JP2006273869A - Ｈｉｖ・ｔａｔトランス活性化を抑制するための化合物 - Google Patents

Abstract

【要約書】
【課題】ＨＩＶ・ＴＡＴトランス活性化を抑制するための化合物を提供すること。
【解決手段】下記構造式：

の化合物であって、ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々、ＨＯ−、ＣＨ₃Ｏ−およびＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−からなる群から選択される。但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々同時にＨＯ−ではなく、各化合物は、クレオソートブッシュであるラレア・トリデンタータ(Ｌarrea tridentata)の葉−花抽出物から単離されたものであり、１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン（ノルジヒドロカイアレ酸(nordihydroquaiaretic acid)、ＮＤＧＡ）の誘導体であり、加えて、これらのＮＤＧＡおよび各誘導体は、ＮＤＧＡまたはその誘導体を細胞に投与することによって、該細胞において、ＨＩＶウイルスを含むレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制するために使用することができる、化合物。
【選択図】なし

Description

本発明は、１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン（ノルジヒドロカイアレ酸(nordihydroquaiaretic acid)、ＮＤＧＡ）の誘導体の単離、精製および特徴付けに関する。この誘導体は、メキシコ・ハマビシまたはクレオソートブッシュ（creosolte bush； Ｌarrea tridentata，Ｚygophyllaceae）の葉および花の抽出物から単離されたものであり、ＮＤＧＡと共に、ＨＩＶウイルスを含むレンチウイルスにおけるＴａｔトランス活性化を抑制するために用いることができる。

（関連技術の説明）
Ｔａｔはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）遺伝子発現のトランス活性化因子であり、ＨＩＶ遺伝子発現のために必要な二以上のウイルス性調節因子（ＴａｔおよびＲｅｖ）の一つである。Ｔａｔは、ＴＡＲ・ＲＮＡ要素に結合することによって作用し、長い末端繰り返し（ＬＴＲ）プロモータからの転写を活性化する。

Ｔａｔタンパクは転写の延長を安定化させるものであり、また転写の開始にも関与することが示されている。以前の研究によって、Ｔａｔは抗体依存性Ｔ細胞増殖の減少を媒介し、免疫応答の失敗に実質的に寄与することが示されている。Ｔａｔはまた、カポシ細胞増殖(Ｋaposi'scell growth)を直接刺激する。

Ｔａｔは明らかな細胞同族体を有していないので、この強力な陽性調節因子は抗ＡＩＤＳ薬の開発のための魅力的な目標になっている（図１）。感染の新たなラウンドを妨害する現在入手可能なＨＩＶ逆転写阻害因子（ＡＺＴ、ＤＤＩ）または潜在的なプロテアーゼ阻害因子とは対照的に、組み込まれたプロウイルスＤＮＡの、ウイルス遺伝子Ｔａｔで調節された発現を抑制する阻害因子は、該ウイルスを初期段階で停止させるであろう（非特許文献１）。

真核宿主における転写レベルおよびポスト転写レベルでの遺伝子発現を制御する因子の解明を目的とした努力によって、最近、Ｔａｔ機能の定量的な評価が可能になった（非特許文献２）。Ｔａｔ調節されたトランス活性化（Ｔａｔ−ＴＲＳ）の阻害因子をスクリーニングするために、分泌された胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポータ遺伝子を、プラスミドｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＳＥＡＰの中のＨＩＶ−１・ＬＴＲプロモータの制御下に置く。Ｔａｔにコードされる活性は、第二のプラスミド構築物ｐＢＣ／ＣＭＶ／ｔ２によって供給される。これら二つのプラスミドを用いたＣＯＳ細胞の一時的な共感染によって、培地中へのアルカリホスファターゼの分泌が導かれ、この培地は単純な発色試験によって分析される（非特許文献３）。従って、このＳＥＡＰ試験は、Ｔａｔトランス活性化の間接的な測定を提供する。阻害剤は、Ｔａｔタンパク（Ｔａｔ−ＴＲＳ）がＨＩＶ−１・ＬＴＲのトランス活性化を介してＳＥＡＰ・ｍＲＮＡを発現させるのを阻害することにより、ＳＥＡＰ活性の減少を生じさせるに違いない。
Ｈsu et al，Ｓcience 1991年 第254巻 ｐ．1799-1820 Ｓim, Ａnn.Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓci 1990年 .第616巻 ｐ．64-70 Ｂerger et al.，Ｇene 1988年 第66巻 ｐ．1-10

