CN1767843A - 从沙棘种子中制备抗菌剂和抗氧化剂部位的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌剂和抗氧化剂部位的一步法。

Description

从沙棘种子中制备抗菌剂和抗氧化剂部位的方法
发明领域
本发明涉及从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌剂和抗氧化剂部位的一步法。
发明背景
由于细菌和真菌感染的存在，多年来对食物变质一直非常关注，并且其引起了世界范围内50％的损失[El-Ghaouth A.Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology 1997；19：160]。随着对食物中合成化学制剂疾病效果关注和报道的增加，对非毒性的天然防腐剂的需求不断增加。据报道，许多存在于浆果中的化合物都具有生物学活性，是抗菌剂、对抗疗法剂、抗氧化剂并具有诸如组织再生活性的生物调节性质[XuMingyu et al.1993.沙棘抗菌实验简报(A brief report on antibacterialexperiment using seabuckthorn).Seabuckthorn 6：28-29]。报道认为沙棘(seabuckthorn)浆果拥有抗菌性、抗氧化剂、抗炎症、抗过敏以及止痛的活性[Benavente-Garcia O，Castillo J，Martin FR，Ortuno A，Del Rio JA.Joumalof Agriculture and Food Chemistry 1997；45：4505]。沙棘是生长广泛的植物，属于沙棘属茱萸科。沙棘已被用于藏药和蒙古药中(Lu Rongsen，1992.沙棘：脆弱高山的多植物物种(Seabuckthom：A multiple plant species for fragilemountains).International center for integrated mountain development，ICIMODoccasional paper No.20，Kathmandu，Nepal)。沙棘是奇异的植物，在两年的多刺小枝上结有从桔黄到红色的小果实。这些类似浆果的果实是从子房或花萼发育而来的，并与子房相连。浆果含有许多生物活性物质，并可用于对如心血管疾病、癌症、急性高原病等若干疾病的治疗。已报道了总数超过300种涉及沙棘的不同药物制剂(Singh，2001.International workshop onseabuckthorn，during 18-21 Feb 2001，New Delhi)。
对文献的调查显示，目前还没有从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的种子中分离抗菌剂和抗氧化剂部位的报道。
发明目的
本发明的主要目的在于提供为制备具有抗菌剂和抗氧化剂活性的生物活性部位的一步法。因此，我们开发了从所述沙棘(Hippophaerhamnoides L.)的非传统部分制备生物活性部位的方法，而这一非传统部分到目前为止还不具有商业价值。
本发明的另一目的在于提供从可用作潜在的天然防腐剂的沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌剂和抗氧化剂部位的技术。
本发明的又一目的在于提供从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分大规模制备抗菌剂和抗氧化剂部位的有效方法。
本发明的再一目的在于提供从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌剂和抗氧化剂部位的一步法。
本发明的又一目的在于提供使用简单提取方法和溶剂的有效方法，其可再次用于从沙棘制备抗菌剂和抗氧化剂部位。
发明概述
因此，本发明提供了制备抗菌剂和抗氧化剂部位的一步法，包括用自来水洗涤沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的种子来去除任何尘土和外源物质，而后在40-50℃干燥3-4小时；将沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的种子磨粉以获得大小为60-80目的颗粒；以55-60℃在索克斯雷特(Soxhlet)萃取器中用左旋系列溶剂(升序排列的洗提作用)，随后用甲醇对上述材料进行8-9小时萃取；使用Whatman 41号滤纸对上述提取物过滤以获得无颗粒提取物；在60-65℃在蒸馏单元中蒸馏上述提取物来回收最高达80-90％的所述溶剂，该溶剂可进一步再循环用于在索克斯雷特单元中另外的萃取；在45-50℃、在闪蒸器中采用200-250毫巴(mbar)的压力的真空条件下对所述无颗粒提取物进行浓缩，从而得到甲醇粗提取物；对于抗氧化剂活性采用冷冻干燥，或对于抗菌活性，在40-50℃、采用175-200毫巴压力在真空炉中保持8-9小时对上述浓缩粗提取物进行干燥。
通过DPPH方法的分别测定，这样获得的干燥产物对不同的革兰氏阳性和阴性细菌具有以最小抑制浓度(μg/ml)定义的200-350μg/ml的抗菌活性，以及在10-50μg/ml浓度具有自由基清除活性％定义的40.379-93.473％的抗氧化剂活性。
在本发明的一个实施方案中，将含有沙棘种子甲醇提取物的烧瓶在60-65℃、200-250毫巴的真空条件下，以80-100rpm进行旋转在闪蒸器中进行浓缩。
在本发明的另一实施方案中，测得冷冻干燥后的甲醇提取物收率为14.264g/100g，而真空干燥后的收率为14.4858g/100g。
发明详述
本法明的方法涉及以下步骤，其包括：
i)用自来水洗洗涤沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子来去除任何尘土和外源物质，而后在40-50℃干燥3-4小时；
ii)将沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的种子磨粉以获得大小为60-80目的颗粒；
iii)以55-60℃在索克斯雷特萃取器中用左旋系列溶剂(升序排列的洗提作用)，随后用甲醇对上述材料进行8-9小时萃取；
iv)使用Whatman 41号滤纸对上述提取物过滤以获得无颗粒提取物；
v)以60-65℃在蒸馏单元中蒸馏上述提取物来回收最高达80-90％的所述溶剂，该溶剂进一步再循环以用于在索克斯雷特单元中进行另外的萃取；
vi)在45-50℃、在闪蒸器中采用200-250毫巴的压力的真空条件下对所述无颗粒提取物进行浓缩，从而得到甲醇粗提取物；
