CN1774509A - 对映异构体富集的氨基戊腈的生物催化法制备 - Google Patents

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Abstract

提供了制备对映异构体富集的氨基戊腈的方法。所述方法包括在选自脂肪酶、酯酶和酰基转移酶的酶的存在下，进行3－氨基戊腈对映异构体混合物的选择性酰化，或者3－氨基戊腈酰胺对映异构体混合物的选择性水解。所述方法产生R－氨基戊腈，其可用于生产药物产品。

Description

对映异构体富集的氨基戊腈的生物催化法制备
技术领域
本发明涉及手性氨基戊腈化合物的生物催化法拆分。
背景技术
外消旋胺的手性拆分是制药工业中一种非常重要的方法，因为这些胺是有用的中间体，用以生产各种抗生素或者作为抑制性递质以控制某些神经疾病。生物活性强烈取决于其绝对构型，并且S和R异构体都具有潜在的治疗用途。传统上，化学手性拆分是通过使用手性化合物如酸与异构体之一进行立体选择性反应而实现，从而便于对映异构体的制备。
3-氨基戊腈(APN)是市售化合物，可以两种异构体形式R-APN和S-APN存在。传统上，R-APN手性拆分通过使APN的外消旋混合物与优选结合R-APN的联苯甲酰-L-酒石酸反应而实现。所得R-APN-联苯甲酰-L-酒石酸盐可被分离，并随后与甲基磺酸反应生成R-APN-甲基磺酸盐。
氨基戊腈的手性拆分需要有效、经济和方便的可供选择的方法。生物催化方法能够满足需要，因为酶通常表现出优异的对映选择性。另外，酶反应的特征在于其特异性和温和的反应条件，酶在APN手性拆分方面的应用尚未公开。
发明内容
提供了制备对映异构体富集的氨基戊腈的方法。所述方法包括选择性酰化反应，其中3-氨基戊腈(APN)的对映异构体混合物在生物催化剂的存在下与酰基供体反应。所述反应得到酰化对映异构体和非酰化对映异构体的混合物。酰化对映异构体可能是R-APN酰胺或S-APN酰胺，这取决于生物催化剂的选择性。酰化对映异构体可以从非酰化对映异构体中分离出来，并随后水解生成其他非酰化对映异构体。
作为选择，所述方法包括酰化APN对映异构体混合物在生物催化剂存在下的选择性水解。选择性水解产生酰化对映异构体和非酰化对映异构体的混合物。酰化对映异构体可以从非酰化对映异构体中分离出来，并水解生成其他非酰化对映异构体。
另外，所述方法可以基于APN对映异构体混合物的化学或酶法酰化，以产生酰化APN的对映异构体混合物，其被用作如上所述选择性水解的底物。
具体地，在本发明的一个实施方案中，制备对映异构体富集的APN的方法包括以下步骤：提供包含R-APN和S-APN的对映异构体混合物；在酶的存在下，使对映异构体混合物与酰基供体反应，以选择性酰化任一对映异构体，从而产生S-APN和酰化R-APN的混合物或者R-APN和酰化S-APN的混合物。该方法进一步包括分离酰化和非酰化对映异构体的步骤，以产生对映异构体富集的酰化R-APN或非酰化R-APN。另一步骤可包括使酰化R-APN水解产生R-APN。对APN酰化表现出对映体选择性的合适的酶包括脂肪酶和酯酶。又一步骤可包括使R-APN与联苯甲酰-L-酒石酸反应以产生R-APN-联苯甲酰-L-酒石酸盐，它可能进一步与甲基磺酸反应形成甲基磺酸盐。
在另一个实施方案中，制备对映异构体富集的APN的方法包括以下步骤：提供包含酰化R-APN和非酰化S-APN的对映异构体混合物，和在生物催化剂的存在下选择性水解酰化R-APN或酰化S-APN。具体而言，青霉素酰基转移酶是合适的酶，它具有水解酰化S-APN的对映体选择性。在使用青霉素酰基转移酶的特定反应中，产生R-APN-酰胺和S-APN的混合物。
该方法可进一步包括从S-APN中分离R-APN-酰胺、回收R-APN-酰胺和非选择性水解已回收的R-APN-酰胺来产生R-APN的步骤。非选择性水解步骤可包括化学或酶反应。在酶反应的情况下，能够用于催化反应的酶可包括水解酶(脂肪酶/酰基转移酶/酯酶)。
在可供选择的实施方案中，制备对映异构体富集的APN的方法的初始步骤是：提供含有R-APN和S-APN的第一对映异构体混合物，和使用酰基供体非选择性酰化R-APN和S-APN以产生含有酰化R-APN和酰化S-APN的第二对映异构体混合物。然后使用第二对映异构体混合物作为在合适的酶存在下选择性水解的底物，如上所述。
制备对映异构体富集的APN的方法可包括以下步骤：使已回收R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐，和回收R-APN-甲基磺酸盐。
根据下列描述和附图，本发明的其他目的和更多好处对本领域的普通技术人员来说将变得显而易见。
具体实施方式
为了促进对本发明原理的理解，将具体描述本发明的示范性实施方案。不过不应理解为本发明的范围因此而受到限制。本发明包括在所述装置和所述方法以及本发明原理的进一步应用方面的任何改变和进一步改进，这对本发明相关领域内的技术人员来说是很正常的。
本发明提供了生产对映异构体富集的APN的方法，使用立体选择性酶优选酰化或优选水解APN对映异构体之一，然后分离特定对映异构体。
酰化或水解的立体选择性源于酶分子活性中心中有利于优先结合相对于其他构型的底物的一种立体构型，并在酰化或水解反应中提供对这种立体构型更高活性的官能团位置的特定特征。
连接在APN分子立体中心的氨基的酰化可以通过在特定的反应条件下，在选定酶的存在下，使APN的对映异构体混合物与酰基供体反应而以立体特异性的方式实现。常用的APN对映异构体混合物是外消旋混合物，具有基本上等量的R-APN和S-APN。酰化反应可如下所示。