本発明によって、以下が提供される：
１．下記構造式の化合物。

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々、ＨＯ−、ＣＨ₃Ｏ−およびＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−からなる群から選択される。但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々同時にＨＯ−ではない。
２．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は夫々ＨＯ−、Ｒ₄はＣＨ₃Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

３．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は夫々ＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

４．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁およびＲ₂は夫々ＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ₄はＣＨ₃Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

５．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−であり、下記の構造式を有する化合物。

６．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

７．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−、Ｒ₄はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

８．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

９．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₄はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

１０．項目１に記載の化合物であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、下記の構造式を有する化合物。

１１．細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する方法であって：
ａ）ラレア・トリデンタータ(Ｌarrea tridentata)からの抽出物を前記細胞に投与する工程であって、該抽出物は、図４に示すガスクロマトグラフィープロファイルを有する抽出物および図５に示すガスクロマトグラフィープロファイルを有する抽出物からなる群から選択される工程と；
ｂ）該抽出物によって、前記細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する工程とを具備した方法。
１２．細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する方法であって：
ａ）下記構造の化合物を前記細胞に投与する工程と；

ｂ）該化合物によって、前記細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する工程とを具備した方法。
１３．細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する方法であって：
ａ）下記構造式の化合物を前記細胞に投与する工程と；

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々、ＨＯ−、ＣＨ₃Ｏ−およびＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−からなる群から選択される。但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々同時にＨＯ−ではない。

ｂ）該化合物によって、前記細胞中のレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制する工程とを具備した方法。
１４．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は夫々ＨＯ−、Ｒ₄はＣＨ₃Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

１５．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄は夫々ＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

１６．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁およびＲ₂は夫々ＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ₄はＣＨ₃Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

１７．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

１８．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

１９．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−、Ｒ₄はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

２０．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₂はＨＯ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

２１．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂およびＲ₃は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₄はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

２２．項目１３に記載の方法であって、Ｒ₁はＨＯ−、Ｒ₂およびＲ₄は夫々ＣＨ₃Ｏ−、Ｒ₃はＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり、前記化合物は下記の構造式を有する方法。

（発明の概要）
本件出願において、我々は、砂漠植物であるラレア・トリデンタータ(Ｌarrea tridentata)のＴａｔ−ＴＲＳ阻害活性を開示する。

熱帯多雨林および砂漠の薬草植物から調製された、ウイルス疾患に対する伝統的な薬に用いられる幾つかの植物抽出物のうちで、メキシコ・ハマビシまたはクレオソートブッシュ(Ｌarrea tridentata)の葉および花からの全抽出物のみが、Ｔａｔ−ＴＲＳ阻害活性を示した。この抽出物はまた、新しく開発された可溶性ホルマザン試験(soluble-formazan assay)によって評価されたように、該ウイルスに慢性的に感染したヒトリンパ芽球に対するＨＩＶ細胞変性効果を阻害する（Ｗeislow et al.,ＪＮＣＩ81:577-586,1989）。

本発明は、下記構造式の化合物を開示する。

ここで、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々、ＨＯ−、ＣＨ₃Ｏ−およびＣＨ₃（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−からなる群から選択される。但し、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は夫々同時にＨＯ−ではない。

各化合物は、クレオソートブッシュであるラレア・トリデンタータ(Ｌarrea tridentata)の葉−花抽出物から単離されたものであり、１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン（ノルジヒドロカイアレ酸(nordihydroquaiaretic acid)、ＮＤＧＡ）の誘導体である。
加えて、ＮＤＧＡおよび各誘導体は、ＮＤＧＡまたはその誘導体を細胞に投与することによって、該細胞において、ＨＩＶウイルスを含むレンチウイルスのＴａｔトランス活性化を抑制するために使用することができる。

好ましい態様の詳細な説明
本発明は、１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン、即ち、ノルジヒドロカイアレ酸（ＮＤＧＡ）の誘導体の単離、精製および特徴付けに関する。以下の手順に従って、ＮＤＧＡの各誘導体が単離され、精製され、特徴付けされた。
〈材料および方法〉
細胞ライン：ＳＶ４０起源の複製を有するＣＯＳ−７細胞が、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質を補充したイスコーブ改変ダルベッコ培地(Ｉsocove's Ｍodified Ｄulbeccos Ｍedium:ＩＭＤＭ)中で維持された。細胞は、３７℃の９５％Ｏ₂／５％ＣＯ₂湿潤インキュベータ中でインキュベートされた。