vii)对于抗氧化剂活性采用冷冻干燥，或对于抗菌活性，在40-50℃、采用175-200毫巴压力在真空炉中保持8-9小时对上述浓缩粗提取物进行干燥。
通过DPPH方法的分别测定，这样获得的干燥产物对不同的革兰氏阳性和阴性细菌具有以最小抑制浓度(μg/ml)定义的200-350μg/ml的抗菌活性，以及在10-50μg/ml浓度具有自由基清除活性％定义的40.379-93.473％的抗氧化剂活性。
从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌部位是通过以下过程完成的：
            沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子
                            ↓
             洗涤和干燥(40-50℃，共3-4小时)
                            ↓
         将所述种子磨粉以获得大小为60-80目的颗粒
                            ↓
使用甲醇以60-65℃在索克斯雷特萃取器中进行8-9小时萃取(用具有
         升序排列的洗提作用的左旋系列溶剂萃取)
                            ↓
                        甲醇提取物
                            ↓
                 通过Whatman 41号滤纸过滤
                            ↓
                  在60-65℃蒸馏以回收溶剂
                            ↓
       在闪蒸器中200-250毫巴压力的真空条件下进行浓缩
                            ↓
通过冷冻干燥或在40-50℃、采用175-200毫巴压力在真空炉中进行
                       真空干燥
                            ↓
         获得抗菌剂和抗氧化剂部位(14.4858-14.264％)
本方法的新颖性在于
1.这是从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分制备抗菌剂和抗氧化剂部位的首次报道。
2.本发明是从沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的非传统部分获得生物活性部位的一步法。
以下实施例仅作为对本发明的示例说明而给出，因此不应被认为是对本发明范围的限制。在不偏离本发明的精神的条件下，本领域的技术人员可对其进行诸多变化和改变。除非有另外的指明，所有的部分和百分数都以重量进行计算。
实施例1
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力175)以40℃干燥4小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得60目大小的粉末颗粒。用200ml甲醇、以60℃在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行8小时的萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在60℃对其进行蒸馏以回收160ml所述溶剂。所述粗提取物在200毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；对于抗氧化剂活性的确定，使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，对于抗菌活性，在40℃、175毫巴压力的真空炉中进行9小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。根据Blois的方法(Blois，1958.利用稳定自由基进行抗氧化剂的测定(Antioxidant determinations by the use of a stablefree radical).Nature，181：1199-1200)，使用稳定的自由基，DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼基)，对每一种抗氧化剂的自由基清除活性进行分析。所述反应混和物包括0.5ml 0.5mM的DPPH以及0.1ml含有不同浓度(10-50μg)氧化剂提取物的二甲亚砜。最后，加入100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)将所述反应混和物的总体积调到1.0ml。在黑暗中室温反应20分钟后，通过在517nm观察到的脱色对每种抗氧化剂的自由基清除活性进行定量。在所述浓度为10μg/ml时，对DPPH的自由基清除活性％为40.379％。对所述沙棘(Hippophae rhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and Food Chemistry 47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养24小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子提取物对于蜡样芽胞杆菌的MIC值是200ppm。
实施例2
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力180毫巴)以40℃干燥3小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得70目大小的粉末颗粒。用200ml甲醇、55℃下在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行9小时萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在65℃对其进行蒸馏以回收170ml所述溶剂。所述粗提取物在250毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，并在50℃、200毫巴压力的真空炉中进行8小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。根据Blois的方法(Blois，1958.