes de usarse en los ensayos experimentales. Cultivos de oliqodendrocitos HUMANOS Preparación de las células: 1. Se cultivan neuroesferas humanas de corteza de embrión humano E19.5 - E22) durante 2 semanas en medio progenitor: DMEM/F12 que contiene 100 pg/ml transferencia, triyodotironina 30 nM, hidrocortisona 20 nM, progesterona 20 nM, biotina 10 nM, 1x oligoelementos, selenio 30 nM, putrescina 60 uM, 0,1 % BSA, 5 U/mi PenStrep, 25 pg/ml insulina) enriquecido con PDGF y FGF. 2. Las neuroesferas se disocian con 20 U/ml papaína a 37°C durante 30-50 min. 3. Las células se disponen en placas recubiertas con PDL a una densidad de 50.000-100.000 célula/pocilio en medio progenitor que contiene PDGF/FGF y se incuban a 37°C con CO2 al 5-6%. 4. El medio y los factores de crecimiento se vuelven a llenar cada 48 h. Tratamiento del compuesto de cultivo humano: 1. 24 a 48 h después de disponer en placas, se elimina el medio usado y se añaden compuestos en medio nuevo (con mitógeno) 2. Las evaluaciones de la dosis y el efecto del compuesto se llevaron a cabo con 3 -6 concentraciones diferentes (10 ^M, 1 µ?, 100 nM, 10 nM, 1 nM y 0,1 nM); 3. Se preparan pocilios por triplicado para cada concentración del compuesto. 5. Se cultivan las células tratadas durante 7 días antes de usarse en los ensayos experimentales. Inmunotinción específica de oliqodendrocitos de RATA/RATON/SERES HUMANOS: Después de la exposición del compuesto, se utilizan anticuerpos específicos de oligodendrocitos para evaluar la capacidad del compuesto para acelerar/promover la diferenciación de oligodendrocitos (por ejemplo, la inmunorreactividad de 04, 01 o proteína básica de mielina en tiempo entre el compuesto tratado y cultivos no tratados). 1. Las células se disponen en placas de 4 pocilios tratadas con poli-D-lisina a 5x103 hasta 20x103 células/pocilio y se inoculan tal como se describió anteriormente. Se realiza la tinción secuencial en las poblaciones de oligodendrocitos con grados en aumento de diferenciación celular, según lo determinado por los días in vitro sin PDGF y FGF. 2. . Se utiliza tinción in vivo durante 30 min a 370C para detectar la expresión del marcador de superficie celular específica de la etapa de oligodendrocitos (incluyendo A2B5, 04 y 01 ). 3. Posteriormente, las células se fijan con 4% paraformaldehído, 0 min a temperatura ambiente. 4. Se utilizan procedimientos de tinción fija para detectar la expresión del marcador específica de la etapa de oligodendrocitos (incluyendo proteína básica de mielina, MBP). 5. Se enjuaga con PBS. 6. Se permeabiliza con 0,1 % Triton/0,01 % NaAz diluido en 1X PBS durante 10 min a temperatura ambiente. 7. Se bloquea con 5-10% suero de cabra en tampón de dilución de anticuerpos (0,1 % Triton-X 100 y 1 % albúmina de suero bovino libre de lgG;también se utiliza para diluir anticuerpos), 15 min, temperatura ambiente. 8. Se añade anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpos. 9. Se incuba durante toda la noche, se agita moderadamente a 4o C. 10. Al día siguiente se enjuaga con PBS 1X 5 min y luego con 3X 15 min cada uno a temperatura ambiente. 11. Se incuba con anticuerpos secundarios adecuados durante 45 min a temperatura ambiente. 12. Los núcleos celulares se tiñen con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 15 min a temperatura ambiente. 13. Se enjuaga varias veces con PBS y se evalúa usando microscopía fluorescente. 14. Las siguientes condiciones se comparan en tiempo y en distintas dosis del compuesto: PDGF/FGF solo, SFM solo, SFM-IGF1 solo, PDGF/FGF y compuesto, SFM y compuesto. Inmunotinción con bromo desoxiuridina (BrdLI) en RATA/RATÓN/SER HUMANO: Para confirmar que los compuestos no promueven la proliferación I celular. 