Figure A20038010905000081
特定的生物催化剂和酰基供体(RCOOR′)决定将要发生的反应路径，是S-APN将酰化，保留R-APN未反应，还是R-APN被酰化，保留S-APN未反应。在任何一种情况下，都能进行对映异构体的分离。此外，还需要另外的化学步骤以脱去酰化R-APN或酰化S-APN的酰基。
建立酶方法的关键在于了解酶是否能够作用于底物和酰基供体。此外，了解是否对于特定对映异构体有优先选择性也是同等重要的。虽然能够成为酰基供体的化合物是通常已知的，但并不是所有已知的酰基供体都能够用于酶选择性酰化反应。
如实施例1(在下面)中所述，测试了几种可能的酰基供体。许多酰基供体自发与APN反应，有些与特定的酶不相容。已经表明在由脂肪酶B催化的反应中酰化APN的酰基供体包括三氟乙基丁酸酯(丁酸酯TFE)、二-三氟乙基1，4-环己烷二羧酸、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、十二烷酸乙烯酯、丁基乙烯基碳酸酯、2，6-呋喃-二甲醇二乙烯基碳酸酯、1，6-己二醇二乙烯基碳酸酯、乙酸乙酯和乙酸丁酯(见表1)。另外，能够催化APN酰化反应的酶，除了脂肪酶B，还包括脂肪酶AL、CHIRAZYME L-10、脂肪酶PL、脂肪酶QL、CHIRAZYME L-1、脂肪酶L-10、脂肪酶AY-30、脂肪酶VII型、脂肪酶″CV″、脂肪酶″PN″、脂肪酶250型、脂肪酶PS-30、脂肪酶TL、脂肪酶″RN″、脂肪酶A-10FG、CHIRAZYME L-8、胆固醇酯酶和CHIRAZYME E-1(见实施例2和表2，CHIRAZYME是瑞士巴塞尔Roche公司的注册商标。)
已发现脂肪酶AL、脂肪酶PL、脂肪酶VII型、脂肪酶″PN″、脂肪酶TL、CHIRAZYME L-8、CHIRAZYME E-1对S-APN的酰化具有选择性，保留R-APN不被酰化(见实施例3、表3A)。
相反，已发现CHIRAZYME L-1、CHIRAZYME L-5、脂肪酶250型和脂肪酶PS-30对R-APN的酰化具有选择性，保留S-APN不被酰化(见实施例3、表3B)。
众所周知，酶法酰化反应的条件强烈影响反应速率和催化剂的立体选择性。下面是几个反应参数对APN与丁酸酯TFE的酶法酰化反应对映体选择性的影响的研究结果，特别强调由脂肪酶TL催化的过程。
温度.对于由溶剂甲基叔丁基醚(MTBE)中不同的酶催化的APN酰化反应的立体选择性，反应温度(在25-45℃范围内)没有表现出显著影响。
溶剂.应用乙腈比MTBE提供更低的APN酰化反应的对映选择性，并且选择MTBE作为APN立体拆分的反应溶剂。事实上，如四氢呋喃(THF)、甲苯、吡啶、1，4-二氧杂环己烷等溶剂已知是由脂肪酶和酯酶催化的反应中的可能介质。
试剂浓度.丁酸酯TFE的浓度是一个很重要的参数，其决定由MTBE中来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的脂肪酶TL催化的酶酰化反应的立体选择性。酰基供体过量于APN外消旋混合物的摩尔数增加(1-30倍)导致1.5-2倍的高反应立体特异性。
酶用量.APN与丁酸酯TFE的酰化反应在10mg固定化酶/mL有机溶剂的恒定浓度悬浮液中进行，酶的浓度对反应对映选择性的影响没有研究。然而，从文献可知，该参数，以及制备生物催化剂的方法(载体上的酶负载量、使用极性溶剂、表面活性剂等对固定化酶的处理)能够影响酶酰化的立体选择性。
水含量.0.4-4溶剂体积％(vol％)的溶剂含水量是有用的(见实施例4)。
除上述酰基供体和酶之外，其他酰基供体包括苯乙酸甲酯、苯氧基乙酸甲酯、苯基乙酰胺和苯乙酸可以与特定的酶如青霉素酰基转移酶一起使用(见实施例5)。
青霉素酰基转移酶还称作青霉素酰胺酶、青霉素G酰胺酶、青霉素氨基水解酶和青霉素V酰基转移酶。固定形式和游离形式的酶都可从许多商业来源得到(见表2)。青霉素酰基转移酶对于酰胺键是高活性的，且在宽的pH范围(5.4-11.0)内和适中的温度(10-45℃)下具有活性。青霉素酰基转移酶催化反应通常在水相中或者含水可混有机溶剂量等于10-30vol.％的主要由水组成的介质中进行。极性有机溶剂的受控加入便于底物(APN)的可混溶性/溶解性以保持青霉素酰基转移酶的活性。通常使用含水介质主要是因为已预知含水体系对于保持这种酶的活性是必需的。然而，已发现该酶在非水介质中也具有活性。使用青霉素酰基转移酶的酰化反应可以在包括乙腈、甲醇或MTBE的溶剂体系(见表5A-5D)中进行，或者在包括MTBE、甲苯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、二氯甲烷和苯的基本非极性有机体系中进行。APN浓度可以在0.02-0.5M范围内。APN的常用浓度是0.25M。酰基供体可以使用约0.04-0.5M范围的浓度。酰基供体的常用浓度是APN浓度的两倍。酶的用量可以在10-100mg/mL反应混合物的范围内。
由青霉素酰基转移酶催化的典型酰化反应在实施例6中示出。在该反应中，反应7小时后能够得到至多约72％的eeR-APN(见表6)。
青霉素酰基转移酶表现出对于S-APN酰化的对映体选择性，保留R-APN不被酰化，如实施例5和6所示。未反应的R-APN能够通过将其洗脱至水溶液中而从酰化S-APN中分离出来，或者能够容易地收集为甲基磺酸盐(将在下面描述)。由于R和S对映异构体酰化的相对速率明显不同，因此通过适当改变反应参数可以实现ee’s＞99％。反应可以间歇方法或者在连续柱式反应器中进行。