プラスミド：Ｔat−感受性ＨＩＶ ＬＴＲプロモータを有するプラスミドpＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰであって、ＳＥＡＰリポータ遺伝子を有するがＴatがコ−ドする機能は有さないプラスミドを使用して、基底の活性のＳＥＡＰを発現した。pＢＣ12/ＲＳＶ/ＳＥＡＰは、Ｔatがコ−ドする機能、すなわち誘導されたＳＥＡＰレベルを提供した。ラウス肉腫ウイルス由来の、Ｔat−非感受性の構成性ＬＴＲプロモ−タを有するpＢＣ12/ＲＳＶ/ＳＥＡＰを、陽性の対照として利用した。プラスミドは全て、デュ−ク医療センタ−のブライアン・カレン(Ｂryan Ｃullen)博士より入手した。プラスミドpＳＥＡＰ及びpＢＫＣＭＶ、並びにＨＩＶＬＴＲ及びＴat ＤＮＡは、クロンテック（Ｃlontech）とストラタジ−ン（Ｓtratagene）より、商業的に入手可能である。プラスミドの形質転換は、エ−ル(Ｙale)大学生物学科のバ−バラ・バックマン（Ｂarbara Ｂachmann）博士から入手した大腸菌(Ｅ.coli)株ＭＣ1061で行った。大腸菌株ＭＣ1061はまた、クロンテックからも入手可能である。プラスミドＤＮＡをキアゲン（Ｑiagen（登録商））・精製キット（キアゲン社）を利用して精製した。

化学試薬：ジエタノ−ルアミン（＃３１５８９）及びp-ニトロフェニルリン酸塩（＃７１７６８）は、フルカ・バイオケミカより購入し、Ｌ-ホモアルギニン（＃Ｈ−１００７）はシグマ社より購入した。リポスペルミンＤＯＧＳ（トランスフェクタム（登録商標）、＃Ｅ１２３Ａ、プロメガ社）をＤＮＡの形質移入実験に使用した。

植物性試験物質の準備：メキシコ・ハマビシの葉と花を、民族薬物学的要求に基づいて回収した。植物性物質は最初、クロロホルム：メタノ−ルを使用した連続的浸出により抽出した。抽出物を残渣にまで濃縮した。得られた全量１７６ｍgの粗抽出物を３ｍlのヘキサンで７回処理した。このステップにより、１３７ｍgのヘキサン不溶性（ＨＩ）物質と、３１ｍgのヘキサン可溶性（ＨＳ）物質になった。これらの抽出物全てを、５.６％のＨ₂ＳＯ₄(v/v)中の２％ＣeＳＯ₄、硫酸セリウムチャ−リング（charring）を利用したＳiＯ₂ＴＬＣと、抗Ｔat-ＴＲＳ活性のＳＥＡＰアッセイにより、ステップごとにモニタ−した。

試験物質をＳＥＡＰアッセイ用に、カルシウム/マグネシウム・フリ−のＰＢＳで調製して、10％ＤＭＳＯ溶液に溶解した。懸濁液を遠心して、ストック溶液（１０ｍg／ｍl）を、マイレックス（Ｍillex（登録商標））−ＧＳ２２μｍフィルタを（ミリポア社）利用してフィルタ−滅菌した。ストック溶液の適切な希釈液を、最終ＤＭＳＯ濃度がＰＢＳ中で０.２％になるように調製して、種々の濃度の試験物質を得た。

向流クロマトグラフィ−（ＣＣＣ）による、活性成分の差動的分画、及び精製：ＳＥＡＰアッセイにおける、上記の分画の予備的結果に基づいて、ＣＣＣによる活性ＨＩ画分をさらに行った。これにより、二つの主要な活性画分（緑と、黄色の成分）が同定されるに至った。この見込みのある実験から、最も活性な画分が同定されたため、植物粉末を利用したフルスケ−ルの差動的分画を行い、大量の緑、及び黄色の画分を得る試みを行った。この分画は、１０１.４ｇの植物粉末を使って行なわれ、表１に概略が示されているように、ヘキサン処理から開始した。

