CN1886373A - 使用水解酶制备(s)－二氢吲哚－2－羧酸和(s)－二氢吲哚－2－羧酸甲酯的方法 - Google Patents

使用水解酶制备(s)－二氢吲哚－2－羧酸和(s)－二氢吲哚－2－羧酸甲酯的方法 Download PDF

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Abstract

公开了一种使用低成本的可产业化获得的能够确保高的光学纯度和产率的酶制备(S)－二氢吲哚－2－羧酸及(S)－二氢吲哚－2－羧酸甲酯的方法。在本发明中，所述水解酶选自由洒维奈斯、水解蛋白酶、脂肪酶243、蛋白酶、内肽酶、蛋白酶7、酰基转移酶所组成的组中，因此通过简单的制备过程即可获得光学纯度至少为99％e.e.的(S)－二氢吲哚－2－羧酸及其甲基酯，从而产生经济效益。

Description

使用水解酶制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸和(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法
技术领域
本发明总体上是关于使用水解酶制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸及其甲基酯的方法，尤其是关于使用可产业化获得的来自微生物的水解酶从外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯制备光学纯度至少为99％e.e.(对映过量，enatiomeric excess)的(S)-二氢吲哚-2-羧酸和(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法。
背景技术
一般来说，(S)-二氢吲哚-2-羧酸及其甲基酯化合物目前用作实验或临床阶段的许多新药的中间体，同样，当通过氢化作用转化成(2S)-(2α，3αβ，7αβ)-八氢吲哚-2-羧酸时可以用来作为治疗高血压的试剂的中间体，例如可以从Servier公司(法国)商购得到的培哚普利(PerindoprilTM)。因此，开始了对(S)-二氢吲哚-2-羧酸及(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的深入研究。
目前，光学活性的(S)-二氢吲哚-2-羧酸及其甲基酯的生产方法大致可分为四种，即(1)使用手性助剂重结晶，(2)使用手性助剂不对称氢化，(3)通过使用手性助剂不对称还原进行化学合成，及(4)使用微生物及酶对映选择性水解。
首先，重结晶方法的特征为使用光学活性物质作为助剂，特定的光学异构体以盐的形式选择性沉淀并从其它的光学异构体中分离。由此，使用(+)-α-甲苄胺作为手性助剂分离出光学纯度为96％e.e.的(S)-二氢吲哚-2-羧酸(Vincent M.et al.，Tetrahedron Letters，23(16)，1677，1982)。
另外，随乙酰化的二氢吲哚-2-羧酸一起使用(-)-(R，R)-4-(O2N)C6H4CH(OH)CH(NH2)CH2OH作为手性助剂，由此分离出光学纯度为99％e.e.的乙酰化的(S)-二氢吲哚-2-羧酸(Hendrickx A.J.J.&Kuilman T.，EP 937,714(1999))。然而，该重结晶方法的缺点在于使用的手性助剂价格昂贵并难以回收，因而降低了其经济效益。因此，难以将上述方法应用到商业化的工业中。
其次，使用手性助剂的不对称氢化方法的特征为将底物和具有手性配位体的金属催化剂加入到溶剂中，然后将底物光学选择性氢化。例如，使用[Rh(降冰片二烯)2]+SbF6-作为催化剂，双(二苯膦乙基)-联二茂铁(S，S)-(R，R)-PhTRAP作为配位体，在含有碳酸铯的异丙醇溶液中，在60℃和5.0兆帕下，对乙酰化的二氢吲哚-2-羧酸甲酯进行氢化，制备光学纯度为95％e.e.的乙酰化(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，产率为95％(Kuwano R.等，JACS，122(31)，7614，2000)。上述方法优点是产率高，但有例如光学纯度低、使用很难合成的昂贵的手性助剂进行氢化等缺点。而且，上述方法需要昂贵的仪器和设备，不能用于大规模生产。
第三，通过使用手性助剂不对称还原进行化学合成的方法的特征为使用手性助剂将前手性型硝基苯丙酮酸光学选择性还原，以制备醇衍生物，然后该醇衍生物用作中间体制备光学活性的(S)-二氢吲哚-2-羧酸。由此，当分别使用D-(+)-脯氨酸和硼氢化钠(NaBH4)作为手性助剂和还原剂，将硝基苯丙酮酸光学选择性还原，从而合成(S)-α-羟基苯丙酸，产率为85％。然后，对合成的(S)-α-羟基苯丙酸进行氯化，然后在碱性水溶液中把硝基还原成胺基得到环状结构，最终合成(S)-二氢吲哚-2-羧酸(Buzby G.C.Jr等，U.S.4,614,806(1988))。然而，上述方法有如下缺点，通过很多反应步骤制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸，例如从硝基苯丙酮酸开始的四步，因而获得不超过32％的很低的产率。而且，上述方法的缺点还在于使用昂贵的D-(+)-脯氨酸，因而不可能经济地获得目标产物。
