CN1762951A - 抑制hiv tat反式激活作用的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了从杂酚油木Larrea tridentata分离、纯化及鉴别具有结构式(I)的一组化合物。在结构式中，R1、R2、R3和R4分别选自HO－，CH3O－和CH3 (C＝O)O－基团，并且R1、R2、R3和R4不同时都是HO－基团。每一种化合物都是1，4－双－(3，4－二羟基苯)－2，3－二甲基丁烷(去甲二氢愈创木酸，NDGA)的衍生物。此外，将NDGA或其衍生物加入到细胞中，NDGA和其衍生物均可以抑制细胞内的包括HIV在内的慢病毒的Tat反式激活作用。

Description

抑制HIV TAT反式激活作用的化合物
本案是分案中请，母案申请号为95196035.0(国际申请号PCT/US95/11779)，申请日为1995年9月22日，发明名称“抑制HIVTAT反式激活作用的化合物”。
                  本发明背景
1.本发明领域
本发明涉及1，4-双-(3，4-二羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氢愈创木酸，NDGA)的衍生物的分离、纯化和鉴别的方法。这些衍生物来源于杂酚油木(Larrea tridentata，Zygophyllaceae)叶片及花的分离和提取，它们与NDGA一起可以抑制包括HIV病毒的慢病毒中Tat的反式激活作用。
2.相关技术
Tat是人类免疫缺损病毒(HIV)基因表达的一个反式激活蛋白。在HIV基因表达中，Tat是必不可少的两个或更多的病毒调节因子之一(Tat and Rev)。Tat的作用是与TAR RNA结合，并从长末端重复(LTR)启动子方向激活转录反应。
Tat蛋白质使转录反应的延长得以稳定，并且也已经证明Tat蛋白质参与了转录反应的启动。前人的许多研究证明Tat调控与抗体相关的T细胞增生的减少，对免疫反应的失败具有重大作用。Tat还直接刺激卡波济细胞(Kaposi’s cell)的生长。
由于Tat没有明显的细胞同源物并且它是一个很重要的阳性调节因子，因此Tat已成为人们开发抗爱滋病(AIDS)药物的一个很有吸引力的目标(见图1)。另一方面，与现在也得到一些HIV反转录酶的抑制物(AZT，DDT)或防止再次感染的潜在的蛋白酶抑制物相比，抑制病毒基因Tat调控的整合前病毒DNA表达的抑制物将在早期捕捉到病毒(Hsu et al.，Science 254：1799-1802，1991)。
对在真核宿主细胞中转录和后期转录水平上控制基因表达的抑制物的研究，近来使对现Tat功能的定量评估成为可能(Sim，Ann.N.Y.Acad，Sci.616：64-70，1990)。为了筛选抑制物用于Tat调节的反式激活作用(Tat-TRS)，抑制物将分泌胎盘碱性磷酸酶(SEAP)的识别基因放入质粒pBC12/HIV/SEAP并置于HIV-1 LTR启动子的控制之下。Tat编码活性由另一个质粒pBC12/CMV/t2提供。COS细胞与这两种质粒的短暂共转染，使得碱性磷酸酶分泌到培养基中，再被用样品色度计分析(Berger et al.，Gene 66：1-10，1988)。因此，对SEAP的测定，间接提供了Tat反式激活作用的鉴别方法。一个抑制因子应该降低SEAP的活性，其原因是由于Tat蛋白质(Tat-TRS)引起的HIV-I LTR启动子的反式激活作用抑制了SEAP m RNA表达的结果。
                     本发明概述
在本发明申请中，我们发现沙漠植物杂酚油木(Larreatridentata)对Tat-TRS有抑制活性。在从热带雨林和被传统用于抗病毒感染的沙漠药用植物中所提取的几种植物成份中，只有杂酚油木(Larrea tridetata)的叶和花的全部提取物对Tat-TRS有抑制作用。对慢性感染了HIV病毒的人成淋巴细胞，这种提取物也可以抑制HIV细胞病理作用，这一作用可以用新发现的可溶甲脂方法测定(Weislow etal.，JNCI 81：577-586，1989)。
本发明所涉及的化合物具下述结构式：
Figure A20051007433500081
其中R1，R2，R3和R4分别选自HO-、CH3O-和CH3(C＝O)O-基团，并且R1、R2、R3和R4不同时是HO-基团。
每种化合物都是从杂酚油木的叶与花分离提取而来，并且每种化合物都是1，4-双-(3，4-二羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氢愈创木酸，NDGA)的衍生物。
除此以外，将DNGA或一种其衍生物给予细胞，NDGA和每一种其衍生物可以抑制包括HIV在内的慢病毒的Tat反式激活作用。
                    附图说明
图1图解说明HIV-1的生活史，以及包括Tat-TRS抑制物在内的可能性治疗物的不同作用位点。1表示转录步骤，2表示病毒调节性的蛋白依赖性反式激活步骤。
图2表示在标准SEAP测定中诱导出的分泌碱性磷酸酶的水平。
图3表示在分泌碱性磷酸酶(SEAP)测定中，杂酚油木叶花提取物对Tat-TRS的抑制活性。
图4表示以分析用不易损坏的毛细管交联5％苯甲基硅氧烷(HP-5)柱子的气相色谱(GC)方法，分析在组分Lo中植物衍生的HIVTat抑制物质。组分Lo是四种成份的混合物。各洗脱时间(分钟)表示在峰顶上。