クロロホルム：水による分画後に得られた有機相（ＯＧ）由来の主要な成分に関する更なる分画は、イトとコンウェイにより記載されている、可変性交差軸プラネット遠心（versatile cross-axis planet centrifuge,ＣＰＣ）を利用した、向流液−液分画クロマトグラフィ−により行った（Ito and Ｃonway ＣＲＣ Ｃritical Ｒeviews of Ａnalytical Ｃhemistry 17:65−,1986）。最適の溶媒系はヘキサン：ＥtＯＡc:ＭeＯＨ:0.5％ＮaＣlが６：４：５：５の比率である、上相（有機層）が可動性相の混合物であった。５ｇの有機画分を２３ｍlの二層混合物に溶解して、ル−プバルブを経由してコイル内へ導入した。８００rpｍで回転している間に、可動性相がコイルからくみ出された。約４ｍl／分の流速で、約３２％の不変相が初期喪失した（６８％が保持された）。可動性相が溶出物中に現れた後に、可動性相の画分を回収して、蒸発により乾燥させ、ＴＬＣでモニタ−して、５つのバッチ（前面溶媒（solvent front）、緑（Ｇr）、黄色（Ｙe）、赤、不変相）にプ−ルした。次にこれらの画分全てを、Ｔat-ＴＲＳ活性に関してのＳＥＡＰアッセイによりモニタ−した。

緑と黄色の画分の更なる精製を、イトーの多層コイル分離器−抽出器（Ito and Ｃonway,ＣＲＣ Ｃritical Ｒeviews of Ａnalytical Ｃhemistry 17:65-,1986）として知られる、周転円状（epicyclic）コイルプラネット遠心を利用したＣＣＣにより行った。溶媒系は、ヘキサン：ＥtＯＨ：ＭeＯＨ:0.5％ＮaＣl（７：３：５：５）であった。緑の画分２００ｍgから、６.８ｍgの、Ｇrと呼ばれる成分（すなわち元の植物粉末に基づくと約０.０５１％の全収量）が得られた。同様の実験を黄色の画分（Ｙe）でも行い、９.３ｍgの成分（Ｌoと表される）が得られた。これらの精製済み成分（ＬoとＧr）はそれぞれ複数の成分からなり、それぞれの「母」画分は、生物学的活性の試験と更なる特徴付けに供されるまで４℃で保存した。

細胞培養、及びＤＮＡの形質移入：ＣＯＳ細胞は、以前に記載された方法(Ｃullen Ｃell 46:973-982,1986)で維持した。ＤＮＡの形質移入は、リポスペルミン(トランスフェクタム、プロメガ社、＃Ｅ１２３Ａ)法(元はＬoeffer and Ｂehr,Ｍethods in Ｅnzymology 217:599-618,1993)を改変した方法を使用して行った。簡潔に言うと、ＤＮＡ形質移入の前日に、直径１７ｍｍの平底面のリンブロ２４(Ｌinbro２４（登録商標）)プレ−トを、０.５ｍlの無菌の０.１％ゲラチン溶液で処理した。このプレ−トをフ−ド（hood）内で１時間保持した（特に言及しないかぎり、ステップは全てフ−ド内で行なわれた）。ゲラチン溶液を吸引して、該プレ−トを０.５ｍlのＩＭＤＭ（１０％のウシ胎児血清及び抗生物質で補充したもの（完全培地））で洗浄した。ＣＯＳ細胞を１７ｍｍのプレ−ト当たり、約１.５Ｘ１０⁵細胞でまいて、湿度９５％／ＣＯ₂５％のインキュベ−タ−内で３７℃でインキュベーションした。ＤＮＡの形質移入は、細胞の集密度が３０−５０％の時に行った。トランスフェクタム試薬（ＤＯＧＳ）のストック溶液は、製造業者推奨の方法にしたがって、蒸留水で作成した１０％（v/v）のエタノ−ル溶液０.３８０ｍl当たり１ｍg（２.３８ｍg／ｍl、または３.４ｍＭ）に調製した。

形質移入用カクテルは、無菌のチュ−ブに調製した二つの溶液よりなる：
(a)溶液Ａは、無菌の１５０ｍＭＮaＣl溶液＋プラスミドＤＮＡ（非選択遺伝子／選択遺伝子の比率が２：１）（ウェル当たり０.３５μｇのpＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰ＋ウェル当たり０.１７５μｇのpＢＣ12/ＣＭＢ/t2(Ｔat機能をコ−ド)）
を含む；
(b)溶液Ｂは、等量の１５０ｍＭＮaＣlと、全量ＤＮＡの６倍であると決定されているトランスフェクタムを１容量を含む。
溶液ＡとＢとを均一化してすぐに混合した。