第四，使用微生物及酶对映选择性水解的方法包括分别由Asada等和Oreste等提出的两种方法。
Asada等提出，将选自由丁醇、戊醇、苄醇、环己醇、环己二醇、丙三醇、丙三醇-α-单氯代醇、乙二醇、双氯丙醇、单氯代醇及戊三醇所组成的组中的具有高分子量的醇与外消旋的二氢吲哚-2-羧酸反应以制备酯化合物，然后使用工业酶和用微生物纯化的酶将所述酯化合物光学选择性离析，以制备(S)-或(R)-酯化合物，然后进一步水解、浓缩、结晶、沉淀及过滤，最终得到具有高光学纯度的(S)-或(R)-二氢吲哚-2-羧酸(Asada等，U.S.4,898,822(1990))。
尽管使用由具有高分子量的醇构成的酯化合物作为底物，由于提高了填充到柱中的疏水树脂的吸附率而能增加产量，但是降低了同样的量的情况下的每单位体积的摩尔数，因此相对于具有低分子量的酯化合物降低了整个反应的产率，增加了成本。
Asada等使用的酶和微生物中，胰脂酶和源自烟草节杆菌(Arthrobacternicotianea)的水解酶具有较高的活性。
尽管胰脂酶是从猪胰腺得到的价格低的脂肪酶，但总量中仅含有25％的蛋白质，其中，蛋白质进一步包括淀粉酶和蛋白酶。由此，发生副反应而容易产生杂质。而且，在产品分离和提纯始，由于杂质以及胰脂酶的总蛋白质中不必要的蛋白质形成乳状层，因此难以进行分离和提纯，并且，纯化产率降低。
此外，根据微生物的培养条件，源自微生物的酶具有不同的效价(titre)和活性，并且酶的纯化需要复杂的工艺，例如柱色谱。
另外，通过例如水解、浓缩、结晶、沉淀及过滤等复杂的工艺可将从酶反应获得的(S)-或(R)-酯化合物转化成具有高光学纯度的(S)-或(R)-二氢吲哚-2-羧酸。因此，反应工艺复杂且产率低，降低了经济效益。
同时，Oreste等提出，用微生物和酶选择性水解外消旋的乙酰化二氢吲哚-2-羧酸甲酯以制备具有光学活性的乙酰化(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯(Oreste G.等，DE 3,727,411(1988))。然而，由于得到的乙酰化(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯产率为9％，光学纯度最大为98％e.e.，上述方法不能应用于要求高光学活性和高产量的工业生产中。而且，由于乙酰基应当从产物中去除，手性中心容易外消旋化，因而降低了光学纯度。
发明内容
为了解决现有技术所遇到的难题，本发明的发明人对(S)-二氢吲哚-2-羧酸及其甲基酯的制备方法进行了深入而彻底的研究，并发现具有低分子量的甲醇与外消旋二氢吲哚-2-羧酸反应制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯，然后使用可产业化获得的水解酶将其光学离析(optical resolution)，由此制得具有高光学纯度的(S)-二氢吲哚-2-羧酸和酯化合物，从而完成了本发明。
因此，本发明的一目的是提供一种使用水解酶制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸和(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法，该方法具有制备工艺简单及制备效率高的优点。
根据本发明的第一方面，提供了一种使用水解酶制备(S)二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法，包括如下步骤：
使外消旋二氢吲哚-2-羧酸与甲醇及亚硫酰氯反应以制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
在缓冲溶液中使用水解酶选择性水解(R)-型的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯以生产(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯(优选具有至少为99％e.e.的光学纯度)；及
分离和回收(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，
其中，所述水解酶选自由洒维奈斯(Savinase)、水解蛋白酶(Alcalase)、脂肪酶243(Novozym 243)、蛋白酶(Everlase)、内肽酶(Esperase)、蛋白酶7(Protease 7)、酰基转移酶(Acylase)所组成的组中。
根据本发明的第二方面，提供了一种使用水解酶制备(S)二氢吲哚-2-羧酸的方法，包括如下步骤：
使外消旋二氢吲哚-2-羧酸与甲醇及亚硫酰氯反应以制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