图5表示以分析用不易损坏的毛细管交联5％苯甲基硅氧烷(HP-5)柱子的气相色谱(GC)方法，分析在组分Gr中植物衍生物的HIV Tat抑制物质。组分Gr是一复合混合物。每一成份被洗脱下的时间(分钟)标在峰顶上。
图6表示植物衍生物中单一化合物Malachi 4：5-6(Mal4)对Tat诱导的SEAP表达水平的抑制以及NOGA在分泌的碱性磷酸酶(SEAP)测定中的水平。
图7描述在分别两个实验中，用Mal4分别处理感染了HIV和没有感染上HIV的CEM-SS细胞，用XTT甲脂的产生进行定量用以衡量活细胞。在实验1中，未经Mal4处理的感染了HIV的细胞中XTT甲脂的产生是8.9％，在实验2中是7.5％。在实验1中，未感染HIV的细胞用·-·表示，感染的细胞用×-×表示。在实验2中，未感染的细胞用·...·表示，感染的细胞用×...×表示。EC50是4.25μg/ml或13.4μM。IC50估计为100μg/ml或325μM。
图8表示杂酚油木NDGA衍生物的逆流色谱(CCC)和分级分离过程。
                   最佳实施例
本发明揭示1，4-双-(3，4-二羟基苯)-2，3-二甲基丁烷或去甲二氢愈创木酸(NDGA)的衍生物的分离、纯化和鉴别的方法。根据下面的各种方法，分离、纯化和鉴别NDGA的每一种衍生物。
材料和方法
细胞系：在补充加入10％小牛胎儿血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改过的Dulbecco培养基中(Isocove’s Modified Dulbecco’sMedium)(IMDM)，培养带有SV40原始复制段的COS-7细胞。将细胞放在37℃，湿润的加有95％O2/5％CO2的温箱中培养。
质粒：质粒pBC12/HIV SEAP包含Tat敏感的HIV LTR启动子与SEAP识别基因，但不具备Tat编码的功能，用这种质粒表达SEAP的基本活性；质粒pBC12/CMV/t2提供Tat编码的功能，如诱发SEAP。质粒pBC12/RSV/SEAP包括构造的禽内瘤病毒(RSV)的Tat非敏感的LTR启动子，作为阳性对照。上述所有质粒来自杜克医学中心(DukeMedical Center)的Bryan Cullen博士。质粒pSEAP和pBKCMV，以及HIVLTR和Tat DNA购于Clontech和Stratagene公司。用大肠肝菌(E.coli)MC1061菌株完成质粒的转换，该菌株来自耶鲁大学(YaleUniversity)，生物系的Barbara Bachmann博士。大肠肝菌MC1061菌株也可从Clontech公司购买到。使用Qiagen提纯盒(Qiagen公司)纯化所有质粒DNA。
化学试剂：二乙醇胺(#31589)和P-硝基苯磷酸酯(#71768)购于Fluka Biochemika公司，L-高精氨酸(#H-1007)购于SigmaCo.公司。脂精胺DOGS(Transfectam，#E123A，Promega)用于DNA转染的研究。
植物试验材料：根据医学药理学的要求，采集杂酚油木的叶片和花。干燥植物材料并用一个带有3mm筛孔的Willy研磨机研磨。在试验性的研究中，用1g这种植物粉末，加入氯仿∶甲醇溶液连续浸泡并提取。提取物被浓缩至残留物。所得到的总重量是176mg的粗提物用3ml己醇处理7次。该步骤产生137mg不溶于已醇的物质(HI)和31mg可溶于己醇的物质(HS)。所有这些提取按步骤被SiO2TLC与硫酸铈炭化法检验2％CeSO4(W/V)于5.6％H2SO4(V/V)中，并用SEAP测定抗Tat-TRS的活性。
对于SEAP测定法，被测试的材料溶解在以无钙/镁离子的PBS制备的10％DMSO溶液中。离心悬浮液，并用Millex-GS 22μm(Millipore)的无菌过滤器过滤原液(10mg/ml)。适当稀释原液，使最终DMSO在PBS中的浓度为0.2％，以得到各种浓度的测试化合物。
应用逆流色谱法(CCC)进行不同的分级分离以及活性成份的纯化：基于上述SEAP检测的分馏初步结果，用CCC方法进一步分级分离HI中的活性成份。因而得到被认为具有活性的两种主要活性馏份，定为“绿色”和“黄色”组分。上述识别出主要活性组分的研究，促进了为得到大量的绿色和黄色组分物，而对大量的植物碎末材料进行全面的分级分离。这种分级分离采用了101.4g的植物碎末，并用己醇处理作为开始，如表1所述。
利用逆流液体-液体分配色谱法，使用如Ito和Conway(CRC.Critical Reviews of Analytical Chemistry 17：65et seq；1986)所描述的万能横轴行星式离心机(CPC)对氯仿∶水提取后所得到有机相的主要化合物进一步分级分离。最佳溶剂体系是己醇∶EtOAC∶MeOH∶0.5％NaCl的混合物，它们之间的比例为6∶4∶5∶5，溶剂上层(有机层)为流动相。5g有机分离的溶解到23ml具有两相的混合溶剂中，并使其通过回路阀放入到蛇形管中。当转速为800rpm时，流动相经蛇形管泵出。在流速大约为每分钟4ml时，固定相约损失32％(保留下68％)。流动相进入流出液后，收集流动相的分离物，并将其蒸发至干燥，用TLC检测，并相应地将其合并为五批：流头(SF)，绿色(Gr)，黄色(Ye)，红色和固定相(Stp)。然后所有这些分离物用SEAP方法来测定抗Tat-TRS的活性。