１０分間反応を行わせた。その間に、増殖用培地をサブコンフルエントなＣＯＳ細胞より除去して、それぞれのウェルに３００μｌ（完全ＩＭＤＭ１００μｌと無血清培地２００μｌ）を加えた。形質移入カクテルを、等量でウェルに入れた。対照試料には無菌の１５０ｍＭＮaＣl溶液のみを加えた。試料は全て、７００μｌの完全増殖培地を加えた後に、１０から１２時間インキュベーションした。５％ＤＭＳＯ／Ｃa-Ｍgフリ−ＰＢＳ（非水溶性物質に対して）中に調製した試験化合物をすぐに、ウェルへ種々の濃度で加えた。薬剤未処理対照試料には、５％ＤＭＳＯ/ＰＢＳ溶液のみを加えた（ＤＭＳＯの最終濃度は０.２％）。次いで、試料全部を、３０μｌの培養上清をＳＥＡＰアッセイ用に除去した後に、更に４８時間インキュベーションした。

分泌アルカリホスファタ−ゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ： 分泌アルカリホスファタ−ゼ分析は、最初に記載されたようにして行った(Ｂerger et al.，Ｇene 66:1-10，1988)。簡潔に言うと、２５０μｌのアリコットをＣＯＳ細胞の培養上清より除去して、６５℃で５分間加熱して、選択的に内在性ホスファタ−ゼを不活化し（ＳＥＡＰは熱にたいして安定である）、微量遠心管で２分間遠心した。１００μｌの２ＸＳＥＡＰアッセイ用緩衝液（１.０Ｍのジエタノ−ルアミンpＨ9.8、０.５ｍＭＭgＣl₂、１０ｍＭＬ-ホモアルギニン）を１００μｌの試料のアリコットへ加えた。この溶液を混合して９６穴の平底面の培養皿（Ｃorning）へ移した。２０μｌの、予め暖めておいた基質溶液（１ＸＳＥＡＰアッセイ用緩衝液に溶解させた、１２０ｍＭp-ニトロフェニルリン酸塩）をマルチピペッタ−で、反応混合液を含むそれぞれのウェルに分配した。反応物のＡ₄₀₅を５分間隔で６０分間、３７℃で、ＥＬ３４０１マイクロプレ−トリ−ダ−（Ｂiotek Ｉnstruments社）を使用して、各測定前に５秒間の自動振動を行って測定した。標準的なＳＥＡＰ誘導のアッセイでの、吸光度の変化を時間に対してプロットした。薬剤スクリ−ニングアッセイでは、ＳＥＡＰ発現の阻害率を次のようにして３０分時に計算した：
阻害率（％）＝１００−［（ＣＴ⁺−Ｃ⁺）Ｘ１００］
ここで
Ｃ^-：対照試料（ＤＮＡなし、薬剤なし）；
ＣＴ^-：対照試料（＋ＤＮＡ、薬剤なし）；
Ｃ⁺：薬剤処理済み試料（ＤＮＡなし、＋薬剤）；
ＣＴ⁺：薬剤処理試料（＋ＤＮＡ、＋薬剤）。

形質移入技術の最適化： 種々の技術が、真核細胞のＤＮＡ形質転換に利用されている。これらの方法には、リン酸カルシウムやカチオン性ポリマ−によるＤＮＡ共沈殿法、化学的方法（洗剤、溶媒、酵素、両極性ポリマ−）、または物理的方法（熱的、浸透圧的若しくは電気ショック的、または粒子砲撃的なもの）によって細胞膜を弱らせる方法がある。これらの技術では、ある程度、効率と細胞毒性に関して、一定しないという難点がある。

ＤＮＡの取り込みに関しての細胞の受入れ、すなわち無傷の細胞膜の通過に対して必要な条件は、「コンパクションとＤＮＡ電荷のマスキング」である(Ｌoffler and Ｂehr,Ｍethods in Ｅnzymology 217:599-618,1993)。新規のトランスフェクタム（transfectam；商標名）法では上記の条件をうまく満たしている。トランスフェクタム試薬（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（dioctadecylamidoglycyl spermine））は、ＤＮＡに対して強い親和性（Ｋd=10^-5−10^-7Ｍ）を有する、＋に帯電したスペルミン頭部を有した、カチオン性の合成リポポリアミンである。このスペルミン頭部はペプチド結合により、脂質部分に共有結合している。リポスペルミン分子は、ＤＮＡに結合して、それを脂質層にコ−ティングする。過剰なリポスペルミン存在下では、カチオン性脂質でコ−ティングされたプラスミドＤＮＡの小胞が形成されて、該複合体の脂質部分が細胞膜と融合する。ＤＮＡのインタ−ナリゼ−ションはエンドサイトーシスにより起こると考えられている。