在酶反应过程中形成的S-APN-苯基乙酰胺可以分离出来并在富水环境中利用相同的酶进行水解。苯乙酸甲酯的MTBE溶液可以再循环。
在另一种方法中，制备对映异构体富集的APN的方法包括在酶的存在下，选择性水解含有酰化R-APN和酰化S-APN的对映异构体混合物。如下列反应式所示，青霉素酰基转移酶是适用于该选择性水解的酶。
Figure A20038010905000111
对映异构体混合物可包含R-APN-苯基乙酰胺和S-APN-苯基乙酰胺。由于青霉素酰基转移酶对S-APN更具活性，因此对映异构体混合物的酶催化水解将会形成S-APN和R-APN-苯基乙酰胺(见上面的反应式)。使用任何合适的传统化学技术，产物可被分离成S-APN和R-APN-苯基乙酰胺，后者可进一步利用相同的酶或其他化学方法在合适的条件下水解产生R-APN。
选择性水解反应可在水溶液、水-水混溶溶剂(5-30vol.％)例如乙腈、甲醇等中进行，或者在一定pH值范围内的两相的水-水不混溶非极性有机溶剂中进行(见实施例7)。
在可供选择的方法中，制备对映异构体富集的3-APN的方法首先是酰化APN的外消旋混合物以产生酰化APN的外消旋混合物。该酰化步骤不是选择性酰化反应，因此R-APN和S-APN都被酰化。非选择性酰化涉及化学反应(见实施例8)。适用于该反应的酰基供体包括苯乙酰氯。使用苯乙酰氯作为酰基供体，所得对映异构体混合物包含基本等量的S-APN-苯基乙酰胺和R-APN-苯基乙酰胺。如上所述，所得APN-苯基乙酰胺的对映异构体混合物可酶促选择性水解。
如前所述，本发明的方法可包括从APN的非酰化对映异构体中分离酰化对映异构体的步骤。该分离步骤可以使用任何合适的分离方法进行。一个实施例是使酰化S-APN和非酰化R-APN的混合物与联苯甲酰-L酒石酸反应，联苯甲酰-L酒石酸对于结合R-APN具有选择性，产生R-APN-联苯甲酰-L酒石酸盐。该盐可从混合物中沉淀并分离出来，产生对映异构体富集的R-APN-联苯甲酰-L酒石酸盐(见实施例9)。R-APN-联苯甲酰-L酒石酸盐可进一步与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐，它是一种用于生产药物分子的有用化合物。
APN的酰化对映异构体和非酰化对映异构体混合物可以直接与甲基磺酸反应，而不经过与联苯甲酰-L酒石酸反应的步骤。在该反应中，R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN甲基磺酸盐(见实施例10)。
为了测定APN或APN酰胺的R-和S-对映异构体的相对量，使用标准手性和非手性液相色谱技术分析酰化反应产物。可使用高效液相色谱(HPLC)测定每种对映异构体的相对比例。
用来测定R-和S-APN的分析方案的实施例如下所示。APN最初由邻苯二甲醛和Boc-L-半胱氨酸衍生而来，并利用HPLC分析。通过向50mg邻苯二甲醛中加入128mg N-叔丁氧羰基L-半胱氨酸，溶解在1.0mL甲醇中并使用pH10.4的0.4N硼酸钾缓冲液稀释至5mL来制备衍生试剂。将这样制备的20μL试剂加入到30μL APN溶液(约2微摩尔)中，并使用pH10.4的40μL硼酸盐缓冲液进一步稀释。将衍生试样注入到保持在40℃的ZORBAX C-18柱(150×4.6mm)(ZORBAX是特拉华州威尔明顿的杜邦公司的注册商标)上，并使用含10％(v/v)乙腈的pH6.2的75∶25磷酸盐缓冲液(0.015M)进行等度洗脱。使用UV检测器在338nm的波长处得到洗脱曲线。
HPLC分析结果可用于确定以对映异构体过量(％ee)为单位的光学纯度，利用下列公式计算：
％eeR-APN＝100([R-APN]-[S-APN])/([R-APN]+[S-APN])
％eeS-APN＝100([S-APN]-[R-APN])/([S-APN]+[R-APN])
对映异构体的进一步鉴定可使用核磁共振(NMR)技术进行。
                          实施例1
                        酰基供体筛选
为了选择不与APN自发反应但仅仅能够参与由酶催化的反应的酰基供体，测试了67种酰基供体与APN自发反应的可能性。酰基供体选自烷基乙酸酯(OAc)、乙烯酯(VE)、乙烯基碳酸酯(ViCarb)和不同羧酸的三氟乙基酯(TFE)。APN(在来自杜邦尼龙专业机构的分析证书上显示为99.5％的纯度)和酰基供体的对照反应设定如下；将0.5mLAPN溶解在20mL甲基叔丁基醚(MTBE)中(0.25M)，向0.25mL该溶液中加入20μL或20mg酰基供体，将所得溶液或悬浮液在40℃放置过夜。14小时的反应时间后取样并利用气相色谱(GC)分析。在67种酰基供体中，23种供体表现出与APN有些自发反应，将它们排除在进一步研究之外。然后从剩余的44种酰基供体中选择用于APN酶酰化反应的试剂。
然后在由南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CHIRAZYME L-2)催化的APN酶酰化反应中测试选定的酰基供体。选择脂肪酶B进行筛选是因为已知该酶在不同酰基受体的酰化反应中具有高活性和宽底物特异性。以10mg/mL的量将酶加入到反应混合物中。这里使用GC法确定反应转化率，但是不允许由S-APN和R-APN形成的酰化产物各自拆分。因此，GC图中的单峰与乙酰化形式的S-和R-APN的对映异构体混合物相对应。在由脂肪酶B催化的APN酰化反应中，以上述相同的反应条件，将列于表1的十三种化合物作为酰基供体进行了测试。
