CN1946420B

CN1946420B - 利用蛋白质进行针对脑膜炎球菌血清群y的免疫

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Publication number: CN1946420B
Application number: CN2005800127317A
Authority: CN
Inventors: M·肯托尼; M·朱利亚尼; M·皮扎
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2025-04-22
Also published as: MXPA06012041A; WO2005102384A2; JP2011105777A; JP4918479B2; CY1114179T1; GB0408977D0; JP2007533729A; EP1737486B2; WO2005102384A3; US20100143418A1; AU2005235265A1; RU2006140958A; RU2378009C2; PT1737486E; US10195264B2; BRPI0510104A8; EP1737486A2; ES2401481T5; BRPI0510104A; CA2566509C

Abstract

有关脑膜炎球菌的已有观念是抗血清群A、C、W135和Y的免疫应该基于四种不同的夹膜多糖，而抗血清群B的免疫不应该基于夹膜多糖。与此不同的是，本发明利用多肽抗原和/或OMV进行抗血清群A、C、W135和Y(特别是抗血清群Y)的免疫。血清群B多肽也可以产生这种保护作用，因此一种多肽疫苗就可用于诱导产生抗所有血清群A、B、C、W13和Y的保护作用。

Description

利用蛋白质进行针对脑膜炎球菌血清群Y的免疫

本文所引用的所有文献都已完整纳入本文作为参考。

技术领域

本发明属于免疫学和疫苗学领域。更具体地说，本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎球菌)来源的抗原及其在免疫接种中的应用。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)是一种不动的革兰氏阴性人类致病菌，寄生在咽部，可导致脑膜炎(偶尔在无脑膜炎的情况下也会导致败血病)。它既可以引起地方病，也可以引起流行病。在引入了抗流感嗜血杆菌的组合疫苗以后，脑膜炎奈瑟氏球菌在美国就成了细菌性脑膜炎的主要致病菌。

根据微生物的夹膜多糖确定了脑膜炎奈瑟氏球菌的不同血清群。血清群A是撒哈拉以南非洲地区流行病的主要致病原。血清群B和C是美国和大多数发达国家的主要致病原。血清群W135和Y是美国和发达国家其他病例的主要致病原。在确定血清群后，进一步的分类包括血清型、血清亚型和免疫型，标准术语表为血清群、血清型、血清亚型和免疫型，其中由冒号分开，如B：4：P1.15：L3，7，9。在血清群B内，某些谱系常常可引起疾病(超侵袭性的)，某些谱系所导致的疾病比其他谱系更严重(超毒力的)，而另外一些谱系却根本不致病。现在已知有7种具有超毒力的谱系，分别是亚群I、II、III和IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇和谱系3。这些谱系已通过多位点酶电泳(MLEE)方法确定，但是也可以用多位点序列分型(MLST)方法对脑膜炎球菌进行分类[参考文献1]。

目前，抗血清群A、C、W135和Y的疫苗以其夹膜多糖为抗原。一种获准上市的抗这4种血清群的人多糖疫苗已被使用许多年[2，3]。最近的研究热点依然集中在糖上，但是这些糖一般都会连接上载体蛋白。抗血清群C的组合疫苗已被批准用于人类，其中包括Menjugate^TM[4]、Meningitec^TM和Neis Vac-C^TM。来自于血清群A+C的组合疫苗混合物已为大家所了解[5，6]，来自于血清群A+C+W135+Y的组合疫苗混合物也有报道[7-10]。

来自于血清群B的夹膜多糖不能用作疫苗，因为它是人类的自身抗原。有人报道了经化学修饰的血清群B多糖[11]，但是还没有用于临床。也有人试验过基于外膜囊泡的疫苗[参见参考文献34]，但是这些疫苗所形成的保护作用一般只限于用于制备疫苗所用的株。血清群A[12]和B[13，14]的基因组序列已被报道出来，其中血清群B的序列已被用于鉴定疫苗抗原[如参考文献15-20]。有人对候选抗原进行了改造以提高其异源表达的能力[参考文献21-23]。

对于脑膜炎球菌来说，已有的观念就是抗血清群A、C、W135和Y的免疫基于四种不同的夹膜多糖，而抗血清群B的免疫基础不在夹膜多糖。

发明概述

与这个观念所不同的是，本发明的发明人发现，抗血清群A、C、W135和Y的免疫(特别是抗血清群Y的免疫)可以通过使用多肽抗原来实现。而且，他们还发现血清群B多肽可以形成这种保护作用，因而单纯使用多肽疫苗就可以形成抗血清群A、B、C、W135和Y的保护作用。

因此，本发明提供了免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的方法，该方法包括给予受试者包含一种或多种免疫原性多肽的组合物。同样，本发明还提供了一种或多种免疫原性多肽在制造用于免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的药物中的应用。

本发明还提供了免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的方法，该方法包括给予受试者包含脑膜炎球菌OMV的组合物。同样，本发明还提供了脑膜炎球菌OMV在制造用于免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的药物中的应用。

本发明的方法及用途优选用于免疫受试者，使其能够抵抗血清群Y以及血清群A、B、C和W135中至少一种的感染。其中的受试者被免疫使其能够抵抗给定的脑膜炎球菌血清群的感染，组合物最好不包含来自该血清群的夹膜多糖(组合的或非组合的疫苗)。因此，优选的组合物不包含来自血清群Y的夹膜多糖，也可以不包含来自于血清群A、B、C和/或W135的一种夹膜多糖。

用于本发明的组合物可利用已知的技术制备，如参考文献15-24所描述的制备脑膜炎球菌多肽抗原的技术，或者参考文献34-38所描述的制备OMV的已知技术。纯化的多肽抗原优选外膜囊泡。

抗致病原体如乙型肝炎病毒、白喉和破伤风的疫苗一般包含单一的蛋白抗原(如HBV表面抗原或破伤风毒素)。而百日咳疫苗一般包含至少三种百日咳蛋白，Prevenar^TM肺炎球菌疫苗包含7种不同的结合多糖抗原。其他疫苗如细胞性百白二联疫苗、麻疹活疫苗、灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)以及脑膜炎球菌OMV疫苗都是其大量抗原的天然混合物。单一抗原、几种特定抗原或非特定抗原的混合物是否能激发保护作用取决于多种因素。

免疫原性多肽

在某些实施方式中，本发明包括给予受试者至少一种免疫原性多肽以提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保护作用。一般来说，这些免疫原性多肽包含脑膜炎球菌的氨基酸序列，如血清群B株所具有的氨基酸序列，例如已测序的MC58株[13]。

有几种特定的抗原可以使用。由于不是包含单一抗原，因此，本发明的组合物优选包含10种或更少(如9、8、7、6、5、4、3、2)纯化抗原的混合物，更优选的是组合物不包含复合物或非特定抗原的混合物，如组合物中最好不包含外膜囊泡。

优选用于本发明的免疫原性多肽是参考文献24所描述的那些：(1)“NadA”蛋白；(2)“741”蛋白；(3)“936”蛋白；(4)“953”蛋白；以及(5)“287”蛋白。这些蛋白在本文中被称为“5种基本抗原”。本发明使用这些抗原中的1、2、3、4种或全部5种。

NadA蛋白

脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B来源的“NadA”(奈瑟菌粘附素A)在参考文献17中被称为蛋白“961”(SEQ IDs 2943&2944)，在参考文献13中被称为“NMB1994”(参见GenBank登录号：11352904&7227256)。有关该蛋白的详细描述见于参考文献25。在血清群A的基因组中无相应的蛋白[12，25]，但NadA⁺血清群A株曾被报道过[25]。