利用CCC方法，使用一个行星蛇形管式离心机，该离心机也称作Ito多层蛇形管分离-提取器(Ito and Conway，CRC.Cribical Reviewsof Analytical Chemistry 17：65et seq，1986)对上述所得的绿色和黄色分离物进一步纯化。溶剂是己醇∶EtoAC∶MeoH∶0.5％NaCl混合物(7∶3∶5∶5)。200mg绿色分离物纯化出6.8mg被称作Gr的成份，总产量大约是原始植物碎末的0.051％。用类似的方法，从黄色分离物中可纯化出9.3mg被称作Lo的成份。这些被提纯了的成份(Lo和Gr)各自都由几种化合物组成。纯化的Lo和Gr作为“原”分离物，在测定其生物活性和用于更进一步的特征研究前，将它们保存在4℃条件下。
细胞培养和DNA转染：COS细胞培养在如前所述的培养基中(Cullen，Cell 46：973-982，1986)。应用经过修改的脂精胺(Transfectam，Promega#E123A)方法，进行DNA转染，该方法最早在其它地方描述过(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology217：599-618，1993)。简单地说，DNA转染前一天，直径为17mm的平底培养平板的Linbro24孔，以0.5ml的0.1％明胶无菌液预处理。该平板在无菌通风罩内放置1小时(除特别指出以外，所有转染步骤均在无菌通风罩内进行)。明胶溶液被吸出后，用0.5ml补充加入10％小牛胎盘血清和抗菌素(完全培养基)的IMDM培养液冲洗平板。COS细胞以每一个17mm板大约1.5×105个细胞的密度接种，并在37℃，湿润的，95％O2/5％CO2的培养箱中培养。当30-50％的细胞融合时，进行DNA转染。按照生产厂家的建议，将Transfectam制剂，DOGS配制成在10％的乙醇蒸馏水中的浓度为1mg/0.380ml(2.38mg/ml or3.4mM)。
在无菌试管中加入两种溶液组成的转染制剂：
a)溶液A中含有150mM无菌NaCl溶液十质粒DNAs(非选择性/选择性基团的比例为2∶1)：每孔加入0.35μg的pBC12/HIV/SEAP+0.175μg的pBC12/CMB/t2(对Tat功能编码)。
b)溶液B含有等体积的150mM NaCl和Transfectam制剂，该制剂为DNA总量的6倍。将溶液A和B各自均化并立刻混合。
反应进行十分钟。同时，将生长培养基从亚融合的COS细胞中除去，并加300μl(100μl完全IMDM培养基+200μl未添加血清的培养基)于每一个孔中。在每一孔中加入相同体积的转染制剂。对照样品孔内不加DNA，只加入150mM无菌NaCl溶液，其它处理相同。所有样品培养10到12小时后，加入700μl完全培养基。将在5％DMSO/无Ca-Mg离子PBS中制备的测试化合物，以不同的浓度迅速加入孔内。未经药品处理的对照样中只加入5％DMSO/PBS溶液(DMSO最终浓度是0.2％)。所有样品再继续培养48小时后，取出300μl每一培养样品的上清液用作SEAP分析。
分泌的碱性磷酸酶(SEAP)测定：按照最初描述的(Berger et al.，Gene 66：1-10，1988)方法进行分泌碱性磷酸酶的分析。简言之，取250μlCOS细胞培养基上清液的等分试样，在65℃加热5分钟以选择性地使内源磷酸酶失去活性(SEAP具热稳定性)，在一小型离心机中离心2分钟。取2×SEAP测定缓冲溶液100μl(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mMMgCl2；10mM L-高精氨酸)，加入到100μl的样品等分试样中。二者混合后，转移到一个96孔的平底培养盘中(Corning)。将预先加热的底物溶液(120mM P-硝基苯磷酸酯溶于1×SEAP测定缓冲溶液)20μl，用一个多头移液器加到已加好反应混合物的每一个孔中。在37℃培养60分钟，每5分钟用EL340i微盘续数仪(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收波下读数，每次读数前自动振动培养盘5秒钟。在标准SEAP诱导测定中，依据吸收度的改变，以时间为横坐标作图。在筛选药物测定中，在30分时SEAP表达抑制的百分率计算如下：
％抑制＝100-〔(CT+-C+)×100〕
其中：
C-：对照样品(无DNA，无药物)
CT-：对照样品(+DNA，无药物)
C+：药物处理的样品(无DNA，+药物)
CT+：药物处理的样品(+DNA，+药物)
最佳的转染技术：多种多样的技术被应用于真核细胞的DNA转染。这些方法包括磷酸钙或阳离子聚合物与DNA一同沉淀，以及应用化学的方法(洗涤剂、溶剂、酶、双嗜性聚合体)或物理的方法(热学、渗透压或电击、或粒子碰撞)改变细胞膜的通透性。这些技术都有不同程度的细胞毒性，并且转染的效率不稳定。
使DNA顺利穿过完整无损的细胞质，被细胞摄取的先决条件是，“其DNA分子呈紧密状态，并将其所带的电荷包埋起来”。(Loefflerand Behr，Methods in Enzymology 217：599-618，1993)。新近应用的Transfectam方法，已经成功地实现了上述要求。Transfectam试剂(双十八烷基酰氨基氨基乙酰精胺)是一种合成的阳离子脂多胺化合物，它具有一个带正电荷的领头的精胺集团并与DNA(Kd＝10-5-10-7M)有很强的亲和力。这一领头的精胺集团以共价链通过肽键与脂相连。这种脂精胺分子与DNA分子结合，将DNA分子用脂肪层包埋起来。在足够多的脂精胺存在条件下，形成带正电荷的脂类包埋的小球形状的质粒DNA，而且复合体的脂肪部分与细胞膜融合，细胞内吞作用将DNA摄入细胞。