表1.由南极假丝酵母脂肪酶B催化，使用选定酰基供体反应18小时后APN的转化率
  酰基供体   转化率(％)
  丁酸酯TFE1，4-环己烷二羧酸二TFE苯甲酸VE*丁酸VE*己酸VE*十二烷酸VE*丁基ViCarb*2，6-呋喃二甲醇二ViCarb*1，6-己二醇二ViCarb*EtOAcBuOAc   10064911001007218100126891
*在与这些酰基供体反应中形成几种反应产物
在不同组的酰基供体中，使用三氟乙基乙酸酯(TFE)得到最好的结果，其在与APN的反应中产生单一产物(表1)。选择丁酸酯TFE作为最有可能的试剂，因为其与APN的反应在相当短的反应时间内便得到好的产量，这实际上能够便于建立APN立体拆分方法。虽然与其他TFE化合物的反应进行较慢，但是它们也能够用作APN立体分离的酰基供体。表1中的其他酰基供体对于建立APN立体拆分方法的便利性稍差，因为它们会形成多种反应产物。在与乙烯酯的反应中，由于乙烯酯的水解，导致形成少量乙醛，而且这种醛能够在与APN的非酶反应中形成席夫碱，其为伴随酶反应所产生的酰胺的副产物。由于碳酸酯基团的双官能特征，导致乙烯基碳酸酯能够与两种受体分子反应，也会生成几种反应产物。
                            实施例2
                      酶(脂肪酶/酯酶)筛选
使用丁酸酯TFE作为酰基供体，APN作为丁酸酯基团的受体，进行全面的脂肪酶/酯酶筛选。总共筛选了70种脂肪酶/酯酶催化剂。筛选设定如下：将2.5mL丁酸酯TFE和0.9mL的APN(如前述所制备)加入到36mL MTBE中，并对溶液进行旋涡搅拌。然后将0.4mL该溶液加入到含有在9×8平板中排布脂肪酶/蛋白酶粉末的试管中，在45℃振荡反应。反应混合物的GC分析表明几种酶以很高的转化率(＞80％)催化外消旋APN酰化反应(表2)。这个事实意味着APN的两种对映异构体：R-APN和S-APN在酰化反应中是有反应性的。这些酶在反应中不表现出任何显著的对映体选择性。因此，在进一步的试验中，不再研究这些酶。许多脂肪酶和蛋白酶的活性不足，因为它们表现出低转化率(＜25％)。因此，表现出低转化率的酶不包括在进一步的筛选试验中。
最适于进一步催化剂开发的是反应转化率为约50±10％的酶。对于这个数字的可能解释是在这些反应中，只有一种对映异构体(R-APN或者S-APN)与酰基供体反应，而另一种对映异构体保持不反应。结果，鉴别出十三种酶，其作为APN光学拆分催化剂进行进一步研究(表2)。
选自表2名单中的十三种脂肪酶/酯酶催化剂在使用丁酸酯TFE的APN酰化反应中进行了进一步测试。反应转化率使用GC法进行评估，手性HPLC可以测定反应混合物中未反应的R-APN和S-APN的量。通过分析这些组合使用方法的结果，未反应的和酰化的R-APN和S-APN的量都可以计算出来。
表2.用于在使用TFE丁酸酯的APN酰化反应中筛选催化剂的酶，其在18小时后的反应转化率为约50±10％
  酶   来源   载体   生产商   转化率(％)
  脂肪酶ALCHIRAZYME L-10脂肪酶PL脂肪酶QLCHIRAZYME L-1脂肪酶L-10脂肪酶AY-30脂肪酶VII型脂肪酶“CV脂肪酶“PN”脂肪酶250型脂肪酶PS-30脂肪酶TL脂肪酶“RN”脂肪酶A-10FGCHIRAZYME L-8胆固醇酯酶CHIRAZYME E-1   产碱菌属产碱菌属产碱菌属产碱菌属洋葱伯克霍尔德菌解脂假丝酵母皱褶假丝酵母皱褶假丝酵母粘稠色杆菌胡须霉猪胰脏洋葱假单胞菌施氏假单胞菌雪白根霉米根霉菌Thermomyces sp.猪胰脏猪肝脏   AccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaAccurelaPowderCeliteb   Meito Sangyo1Roche2Meito Sangyo1Meito Sangyo1Roche2Amano3Anano3Sigma4Finn Sugar5Wako6Solvay7Amano3Meito Sangyo1Fluka8Nagase9Roche2Sigma4Roche2   54.047.156.550.156.447.940.944.248.649.555.950.256.048.958.950.555.144.4
1.Meito Sangyo Co.，Nishi-Ku Nagoya，Japan；2.Roche Corp.，Basel，Switzerland；3.Amano Enzyme Inc.，Nagoya，Japan；4.Sigma Aldrich Corp.，St Louis，MO，USA；5.Finnsugar Bioproducts，Helsinki，Finland，6.Wako Chemicals GmbH，Neuss，Germany；7.Solvay S.A.，Brussels，Belgium；8.Fluka，Buchs SG，Switzerland；9.Nagase，Tokyo，Japan；a.Accurel Type EP100(MP 1004)，粒径200-400微米，是Akzo Nobel Faser AG，Obernburg Germany的产品；b.Celite公司.2500 Miguelito.Lompoc，CA，USA.