按照本发明的描述被使用时，NadA可有不同的形式。NadA的优选形式是截短的或缺失的变体，如参考文献21到23所描述的那些形式。更特殊的是，无C端膜锚定蛋白的NadA是优选的(如，对于2996株来说，缺失残基351-405[SEQ ID NO：1])，在本文中有时用“C”上标来加以区分，如NadA^(C)。无膜锚定区的NadA(如SEQ IDNO：1)在大肠杆菌内表达可导致蛋白分泌到培养物上清中，同时其23聚的前导肽被去除(如，对于2996株来说，剩下的是一个327聚的多肽[SEQ ID NO：2])。无前导肽的多肽在本文中有时用“NL”上标来加以区分，如NadA^(NL)或NadA^(C)(NL)。

优选的NadA序列与SEQ ID NO：2具有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)序列一致性。这包括NadA变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变株等)。NadA的等位基因形式描述于参考文献26的图9中。

其他优选的NadA序列包含SEQ ID NO：1的至少n个连续氨基酸，其中的n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的片段包含NadA来源的表位。其他的优选片段缺失SEQ ID NO：1C端和/或N端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)(如NadA^(C)，NadA^(NL)，NadA^(C)(NL))。如果是N端残基缺失，那么这种缺失最好不会导致NadA失去黏附到人上皮细胞上的能力。SEQ ID NO：1的优选片段是SEQ ID NO：2。

NadA优选以低聚物的形式使用(如以三聚物的形式)。

741蛋白

来自于血清群B的“741”蛋白描述于参考文献17中(SEQ IDs 2535&2536)，在参考文献13中标记为“NMB1870”(参见GenBank登录号GI：7227128)。血清群A的相应蛋白[12]在GenBank中的登录号为7379322。天然的741是脂蛋白。

按照本发明的描述被使用时，741可有不同的形式。741的优选形式是截短的或缺失的变体，如参考文献21到23所描述的那些形式。更特殊的是，741的N端可以被删除直到并包含其聚甘氨酸序列(即，对于MC58株来说是删除残基1到72[SEQID NO：3])，在本文中有时用“ΔG”前缀加以区分。这种删除可增强其表达能力。删除还可以去除741的脂化位点。

优选的741序列与SEQ ID NO：3具有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)序列一致性。这包括741变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变株等)。741的等位基因形式可见于参考文献23的SEQ IDs1-22以及参考文献27的SEQ IDs 1-23和123-141。参考文献28的SEQ IDs 1-299给出了741的其他序列。

其他优选的741序列包含SEQ ID NO：3的至少n个连续氨基酸，其中的n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的片段包含741来源的表位。其他的优选片段缺失SEQ ID NO：3C端和/或N端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。

蛋白741是十分有效的激发抗脑膜炎球菌抗体反应的抗原，在几乎所有的脑膜炎球菌血清群中都表达。系统进化分析表明该蛋白进化分裂成两组，其中一组再次分裂共形成三种变体[29]，一种给定变体的的抗血清在同一个变体群内具有抗菌性，而对于表达其他两种变体之一的菌株没有活性，即具有变体内交叉保护，但没有变体间交叉保护。为了使株间交叉保护效应达到最大化，优选的组合物应当包含蛋白741的不止一种变体。在本文中每种变体的典型序列分别被命名为SEQ ID NOs：10、11和12，其N端以半胱氨酸为起点，脂质共价结合到该氨基酸上形成741的脂蛋白形式。

因而，优选的组合物应当包含如下蛋白中的至少两个：(1)第一蛋白，包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：10至少有a％的序列一致性和/或包含的氨基酸序列由SEQ IDNO：10的至少x个连续氨基酸组成的片段组成；(2)第二蛋白，包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：11至少有b％的序列一致性和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO：11的至少y个连续氨基酸组成的片段组成；以及(3)第三蛋白，包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：12至少有c％的序列一致性和/或包含的氨基酸序列由SEQ ID NO：12的至少z个连续氨基酸组成的片段组成.

a的值至少是85，如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更大。b的值至少是85，如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更大。c的值至少是85，如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更大。a、b、c的值彼此无内在联系。

x的值至少是7，如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y的值至少是7，如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z的值至少是7，如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值彼此无内在联系。

对于任何一个给定的741氨基酸序列来说，优选的是不会落入范畴(1)、(2)、(3)中的不止一个范畴。因此，任何给定的741序列都会只属于范畴(1)、(2)、(3)中的一个范畴。因此优选的是：蛋白(1)与蛋白(2)的序列一致性低于i％；蛋白(1)与蛋白(3)的序列一致性低于j％；以及蛋白(2)与蛋白(3)的序列一致性低于k％。i的值是60或更大(如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)，最大是a。j的值是60或更大(如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)，最大是b。k的值是60或更大(如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等)，最大是c。i、j和k的值彼此无联系。

936蛋白

来自于血清群B的“936”蛋白描述于参考文献17中(SEQ IDs 2883&2884)，在参考文献13中标记为“NMB2091”(参见GenBank登录号GI：7227353)。血清群A的相应基因[12]在GenBank中的登录号为7379093。

按照本发明的描述被使用时，936可有不同的形式。936的优选形式是截短的或缺失的变体，如参考文献21到23所描述的那些形式。更特殊的是，936的N端前导肽可以是缺失的(即，对于MC58株来说删除残基1到23[SEQ ID NO：4])，被称为936^(NL)。

优选的936序列与SEQ ID NO：4具有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)序列一致性。这包括变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变株等)。其他优选的936序列包含SEQ ID NO：4的至少n个连续氨基酸，其中的n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的片段包含936来源的表位。其他的优选片段缺失SEQ ID NO：4C端和/或N端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。

953蛋白

来自于血清群B的“953”蛋白描述于参考文献17中(SEQ IDs 2917&2918)，在参考文献13中标记为“NMB1030”(参见GenBank登录号GI：7226269)。血清群A的相应基因[12]在GenBank中的登录号为7380108。

按照本发明的描述被使用时，953蛋白可有不同的形式。953的优选形式是截短的或缺失的变体，如参考文献21到23所描述的那些形式。更特殊的是，953的N端前导肽可以是缺失的(即，对于MC58株来说删除残基1到19[SEQ ID NO：5])，被称为953^(NL)。

优选的953序列与SEQ ID NO：5具有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)序列一致性。这包括953变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变株等)。953的等位基因形式参见参考文献19的图19。

其他优选的953序列包含SEQ ID NO：5的至少n个连续氨基酸，其中的n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的片段包含953来源的表位。其他的优选片段缺失SEQ ID NO：5C端和/或N端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。

287蛋白

来自于血清群B的“287”蛋白描述于参考文献17中(SEQ IDs 3103&3104)，在参考文献13中标记为“NMB2132”，在参考文献20中被标记为“GNA2132”(参见GenBank登录号GI：7227388)。血清群A的相应基因[12]在GenBank中的登录号为7379057。

按照本发明的描述被使用时，287蛋白可有不同的形式。287的优选形式是截短的或缺失的变体，如参考文献21到23所描述的那些形式。更特殊的是，287的N端可以被删除直到并包含其聚甘氨酸序列(即，对于MC58株来说是删除残基1到24[SEQ ID NO：6])，在本文中有时用“ΔG”前缀加以区分。这种删除可增强其表达能力。

优选的287序列与SEQ ID NO：6具有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)序列一致性。这包括287变体(如等位基因变体、同源物、直向同源物、横向同源物、突变株等)。287的等位基因形式参见参考文献19的图5和图15，以及参考文献17的实施例13和图21。

其他优选的287序列包含SEQ ID NO：6的至少n个连续氨基酸，其中的n是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。优选的片段包含287来源的表位。其他的优选片段缺失SEQ ID NO：6C端和/或N端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)。

融合蛋白

五种抗原可以五种独立多肽的形式存在于组合物中，但是优选的是至少有两种抗原作为一个多肽链表达(“杂合”蛋白[参考文献21-24])，这样五种抗原所形成的多肽数目就会少于5个。杂合蛋白主要有两个优点：第一，自身无法稳定表达或表达水平较低的蛋白可以通过连接上一个合适的杂合伴侣而使这一问题得到解决；第二，产品的商业化制备过程得以简化，因为只需要进行一次表达和纯化就可以得到两种有用的蛋白质。