1. Se marcan células progenitoras de oligodendrocitos con 10 µ? BrdU durante 20 h y luego se fijan bien con etanol al 70% o con — -5 paraformaldehído al 4%. I 2. Las células se incuban sucesivamente con BrdU anti-ratón biotinilado y Estreptavidina-Peroxidasa, interrumpiendo con tres lavados de PBS. 3. La visualización colorimétrica de la inmunorreactividad de BrdU se desarrolla con DAB y se evalúan las cantidades de células totales usando 10 hematoxilina contra-tinción. I 4. Las células con BrdU inmunopositivas son contadas por dos : observadores independientes. Análisis de las imágenes de los cultivos de RATA/RATÓN/SERES — HUMANOS: Se emplea microscopía fluorescente para cuantificar el grado de ~ 15 diferenciación de oligodendrocitos después de la exposición al compuesto. Este I ensayo demuestra que los agonistas selectivos aceleran/promueven la diferenciación de oligodendrocitos. 1 . Recuento manual de células: Se seleccionan aleatoriamente cuatro campos para cada condición experimental y se cuentan 500-600 células en 20 cada campo. El porcentaje de células inmunopositivas MBP (u O4) (células con un I proceso de madurez con o sin láminas de mielina) frente a células positivas con DAPI (cantidad total de células) se compara entre el control y los grupos tratados con el fármaco. 2. Recuento automático de células: Se emplea microscopía fluorescente para cuantificar el grado de diferenciación de oligodendrocitos después de la exposición al compuesto. Se seleccionaron aleatoriamente seis campos/pocilio para evaluar la cantidad de oligodendrocitos de diferenciación entre la población total (se cuentan ~8 a 15x103 células/pocilio). Las imágenes de inmunofluorescencia se obtuvieron usando un sistema de imágenes digitales Zeiss AxioVision, con una cámara de CCD Zeiss AxioCam HRc enfriada conectada al mismo microscopio. Se ajustaron todos los parámetros de imágenes microscópicas para adquirir imágenes para el análisis de intensidad de la inmunofluorescencia celular. Se comparó el porcentaje de células BP positivas (diferenciadas) frente a las células totales (tinción nuclear DAPI) entre el control y los grupos tratados con el fármaco. La autofluorescencia celular no fue detectable bajo las condiciones de las imágenes. a) 3. Ensayo de diferenciación de oligodendrocitos humanos: cantidad total con recuento manual de células inmunopositivas 04/pocillo (bipolar y multipolar). Los resultados del uso de cultivos de oligodendrocitos de rata se muestran en la figura 1 y los resultados del uso de cultivos mixtos de oligodendrocitos humanos se muestran en las Figuras 5 y 6. Tal como lo indican los resultados, los agonistas del PPAR delta aumentan o aceleran la diferenciación de oligodendrocitos de ratas y seres humanos, según lo medido por el aumento de la expresión de proteína básica de mielina en comparación con los controles no tratados. Este nuevo hallazgo sugeriría que el compuesto 1 y el compuesto 2 y los agonistas selectivos de PPAR delta en general aumentarían, acelerarían o estimularían la diferenciación de oligodendrocitos y la formación de mielina ¡n vivo, en el SNC enfermo o dañado, incluyendo la EM y otras enfermedades de desmielinización. Reacción en cadena por la polimerasa (PCR) cuantitativa en RATA/RATÓN/SER HUMANO: Para evaluar la activación de la vía de PPAR delta inducida por el compuesto y el grado de maduración de los oligodendrocitos (cambios en los niveles de ARNm). 1 . Se extrae ARN total de oligodendrocitos cultivados usando el reactivo TriZol. 2. Posteriormente, se trata el ARNm con DNasa libre de RNasa, se repurifica y luego se convierte al molde de ADNc usando una reacción RT (Clontech Advantage RT para Kit de PCR). 3. La expresión de transcripción de miembros de la vía de PPAR delta se cuantifica usando Sybr Green PCR Master Mix. 4. Se utiliza la mezcla de cebador de 18S ribosómico/sonda (producto 186 bp), suspendida en Taqman 2X PCR Master Mix como control interno. 5. Se lleva a cabo la PCR cuantitativa usando tecnología en tiempo real Taqman® (Gibson, et al., 1996) con un Sistema Detector de Secuencias modelo 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). 