在缓冲溶液中使用水解酶选择性水解(R)-型的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯以获得未水解的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
分离和回收(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯；及
在碱性水溶液中水解回收的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯以制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸，然后回收所得的(S)-二氢吲哚-2-羧酸(优选具有至少为99％e.e.的光学纯度)，
其中，所述水解酶选自由洒维奈斯(Savinase)、水解蛋白酶(Alcalase)、脂肪酶243(Novozym 243)、蛋白酶(Everlase)、内肽酶(Esperase)、蛋白酶7、酰基转移酶所组成的组中。
具体实施方式
根据本发明，为制备目标(S)-二氢吲哚-2-羧酸及(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，首先使外消旋二氢吲哚-2-羧酸与甲醇及亚硫酰氯反应。
外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的制备如以下反应式1所示：
反应式1
将作为反应式1的原材料的外消旋二氢吲哚-2-羧酸溶解在甲醇中，然后慢慢添加亚硫酰氯进行反应以制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯。
此时，以外消旋二氢吲哚-2-羧酸为基准，分别使用约1-30当量的甲醇和1-2当量的亚硫酰氯。
然后，按照如下的反应式2，对外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯进行光学离析，即，酶促光学离析。如反应式2所示，将由反应式1制备的用作底物的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯适当地溶解和分散到缓冲溶液中(例如，100毫摩尔/升的碳酸钠缓冲溶液)，然后加入水解酶并搅拌。在水解过程中，通过水解酶的作用，仅选择性水解(R)-型的二氢吲哚-2-羧酸甲酯。结果是，(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯没有水解，并具有高的光学纯度(即，至少99％e.e.)。得到的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯可以与(R)-二氢吲哚-2-羧酸分离，然后以本领域已知的任意方法回收。
化学式2
本发明中，由于使用例如外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的具有低分子量的酯化合物作为酶的底物，在相同的用量的情况下相比于由具有高分子量的醇构成的酯化合物，提高了单位体积的摩尔数。因此，能够开发出一种经济的生产方法。此外，随着使用作为催化剂具有稳定的效价及优异的活性可工业得到的酶代替从微生物纯化的酶，可以实现具有高活性的工业可得到的酶的制备比传统开发的工业酶成本低，这正是大批量生产所非常需要的。
鉴于以上所述，为了寻找到适于对映选择性水解外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的可商购得到的酶，本发明人应用了各种得自微生物或哺乳动物的水解酶。其结果是，下述7种酶在仅对映选择性水解(R)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯上有重要作用，由此可获得保留的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯作为所要的产物。具有上述活性的工业酶可举例为蛋白酶家族和酰基转移酶。
蛋白酶可举例为洒维奈斯(源自芽胞杆菌(Bacillus)，Novo)、水解蛋白酶(源自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，Novo)、脂肪酶243(源自地衣芽胞杆菌，Novo)、蛋白酶(源自芽胞杆菌，Novo)、内肽酶(源自芽胞杆菌，Novo)及蛋白酶7(源自米曲霉(Aspergillus oryzae)，Europa)，酰基转移酶可举例为酰基转移酶(源自青霉(pencillium)，Europa)。
上述7种酶中，由于能短时间内表现出对(R)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的优异的选择性水解性能，因而优选洒维奈斯以高产率制备具有高纯度的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯。另外，洒维奈斯成本不高，特别适于商业化应用。