本发明的组合物中所包含的杂合蛋白可包含五种基本抗原中的两个或多个(即2、3、4或5)。优选的杂合抗原由五种基本抗原中的两种组成。

在五种基本抗原的组合中，一种抗原可以存在于不止一个杂合蛋白内，和/或作为非杂合蛋白而存在。但是优选的是，抗原作为杂合蛋白或非杂合蛋白而存在，或者二者都不是，虽然以杂合抗原和非杂合抗原(优选脂蛋白)形式存在的蛋白质741被包含在其中可能是有益的，特别是在使用多个741变体时。

用于本发明的双抗原杂合体包括：NadA&741；NadA&936；NadA&953；NadA&287；741&936；741&953；741&287；936&953；936&287；953&287。优选的双抗原杂合体包括：741&936；953&287。对其进一步的详细描述见参考文献24。

杂合蛋白可用分子式NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH代表，其中的X是五种基本抗原之一的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N端氨基酸序列；B是可选的C端氨基酸序列；n是2、3、4或5。

如果-X-基团在其野生型蛋白中存在前导肽序列，那么在杂合蛋白中可保留或删除。在某些实施方式中，除非-X-基团的前导肽序列位于杂合蛋白的N端，否则该前导肽都将被删除，即，X₁的前导肽将被保留，但是X₂...X_n的前导肽将被删除。这与删除所有的前导肽并且只利用X₁的前导肽作为基团-A-相同。

在[-X-L-]的n被赋予不同的值时，接头氨基酸序列-L-可以存在，也可以不存在。例如，当n＝2时，杂合体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等，接头氨基酸序列-L-一般比较短(如20个氨基酸或更少，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。典型的接头包括有利于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即，包含Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、以及组氨酸标记(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多))。其他合适的接头氨基酸序列都是本领域技术人员所熟知的。一种有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：9)，该序列含有一个由BamHI限制性酶切位点形成的Gly-Ser二肽，这样就有助于克隆和操作，其中的(Gly)₄四肽是典型的聚甘氨酸接头。如果X_n+1是ΔG蛋白，L_n是甘氨酸接头，这与X_n+1不是ΔG蛋白、L_n不存在等价。

-A-是可选的N端氨基酸序列。这个序列一般较短(如40个氨基酸或更少，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。典型的例子包括引导蛋白定位的前导序列或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标记，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其他合适的N端氨基酸序列都是本领域技术人员所熟知的。如果X1缺少其自身的N端甲硫氨酸，优选的-A-为可提供N端甲硫氨酸的寡肽(如，含有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。-B-是可选的C端氨基酸序列。这个序列一般较短(如40或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。典型的例子包括引导蛋白定位的序列、有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标记，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)或能增强蛋白稳定性的序列。其他合适的C端氨基酸序列都是本领域技术人员所熟知的。

更优选的是n等于2。这一类型的2个优选蛋白是：X₁是936，X₂是741；X₁是287，X₂是953。

本发明两个特别优选的杂合蛋白如下：

n

A

X₁

L₁

X₂

L₂

B

[SEQ ID NO：]

2

MA

ΔG287

SEQ ID NO：9

953^(NL)

-

7

2

M

936^(NL)

SEQ ID NO：9

ΔG741

-

8

这两个蛋白可用于和NadA(特别是含有SEQ ID NO：2的NadA)组合[24]。

不包含OMV和/或不包含脂多糖的混合物是优选的。

外膜囊泡

作为使用纯化多肽抗原的替代方法，本发明可以使用脑膜炎奈瑟氏球菌微囊泡[30]、“天然OMV”[31]、泡或外膜囊泡[如32-37等]的制备物。所有这些制备物在本文中都被归于通用术语“OMV”的范畴。

在某些实施方式中，OMV可从细菌中制备，这些细菌已被遗传改造[38-41]，如增加其免疫原性(如过量表达的免疫原)、降低其毒性、抑制其荚膜多糖的合成、下调或敲除PorA的表达、下调或敲除lgtB的表达[42]等。OMV也可以从超级出疱株中制备[43-46]。非致病性奈瑟菌来源的囊泡也可以包括在内[47]。OMV的制备可以不使用去污剂[48，49]。它们可以在其表面表达非奈瑟菌蛋白[50]。它们可以是LPD缺失的。它们可以保留脂多糖作为重要的抗原[42，51]。它们可以和重组抗原混合[32，52]。它们可以被处理以降低其脂多糖免疫型的相变异性[53]。OMV混合物也可以使用[30]，其中包括不同血清型和/或血清亚型来源的混合物[30，54]。

具有不同I类外膜蛋白亚型的细菌来源的囊泡也可以使用，如，由两种不同的经遗传改造的囊泡群形成的6种不同的亚型[55，56]，其中每种囊泡群展示3种亚型，或者由三种不同的经遗传改造的囊泡群形成的9种不同的亚型，其中每种囊泡群展示3种亚型，等等。有用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。

免疫结果

免疫的结果将是在受试者体内产生抗体，该抗体可(a)识别免疫原性多肽和(b)保护受试者以免被多种血清型的脑膜炎球菌感染。免疫的一种典型结果是产生抗体反应，该反应至少对于血清群Y奈瑟菌来说是杀菌性的，更典型的结果是产生的抗体能够抵抗血清群A、B、C、W135和Y中的每一种。

一种优选的结果是产生抗(a)血清群Y和A；(b)血清群Y和B；(c)血清群Y和C；(d)血清群Y和W135等的免疫。至少抗血清群A、B、C和Y的免疫是优选的。免疫的结果还可以提供抗其他血清群(非致病性的)如H、I、K、L、X、Z、29E等的保护作用。免疫的结果还可以提供抗其他奈瑟菌如乳糖奈瑟菌、淋病奈瑟菌、灰色奈瑟菌等的保护作用。

免疫以后，优选血清中产生的杀菌滴度至少为1024(如2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即，当一株特定的检测细菌被稀释到1/1024时，血清可以将其至少50％杀灭，如参考文献20所描述。

血清群和菌株

本发明的方法和用途优选用于免疫受试者使其能够抵抗血清群Y和血清群A、B、C和W135之一的感染。

本发明的优选蛋白包含脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的氨基酸序列。在血清群B中，优选的菌株是2996、MC58、95N477和394/98。菌株394/98在本文中有时也被称为“NZ”，因为它是新西兰株。

蛋白287优选来自菌株2996，更优选的是来自菌株394/98。

蛋白741优选来自血清群B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或者血清群C菌株90/18311。其中菌株MC58是更优选的。

蛋白936、953和NadA优选来自菌株2996。

菌株可作为脚注来指示，如741_MC58是来自菌株MC58的蛋白741。除非特别说明，本文所提到的蛋白(如，没有脚注的)都来自于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株2996，该菌株作为“参照”菌株。但应当理解的是，本发明总体而言不受菌株的限制。如上文所提到的，一个蛋白的通用参照(如“287”，“919”等)可以包括任何菌株来源的蛋白。一般来说，该菌株与2996具有90％或更高(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的序列一致性。

如果一个组合物包含一种特定的蛋白抗原(如741或287)，那么该组合物就可以包含不止一种变体形式的抗原，如来源于不止一个菌株的相同蛋白。这些蛋白可以串联在一起，也可以单独存在。

当使用杂合蛋白时，杂合蛋白内的每个抗原(即每个-X-基团)都可以来源于一个或多个菌株。例如，如果n＝2，X₂可以和X₁一样来源于同一个菌株，或者来源于不同的菌株。如果n＝3，菌株可以是(i)X₁＝X₂＝X₃(ii)X₁＝X₂≠X₃(iii)X₁≠X₂＝X₃(iv)X₁≠X₂≠X₃或(v)X₁＝X₃≠X₂等。