用Transfectam试剂调控的DNA转染方法，已经被证明具有比其它现有方法更高的转染效率。(Barthel et al.，DNA和Cell Biology 12(6)：553-560，1993)。以外，Transfectam是一种性能稳定的并且基本上无细胞毒性的制剂。然而，在选用COS细胞系进行DNA转染时，要对达到理想转染的几个因素加以说明。这些因素包括转染的延续时间，Transfectam试剂与DNA的比例，DNA的浓度，以及其它稀释因子如NaCl的体积和离子强度。下面是得到理想转染结果时的实验条件。
a)转染的持续时间：用COS细胞与固定浓度的质粒DNA一起培养来研究培养时间。这一研究的目的在于筛选出次最佳培养时间点以用于研究各种测试化合物对SEAP表达的抑制实验。诱导SEAP表达的时间研究结果显示(具体结果未描述)，SEAP的表达随时间的延长有一定的增加。这种诱导开始于4小时之内，24小时达到最高。在10，12和15小时之间，没发现有显著的区别。因此，在所有后来药物筛选的研究中，对SEAP表达的抑制实验选用12-15小时作为适合的次最佳的DNA转染培养时间。
b)DNA浓度：根据以前使用Transfectam试剂的研究结果(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology 217：599-618，1993)，决定DNA在转染中的最佳浓度。对于共转染，如已经报道的(Hsu et al.，Science 254：1799-1802，1991)，2∶1的比例(非选择性基因/选择性基因)被认为是最适合的。在Linbro17mm直径24孔平底培养平板中，非选择性的质粒pBCl2/HIV/SEAP加入的浓度为每孔0.35μg，对Tat功能编码的质粒pBC 12/CMV/t2浓度为每孔0.75μg。
c)Transfectam对DNA的比例和离子强度的确定：Transfectam(DOGS)与质粒DNA的最佳比例和所用NaCl离子强度是在以前研究基础上的修改值(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology217：1799-1802，1993)，其确定如下所示：将原浓度为1mg/0.400ml(2.38mg/ml)的Transfectam原液，配在10％(v/v)酒精的蒸馏水中，每一微克所用DNA需要6倍体积(μl)的原液。由以下关系式决定150mM NaCl的一个适当体积，以保证该溶液的最佳离子强度。
NaCl体积(μl)＝Trahsfectam体积(μl)/0.6
在选择了上述最佳反应条件后，在标准测定中Tat所诱导出的SEAP水平的结果如图2如示。概括地说，在补充加有10％小牛胎血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改过的Dulbecco培养基中(IMDM)培养COS细胞。细胞以每孔大约1.5×105个细胞的浓度，接种到17mm直径Cinbro24孔平底培养平板中，做三组重复样品，接种后在37℃，加湿并在95％O25％CO2的培养箱中培养，直到细胞达到50％融合。次融合细胞用脂精胺的方法进行转染(Loeffler and Behr，Methods inEnzymology 217：599-618，1993)。吸干次融合细胞的培养基，重新加入300μl新鲜培养基(IMDM加3％FCS)。对COS细胞进行三种处理的转染。处理1为只加入质粒pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，处理2为以0.175μg/孔的浓度加入质粒pBC12/CMV/t2(对Tat功能编码)+pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，处理3为只加入缓冲溶液(无DNA对照样器)。该培养平板在培养12到15小时之后，加入700μl完全培养基(IMDM含10％FCS)。再培养48小时之后，取250μl该细胞培养的上清液的等份试样，并在65℃加热5分钟，使细胞内的磷酸酶失去活性(SEAP具热稳定性)。这些样品在一小型离心机内离心2分钟。并加入100μl 2×SEAP测定缓冲溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mM MgCl2；10mM L-亮精氨酸)加入到100ml样品的等份试样中。将溶液混合后移入一个96孔平底的培养板中(Corning)。用一多头滴定器将20μl预先加热的底物溶液(120mM硝基苯磷酸盐溶于1×SEAP测定缓冲溶液)滴加到含有上述反应混合液的每一孔中。该培养板在37℃条件下培养60分钟，每5分钟用一台EL340i微盘读数仪(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收波下读数，每次读数前自动振动培养盘5秒钟。象以前所描述的一样(Berger et al.，Gene 66：1-10，1988)，吸收度的改变被换算为SEAP的表达水平的mU单位，并对照时间作图。
实验结果表明，在一小时之后，诱导的SEAP水平比较无DNA的对照样品，或只用非选择性基团(HIV/SEAP)的诱导水平增加了几乎65倍。