利用稳定自由基进行抗氧化剂的测定(Antioxidantdeterminations by the use of a stable free radical).Nature，181：1199-1200)，使用稳定的自由基，DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼基)，对每一种抗氧化剂的自由基清除活性进行分析。所述反应混和物包括0.5ml 0.5mM的DPPH以及0.1ml含有不同浓度(10-50μg)氧化剂提取物的二甲亚砜。最后，加入100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)将所述反应混和物的总体积调到1.0ml。在黑暗中室温反应20分钟后，通过在517nm观察到的脱色对每种抗氧化剂的自由基清除活性进行定量。在所述浓度为20μg/ml时，对DPPH的自由基清除活性％为71.2277％。对所述沙棘(Hippophae rhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and Food Chemistry47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养20小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophaerhamnoides L.)种子提取物对于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的MIC值是300ppm。
实施例3
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力200毫巴)以45℃干燥3小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得80目大小的粉末颗粒。用200ml甲醇、60℃下在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行8小时萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在60℃对其进行蒸馏以回收175ml所述溶剂。所述粗提取物在200-250毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，以及在40℃、175-200毫巴压力的真空炉中进行8小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。根据Blois的方法(Blois，1958.利用稳定自由基进行抗氧化剂的测定(Antioxidant determinations by the use of a stable free radical).Nature，181：1199-1200)，使用稳定的自由基，DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼基)，对每一种抗氧化剂的自由基清除活性进行分析。所述反应混和物包括0.5ml0.5mM的DPPH以及0.1ml含有不同浓度(10-50μg)氧化剂提取物的二甲亚砜。最后，加入100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)将所述反应混和物的总体积调到1.0ml。在黑暗中室温反应20分钟后，通过在517nm观察到的脱色对每种抗氧化剂的自由基清除活性进行定量。在所述浓度为30μg/ml时，对DPPH的自由基清除活性％为85.1777％。对所述沙棘(Hippophaerhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and FoodChemistry 47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养22小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophaerhamnoides L.)种子提取物对于凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)的MIC值是300ppm。
实施例4
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力200毫巴)以50℃干燥3小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得80目大小的粉末颗粒。用200ml甲醇、60℃下在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行8小时萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在60℃对其进行蒸馏以回收175ml所述溶剂。所述粗提取物在250毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，以及在40℃、200毫巴压力的真空炉中进行8小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。根据Blois的方法(Blois，1958.利用稳定自由基进行抗氧化剂的测定(Antioxidantdeterminations by the use of a stable free radical).Nature，181：1199-1200)，使用稳定的自由基，DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼基)，对每一种抗氧化剂的自由基清除活性进行分析。所述反应混和物包括0.5ml 0.5mM的DPPH以及0.1ml含有不同浓度(10-50μg)氧化剂提取物的二甲亚砜。最后，加入100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)将所述反应混和物的总体积调到1.0ml。在黑暗中室温反应20分钟后，通过在517nm的脱色对每种抗氧化剂的自由基清除活性进行定量。在所述浓度为40μg/ml时，对DPPH的自由基清除活性％为92.2185％。对所述沙棘(Hippophae rhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and Food Chemistry 47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养20小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子提取物对于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的MIC值是300ppm。