超毒力谱系和杀菌性抗体反应

一般来说，本发明的组合物在给予受试者后可在血清中诱导产生杀细菌性抗体反应。这些反应在小鼠体内可以很方便地检测，是疫苗效应的标准指标[参见参考文献20的尾注14]。血清的杀菌活性(SBA)表示补体介导的细菌杀伤能力，可用人或仔兔补体来分析。WHO的标准要求一个疫苗能够在超过90％的接种者体内诱导产生的SBA至少升高4倍。

除了能够提供狭窄的保护作用以外，本发明的组合物还能够诱导抗多个脑膜炎球菌血清群的杀菌性抗体反应。更具体地说，本发明的组合物可诱导抗下列三个超毒力谱系中的两个或三个的抗体反应：(i)簇A4；(ii)ET5复合物；以及(iii)谱系3。它们还可以诱导产生抗一个或多个超毒力谱系亚群I、亚群III、亚群IV-1或ET-37复合物，以及其他谱系如超侵袭性谱系的杀菌性抗体反应。然而，组合物并不需要能够诱导针对一个特定超毒力谱系的每一株细菌的杀菌性抗体。

优选的组合物可以诱导产生抗如下菌株的杀菌性反应：(a)脑膜炎球菌血清群Y的860800、ES13822、ES15085和/或ES14487株；(b)脑膜炎球菌血清群A的F6124株；(c)脑膜炎球菌血清群W135的LPN17592株；(d)脑膜炎球菌血清群C的C11株；(e)脑膜炎球菌血清群B内的：(i)簇A4来源的961-5945株(B：2b：P1.21，16)和/或G2136株(B：-)；(ii)ET-5复合物来源的MC58株(B：15：P1.7，16b)和/或44/76株(B：15：P1.7，16)；(iii)谱系3来源的394/98株(B：4：P1.4)和/或BZ198株(B：NT：-)。

血清群Y菌株860800见于参考文献1的29行和参考文献57中。血清群A的菌株F6124见于参考文献20、57和58中。血清群C的菌株C11是参考文献59所描述的参照菌株之一。血清群B的菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST参照菌株[参考文献60中的ids 638&1002]。菌株MC58用途广泛(如ATCC BAA-335)，是参考文献13中被测序的菌株。菌株44/76被广泛应用和研究(如参考文献61)，是一种奈瑟菌MLST参照菌株[参考文献60中的id 237；参考文献1的表2中32行]。菌株394/98最初是于1998年从新西兰分离的，有好几篇已发表的研究报告使用了该菌株(如参考文献62和63)。菌株BZ198是另一个MLST参照菌株[参考文献60中的id 409；参考文献1中的表2的41行]。

免疫原性组合物和药物

本发明的组合物是免疫原性组合物，更优选的是疫苗组合物。本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的(即治疗感染)，但是一般都是预防性的。

组合物的pH值优选在6到8之间，优选约为7。通过使用缓冲物可维持适宜的pH。当组合物包含氢氧化铝时，优选使用组氨酸缓冲液[64]。组合物可以是无菌的和/或无热原的。本发明的组合物对于人体来说是等渗的。

组合物可以装在小玻璃瓶内，或者置于预装的注射器内。注射器可以带针头，也可以不带。注射器可装单次剂量的组合物，而小玻璃瓶可装单次剂量或多次剂量。可注射的组合物通常都是液体溶液或悬液。另外也可以固体形式存在(如冻干的)，在注射前用液体溶剂制成溶液或悬液。

本发明的组合物可包装成单次剂量或多次剂量的形式。如果是多次剂量，小玻璃瓶最好是预装的注射器。根据常规的方法就可以确定有效剂量的体积，但是一般人用的注射剂量为0.5ml。

如果本发明的组合物是在使用前临时配制(如，一种组分以冻干形式存在)，那么组合物可以试剂盒的形式包装，试剂盒可包含两个小玻璃瓶，或者一个预装的注射器和一个小玻璃瓶，在注射前用注射器的内容物灭活小玻璃瓶的内容物。

本发明的免疫是在哺乳动物体内进行，优选在人体内进行。当疫苗作预防用时，人体优选儿童(如幼儿或婴儿)；当疫苗作治疗用时，人体优选成年人。用于儿童的疫苗也可给予成人，如用于评价安全性、剂量、免疫原性等。

这些用途和方法优选用于预防和/或治疗奈瑟菌引起的疾病(如脑膜炎、败血病、菌血症、淋病等)。优选的是细菌性脑膜炎或脑膜炎球菌性脑膜炎的预防和/或治疗。

检查治疗效果的一种途径是在给予本发明的组合物后监测奈瑟菌的感染情况。检查预防效果的一种途径是在给予抗原后监测抗该抗原的免疫反应。本发明的组合物的免疫原性可通过将其给予受试者(如12-16个月大的儿童或动物模型[65])后测定标准参数来确定，其中的标准参数包括血清杀菌性抗体(SBA)和总IgG及高亲和力IgG的ELISA滴度(GMT)。这些免疫反应通常在给予组合物4周后通过与给予组合物前所测定的值进行比较来确定。SBA至少增加4倍或8倍是优选的。如果组合物给予了多次，那么就需要进行多次的注射后检测。

本发明的优选组合物在患者体内产生的抗体滴度要优于每一抗原性组分在可接受百分比的人群中所产生的血清保护标准。具有相关抗体滴度的抗原是本领域所熟知的，在该滴度之上宿主被认为会发生该抗原转阴，这种滴度已由某些机构如WHO发布。优选在有统计意义的受试者样本中超过80％的受试者转阴，更优选的是超过90％、93％，最优选的为96-100％。

组合物通常直接给予患者。直接给药可通过胃肠道外注射(如皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射或注射到组织间隙)、直肠给药、口服、阴道内给药、局部给药、透皮给药、鼻内给药、眼内给药、耳内给药、肺内吸入或其他粘膜给药途径来完成。大腿或上臂肌肉注射是优选的给药途径。注射可使用注射针头(如皮下针头)，但是无针注射也可以使用。典型的肌肉注射剂量是0.5ml。

本发明可用于激发全身免疫和/或粘膜免疫。

给药方案可以是单剂量的，也可以是多剂量的。多剂量给药可用于初次免疫和/或加强免疫。初级免疫后还可以进行加强免疫。致敏剂量之间的合适时间间隔(如4-16周之间)以及初次免疫和加强免疫之间的时间间隔可通过常规方法确定。

奈瑟菌感染可影响身体的各个部位，因此，本发明的组合物可制备成各种剂型。例如，组合物可制备成可注射的液体溶液或悬液。也可以制备成适于在注射前用液体溶剂配制成溶液或悬液的固体制剂(如，冻干组合物)。组合物可以制备成局部应用的制剂，如软膏、乳膏或粉末。组合物还可以制备成口服制剂，如胶囊或片剂，或者糖浆(可以添加香料)。组合物还可以制备成肺内吸入制剂，如利用精细粉末或喷雾剂制成的吸入剂。组合物可以制备成栓剂或子宫托。组合物还可以制备成鼻内、耳内或眼内制剂，如喷雾剂、滴眼剂、凝胶剂或粉末[参见参考文献66和67]。已有报道成功地实现了肺炎球菌多糖[68，69]、肺炎球菌多肽[70]、Hib多糖[71]、MenC多糖[72]、以及Hib和MenC多糖结合物(conjugate)的混合物[73]的鼻内给药。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原以及所需的其他组分。“免疫有效量”是指将该剂量的药物给予患者时，不论是单次给予或是作为系列给药的一部分，都可以产生有效的治疗或预防效果。该剂量要根据所治疗病人的健康状况和病情、年龄、分类学上的种群(如非人灵长类动物，灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需要产生的保护力度、疫苗的剂型、治疗医生对医疗状况的评价以及其他相关因素来确定。我们期望这个剂量能落入一个相对较宽的范围，该范围可通过常规试验来确定，一次剂量所含有的每种脑膜炎球菌多糖抗原的量一般在1μg到20μg之间，如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(以多糖来计)。