以检测为指导的应用逆流色谱法分离杂酚油木提取物的活性成份：如上所述，应用逆流色谱法(CCC)对杂酚油木提取成分进行不同的分级分离及纯化，分离得到两大组分(表1)。用SiO2TLC方法从绿色分离物中分离到6.8mg的被称为Gr的成份，总收获率大约是开始植物碎末重量的0.051％。从黄色分离物(Ye)中分离出9.3mg被称为Lo的成份。
杂酚油木叶和花的提取物对Tat-TRS活性的抑制作用：用几种植物提取物进行SEAP测定试验发现，只有从杂酚油木Larrea tridertata叶和花的提取物显示出对HIV Tat蛋白质活性有明显的抑制作用。如图3所示，杂酚油木对SEAP的表达有依据剂量的抑制作用。概括地说，用三组重复的COS细胞应用上述脂精胺方法，以2∶1的比例转染混合质粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMV/t2(Tat功能编码)。转染后，细胞培养12-15小时。杂酚油木的提取母液(10mg/ml)以10％DMSO无Ca/镁离子的PBS溶液制备，并用一个Millex-GS 22μm的过滤器(Millipore)进行无菌过滤。将适当浓度的杂酚油木的提取液加到已转染DNA的细胞液中，使样品中DMSO的最终浓度为0.2％，并将样品再培养48小时。SEAP测定，从每孔中取250μl COS细胞培养液的上清液，并在65℃加热5分钟，使细胞内的磷酸酶失去活性(SEAP具有热稳定性)。用一小型离心机离心样品2分钟。从离心后的样品中各取出100μl上清液，将100μl2×SEAP测定缓冲溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mM MgCl2；10mM L-高亮精氨酸)加入到100μl样品的等份试样中。将溶液混合后移入到一个96孔平底的培养平板中(Corning)。用一多头滴定器将20μl预先加热的底物溶液(120mM硝基苯磷酸盐溶于1×SEAP测定缓冲溶液)滴加到含有上述反应混合液的每一孔中。该培养板在37℃下培养60分钟，每5分钟用EL340i微盘读数仪(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收度下读数，每次读数前仪器会自动振动培养板5秒钟。在30分钟时，SEAP表达的抑制百分比计算如下：
％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/
(CT--C-)×100〕
其中：
C-：对照样品(无DNA，无药物)
CT-：对照样品(+DNA，无药物)
C+：药物处理的样品(无DNA，+药物)
CT+：药物处理的样品(+DNA，+药物)
如图3中所看到的，当浓度是20μg/ml时，开始出现抑制作用；当浓度是600μg/ml时，抑制作用达到最大值。对于这种粗提物质，它的EC50(抑制50％时的浓度)估计为110μg/ml。随着这些活性成份被进一步纯化，这种(些)活性成份的活性作用逐渐增加，比较最原始的总的粗提物的21％，经分离后的有机相分离物其活性提高了三倍(68％)。
HIV细胞药理作用的抑制：一种抑制Tat反式激活作用的化合物，应该能阻断HIV的复制。因而杂酚油木提取物被送到国家癌症研究所(NCI)，用甲脂溶解测定方法试验该提取物对HIV细胞病理机制的抑制作用(Weislow et al.，JNCI 81：577-586，1989)。用CEM-SS细胞(ATCC，Rockuille，MD)与产生HIV的H9细胞一起培养。HIV病毒侵染寄生CEM-SS细胞，在一周内，病毒在CEM-SS细胞内复制并杀死多数细胞。如果该药物能抑制HIV的在细胞内的繁殖，那么CEM-SS细胞就可以避免由于HIV的存在而死亡。四唑翁制剂是由于活细胞的代谢减弱而得到一种带颜色的甲脂产物，在450nm的色度计φ可以测量到。
在实验中，将三组CEM-SS细胞(5000)加入到96孔微滴定板中。将适当浓度的测试化合物加到5％DMSO无钙/镁离子的PBS溶液，最终液体体积为100μl。对照样品中只加化合物的介质(PBS)。五分钟后，将500高度侵染性HIV-I的H9细胞或正常的H9细胞加入到己含有适当浓度药物的孔中。该微滴板在37℃，95％O2/5％CO2条件培养6在后，加入50μlXTT与甲硫酸N-甲基吩嗪翁(PMS)的混合物。之后再培养4小时，观察其颜色的变化(XTT甲脂产物)。将微滴板封好，用一台微盘读数仪在OD450测定样品，在读数之前读数仪自动摇动滴板，使孔内成份混合均匀。每一数值代表三次读数的平均。在测试化合物存在的条件下，未侵染的细胞与HIV感染了的细胞其两次重复数据的平均值之间没有显著差异。相反，感染了HIV的样品在有测试化合物或没有测试化合物存在的条件下，两次重复数据的平均值之间有显著性差异(P＜0.05)。
上述研究结果归纳在表2之中，浓度为0.75μg/ml的Gr成份对HIV的抵御为58％(细胞成活率)，而Gr不存在时，只有15％的细胞成活。在成份Lo只有0.187μg/ml这么低时，也显示了对HIV细胞病理活性的更强抑制。在有HIV侵染的样品中，成活细胞是87％，该百分比与没有加入侵染的HIV对照样品的结果(89％)很接近；相反，在没有成份Lo，侵染HIV存在时，成活细胞只为14％。所用的这些化合物的浓度，不会对细胞造成毒害。
            表2.在溶解性甲测定法中，杂酚油木提取