洒维奈斯是具有丝氨酸基团的类似于枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶(EC3.1.21.62)，通过基因改性的嗜碱芽胞杆菌(Alkalophilic Bacillus sp.)发酵而制备，其成本低廉至可以大量地应用到洗涤剂工业(Mahmoudian M.等，Tetrahedron：Asymmetry，10，1201，1999)。另外，由于以水溶液形式购买酶，可以直接将其应用到反应器进行水解反应。当然，上述酶可以为粉末或液体的形式，或者为固定在载体上的形式。
本发明中，酶反应的pH优选为7-9。太低的pH会降低反应速率，然而过高的pH可能会降低产率。另外，酶反应的温度优选为25-50℃。如果温度太低，反应速率会变得太慢，而温度过高，会降低光学纯度。
酶与底物的重量比优选为1∶10-1∶40。如果比例超出上述范围，则酶的用量太大，难以维持经济效益，或反应速率变得太慢。同样地，底物的浓度优选为10-50％(重量/体积)。如果浓度低于10％，底物的用量太少，降低了经济效益，然而，如果浓度超过50％，反应速率变慢，产量降低。另外，反应时间优选为3-85小时。
最后，以如下反应式3进行水解，由上述获得的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯制备光学纯的(S)-二氢吲哚-2-羧酸。
反应式3
在碱性水溶液(例如，氢氧化钠水溶液)中将由反应式2制备的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯水解成(S)-二氢吲哚-2-羧酸，特别是室温条件下光学纯度基本上不会降低。然后，通过常规方法回收(S)-二氢吲哚-2-羧酸。例如，在水解完成时或完成后，用酸性水溶液(例如，盐酸水溶液)使反应混合物酸化以维持pH值为5，然后用有机溶剂萃取制备光学纯的(S)-二氢吲哚-2-羧酸。
制备的(S)-二氢吲哚-2-羧酸具有至少99％e.e.的高光学纯度。
对本发明已作出了总体的描述，通过参照下面的实施例将能进一步理解本发明，除非特别声明，这些实施例仅是用来解释而不是试图限制本发明。
实施例1
制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯
将25克二氢吲哚-2-羧酸和130毫升甲醇加入配有滴液漏斗的500毫升反应器中，然后，通过滴液漏斗慢慢加入11.2毫升的亚硫酰氯。添加亚硫酰氯后，将反应温度升到60℃，在该温度下搅拌2小时。减压蒸馏反应产物以移除亚硫酰氯和甲醇，然后添加130毫升乙酸乙酯，在搅拌条件下缓慢加入100毫升饱和碳酸氢钠水溶液，静置。得到的反应产物用130毫升乙酸乙酯使用分液漏斗萃取两次，然后将有机层放入500毫升圆底烧瓶，减压蒸馏移除溶剂，获得266克外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯。用核磁共振分析方法确认所获得产品为外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯。核磁共振结果如下：
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ3.38(dd，2H)，3.77(s，3H)，4.40(dd，1H)，6.76(t，2H)，7.07(t，2H)
实施例2
用工业水解酶光学离析外消旋酯
将20克实施例1制备的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯加入到80毫升的100毫摩尔/升的碳酸盐缓冲溶液(pH为8)，控制pH为8，然后定量添加1克洒维奈斯(Novo)进行酶分解。在35℃下进行反应，使用5摩尔/升的氢氧化钠溶液将pH值维持在7.8-8.2。然后，每隔规则时间，将0.1毫升得到的反应产物与0.1毫升的饱和碳酸氢钠溶液充分混合，然后用0.5毫升的乙酸乙酯萃取，然后用气相色谱分析。
气相色谱条件为，硅填充毛细管柱(Beta-DEX 120，30m×0.25mm×0.25m，Supelco)在160℃静置1分钟，然后以1℃/分钟的速率增加到180℃，然后静置5分钟。氦载气流速为1毫升/分钟，使用火焰离子化检测器在250℃检测。实际上，因为在17分钟时检测到(R)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，而在17.4分钟检测到(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯。因此，可以很容易的识别两种异构体。
用产率(％)和光学纯度(％e.e.)表示分析结果，分别根据方程式1和2计算(S)-酯的产率和光学纯度：
方程式1
方程式2
Figure A20048003498200132
随反应时间测量(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度(％e.e.)，结果如下表1所示。
表1
不同反应时间的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度(％e.e.)
  反应时间(小时)   光学纯度(％e.e.)