组合物中其他的非抗原组分

一般来说，本发明的组合物除了含有上面所提到的组分以外，还包含一种或多种“药用载体”，包括其自身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体。适宜的载体通常都是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[74]、海藻糖[75]、乳糖和脂类聚合物(如油滴或脂质体)。这种载体是本领域技术人员所熟知的。疫苗还可以包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，辅助物质如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等也可以存在于疫苗内。无菌无热原的磷酸盐缓冲的生理盐水是典型的载体。有关药用赋形剂的全面讨论见参考文献76。

本发明的组合物可以包含抗菌剂，特别是在多剂量包装内。

本发明的组合物可以包含去污剂，例如Tween(聚山梨酯)，如Tween 80。去污剂存在的量一般较低，如＜0.01％。

本发明的组合物可以包含钠盐(如氯化钠)以赋予制剂涨度。氯化钠的浓度一般为10±2mg/ml。

本发明的组合物通常都包含缓冲物质，一般为磷酸盐缓冲物。

本发明的组合物还可以包含糖乙醇(如D-甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，浓度约为15-30mg/ml(如25mg/ml)，特别是被冻干或包含从冻干材料再生的材料时。在冻干前可将组合物的pH调整到6.1以便于冻干。

本发明的疫苗可与其他免疫调节剂联合使用。更具体地说，组合物通常包含佐剂。可用于本发明的组合物中的佐剂包括而不限于：

A.含无机物的组合物

在本发明的组合物中适于作为佐剂的无机物包括无机盐，如铝盐和钙盐。本发明涉及无机盐如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[参见参考文献77的8和9章]，或者不同无机化合物的混合物，以及任何合适形式的化合物(如凝胶、结晶、无定形的等)、优先具有吸附功能的化合物。组合物中所含的无机物还可以作为金属盐粒子来制备[78]。

磷酸铝是特别优选的，特别是在含嗜血流感杆菌多糖抗原的组合物内，典型的佐剂是无定形的羟基磷酸铝，PO₄/Al的摩尔比在0.84到0.92之间，其含量为0.6mgAl³⁺/ml。可以使用具有吸附作用的低剂量磷酸铝，如每个剂量中每个结合物含50-100μg Al³⁺。如果组合物中不止有一种结合物，那么并不是所有的结合物都需要被吸附。

B.油乳胶

在本发明中适于作为佐剂的油乳胶组合物包括角鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献77的10章；也可参见参考文献79](5％角鲨烯，0.5％Tween 80和0.5％Span 85，利用微流化仪制备成亚微粒粒子)。完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可以使用。

C.皂角甙制剂[参考文献52的22章]

皂角甙制剂也可用作本发明的佐剂。皂角甙是固醇苷和三萜苷的异源基团，可见于多种植物的皮、叶子、茎、根、甚至花中。来自南美皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂角甙已被作为佐剂进行了大量的研究。皂角甙还可从Smilax ornata(sarsaprilla)、重瓣满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)获得。皂角甙佐剂制剂包含纯化的制剂，如QS21，以及脂质制剂，如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。

皂角甙组合物可用HPLC和RP-HPLC纯化。利用这些技术已鉴定出特异性的纯化组分，其中包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选的皂角甙是QS21。制备QS21的方法描述于参考文献80中。皂角甙制剂还可以包含固醇，如胆固醇[81]。

皂角甙和胆固醇的组合可用于制备被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特粒子[参考文献77的23章]。ISCOM一般还包含磷脂，如脑磷脂或卵磷脂。任何已知的皂角甙都可用于ISCOM中。优选的ISCOM包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM在参考文献81-83中有进一步的描述。另外，ISCOM可以不必额外添加去污剂[84]。

开发以皂角甙为基础的佐剂的有关综述见参考文献85和86。

D.病毒体和病毒样粒子

病毒体和病毒样粒子(VLP)也可作为佐剂用于本发明中。这些结构通常包含病毒来源的一种或多种蛋白，这些蛋白还可以和磷脂结合。它们通常是非致病性和非复制型的，通常不含天然病毒基因组的任何组分。病毒蛋白可通过重组方法制备，也可以从全病毒中分离。适用于病毒体或VLP的这些病毒蛋白包括流感病毒(如HA或NA)、乙型肝炎病毒(如核心蛋白或外壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如包被蛋白)GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如逆转录转座子Ty蛋白p1)来源的病毒。有关VLP的进一步讨论见参考文献87-92。

有关病毒体的进一步讨论见参考文献93。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠道细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化的毒素及其脱毒的衍生物。

LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是携带4、5或6个乙酰化侧链的3脱-O-乙酰化单磷酰脂质A的混合物。3脱-O-乙酰化单磷酰脂质A的优选“小粒子”形式描述于参考文献53中。3dMPL的这种“小粒子”要小到能够通过0.22μm的膜过滤除菌[94]。其他非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，如RC-529[95，96]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌来源的脂质A的衍生物，如OM-174。OM-174在参考文献97和98中有描述。

适于作为本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含CpG基序(一种二核苷酸序列，其中未甲基化的胞嘧啶通过磷酸键与鸟嘌呤相连)的核苷酸序列。试验已证实，双链RNA和含再发序列或poly(dG)序列的寡核苷酸也是免疫刺激因子。

CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如磷硫酰修饰，可以是双链的，也可以是单链的。参考文献99、100和101描述了可能的类似物替代，如，用2′-脱氧-7-脱氮杂鸟苷(2′-deoxy-7-deazaguanosine)替代鸟苷。CpG寡核苷酸的佐剂效应在参考文献102-107中有进一步的讨论。

CpG序列可直接定向到TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[108]。CpG序列可以特异性地诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或者更特异地诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN在参考文献109-111中有描述。优选的CpG是CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸，这样其5’端就易于被受体识别。另外，两个CpG寡核苷酸序列可以其3’端相连形成“immunomer”。参见参考文献108和112-114。

细菌的ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选的蛋白来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定性的肠毒素“LT”)、霍乱毒素(“CT”)或百日咳毒素(“PT“)。有关脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用见参考文献115的描述，作为胃肠外佐剂的应用见参考文献116的描述。毒素和类毒素优选全毒素的形式，包含A和B两个亚单位。优选的是A亚单位包含脱毒突变，而B亚单位是非突变的。优选的佐剂是脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72，作为佐剂的应用见参考文献117-124的描述。氨基酸替代的数字参照最好根据参考文献125中所列的ADP-核糖基化毒素A和B亚单位的排列而定，本文已特地完整纳入作为参考。

F.人免疫调节因子

适于作为本发明佐剂的人免疫调节因子包括细胞因子，如白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[126]等)[127]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘附剂和粘膜粘附剂

生物粘附剂和粘膜粘附剂也可作为佐剂用于本发明中。适宜的生物粘附剂包括酯化的透明质酸酶微球[128]或粘膜粘附剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrollidone)、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可作为佐剂用于本发明中[129]。

H.微粒

微粒也可作为佐剂用于本发明中。以生物可降解且无毒的材料(如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、多正酯、聚酐、聚已酸内酯等)制备的、携带聚(丙交酯-共-乙交酯)的微粒(即直径为约100nm到约150μm的粒子，更优选的是直径为约200nm到约30μm，最优选的是直径为约500nm到约10μm)是优选的，微粒还可以被进一步处理使其表面携带负电荷(如，用SDS处理)，或者携带正电荷(如，用阳离子去污剂如CTAB处理)。

I.脂质体(参考文献77的13和14章)

适于作为本发明佐剂的典型脂质体制剂见于参考文献130-132的描述。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[133]。这种制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂混以辛苯聚醇[134]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂混以至少一种其他的非离子型表面活性剂如辛苯聚醇[13]。优选的聚氧乙烯酯选自如下一组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-steoryl醚、聚氧乙烯-8-steoryl醚、聚氧乙烯-4-月桂酯聚氧乙烯-35-月桂酯以及聚氧乙烯-23-月桂酯。