             化合物对HIV-1细胞病理机制的抑制作用
测试样品   不杀死细胞并可最大程度抵御HIV的测试样品的浓度  用XXT甲产物测定在第六天时成活细胞的百分率
 未感染加测试样品   感染HIV加测试样品   感染HIV无测试样品
绿色分离物成分Gr-重复成分Gr黄色分离物成分Lo-重复成分Lo   μg/ml0.1870.750.750.1870.1870.187 598070609189 676748578687 161614141414
杂酚油木提取物活性成份的结构说明：确定已经纯化了的从植物提取的活性组分的化学性质，主要采用质谱仪和H-与C-的核磁共振(NMR)的方法。发现成份Lo是四种相关化合物的混合体(L1，L2，L3和L4)。应用气相色谱(GC)方法，该方法用一个分析用不含换坏的毛细管并以5％苯甲基硅氧烷(HP-5)交联成的柱子，该柱子与一台质谱质相连接，对上述混合物的每一峰值进行分离和鉴别。GC研究发现，第一化合物(L1)占混合成份的6％；第二化合物(L2)占总混合成份的76％(MW＝316)；第三化合物(L3)与L2为异构体并占总混合成份的9％(MW＝316)；第四化合物(L4)占总混合成份的9％(MW＝358)。这些化合物从柱子中流出的时间标在图中的蜂值处(图4)。
组份Gr包括五种化合物。应用气相色谱(GC)方法，该方法以分析用不会损坏的毛细管交联5％苯甲基硅氧烷(HP-5)而成的柱子与一台质谱仪相连接，对上述混合物的每一峰值进行分析和鉴别。该GC研究发现，十五种化合物中的四种(G1，G2，G3和G4)是木酚素，并与L化合物结构相关。这些化合物从柱子中流出的时间在图中的蜂处标出(图5)。
这八种(L1，L2，L3，L4，G1，G2，G3和G4)化合物的化学结构描述如下：
L1的成份是C18H22O4，已经确认出该化合物与以前已知的一化学品相同，为1，4-双-(3，4-二羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氢愈创木酸，NDGA，Merck Index，10th Edition，#6534)。L1的化学结构式如下：
Figure A20051007433500191
L2由C19H24O4组成，并被确认为3-O-甲基-NDGA或1-(3，4-二羟基苯)-4-(3-甲氧基-4-羟基苯)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-NDGA结构式如下：
Figure A20051007433500201
L3也含有C19H24O4，并被确认为4-0-甲基-NDGA或1-(3，4-二羟基苯)-4-(3-羟基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷。4-O-甲基-NDGA还被记载为Malachi 4：5-6或Mal4。4-O-甲基-NDGA结构式如下：
Figure A20051007433500202
L4由C21H26O5组成，并被确认为3-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA或1-(3，4-二羟基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙酸苯基)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA结构式如下：
G1的分子量为344，由C21H22O4组成，并被确认为3，3’，4-三-O-甲基-NDGA或1-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-4-(3，H-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷。3，3’，4-三-O-甲基-NDGA结构式如下：
Figure A20051007433500204
G2的分子量是344，由C21H22O4组成，被确认为3，4，4’-三-O-甲基-NDGA或1-(3-甲氧基-4-羟基苯)-4-(3，4-二甲氧基苯)-2，3-二甲基丁烷。该3，4，4’-三-O-甲基-NDGA的结构式如下：
Figure A20051007433500211
G3和G4的分子量都是372，由C22H28O5组成。G3是3’，4-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA(如G3A)或3，3’-二-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA(如G3b)。3’，4-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA也被称作1-(3-甲氧基-4-羟基苯基)-4-(3-乙酰氧基-4-甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷，其结构式如下：
G3a：
Figure A20051007433500212
3，3’-二-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA也称作为1-(3-甲氧基-4-羟基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，结构式如下：
G3b：