                             实施例3
                       选定酶的对映体选择性
首要目标是找到这样的酶，其能够特异性酰化S-APN而保留尽可能多的未反应的R-APN，然后从S-APN和酰化形式的R-和S-APN中分离出未酰化R-APN。这些酶应提供高的eeR-APN值。发现(表3A)许多被测试的酶表现出这种对映体选择性，并因此能够用于提高酰化反应混合物中R-APN超出S-APN的相对量。根据它们的高eeR-APN值，脂肪酶AL和TL属于该组酶中最好的催化剂。
表3A.在酰化反应中对于S-APN表现出高对映体选择性、产生高的R-APN对映异构体过量(eeR-APN)的酶
  脂肪酶/酯酶   来源   转化率(％)24h内   eeR-APN(％)
  AL，产碱菌属PL，产碱菌属VII型，皱褶假丝酵母PN，胡须霉TL，施氏假单胞菌CHIRAZYME L-8，Thermomycesp.CHIRAZYME E-1，猪肝脏酯酶   MeitoSangyoMeitoSangyoSigmaWakoMeitoSangyoRocheRoche   85784568988668   70156991266
第二个目标是找到能够特异性酰化R-APN而保留尽可能多的未酰化S-APN的酶。然后可将酰化R-APN和未酰化S-APN分离。之后，利用化学或酶方法，使分离出来的酰化R-APN水解成R-APN。这里为了成功应用，酶应具有高的eeS-APN值。在所有被测试的脂肪酶和酯酶中，CHIRAZYME L-5和脂肪酶PS-30是其中最有效的酶(见表3B)。
表3B.在酰化反应中对于R-APN表现出高对映体选择性、产生高的S-APN对映异构体过量(eeS-APN)的酶
 脂肪酶/酯酶   来源   转化率(％)24h内   eeS-APN(％)
 CHIRAZYME L-1，洋葱伯克霍尔德菌CHIRAZYME L-5，南极假丝酵母250型，猪胰脏PS-30，洋葱假单胞菌   RocheRocheSolvayAmano   99996192   2895556
                             实施例4
              含水量对外消旋APN酶法酰化反应的影响
由不同酶催化的与丁酸酯TFE进行的APN酰化反应的立体选择性取决于有机溶剂中的含水量，这利用Karl Fisher滴定法测定。这个结论可能对于APN立体拆分的实用方面具有重要影响。为了验证这个结论，向MTBE中加入不同量的水，进行反应。所有其他条件包括：1mL的MTBE，25μL的外消旋APN(如前述所制备，75μL的TFE丁酸酯，5mg的固定化酶，在45℃进行反应。通过将2mL干燥的MTBE与2mL水混合制备水饱和溶剂。表4中的结果表明增加含水量会降低酶的对映体选择性。
表4在由施氏假单胞菌脂肪酶TL催化的与丁酸酯TFE进行的APN酰化反应中，反应转化率和产物立体选择性与向MTBE中加入的不同量的水之间的函数关系
  含水量μL/mL MTBE   转化率(％)6小时反应  eeR-APN(％)6小时反应   转化率(％)24小时反应   eeR-APN(％)24小时反应
  471015203040水饱和   79.574.675.475.074.475.572.5  44383736323127   95.292.693.393.093.293.792.646.3   857878736966629
                            实施例5
在不同的缓冲液中进行的由青霉素酰基转移酶催化的APN选择性酰化反应
使用不同的溶剂和反应条件进行了几组酰化反应。在一组反应中，向每个反应小瓶中加入30mg/mL青霉素酰基转移酶(PGA-450)、0.1M磷酸盐(pH＝6.0)或硼酸盐(pH＝10.4)，0.04M APN外消旋混合物、0.07M酰基供体和一定量的溶剂进行1.0mL的反应。温度保持在45℃或者室温。反应持续进行22小时，之后分析反应样品。表5中的报告结果表明当使用苯乙酸甲酯或苯基乙酰胺作为酰基供体时，青霉素酰基转移酶在酰化APN时具有催化效果。还表明该酶对于S-APN的酰化具有选择性，保留R-APN不被酰化。
表5A在缓冲极性溶剂中APN的选择性酰化
  pH   酰基供体   温度(℃)   溶剂   溶剂(％)   eeR-APN(％)
  10.410.410.410.410.410.46.06.06.06.06.06.0   苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酸甲酯苯乙酰胺苯乙酸甲酯苯乙酰胺苯乙酸甲酯苯乙酰胺   454545454545室温室温室温室温室温室温   -乙腈甲醇-乙腈甲醇--乙腈乙腈甲醇甲醇   -1010-1010--10101010   6480242828412
在另一组反应中，以苯乙酰胺和苯乙酸甲酯为酰基供体制备进行1.0mL反应的反应小瓶。向包含2μL APN的每个小瓶中加入PGA-450＝30mg、0.2mL缓冲液(pH＝6.0，0.5M)。24小时后分析反应样品。结果(表5B)表明，在pH6.0时，青霉素酰基转移酶在催化APN酰化方面是有效的。甲醇表现为合适的共溶剂。反应产物表现出1.2-26.7之间的％eeR-APN。
表5B pH6.0时APN的选择性酰化
  酰基供体   酰基供体(M)   溶剂(％)   溶剂   温度(℃)   eeR-APN(％)
  苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酰胺苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯   0.10.10.10.10.10.10.10.10.350.350.350.350.350.350.350.350.350.35   00101020203030001010202030308080   --甲醇甲醇甲醇甲醇甲醇甲醇--甲醇甲醇甲醇甲醇甲醇甲醇MTBEMTBE   254525452545254525452545254525452545   6.410.811.812.426.714.312.44.75.219.310.318.121.48.511.01.211.222.8
在另一组反应中，溶剂体系通过用水预饱和MTBE而制备。在所有的反应小瓶中，在加入0.6mL的MTBE同时，加入20mg酰基供体、10mg酶PGA-450 P和20微摩尔APN。加入磷酸盐缓冲液(pH＝6.0；0.5M)以调整相体积比。18小时之后，向每个小瓶中加水，使所有小瓶中的总含水量保持相等，以弥补挥发损失。混合之后，分析水相，得到衍生APN之后的％eeR-APN。表5C中的数据表明，除了苯乙酸甲酯外，苯氧基乙酸甲酯和苯乙酸也可用作酰基供体。在该两相体系中，青霉素酰基转移酶在APN酰化方面是有效的。在45℃下进行的反应通常得到更高的％eeR-APN，可达33.6％。
表5C两相体系中APN的选择性酰化
  酰基供体   温度(℃) 溶剂∶水比率   eeR-APN(％)
  苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯乙酸甲酯苯氧基乙酸甲酯苯氧基乙酸甲酯苯乙酸苯乙酸   rtrtrt454545rt45rt45   0.860.800.350.860,500.350.500.500.500.50   17.01.42.533.63.82.31.92.50.71.7
rt＝室温
在另一组试验中，以苯乙酸甲酯作为酰基供体，连同10mg的PGA-450，加入水饱和MTBE(0.6mL)得到反应混合物。使用0.5M磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)调整缓冲液比例。每个小瓶中的酶使用缓冲液预平衡几分钟，然后加入APN和酰基供体，进行1.0mL的反应。在18小时处分析反应混合物并测定％eeR-APN。结果(表5D)表明，在非水介质中，青霉素酰基转移酶催化反应可以得到＞99％eeR-APN的对映异构体过量。
表5D：主要为非水溶液的介质中APN的选择性酰化：(pH＝6.0)
  温度(℃) 苯乙酸甲酯(M)   缓冲液(％)   APN(M)   eeR-APN(％)
  4040404040404010   0.20.20.20.20.040.040.040.04   00.41.78.31.71.71.74.0   0.0330.0330.0330.0330.0330.0850.1700.033   ＞85＞99＞9964.062.030.014.040.0
                           实施例6
       非极性有机溶剂中青霉素酰基转移酶催化APN反应的典型反应
将3.0g青霉素酰基转移酶(PGA-450)和0.15mL水加入到小瓶中。然后摇动小瓶15分钟，并保持在4℃放置过夜以达平衡。向500mL三颈烧瓶中，加入100mL水饱和MTBE、2.5mL的APN和7.5mL苯乙酸甲酯。在室温下使用顶置式搅拌器搅拌反应混合物。在连续搅拌的同时向该混合物中加入平衡酶。通过使用前述的手性拆分方法分析取自该反应溶液中的样品来跟踪反应进度。不同时间间隔的R-APN对映异构体过量示于表6。
表6：随反应时间增加的R-APN产量
  时间(min.)   eeR-APN(％)
  03060120210300420   0.47.613.025.541.556.472.0
                        实施例7
在不同缓冲液中由青霉素酰基转移酶催化的选择性水解
通常进行如下三组反应。对于在缓冲介质中的反应，将APN-苯乙酰胺转移到2.5mL的玻璃小瓶中，并向该小瓶中加入青霉素酰基转移酶(PGA-450)，然后加入缓冲液。对于在缓冲液-溶剂混合物中的反应，将APN-苯乙酰胺溶解在溶剂/水混合物中，加入酶，即青霉素酰基转移酶(PGA-450)之后，将计算量的该溶液转移到小瓶中，使反应体积为1.0mL，然后使用磁力搅拌器连续搅拌反应混合物。
水解反应之后，使用HPLC测定不同时间间隔所形成的3-氨基戊腈苯乙酰胺和苯乙酸的浓度。将用乙腈稀释后的反应混合物注入到PHENOMENEX C18柱(PHENOMENEX是CA，Torrence的Phenomenex的注册商标)上，并以含有(0.1％高氯酸)的乙腈∶水混合物(40∶60)洗脱，同时使用UV检测器在254nm处得到洗脱曲线。
研究(表7A)表明，APN-苯乙酰胺可以在极性溶剂如乙腈的存在下，利用青霉素酰基转移酶水解。结果表明，青霉素酰基转移酶对于S-APN-苯乙酰胺水解的活性更大，产生对映异构体过量的S-APN，保留R-APN-苯乙酰胺不反应。在该具体研究中，使用0.1M的APN-苯乙酰胺。使用0.5M磷酸盐或碳酸氢盐缓冲液调整pH。18小时后进行分析。
表7A极性溶剂存在下APN-苯乙酰胺的水解
  PGA-450(mg)   pH   溶剂   eeS-APN(％)
  10010010010060606060   6.07.08.09.06.07.08.09.0   ----5％乙腈5％乙腈5％乙腈5％乙腈   3010421881010
研究(表7B)表明，APN-苯乙酰胺的选择性水解也可以使用包含MTBE的溶剂进行。反应的pH也可以在约6-约9内变化。在该具体实验中，将65微摩尔APN-苯乙酰胺连同10mg酶PGA-450一起使用。反应使用0.025mL的0.5M磷酸盐和碳酸氢盐溶液进行缓冲。为了测定％ee，将反应混合物的溶剂在氮气流中进行干燥，加入水以将体积补足到1.0mL，并利用HPLC进行分析。
表7B MTBE存在下由PGA-450对APN-苯乙酰胺的水解