K.聚膦腈(PCPP)

PCPP制剂描述于参考文献136和137中。

L.胞壁酰肽

适于作为本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)以及N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)。

M.咪唑奎诺酮化合物

适于作为本发明佐剂的咪唑奎诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(如“Resiquimod 3M”)，其进一步的描述见参考文献138和139。

本发明还包括上述一种或多种佐剂不同方面的组合。例如，下列佐剂组合物也可用于本发明中：(1)皂角甙和水包油乳剂[140]；(2)皂角甙(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3Dmpl)[141]；(3)皂角甙(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)(皂角甙(如QS21)+3dMPL+IL-12(还可以加上固醇)[142]；(5)3dMPL与QS21和/或水包油乳剂的混合物[143]；(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％Tween 80^TM、5％pluronic封闭的聚合物L121以及thr-MDP，微流化成亚微粒乳剂或者窝旋成大粒子乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鲨烯、0.2％Tween 80以及选自如下一组的一种或多种细菌细胞壁成分：单磷酸类酯A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；以及(8)一种或几种无机盐(如铝盐)+LPS的非毒性衍生物(如3dMPL)。

其他可作为免疫刺激因子的物质见参考文献77的7章的描述。

使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂是特别优选的，抗原通常都能吸附到这些无机盐上。如果组合物内包含Hib抗原最好不要用氢氧化铝作为佐剂。如果使用磷酸铝并且希望抗原不要吸附到佐剂上，那么溶液中最好是磷酸盐离子(如，通过使用磷酸盐缓冲液)。防止吸附还可以通过在抗原/佐剂混合时选择正确的pH、使用具有零电荷合适点的佐剂、以及组合物中不同抗原选择合适的混合顺序来实现[144]。

磷酸钙是另一种优选的佐剂

其他抗原

本发明的组合物包含五种基本的脑膜炎球菌蛋白抗原。但是本发明的组合物还可以包含其他抗原，虽然它可能不包含五种基本抗原之外的脑膜炎球菌蛋白抗原。其他抗原可以是如下抗原：

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B来源的多糖抗原。

-脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W135和/或Y来源的多糖抗原，如参考文献5所描述的来源于血清群C的多糖，或者参考文献8所描述的多糖(见下文)。

-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)来源的多糖抗原[如180，181，182]。

-甲型肝炎病毒来源的抗原，如灭活的病毒[如145，146]。

-乙肝炎病毒来源的抗原，如表面抗原和/或核心抗原[146，147]。

-白喉抗原，如白喉毒素[如参考文献148的3章所描述]，如CRM₁₉₇突变体[如149]。

-破伤风抗原，如破伤风毒素[如参考文献148的4章所描述]。

-百日咳杆菌(Bordetella pertussis)来源的抗原，如百日咳杆菌来源的百日咳全毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，该抗原还可以和百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3结合[如参考文献150和151]。细胞性的百日咳抗原也可以使用。

-从脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B制备的外膜囊泡(OMV)，如参考文献34、35、37、152等所描述的。

-脊髓灰质炎病毒抗原[如153，154]，如OPV，或者优选的IPV。

组合物可包含这些其他抗原中的一种或几种。每种抗原存在的浓度一般为至少1μg/ml。总之，任何给定抗原的浓度要足以激发出抗该抗原的免疫反应。优选的是当不同多糖抗原混合在一起时其保护效应不会被消除，尽管其实际的免疫原性(如ELISA滴度)可能会降低。

如果组合物中包含白喉抗原，那么最好也包含破伤风抗原和百日咳抗原。同样，如果组合物中包含破伤风抗原，那么最好也包含白喉抗原和百日咳抗原。同样，如果组合物中包含百日咳抗原，那么最好也包含白喉抗原和破伤风抗原。这种DTP组合可用于重建冻干的结合物。

如果使用的是多糖抗原或碳水化合物抗原，那么最好连接到载体蛋白上以增强其免疫原性(见下文)。

如果需要可将毒性蛋白抗原脱毒(如，通过化学和/或遗传方法将百日咳毒素脱毒[151])。

作为在本发明的组合物中使用蛋白抗原的替代方法，可以使用编码抗原的核酸[如参考文献155-163]。因此，本发明组合物中的蛋白组分可用编码蛋白质的核酸替代(优选DNA，如质粒形式的DNA)。同样，本发明的组合物可以包含能模拟多糖抗原的蛋白质，如模拟表位[164]或抗独特型抗体。这些物质可替代各种多糖组分，或者作为多糖组分的补充。其中一个典型的例子是，疫苗包含MenC[165]或MenA[166]夹膜多糖的肽模拟物来代替多糖自身。

本发明特别优选的组合物包含如下两种抗原中的一种或两种：(a)B型流感嗜血杆菌来源的多糖抗原；和/或(b)肺炎链球菌来源的抗原。它们还可以包含脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A来源的多糖抗原，除非一个给定血清群来源的多糖只有在多肽和/或OMV不是用于提供抗该抗原的保护作用时才被包含在组合物中。

B型流感嗜血杆菌

如果组合物中包含B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)抗原，那么它一般都是Hib夹膜多糖抗原。流感嗜血杆菌b来源的多糖抗原是大家所熟知的。

Hib多糖优选共价连接到载体蛋白上以增强其免疫原性，尤其对于儿童来说。制备多糖结合物的通用方法以及制备Hib夹膜多糖的特定方法都已有文献描述[如参考文献165-175等]。本发明可使用任何适宜的Hib结合物。适宜的载体蛋白见下文的描述，Hib多糖的优选载体是CRM₁₉₇(‘HbOC’)、破伤风毒素(‘PRP-T’)和脑膜炎奈瑟氏球菌的其他外膜复合物(‘PRP-OMP’)。

结合物的多糖基团可以是多糖(如全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但是优选将多糖水解形成寡糖(如分子量从约1到约5kDa)。

优选的结合物包含一个通过己二酸接头共价连接到CRM₁₉₇上的Hib寡糖[176，177]。破伤风毒素也是优选的载体。

给予Hib抗原后优选的结果是产生浓度≥0.15μg/ml的抗PRP抗体，更优选的是≥1μg/ml。

本发明的组合物可以包含一种以上的Hib抗原。

如果组合物包含Hib糖抗原，那么最好就不要包含氢氧化铝佐剂。如果组合物包含磷酸铝佐剂，那么Hib抗原可以吸附到佐剂上[178]，也可以不吸附到佐剂上[179]。

Hib抗原可以是冻干的，比如和脑膜炎球菌抗原一起冻干。

肺炎链球菌

在组合物包含肺炎链球菌抗原时，这种抗原通常是夹膜多糖，优选连接到载体蛋白上[如参考文献180-182]。优选的是所包含的糖抗原来源于多种血清型的肺炎链球菌。例如，来源于23种不同血清型的多糖混合物被广泛应用，一种含有5到11种不同血清型来源的多糖的组合疫苗也是如此[183]。例如，PrevNar^TM[184]包含7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)来源的抗原，每种糖抗原都分别通过还原氨基化作用连接到CRM₁₉₇上，每0.5ml制剂中所含有的每种糖抗原为2μg(血清型6B为4μg)，结合物吸附到磷酸铝佐剂上。本发明的组合物优选至少包含血清型6B、14、19F和23F。结合物可以吸附到磷酸铝上。

除了使用肺炎球菌来源的糖抗原以外，组合物还可以包含一种或多种多肽抗原。现在已经知道了几株肺炎球菌的基因组序列[185，186]，因此可以利用疫苗学的知识[187-190]反过来鉴定合适的多肽抗原[191，192]。例如，组合物可包含下列抗原中的一种或几种：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp130，如参考文献193所定义的。组合物可包含这些抗原中的多种抗原(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)。

在某些实施方式中，组合物可以同时包含肺炎球菌来源的糖抗原和多肽抗原。这些抗原可以简单混合，或者肺炎球菌糖抗原连接到肺炎球菌蛋白上。这种实施方式的适宜载体包括上述段落中所列的抗原[193]。