Figure A20051007433500213
类似地，G4为4，4’-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA(如在G4a中)或3，4’-二-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA(如在G4b中)。4，4’-二-O-3-O-乙酰基-NDGA也被称作为1-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-4-(3-乙酰氧基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷，其结构式如下：
G4a：
3，4’-二-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA也称作为1-(3-羟基-4-甲氧苯基)-4-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，其结构式如下：
G4b：
Figure A20051007433500222
除上面所述的分离和纯化方法以外，每种所揭示出的NDGA的衍生物也可以应用Ikeya等(Chem.Pharm.Bull.27(7)：1583-1588，1979)的方法，通过对NDGA甲基化和/或乙酰化的化学合成方法而得到。
大量提纯Lo组分以及从Lo组分中提纯两种纯化物(L2和L3)：对一大批植物材料应用大规模CCC分级分离方法，以得到大量的组份Lo。总共称取110g植物碎末，先用700ml己醇处理5次，去掉溶于己醇的物质(1.17g)。干燥不溶于己醇的物质(HI组分)，并用800ml氯仿∶甲醇溶液连续浸渍三次。这样总共得到20g提取物(Jex)，并将其与前一批得到的7.6gHI组份合并在一起，因此共得到27.6g植物粗提物。将其分为10g和17.6g两批做进一步分离。这两批样品先分别在己醇∶EtoAc∶MeOH∶0.5％NaCl其比例为6∶4∶5∶5的溶剂系统中过大容量可能横轴CPC(Shinomiya et al.，J.Chromatogr 644：215-229，1993)，其上层(有机层)作为流动相。完全根据TLC的图形将所得到的分离物放在一起，从两次CCC的分离中共确定出四种主要的组份，它们是绿色组分(Gr)(1.12g)，组份Lo(2.87g)，末尾组分(1.78g)，和最后固定相SP(20.84)。所得到整个2.87g的Lo组份用己醇∶EtoAc∶MeOH∶H2O其比例为7∶3∶5∶5的系统在大型三联体CPC中进一步分离，水质层作为流动相。根据脱流出的先后顺序及TLC图形，四个分离物分别定为LYI(0.375g)，LYII(0.113g)，LYIII(0.280g)和LYIV(2.80g)。这些分离物以10μg/ml的浓度进行抗Tat-TRS活性的测定。根据测试的结果，选择LYI做进一步提纯。
从组份Lo中的LYI分离物中分离纯净的L2和L3化合物：采用前面已经改善了的条件，如：三联体CPC用Hex∶CHCl3∶MeOH∶10mMNaCl其比例为1∶4∶4∶2的溶剂系统来进一步较少疏水性的LYI组份。得到经NMR和质谱仪确定的148mg L3类似物和109.3mg的纯净L2oL3(Malachi 4：5-6)和L2的结构式前面已有描述。
化合物L2和L3都是以前已定名的化学品1，4-双-(3，4-二羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氢愈创木酸，NDGA，MerckIndex，10th Edition，#6534)的衍生物。MDGA的结构式与前所述L1的结构式相同，如下：
Figure A20051007433500231
NDGA和它的衍生物的抗-HIV活性(Tat调控HIV反激活的抑制作用)以前不为人知。NDGA和其衍生物Malachi 4：5-6(Mal4)的抗-HIV反式激活作用的活性比较见图6所示。概括地说，用上面已经描述过的脂精胺方法对两组重复的亚融合态的COS细胞，分别同时转染质粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMB/t2(Tat功能编码)。然后培养转染细胞12到15小时。先将所要测试的化合物溶解到10％DMSO/无钙-镁离子的PBS溶液中，再将其以适当的浓度加到已转染了的细胞中，使DMSO的最终浓度为0.2％。样品培养48小时之后，每一样品取250μl的细胞培养上清液，用图3中的标准测定曲线进行SEAP分析。在30分钟时SEAP表达抑制百分率的计算方法如下：
％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/(CT--C-)×100〕
其中：C-：对照样品(无DNA，无药物)
CT-：对照样品(+DNA，无药品)
C+：药物处理样品(无DNA，+药物)
CT+：药物处理样品(+DNA，+药物)
图中每一点代表两组数据的平均值。Mal4和NDGA其浓度分别是8μg/ml(25μM)和6μg/ml(20μM)，它们的EC50值之间没有显著性差异。EC50是指在未处理的对照细胞中，Tat调控的HIV反式激活作用降低到50％时，所测试的化合物的抑制浓度。
比较Mal4和NDGA所产生的HIV反式激活作用的抑制见表3。
                     表3：天然化合物Mal4和NDGA对HIV