  pH   温度(℃)   总体积(mL) 溶剂-水比率   eeS-APN(％)
  6.06.06.06.07.07.07.07.08.08.08.09.09.0AA   252545452525454525254525252525   0.61.00.61.00.61.00.61.00.61.00.60.61.00.61.0   0.830.500.830.500.830.500.830.500.830.500.830.830.500.830.50   24.031.221.722.224.026.324.418.916.421.120.128.328.121.319.7
A-表示未经缓冲的溶液
表7C中的研究表明，APN-苯乙酰胺的选择性水解可在较低pH(4.7-6.0)的两相溶剂体系中进行。在该研究中，反应利用磷酸盐(pH＝6.0)、乙酸盐(pH＝4.7)、柠檬酸盐(pH＝5.5)和甲酸盐(pH＝5.5x)进行缓冲。每个小瓶中均有10mg的PGA-450、0.02mL缓冲溶液(0.5M)和65微摩尔APN-苯乙酰胺。使用两相溶剂体系，其中含有MTBE与水相的比率为1∶1。分析水相中的产物(测定％eeS-APN)。
表7C两相体系中APN-苯乙酰胺的选择性水解
  pH   温度(℃)   eeS-APN(％)
  6.06.06.04.74.74.75.55.55.55.5x5.5x5.5x   40室温1040室温1040室温1040室温10   25.228.833.425.031.534.522.729.734.618.827.233.5
                          实施例8
                利用化学反应生成3-APN-苯乙酰胺
酰化(酰胺化)反应在Schotten-Baumann条件下进行如下。在50mL水中溶解5g NaOH，并加入5mL APN外消旋混合物(4.665g；d＝0.933；0.0475摩尔；M.W.＝98.15)，再加入8mL苯乙酰氯(9.3g；0.06摩尔)，在室温下搅拌2小时。用乙酸乙酯(30mL)萃取酰胺，并用水洗涤乙酸乙酯层。使用丙酮/干冰阱通过旋转蒸发除去溶剂。在加入几mL甲醇并除去溶剂后，进一步干燥化合物。收集所形成的沉淀，并在真空干燥器中进行干燥。产量＝8.7克(85％)，利用NMR对产物进行确认。
                         实施例9
           R-氨基戊腈联苯甲酰-L-酒石酸盐的生成
将外消旋APN(5mL)和丁酸酯TFE(15mL)加入到0.2L的MTBE中。然后，加入1.0g由Meito Sangyo生产并固定在Accurel上的脂肪酶TL(施氏假单胞菌)，该悬浮液在45℃的恒温振荡器(250rpm)中反应8小时。通过将该悬浮液冷却到20℃并在玻璃漏斗上使用滤纸将固定化催化剂滤出而终止反应。将反应混合物浓缩为油之后，使用乙酸乙酯稀释该油。接着，加入存在于乙酸乙酯/水(8∶1)中的0.7meq联苯甲酰-L-酒石酸，并收集固体。对该固体的手性HPLC分析表明具有26％S-APN和74％R-APN(ee.48％)。
                        实施例10
               R-氨基戊腈甲基磺酸盐的生成
室温下，将外消旋APN(0.25M)、苯乙酸甲酯(0.5M)和3g青霉素酰基转移酶(青霉素G酰胺酶)在100mL水饱和MTBE中混合。在不同时间，移出样品，并利用HPLC进行分析。7小时后，此时产物(R-APN)的ee＞72％，通过将酶滤出而终止反应。使用额外的MTBE来洗涤酶，然后将其加入到反应溶液中。
将110mL反应溶液试样在减压条件下浓缩得到油。使用7mL的EtOAc稀释该油，并加入1.1mL甲基磺酸(MsOH)，在室温下搅拌16小时。将该浆液冷却到0-5℃，通过过滤收集固体。使用EtOAc(2×25mL)清洗滤饼，并干燥(45℃，真空箱)得到含R-APN-甲基磺酸盐(R-APN-MsOH)的白色固体(0.67g，87％ee，59％产率)。
虽然在前面的内容中，对本发明进行了详细的说明和描述，但其在本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。应该理解仅示出和描述了示例性的实施方案，在本发明实质范围内的所有变化和改进都将受到保护。

Claims (56)

1.一种制备对映异构体富集的3-氨基戊腈的方法，包括以下步骤：
提供包含R-3-氨基戊腈(R-APN)和S-3-氨基戊腈(S-APN)的对映异构体混合物；和
在酶的存在下，使对映异构体混合物与酰基供体反应，以选择性酰化R-APN和S-APN之一。
2.权利要求1的方法，其中所述对映异构体混合物是包含基本等量的R-APN和S-APN的外消旋混合物。
3.权利要求1的方法，其中所述酶选自CHIRAZYME L-1、CHIRAZYME L-5、来自猪胰脏的250型和PS-30。
4.权利要求3的方法，其中所述反应步骤产生S-APN和酰化R-APN的混合物。
5.权利要求4的方法，其还包括分离S-APN和酰化R-APN的步骤。
6.权利要求5的方法，其还包括下列步骤：
水解已分离出的酰化R-APN，产生R-APN。
7.权利要求6的方法，其中所述水解步骤在水解酶的存在下进行。
8.权利要求7的方法，其中所述水解酶包括脂肪酶和酯酶。
9.权利要求1的方法，其中酶选自脂肪酶AL、脂肪酶PL、脂肪酶VII型、脂肪酶PN、脂肪酶TL、CHIRAZYME L-8和CHIRAZYME E-1。
10.权利要求9的方法，其中所述反应步骤产生R-APN和酰化S-APN的混合物。
11.权利要求10的方法，其还包括分离R-APN和酰化S-APN的步骤。
12.权利要求11的方法，其中所述分离步骤包括使R-APN和酰化S-APN的混合物与联苯甲酰-L-酒石酸反应以产生R-APN-联苯甲酰-L-酒石酸盐。