6. Los resultados se analizan usando los Sistemas de Detección de Secuencias, versión de software 1.91. Los resultados para estos ensayos se muestran en las Figuras 2, 3, 4A y 4B. Estos resultados sugieren que los agonistas selectivos del PPAR delta se unen al receptor PPAR delta y activan directamente la vía de PPAR delta en oligodendrocitos, y deberían actuar de modo similar ¡n vivo. Ensayo ELISA en RATAS: Para evaluar la activación de la vía de PPAR delta inducida por el compuesto y el grado de maduración de los oligodendrocitos (cambios en los niveles de proteínas). 1. Se lavan las placas con PBS y luego se mantienen en hielo. Se añaden 200 µ\ de tampón de lisis usado (Tris 50mM, pH7,4, MgCI2 2m , EDTA 1mM, /?-mercaptoetanol 5mM, Nonidet P-40 1 %, cóctel inhibidor de proteasa (Roche): 1 comprimido /50 mi) a cada pocilio. 2. Se lisan las células usando una pipeta y se centrifugan las placas a 2000 rpm a 4°C durante 5 min. El sobrenadante está listo para usar. 3. Se introducen con pipeta 50 µ\ de controles y muestras patrón a los pocilios. 4. Se añaden 50 µ\ de Tampón de Ensayo MBP a cada pocilio. 5. Se incuba el pocilio, agitando a 500-700 rpm en un agitador de microplacas orbital durante 2 h a temperatura ambiente. 6. Se añaden 100 µ? de Conjugado de Biotina-Anticuerpo MBP a cada pocilio. 7. Se incuba el pocilio, agitando a 500-700 rpm en un agitador de microplacas orbital durante 1 h a temperatura ambiente. 8. Se lava 5 veces con Disolución de Lavado. Se seca invirtiendo la placa en material absorbente. 9. Se diluye el conjugado de estreptavidina-enzima a una concentración de 1 :50 con tampón de ensayo Elisa BP. (se debe diluir inmediatamente antes de usarse para el ensayo. 10. Se añaden 100 µ\ de disoluciones con conjugado de estreptavidina-enzima a cada pocilio. 11. Se incuba el pocilio, agitando a 500-700 rpm en un agitador de microplacas orbital durante 30 h a temperatura ambiente. 12. Se lava 5 veces con Disolución de Lavado. Se seca invirtiendo la placa en material absorbente. 13. Se añaden 100 µ\ de Disolución TMB Chromogen a cada pocilio.. 14. Se incuba el pocilio, agitando a 500-700 rpm en un agitador de microplacas orbital durante 10 - 20 min a temperatura ambiente. Se evita la exposición a la luz solar directa. 15. Se añaden 100 µ\ de Disolución Stopping a cada pocilio. 16. Se lee la absorbancia de la disolución en los pocilios dentro de los 30 min, usando una lectora de microplacas ajustada a 450 n . Los resultados anteriormente expuestos tomados en general y exhibidos en las Figuras 1-6 ilustran que los agonistas de PPAR delta promueven la diferenciación de oligodendrocitos incluso en presencia de mitógenos, que normalmente mantienen las células mitóticamente activas e inhiben la diferenciación celular. Por lo tanto, se espera que en el SNC dañado o enfermo, los agonistas selectivos del PPAR delta provoquen que las células progenitoras de oligodendrocitos expresen proteínas de mielina y envainen axones desmielinizados o hipomielinizados. Prueba ¡n vivo de los modelos conceptuales Lesiones focales: (se utilizan para evaluar si los compuestos protegen la integridad de la mielina o aceleran/aumentan el índice de remieiinización). 1. A ratas de 7 semanas de vida se les provee acceso ilimitado a agua y alimento, y se las aclimata durante un mínimo de 4 días antes de ser usadas en los experimentos. 2. Antes de la cirugía se pesa a cada animal. La rata luego se anestesia con cetamina (100 mg/ml) combinada con xilazina (20 mg/ml) en una relación de 1 ,8: 1. A las ratas se les inyecta 0,15 ml/180 g peso corporal i.p. de la disolución anestésica antes del procedimiento quirúrgico. Se prepara al animal para la cirugía usando condiciones asépticas de acuerdo con las pautas IACUC. Todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave. El pelo se recoge con una grapa entre de las orejas y esta región se frota con Betadina, se lava con disolución salina estéril y finalmente se frota con un hisopo estéril embebido en alcohol. 