  1   62.7
  2   87.0
  3   95.5
  4   97.9
  5   99.3
反应5小时后，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯光学纯度达到99％e.e.或更多后，停止反应。将反应溶液转移到分液漏斗，用80毫升乙酸乙酯萃取3次。分离出有机溶剂层并减压蒸馏移除溶剂。其结果是，获得9.38克(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，然后用气相色谱分析。如此，获得的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯具有47.0％的产率和99.3％e.e.的光学纯度。
实施例3
水解制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸
将由实施例2制备的8.1克(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯和50毫升的1摩尔/升氢氧化钠水溶液加入配有pH计的250毫升的反应器中，在室温下强烈搅拌。确认(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯是否转化成(S)-二氢吲哚-2-羧酸。然后在反应器温度维持在20℃或更低的同时，将1摩尔/升盐酸溶液缓慢加入反应器中以控制pH值为5。得到的反应产物用50毫升乙酸乙酯使用分液漏斗萃取三次，将有机层加入到圆底烧瓶中，减压蒸馏移除有机层中的溶剂，制得7.0克(S)-二氢吲哚-2-羧酸。使用液相色谱分析制得的(S)-二氢吲哚-2-羧酸的光学纯度。
液相色谱条件为，使用由直链淀粉衍生物构成的chiralpak AD柱(Daicel)，使用正己烷、异丙醇和三氟醋酸之比为95∶5∶0.1的洗脱液以1毫升/分钟洗脱。反应产物在紫外光220nm处检测。作为上述反应的反应物，在11.9分钟时检测到(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，在12.4分钟时检测到(R)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯。此外，作为水解产物，在23.8分钟时检测到(S)-二氢吲哚-2-羧酸，在32.0分钟时检测到(R)-二氢吲哚-2-羧酸。
用产率(％)和光学纯度(％e.e.)表示分析结果，根据方程式3计算(S)-酯的产率，根据方程式2计算光学纯度：
方程式3
水解制备的(S)-二氢吲哚-2-羧酸具有94.5％的产率和99.3％e.e.的光学纯度。
实施例4-10
本组实施例除了缓冲溶液的pH分别改变为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0外，底物和酶的用量、反应温度、以及缓冲溶液的体积均与实施例2的反应条件相同。每小时对反应产物进行分析，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度达到99％e.e.时停止反应。按照实施例2对反应产物进行回收和分析，结果如下表2所示。
表2
缓冲溶液的不同pH的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的反应时间、产率(％)及光学纯度(％e.e.)
  实施例编号   pH   时间(小时)   产率(％)   光学纯度(％e.e.)
  4   6.5   80   55.0   96.2
  5   7.0   33   48.2   99.1
  6   7.5   11   47.3   99.5
  7   8.0   5   47.0   99.3
  8   8.5   3   45.6   99.0
  9   9.0   2   43.6   98.9
  10   10.0   2   6.3   98.8
实施例11-17
本组实施例除了反应温度分别改变为25、30、35、40、45、50和60℃外，底物和酶的用量、缓冲溶液的pH值及体积均与实施例2的反应条件相同。每小时对反应产物进行分析，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度达到99％e.e.时停止反应。按照实施例2对反应产物进行回收和分析，结果如下表3所示。
表3
不同反应温度的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的反应时间、产率(％)及光学纯度(％e.e.)
  实施例编号   温度(℃)   时间(小时)   产率(％)   光学纯度(％e.e.)
  11   25   7   46.9   99.2
  12   30   7   46.6   99.4
  13   35   5   47.0   99.3
  14   40   4   46.8   99.0
  15   45   4   44.5   99.5
  16   50   3   44.7   99.1
  17   60   5   55.1   77.8
实施例18-22
本组实施例除了将底物与酶的比率设定为20且在此基础上底物的用量改变为10、20、30、40和50克外，缓冲溶液的pH值及体积、反应温度均与实施例2的反应条件相同。每小时对反应产物进行分析，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度达到99％e.e.时停止反应。按照实施例2对反应产物进行回收和分析，结果如下表4所示。
表4
不同底物的用量(克)的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的反应时间、产率(％)及光学纯度(％e.e.)
  实施例编号   底物(克)   酶(克)   时间(时间)   产率(％)   光学纯度(％e.e.)
  18   10   0.5   3   44.0   99.5
  19   20   1   5   47.0   99.3
  20   30   1.5   9   47.1   99.0
  21   40   2   14   49.1   99.3
  22   50   2.5   44   27.6   98.9
实施例23-26
本组实施例除了将底物与酶的比率改变为10、20、30和40外，缓冲溶液的pH值及体积、反应温度均与实施例2的反应条件相同。每小时对反应产物进行分析，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度达到99％e.e.时停止反应。按照实施例2对反应产物进行回收和分析，结果如下表5。
表5
不同底物与酶的比率的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的反应时间、产率(％)及光学纯度(％e.e.)