                     启动子活性的反式激活作用的抑制
  测试化合物   Tat诱导Seap表达的抑制(％抑制/测试化合物的浓度)
  Mal4NDGA   ％μm   ％μm   ％μm   ％μm
  13.617.0   9.59.9   60.473.8   31.332.6   9288.1   62.765.2   10092.9   9599
化合物NDGA和Mal4如图6所示测定。对照样品做四次重复。30分钟后的抑制百分比和OD405值是：
C-：对照样品(无DNA，无药物)：0.091
CT-：对照样品(+DNA，无药物)：0.805
图7所示的是Mal4处理CEM-SS细胞后，作为衡量细胞成活的XTT甲脂产物的数量。图中的每一点表示经过连续Mal4稀释的感染或未感染HIV的CEM-SS靶细胞(104/M孔)。EC50表示Mal4的浓度(如13.4μM)将感染培养物的XTT甲脂产生量增加(即保护)到未感染、未处理的培养细胞的50％的Mal4的浓度(例如，13.4μM)。IC50表示将未感染的培养细胞的XTT甲脂产量降低到未处理、未感染的对照细胞的50％的Mal4抑制或毒性浓度(例如，325μM，估计值)。未处理的感染对照细胞的XTT甲脂产量是未处理的未感染对照细胞的9％。对HIV-1细胞致病作用的溶解性甲脂检测按照Weislow et al.，JNCI 81：577-586，1989所述的程序进行。
虽然本发明已经按照现在认为是最佳和最实际的方案进行了描述，但应该理解的是本发明并不应该仅限于这些实例，与此相反，不离开本发明的实质和附属的权利要求书的范围的其它变型和修饰都是本发明所包含的。
因此，应该理解的是在不脱离权利要求书所限定的本发明的创新方面的前提下，可以有众多的NDGA衍生物的变型，以及对Tat反式激活的抑制方法。

Claims (20)

1.结构式如下的化合物：
Figure A2005100743350002C1
2.结构式如下的化合物：
3.结构式如下的化合物：
Figure A2005100743350002C3
4.结构式如下的化合物：
5.结构式如下的化合物：
6.结构式如下的化合物：
Figure A2005100743350003C1
7.结构式如下的化合物：
8.结构式如下的化合物：
9.一种在细胞中抑制惯病毒的Tat反式激活作用的方法，包括下列步骤：
a)将杂酚油木Larrea tridentata的提取物用于细胞，其中所述的提取物选自于气相色谱图谱如图4中所示的提取物，和气相色谱图谱图5中所示的提取物；和
b)使该提取物在细胞内抑制慢病毒的Tat反式激活作用。
10.一种在细胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步骤：
a)将具有下述结构的一种化合物用于细胞：
Figure A2005100743350004C1
                            ；和
b)使该化合物抑制慢病毒在细胞中的Tat反式激活作用。
11.一种在细胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步骤：
a)将具有下述结构式的化合物用于细胞：
Figure A2005100743350004C2
其中R1、R2、R3和R4分别选自HO-，CH3O-和CH3(C＝O)O-，并且R1、R2、R3和R4不能同时是HO-；和
b)使该化合物抑制细胞内慢病毒的Tat反式激活作用。
12.根据权利要求11的方法，其中R1、R2和R3均为HO-且R4是CH3O-，该化合物结构式如下：
Figure A2005100743350004C3
13.根据权利要求11的方法，其中R1，R2和R4均为HO-且R3是CH3O-，该化合物结构式如下：
14.根据权利要求11的方法，其中R1和R2是HO-，R3是CH3(C＝O)O-且R4是CH3O-，该化合物结构式如下：
Figure A2005100743350005C1
15.根据权利要求11的方法，其中R1、R3和R4均为CH3O-且R2是HO-，该化合物的结构式如下：
Figure A2005100743350005C2
16.根据权利要求11的方法，其中R1是HO-且R2、R3和R4均为CH3O-，该化合物的结构式如下：
Figure A2005100743350005C3
17.根据权利要求11的方法，其中R1和R3是CH3O，R2是HO-且R4是CH3(C＝O)O-，该化合物的结构式如下：
Figure A2005100743350005C4
18.根据权利要求11的方法，其中R1和R4是CH3O-，R2是HO-且R3是CH3(C＝O)O-，该化合物的结构式如下：
19.根据权利要求11的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-且R4是CH3(C＝O)O-，该化合物的结构式如下：
Figure A2005100743350006C1
20.根据权利要求11的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-和R3是CH3(C-0)O-，该化合物的结构式如下：
Figure A2005100743350006C2
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