3. Para el procedimiento quirúrgico, la rata se dispone en su superficie vental en un instrumento estereotáxico para animales diseñado para sostener firme la cabeza. La barra de incisión está siempre regulada a -3,9 mm, ya que se ha demostrado que así se logra una posición plana del cráneo en ratas SD. 4. Se realiza una incisión en la piel previamente rasurada que cubre el cráneo entre las orejas. 5. Se perfora una pequeña área de hueso (0,75 mm de diámetro) en las coordenadas AP -1 ,8, ML -3,1 de lambda. 6. Se extrae el hueso, y a las ratas se les inyectan 2 *l de bromuro de etidio, lisolecitina o SIN-1 en el pedúnculo cerebeloso caudal derecho, DV -7,1 mm, durante un período de 2 min mediante jeringa y aguja µ\ Hamilton. Alternativamente, las inyecciones se aplican en la médula espinal, el cuerpo calloso o la corteza. 7. Se deja allí la aguja durante los 2 min. subsiguientes. 8. Después de retirar la aguja, se sutura la incisión. 9. Cada rata recibe una inyección i.m. de 0,003 mg de buprenorfina en una de las patas traseras. 10. Se dispone a la rata en un armario de calentamiento hasta que vuelve en sí. En ese momento, se la transfiere nuevamente a su jaula. No se permiten más de 2 ratas por jaula, ya que se quitarán las suturas entre sí. . Se realizan procedimientos similares usando ratones. Modelo de encefalomieiitis alérgica experimental (EAE)en la rata: a encefalomieiitis alérgica experimental (EAE) es una enfermedad autoinmunitaria mediada por las células T del sistema nervioso central que se desarrolla en animales susceptibles después de la sensibilización, sea con homogeneizados de la médula espinal total o solo un componente de ésta (proteína básica de mielina). El modelo de roedor de EAE es una herramienta apropiada para estudiar la inflamación del cerebro y la médula espinal, que se observa en pacientes con EM. En roedores, la inyección de la médula espinal total o algunos componentes de la médula espinal, tales como la proteína básica de mielina, induce una respuesta autoinmunitaria que se basa en la activación de los linfocitos T. La enfermedad clínica típicamente se manifiesta alrededor del día 8- 10 después de la inoculación, y se observa como un amplio espectro de anomalías del comportamiento que van desde una alteración leve en la marcha o atonía del rabo hasta parálisis completa y muerte. Típicamente, se produce una pérdida de peso. En los animales que sobreviven se produce una recuperación espontánea, acompañada de la recuperación variable de la mayor parte de la función motora. Dependiendo de la especie, el alérgeno y la metodología que se utilice, los animales ensayados por el modelo EAE podrán experimentar un solo ataque (EAE aguda) o diversos ataques (EAE crónica con recidiva). Se pueden utilizar diversos paradigmas de tratamiento: el fármaco o el tratamiento de elección se puede administrar antes de la inmunización, durante el período asintomático o durante la enfermedad clínica. Animales: Ratas Lewis hembra, 160-220g (Charles River) Antígeno: Médula espinal de cobaya entera (Harían Biosciences). Adyuvante de Freund completo H37 Ra [1 mg/ml Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra] (Difco). Antígeno adicional: ycobacteríum Tuberculosis (Difco). Bordeteila Pertussis [exterminado por calor] (Difco). Preparación de antígenos: (para aproximadamente 720 animales): 1 . Se pesan 5 gramos de médula espinal congelada de cobaya. 2. Se añaden 5g de médula espinal a 5 mi de disolución salina al 0,9% (1 g/ml) en un tubo centrífugo de fondo redondo 3. Se homogeneiza en hielo con Tissue-tech hasta que el tejido se rompe por completo (aproximadamente 5 minutos). 4. Se añaden 10 mi de adyuvante de Freund completo H37 Ra enriquecido con 200 mg de Mycobacterium Tuberculosis (20 mg / mi adyuvante de Freund completo H37 Ra). 5. Se extrae el homogeneizado / adyuvante del tubo aspirándolo con una jeringa de 10 mi equipada con una aguja emulsionante de 18 gauge. 6. Se emulsiona entre dos jeringas de vidrio de 30 mi hasta que se torna difícil continuar pasando el material a través de la aguja. (Aproximadamente 5 minutos {no debe haber separación entre la fase oleosa y la fase acuosa}). 