13.权利要求11的方法，其还包括水解已分离出的酰化S-APN以产生S-APN的步骤。
14.权利要求11的方法，其中所述水解步骤在水解酶的存在下进行。
15.权利要求14的方法，其中水解酶选自脂肪酶和酯酶。
16.权利要求1的方法，其中酰基供体选自三氟乙基丁酸酯、二-三氟乙基1，4-环己烷二羧酸、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、十二烷酸乙烯酯、丁基乙烯基碳酸酯、2，6-呋喃-二甲醇二乙烯基碳酸酯、1，6-己二醇二乙烯基碳酸酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯乙酸、苯乙酸甲酯、苯氧基乙酸甲酯和苯乙酰胺。
17.权利要求16的方法，其中酶选自脂肪酶和酯酶。
18.权利要求17的方法，其中酶选自脂肪酶AL、CHIRAZYME L-10、脂肪酶PL、脂肪酶QL、CHIRAZYME L-1、脂肪酶L-10、脂肪酶AY-30、脂肪酶VII型、脂肪酶″CV″、脂肪酶″PN″、脂肪酶250型、脂肪酶PS-30、脂肪酶TL、脂肪酶″RN″、脂肪酶A-10FG、CHIRAZYME L-8、胆固醇酯酶和CHIRAZYME E-1。
19.权利要求18的方法，其中所述酰基供体是三氟乙基丁酸酯，酶是脂肪酶TL。
20.权利要求18的方法，其中所述反应步骤在有机溶剂的存在下进行。
21.权利要求20的方法，其中有机溶剂选自甲基叔丁基醚、四氢呋喃、甲苯、吡啶，和1，4-二氧杂环己烷、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、二氯甲烷、苯。
22.权利要求1的方法，其中酰基供体摩尔过量于对映异构体混合物1-30倍。
23.权利要求20的方法，其中有机溶剂中的含水量为甲基叔丁基醚的0.4-4体积％。
24.权利要求1的方法，其中所述反应步骤在25℃-45℃的温度下进行。
25.权利要求1的方法，其中对映异构体混合物的浓度范围为约0.02M-0.5M。
26.权利要求25的方法，其中对映异构体混合物的浓度为约0.25M。
27.权利要求1的方法，其中酰基供体的浓度范围为约0.04M-0.5M。
28.权利要求27的方法，其中酰基供体的浓度为约0.25M。
29.权利要求1的方法，其中酰基供体的量是对映异构体混合物的两倍。
30.权利要求1的方法，其中所述反应步骤在反应混合物中进行，并且其中每mL反应混合物中存在约10mg-100mg的酶。
31.权利要求1的方法，其中酶包括青霉素酰基转移酶。
32.权利要求31的方法，其中酰基供体选自苯乙酸、苯乙酸甲酯、苯氧基乙酸甲酯和苯乙酰胺。
33.权利要求32的方法，其中所述反应步骤在有机溶剂的存在下进行。
34.权利要求33的方法，其中所述有机溶剂是甲基叔丁基醚。
35.权利要求1的方法，其中酶是固定化酶。
36.权利要求5的方法，其还包括以下步骤：使已分离出的R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐；并回收所述的R-APN-甲基磺酸盐。
37.权利要求10的方法，其还包括以下步骤：使已分离出的R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐；并回收所述的R-APN-甲基磺酸盐。
38.一种制备对映异构体富集的3-氨基戊腈的方法，包括以下步骤：
提供包含酰化R-APN和酰化S-APN的对映异构体混合物；和
在酶的存在下，对酰化R-APN和酰化S-APN之一进行选择性水解。
39.权利要求38的方法，其中对映异构体混合物包含R-APN-苯乙酰胺和S-APN-苯乙酰胺。
40.权利要求39的方法，其中酶包括青霉素酰基转移酶。
41.权利要求40的方法，其中所述选择性水解步骤产生R-APN-苯乙酰胺和S-APN的混合物。
42.权利要求41的方法，其还包括分离R-APN-苯乙酰胺和S-APN的步骤。
43.权利要求42的方法，其还包括水解已分离出的R-APN-苯乙酰胺以产生R-APN的步骤。
44.权利要求43的方法，其还包括以下步骤：使已分离出的R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐；并回收所述的R-APN-甲基磺酸盐。
45.权利要求42的方法，其中所述水解步骤在水解酶的存在下进行。
46.权利要求45的方法，其中水解酶选自脂肪酶和酯酶。
47.一种制备对映异构体富集的3-氨基戊腈的方法，包括以下步骤：
提供包含R-APN和S-APN的第一对映异构体混合物；
在酰化反应中使用酰基供体酰化R-APN和S-APN，产生包含酰化R-APN和酰化S-APN的第二对映异构体混合物；和
在酶的存在下，对酰化R-APN和酰化S-APN二者之一进行选择性水解。
48.权利要求47的方法，其中酰基供体是苯乙酰氯，并且第二对映异构体混合物包含R-APN-苯乙酰胺和S-APN-苯乙酰胺。
49.权利要求48的方法，其中酶包括青霉素酰基转移酶。
50.权利要求49的方法，其中所述选择性水解步骤产生R-APN-苯乙酰胺和S-APN的混合物。
51.权利要求50的方法，其还包括分离R-APN-苯乙酰胺和S-APN的步骤。
52.权利要求51的方法，其还包括水解已分离出的R-APN-苯乙酰胺以产生R-APN的步骤。
53.权利要求52的方法，其还包括以下步骤：使已分离出的R-APN与甲基磺酸反应形成R-APN-甲基磺酸盐；并回收所述的R-APN-甲基磺酸盐。
54.权利要求52的方法，其中所述水解步骤在酶反应中进行。
55.权利要求54的方法，其中酶反应在水解酶的存在下进行。
56.权利要求55的方法，其中水解酶选自脂肪酶和酯酶。
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