实施例5
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力200毫巴)以50℃干燥3小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得60目尺寸的粉末颗粒。用200ml甲醇、60℃下在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行8小时萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在65℃对其进行蒸馏以回收180ml所述溶剂。所述粗提取物在250毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，以及在50℃、200毫巴压力的真空炉中进行8小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。根据Blois的方法(Blois，1958.利用稳定自由基进行抗氧化剂的测定.Nature，181：1199-1200)，使用稳定的自由基，DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼基)，对每一种抗氧化剂的自由基清除活性进行分析。所述反应混和物包括0.5ml0.5mM的DPPH以及0.1ml含有不同浓度(10-50μg)氧化剂提取物的二甲亚砜。最后，加入100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)将所述反应混和物的总体积调到1.0ml。在黑暗中室温反应20分钟后，通过在517nm观察到的脱色对每种抗氧化剂的自由基清除活性进行定量。在所述浓度为50μg/ml时，对DPPH的自由基清除活性％为93.473％。对所述沙棘(Hippophaerhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and FoodChemistry 47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养20小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophaerhamnoides L.)种子提取物对于单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的MIC值是300ppm。
实施例6
将100g沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子洗涤并在真空炉中(压力200毫巴)以40℃干燥3小时，然后在混合研磨器中以18000rpm进行研磨以获得60目大小的粉末颗粒。用200ml甲醇、60℃时在索克斯雷特萃取器中对所述粉末进行8小时萃取。用Whatman 41号滤纸对所述甲醇提取物进行过滤以获得清亮的提取物并使用蒸馏单元在60℃对其进行蒸馏以回收180ml所述溶剂。所述粗提取物在200毫巴压力的真空以及以100rpm的烧瓶旋转速度在闪蒸器中保持2小时进行浓缩；使用冷冻干燥技术进行6小时干燥，以及在40℃、175毫巴压力的真空炉中进行9小时真空干燥。对于抗氧化剂活性的冷冻干燥甲醇提取物的收率和对于抗菌分析的真空炉干燥甲醇提取物的收率分别为14.264g和14.4858g。对所述沙棘(Hippophae rhamnoides L.)提取物的抗菌分析是通过Negi等人(J.Agricultural and Food Chemistry 47，4297-4300，1999)对蜡样芽胞杆菌的铺板方法进行检测的。向含有20ml溶化的营养琼脂的烧瓶中加入以不同浓度溶于丙二醇的检测材料。加入相等量的丙二醇作为对照。在无菌条件下，将100μl(约103cfu/ml)培养物接种至所述烧瓶中。以每组四份将所述培养液倒入无菌的培养皿中，并在37℃培养24小时以进行生长。在检测中能完全抑制所检测细菌生长的最低化合物浓度就是所述最小抑制浓度(MIC)。沙棘(Hippophae rhamnoides L.)种子提取物对于小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的MIC值是350ppm。
本发明的优点在于：
1.本方法很简单且在本方法中使用过的溶剂还可以再生以再次使用。
2.目前所述原材料(种子)还没有商业价值。

Claims (9)

1.从沙棘的非传统部分制备抗菌剂部位的一步法，所述方法包括：
i)用水洗涤沙棘的种子来去除任何尘土和外源物质，然后进行干燥；
ii)研磨所述干燥的种子以获得大小为60-80目的颗粒；
iii)将所述研磨成干粉的种子用为获得升序排列的洗提作用的左旋系列溶剂，随后用为获得提取物的甲醇进行萃取；
iv)将所述提取物过滤以去除任何颗粒，并得到无颗粒提取物；
v)蒸馏所述无颗粒提取物以回收所述溶剂；
vi)将所述蒸馏的无颗粒提取物在真空条件下浓缩以获得浓缩的甲醇粗提取物；
vii)将所述浓缩的粗提取物干燥以获得具有抗菌活性和/或抗氧化剂活性的提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述沙棘种子用自来水洗涤，并随后在40-50℃干燥3-4小时。
3.如权利要求1所述的方法，其中对所述粉碎种子的萃取是在55-60℃在索克斯雷特萃取器中进行8-9小时完成的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物的过滤是使用Whatman41号滤纸完成的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述蒸馏是根据沸点在60-65℃在蒸馏单元中完成的，来回收最高达80-90％的所述溶剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的回收溶剂再循环至所述索克斯雷特单元中以用于另外的萃取。
7.如权利要求1所述的方法，其中为了获得的甲醇粗提取物，所述无颗粒提取物的浓缩是在45-50℃、在闪蒸器中采用200-250毫巴条件下进行的。
8.如权利要求1所述的方法，其中对于所述部位中的抗氧化剂活性，所述浓缩粗提取物的干燥是通过冷冻干燥完成的。
9.如权利要求1所述的方法，其中对于所述部位中的抗菌活性，所述浓缩粗提取物的干燥是在40-50℃、采用175-200毫巴压力在真空炉中保持8-9小时完成的。
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