肺炎球菌抗原可以是冻干的，例如和脑膜炎球菌抗原和/或Hib抗原一起冻干。

脑膜炎球菌血清群Y、W135、C和A

如上所述，抗血清群A、C、W135和Y的多糖疫苗已为大家熟知多年。这些疫苗(MENCEVAXACWY^TM和MENOMUNE^TM)的基础是微生物的夹膜多糖，虽然这些疫苗在青少年和成人身上是有效的，但是产生的免疫反应较弱、保护作用的持续时间较短，并且不能用于婴儿。

与这些疫苗中未结合的多糖抗原不同，最近批准的血清群C疫苗(Menjugate^TM[4]，Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)包含结合的糖抗原。Menjugate^TM和Meningitec^TM含有连接到载体CRM₁₉₇上的寡糖抗原，而NeisVac-C^TM包含连接到破伤风毒素载体上的完整多糖(脱-O-乙酰化的)。

本发明的组合物优选包含一种或多种血清群Y、W135、C和A来源的夹膜多糖抗原，其中的抗原连接到载体蛋白上，并且可以是寡糖。脑膜炎球菌夹膜多糖及其结合物可按参考文献7和8所描述的方法制备。

每次剂量中每种脑膜炎球菌糖抗原的量一般为1μg到20μg，如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(以糖来计)。

在混合物包含两种血清群A和C来源的夹膜多糖时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)可以是大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。在混合物所包含的夹膜多糖来源于血清群Y和C或W135之一，或者是Y、C和W135时，MenY糖∶MenW135糖的比例(w/w)可以是大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)，和/或MenY糖∶MenC糖的比例(w/w)可以是小于1(如1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清群A∶C∶W135∶Y来源的糖的优选比例(w/w)为1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和2∶2∶2∶1。血清群C∶W135∶Y来源的糖的优选比例(w/w)为1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1和2∶1∶1。每种糖的分子量基本相同是优选的。

夹膜多糖通常以寡糖形式使用。通过将纯化的夹膜多糖片段化可以很方便地制备寡糖(如，水解)，然后通常是纯化所需大小的寡糖片段。

多糖片段化后所形成的寡糖的最终平均聚合度(DP)优选低于30(如10到20之间，对于血清群A来说，优选的是约10；对于血清群W13来说，优选的是15到25之间；对于血清群Y来说，优选的是约15-20；对于血清群C来说，优选的是12到22之间；等等)。通过离子交换层析或比色分析可以很容易地测定DP[194]。

如果进行了水解，通常需要测定水解产物的大小以便于去除较短的寡糖[195]。可通过各种方式达到此目的，如超滤后再进行离子交换层析。对于血清群A来说，优选去除聚合度小于等于6的寡糖，对于血清群W135和Y来说，优选去除聚合度小于4的寡糖。

优选的MenC糖抗原见参考文献5的描述，如Meniugate^TM中所使用的。

糖类最好单独制备(包括片段化、结合、修饰等)，然后混合在一起形成本发明的组合物。

但是，如果组合物中包含血清群A来源的夹膜多糖，那么最好在使用前临时将血清群A多糖与其他多糖混合，这样可以将水解的可能降到最低。通过下列过程就可以很容易地达到此目的：当准备使用时将冻干的血清群A组分(一般混合有适当的赋形剂)和冻干的其他血清群组分(也混有赋形剂)与用于重建冻干MenA组分的液体组分混合。如果使用的是铝盐佐剂，那么优选的是将佐剂装在盛有液体疫苗的小瓶内，并且冻干不含佐剂的MenA组分。因此，本发明的组合物可使用试剂盒来配制，其中试剂盒包含：(a)冻干形式的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A来源的夹膜多糖；以及(b)组合物中液体形式的其他抗原。

共价结合

本发明组合物中的夹膜多糖通常都连接到载体蛋白上。总的来说，这种结合可增强多糖的免疫原性，因为它可以将多糖从T非依赖性抗原转变成T依赖性抗原，从而使之具有激发免疫记忆的能力。结合对于儿科用疫苗是特别有益的，也是大家所熟知的技术[综述见参考文献196和167-175]。

优选的载体蛋白是细菌毒素和类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。CRM₁₉₇白喉毒素突变体[197-199]是特别优选的。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白[200]、合成肽[201，202]、热休克蛋白[203，204]、百日咳蛋白[205，206]、细胞因子[207]、淋巴因子[207]、激素[207]、生长因子[207]、含有各种致病原来源抗原的多重人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[208]、流感嗜血杆菌来源的蛋白质D[209，210]、肺炎球菌表面蛋白PspA[211]、离子摄取蛋白[212]、艰难梭菌(C.difficile)来源的毒素A或毒素B[213]等。优选的载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白质D和CRM₁₉₇。

在本发明的组合物内，使用多个载体蛋白以降低载体抑制的风险是可能的。这样不同的血清群可使用不同的载体蛋白，如血清群A多糖可连接到CRM₁₉₇，而血清群C多糖可连接到破伤风类毒素上。一种特定多糖抗原使用多种载体蛋白也是可以的，如血清群A多糖可分为两部分，其中某些多糖连接到CRM₁₉₇上，而另一些连接到破伤风类毒素上。

一个载体蛋白可携带多个多糖抗原[214]。例如，一个载体蛋白可将血清群A和C的多糖都连接到其上。为达到此目的，可在结合反应前将多糖混合。但是，总的来说，不同的血清群用不同的连接物是优选的。

连接物中多糖∶蛋白的比例(w/w)为1∶5(即蛋白质过量)到5∶1(即多糖过量)之间是优选的。比例在1∶2和5∶1之间是优选的，比例在1∶1.25和1∶2.5之间是更优选的。对于MenA和MenC来说，载体蛋白过量是优选的。

结合物可用于与游离载体蛋白结合[215]。当本发明的组合物中一种给定的载体蛋白既有游离的形式又有结合的形式时，未结合形式的载体蛋白在组合物中占载体蛋白总量的比例以重量计最好不要超过5％，更优选的是不要超过2％。

任何合适的连接反应都可以利用，在需要时可使用任何适宜的接头。

多糖在连接前通常都要活化或功能化。活化包括氰化(cyanylating)试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐[216，217等]。其他合适的方式使用的是碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烯(norborane)、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；参见参考文献173的介绍)。

通过连接基团进行的连接可利用任何已知的技术来完成，如，参考文献218和219所描述的技术。其中一类连接的方法如下：将多糖还原氨基化，将所得到的氨基偶连到己二酸连接基团的一端，然后将蛋白偶连到己二酸连接基团的另一端[177，220，221]。其他接头包括B-丙酰胺基[222]、硝基苯基乙胺[223]、卤代酰卤[224]、糖苷键连接[225]、6-氨基己酸[226]、ADH[227]、C₄到C₁₂基团[228]等。除了利用接头之外，也可以直接连接。直接连接到蛋白质上可以是氧化多糖，然后与蛋白质进行还原氨基化，如参考文献229和230所描述。

在糖上引入氨基基团(如，用-NH₂替代末端的＝O基团)，然后用脂肪二酯(如，脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化并且与载体蛋白反应的方式是优选的。另一种优选的反应使用CDAP活化蛋白质D载体以连接MenA或MenC。