  实施例编号   底物/酶   酶(克)   时间(小时)   产率(％)   光学纯度(％e.e.)
  23   10   2   3   44.0   99.7
  24   20   1   5   47.0   99.3
  25   30   0.67   7   44.7   99.0
  26   40   0.5   9   43.6   99.6
实施例27-33
本组实施例除了酶的用量改为4克以及工业酶使用洒维奈斯、水解蛋白酶、脂肪酶243、蛋白酶、内肽酶、蛋白酶7、酰基转移酶外，缓冲溶液的pH值及体积、底物的用量、反应温度均与实施例2的反应条件相同。每小时对反应产物进行分析，当(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度达到99％e.e.时停止反应。按照实施例2对反应产物进行回收和分析，结果如下表6所示。
表6
不同酶的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的反应时间、产率(％)及光学纯度(％e.e.)
  实施例编号   酶   时间(小时)   产率(％)   光学纯度(％e.e.)
  27   洒维奈斯   1   43.8   99.5
  28   水解蛋白酶   2   31.4   99.6
  29   脂肪酶243   3   36.8   99.7
  30   蛋白酶   3   42.9   99.5
  31   内肽酶   5   40.2   99.3
  32   蛋白酶7   7   35.5   98.5
  33   酰基转移酶   9   30.2   99.0
工业实用性
综上描述，本发明提供了一种使用可商购的水解酶制备具有至少为99％e.e.的高光学纯度的(S)-二氢吲哚-2-羧酸及其甲基酯的方法，该方法简化了制备工艺，因而产生经济效益。
尽管为了描述的目的公开了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将会理解各种修改、添加或替代是可行的。因此，应当理解，在随附权利要求书的范围内，可以以不同于以上描述的方式而实施本发明。

Claims (14)

1、一种使用水解酶制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的方法，该方法包括以下步骤：
使外消旋二氢吲哚-2-羧酸与甲醇及亚硫酰氯反应，以制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
在缓冲溶液中使用水解酶选择性水解(R)-型的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯，以生产(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯；及
分离和回收(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，
其中，所述水解酶选自由洒维奈斯、水解蛋白酶、脂肪酶243、蛋白酶、内肽酶、蛋白酶7和酰基转移酶所组成的组中。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，缓冲溶液为碳酸钠水溶液，缓冲溶液的pH值维持在7至9。
3、根据权利要求1所述的方法，其中，选择性水解步骤在25-50℃下进行3-85小时。
4、根据权利要求1所述的方法，其中，水解酶与外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的重量比为1∶10-1∶40。
5、根据权利要求1所述的方法，其中，选择性水解步骤中外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的浓度范围为10-50％(重量/体积)。
6、根据权利要求1所述的方法，其中，水解酶为粉末或液体的形式，或者为固定在载体上的形式。
7、根据权利要求1所述的方法，其中，回收的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯的光学纯度至少为99％e.e.。
8、一种使用水解酶制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸的方法，该方法包括以下步骤：
使外消旋二氢吲哚-2-羧酸与甲醇及亚硫酰氯反应，以制备外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
在缓冲溶液中使用水解酶选择性水解(R)-型的外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯，以获得未水解的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯；
分离和回收(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯；及
在碱性水溶液中水解回收的(S)-二氢吲哚-2-羧酸甲酯，以制备(S)-二氢吲哚-2-羧酸，然后回收所得的(S)-二氢吲哚-2-羧酸，
其中，所述水解酶选自由洒维奈斯、水解蛋白酶、脂肪酶243、蛋白酶、内肽酶、蛋白酶7、酰基转移酶所组成的组中。
9、根据权利要求8所述的方法，其中，缓冲溶液为碳酸钠水溶液，缓冲溶液的pH值维持在7至9。
10、根据权利要求8所述的方法，其中，选择性水解步骤在25-50℃下进行3-85小时。
11、根据权利要求8所述的方法，其中，水解酶与外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的重量比为1∶10-1∶40。
12、根据权利要求8所述的方法，其中，选择性水解步骤中外消旋二氢吲哚-2-羧酸甲酯的浓度范围为10-50％(重量/体积)。
13、根据权利要求8所述的方法，其中，水解酶为粉末或液体的形式，或者为固定在载体上的形式。
14、根据权利要求8所述的方法，其中，回收的(S)-二氢吲哚-2-羧酸的光学纯度至少为99％e.e.。
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