7. Se usa de inmediato o se conserva en hielo hasta que se usa (no más de 30 mín) (no congelar). Protocolo 1 . A ratas Lewis hembra (Charles River) se les provee acceso ilimitado a alimento y agua, y se las aclimata durante un mínimo de 3 días antes de usarse en los experimentos. 2. A las ratas que pesan 160 y 220 gramos se las induce iniciaimente con isoflurano al 5% (Aerrane, Fort Dodge), 02 al 30%, N2O al 70% durante 2-5 minutos. 3. La rata se dispone luego en una manta de calentamiento con agua circulante (Gaymar) (superficie dorsal hacia arriba) y se le coloca un cono nasal para respiración espontánea de gases anestésicos. El isoflurano se reduce ai 2%. 4. Se aplican dos inyecciones subcutáneas (0,1 mi cada una) bien de antígeno o de disolución salina normal en la superficie ventral de las garras traseras. 5. Se les retira el cono nasal, se pesan y se numeran. 6. Se permite que las ratas despierten de la anestesia y se disponen en jaulas individuales. 7. Los animales son observados diariamente para detectar signos de inducción de EAE (véanse criterios a continuación) ETAPA: 0 NORMAL ETAPA: 1 Marcha anormal y atonía del rabo ETAPA: 2 Debilidad leve pero concreta de una o ambas patas traseras ETAPA: 3 Debilidad intensa de una o ambas patas traseras o ataxia leve ETAPA: 4 Paraparesia intensa y movimientos mínimos de las patas traseras ETAPA: 5 Ningún movimiento de las patas traseras y paraplegia ETAPA: 6 Estado moribundo sin movimiento espontáneo y dificultad respiratoria. También puede haber un grado en aumento de la implicación de la pata delantera e incontinencia urinaria y fecal ETAPA: 7 MUERTE El tratamiento comienza en el día 10 después de la inmunización. Ya que los síntomas de enfermedad en este modelo típicamente aparecen en los días 10-11 después de la inoculación, se puede considerar que este punto de tiempo representa la fase inicial de un episodio agudo de EM. Se juzga que esta demora en el inicio del tratamiento ¡mita la situación clínica más precisamente que los protocolos tradicionalmente utilizados en los que los fármacos se administran al momento de la inoculación o incluso antes (Teitelbaum D. et al., Proc Nati Acad Sci USA 1999;96: 3842-3847 y Brod S. A., et al., Ann Neurol 2000; 47: 127-131).

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para tratar enfermedades de desmielinización en un paciente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista de hPPAR delta.

2. - El método según la reivindicación 1 , en el que el agonista de hPPAR delta es un agonista selectivo.

3. - El método según la reivindicación 1 , en el que la enfermedad de desmielinización se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de C arcot- arie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia, síndrome de Guillian-Barre y trastornos en los que están dañadas las células gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la médula espinal, neuropatías y lesiones nerviosas.

4. - El método según la reivindicación 3, en el que la enfermedad de desmielinización es la esclerosis múltiple.

5. - El método según la reivindicación 1 , en el que el agonista se selecciona del grupo que consiste en el compuesto de fórmula (1 ) y fórmula (2) (1 ) (2)

6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en el compuesto de fórmula (1 ) y fórmula (2) en una cantidad eficaz para tratar la esclerosis múltiple, enfermedad de Charcot- arie-Tooth, enfermedad de Pelizaeus- erzbacher, encefalomielitis, neuromielitis óptica, adrenoleucodistrofia, síndrome de Guillian-Barre y trastornos en los que están dañadas las células gliales formadoras de mielina, incluyendo lesiones de la médula espinal, neuropatías y lesiones nerviosas, en combinación con por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable (2)·

7. La composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende una cantidad eficaz para tratar la esclerosis múltiple.