连接以后，游离的和结合的糖可以被分开。有许多合适的方法可用于此，其中包括疏水层析、正切超滤、透析等[也可参见参考文献231和232等]。

如果本发明的组合物包含结合的寡糖，那么最好在连接前制备寡糖。

除了通过纯化获得以外，还可以通过全部或部分合成来获得夹膜多糖，如参考文献233描述的Hib合成以及参考文献234描述的MenA合成。

其他的和另外的血清群B多肽抗原

本发明所使用的组合物在给予受试者后能够在该受试者体内诱导产生抗体反应，其中的抗体反应至少可以起到抗脑膜炎球菌血清群Y的保护作用。虽然NadA、741、936、953和287是产生这种保护作用的优选抗原，但是包含在本发明组合物中的其他MenB多肽抗原(还可以联合五种基本抗原中的一种或几种)包括含如下氨基酸序列之一的那些抗原：参考文献15所述的SEQ ID NO：650；参考文献15所述的SEQ IDNO：878；参考文献15所述的SEQ ID NO：884；参考文献16所述的SEQ ID NO：4；参考文献17所述的SEQ ID NO：598；参考文献17所述的SEQ ID NO：818；参考文献17所述的SEQ ID NO：864；参考文献17所述的SEQ ID NO：866；参考文献17所述的SEQ ID NO：1196；参考文献17所述的SEQ ID NO：1272；参考文献17所述的SEQID NO：1274；参考文献17所述的SEQ ID NO：1640；参考文献17所述的SEQ IDNO：1788；参考文献17所述的SEQ ID NO：2288；参考文献17所述的SEQ ID NO：2466；参考文献17所述的SEQ ID NO：2554；参考文献17所述的SEQ ID NO：2576；参考文献17所述的SEQ ID NO：2606；参考文献17所述的SEQ ID NO：2608；参考文献17所述的SEQ ID NO：2616；参考文献17所述的SEQ ID NO：2668；参考文献17所述的SEQ ID NO：2780；参考文献17所述的SEQ ID NO：2932；参考文献17所述的SEQ IDNO：2958；参考文献17所述的SEQ ID NO：2970；参考文献17所述的SEQ IDNO：2988；或者包含如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列：(a)与所述序列有50％或更高的(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列一致性；和/或(b)包含所述序列的至少n个连续氨基酸的片段，其中的n等于7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。对于(b)来说，优选片段包含相关序列来源的表位。可以包含这些多肽中的多个多肽(如2、3、4、5、6)。

抗原转铁蛋白结合蛋白和/或Hsf蛋白也可以使用[235]。NspA蛋白也可以使用[236]，如参考文献237所述，优选重组表达的和纯化的。

总体阐述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由...组成”，例如，一种组合物“包含”X可以是指只包含X，还可以指也包含其他物质，如X+Y。

术语“约”指数值x时意味着x+10％。

术语“基本上”不排除“完全”，如，组合物是“基本上不含”Y可以指完全不含Y。如果需要，术语“基本上”可从本发明的定义中删除。

两个氨基酸序列之间的百分序列一致性是指两个序列排列在一起比较时相同氨基酸所占的百分率。这种排列和百分同源性或序列一致性可用本领域熟知的软件程序确定，如参考文献的7.7.18部分所描述的那些程序。一种优选的排列是由Smith-Waterman同源性检索算法完成的，该算法使用仿射缺口检索(affine gap search)，缺口开放罚分(gap open penalty)等于12，缺口延伸罚分(gap extension penalty)等于2，BLOSUM矩阵(BLOSUM matrix)为62。Smith-Waterman同源性检索算法在参考文献239中有描述。

术语“多肽”一般是指氨基酸残基的聚合物，但是并不限定产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在此定义之内。全长蛋白及其片段也都包括在此定义之内。一般来说，可用于本发明的多肽都具有与其应用目的相适应的最大长度。一般来说最大长度并不是关键，本领域的技术人员很容易选择。

本发明的多肽可以多种方式制备，如化学合成(至少部分化学合成)、利用蛋白酶消化较长的多肽、从RNA翻译、从细胞培养物中纯化(如，来源于重组表达)、来源于微生物本身(如，细菌培养后)、来源于细胞系等。对于长度＜40个氨基酸的肽来说，其优选制备方法包括体外化学合成[240，241]。固相肽合成方法是特别优选的，如基于tBoc或Fmoc化学的方法[242]。酶催化合成方法[243]也可用于全长多肽或其部分。除了化学合成以外，生物合成也可以利用，如，可以通过翻译来制备多肽。这可以在体外或体内进行。生物合成方法一般只限于制备含L氨基酸的多肽，但是通过改造翻译机器(如氨酰tRNA分子)也可以引入D氨基酸(或其他非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)等)[244]。但是，如果多肽内包含D氨基酸，那么优选通过化学合成方法合成。本发明的多肽可在C端和/或N端进行共价修饰。

本发明的多肽可有多种形式(如，天然的、融合的、糖基化的、非糖基化的、脂化的、非脂化的、磷酸化的、非磷酸化的、十四烷酰化的、非十四烷酰化的、单体的、多聚体的、微粒的、变性的等)。纯化的多肽可从其表达宿主微生物中分离。

术语“核酸”通常包括任意长度的核苷酸聚合物，有脱氧核糖核酸、核糖核酸、和/或其类似物。其中包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。还包含DNA或RNA类似物，如包含修饰骨架(如肽核酸(PNA)或磷硫酰)或修饰碱基的那些核酸。因此，本发明的核酸包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、探针、引物等。在本发明的核酸是RNA时，可以包含5’帽子，也可以不包含。

本发明的核酸可以各种方式制备，如化学合成(至少部分化学合成)、利用核酸酶(如限制性内切酶)消化较长的核酸、连接较短的核酸(如，使用连接酶或聚合酶)、来源于基因组文库或cDNA文库等。

核酸和多肽中包含有利于克隆或纯化等的序列并不必然有利于本发明，因此可以被删除或去除。

实现本发明的模式

多肽

ΔG287-953杂合多肽、936-ΔG741杂合多肽以及NadA^(NL)(C)多肽可按照参考文献24所描述的方法制备。这些多肽由脑膜炎球菌血清群B株基因组来源的序列编码。

三种多肽混合在一起形成混合制剂，其中包含氢氧化铝佐剂。制剂用于免疫小鼠，测定免疫血清中抗血清群A、B、C、W135和Y脑膜炎球菌菌株的杀菌滴度。其中针对11株细菌的结果如下：

因此，混合的组合物可有效地诱导产生针对血清群B的血清，该血清群是多肽中所含氨基酸序列的起源血清群。同一范围的滴度也可见于抗血清群A和C的血清，抗血清群W的血清滴度稍低。令人吃惊的是，针对血清群Y菌株的滴度最高。

另外，抗血清群Y菌株的血清滴度与使用四价A/C/W135/Y组合疫苗所得到的滴度相似[8]：

菌株	860800	ES13822	ES15085	ES14487
					多肽	65536	4096	4096	4096
四价组合疫苗	32768	＞8192	＞8192	4096

由此可见，本发明的发明人首次不需要使用夹膜多糖，只利用多肽抗原就获得了抗各种致病性血清群(A、B、C、W135和Y)脑膜炎球菌菌株的有效免疫反应。

应当理解的是，本发明只是用实施例的方式进行描述，只要不偏离本发明范围和精神，可以对本发明作出修改。

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序列表

SEQ ID NO：1-菌株2996来源的NadA，其C端缺失

MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

SEQ ID NO：2-菌株2996来源的NadA，其C端缺失，前导肽经过处理

ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

SEQ ID NO：3-菌株MC58来源的ΔG741

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

SEQ ID NO：4-菌株MC58来源的936，其前导肽经过处理

VSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR

SEQ ID NO：5-菌株MC58来源的953，其前导肽经过处理

ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ

SEQ ID NO：6-菌株MC58来源的ΔG287

SPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD

SEQ ID NO：7-287-953杂合体

MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ*

SEQ ID NO：8-936-741杂合体

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ*

SEQ ID NO：9-接头

GSGGGG

SEQ ID NO：10-741序列

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

SEQ ID NO：11-741序列

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

SEQ ID NO：12-741序列

CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

Claims

1.一种或多种免疫原性脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B多肽在制造用于免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的药物中的应用。

2.脑膜炎球菌OMV在制造用于免疫受试者使其能够抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群Y感染的药物中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，用于免疫受试者使其还能抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、B、C和/或W135的感染。