トランスフェクタム−仲介性形質移入は、すでにある方法よりもより効率のよいものであることが示された（Ｂarthel et al.，ＤＮＡ and Ｃel Ｂiology12(6):553-560,1993）。更に、トランスフェクタムは安定で、実質的に細胞無毒性の試薬である。しかしながら、特定のＣＯＳ細胞株における形質移入の最適化のための因子に関しての処理が必要である。これらの因子には、形質移入の期間、トランスフェクタム試薬のＤＮＡに対する比率、ＤＮＡ濃度、及びその他の希釈因子（例えばＮaＣlの容量と強度）が含まれる。形質移入の条件の最適化を以下に示す。

(a)形質移入の期間： 経時試験においてＣＯＳ細胞は、固定した濃度のプラスミドＤＮＡとインキュベーションした。これらの試験は、種々の試験化合物によるＳＥＡＰ発現試験のために、サブオプティマルなインキュベーション時間を選択することを目的とした。ＳＥＡＰ発現の経時誘導の結果は（非掲載）、ＳＥＡＰ発現は、漸進的な時間異存性上昇を示した。この誘導の開始は４時間未満でおきて、２４時間で最大になった。１０、１２、１５時間で見られた値の間には顕著な違いはなかった。よって、１２−１５時間の終末点を、以下の薬剤スクリ−ニングの全てにおける、ＳＥＡＰ発現の阻害に対して適切なサブオプティマル・インキュベーション期間として選択した。

(b)ＤＮＡ濃度： 形質移入に対して最適なＤＮＡ濃度は、トランスフェクタム試薬を使用した以前の研究に基づいて決定した（Ｌoeffler and Ｂehr,Ｍethods in Ｅnzymology,217:599-618,1993）。共形質移入に関しては、２：１（非選択遺伝子/選択遺伝子）の比率が最も適しているということが、他で報告されている（Ｈsuet al.,Ｓcience 254:1799-1802,1991）。リンブロ（登録商標）の２４穴平底面の直径１７ｍｍプレ−トを使用して、非選択プラスミドpＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰは、０.３５μｇ／ウェルの濃度で、Ｔat機能をコ−ドしているpＢＣ12/ＣＭＶ/t2は、０.７５μｇ／ウェルで使用した。

(c)トランスフェクタムのＤＮＡに対する比率と、イオン強度の決定： プラスミドＤＮＡに対するトランスフェクタム（ＤＯＧＳ）の最適な比率、及び使用したＮaＣlのイオン強度は、以前報告されている値を修飾したものであり（Ｌoeffler and Ｂehr,Ｍethods in Ｅnzymology,217:1799-1802,1993）、次のようにして決定した：
蒸留水で作成した１０％（v／v）のエタノ−ル溶液０.４００ｍl当たり、１ｍg（２.３８ｍg／ｍl）の、オリジナルのトランスフェクトラムストック溶液からは、６倍量（μｌ）のストック溶液が、使用した各μｇのＤＮＡに対して必要であった。該溶液の最適のイオン強度は、適切な容量の１５０ｍＭＮaＣlにより提供され、以下の関係で決定される：
ＮaＣlの容量（μｌ）＝トランスフェクタムの容量（μｌ）／０.６。

上記の条件の最適化後の、標準的アッセイにおけるＴat-誘導ＳＥＡＰレベルの結果は、図２に例示されている。簡単に言うと、ＣＯＳ細胞はイスコ−ブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び抗生物質で補充済み）中で維持した。３つ一組の細胞試料を、リンブロの２４穴平底面、直径１７ｍｍプレ−トのウェル当たり、約１.５Ｘ１０⁵の密度でまいて、湿度９５％／ＣＯ₂５％のインキュベ−タ中で、５０％集密度が得られるまで３７℃でインキュベーションした。サブコンフルエントな細胞をリポスペルミン法形質移入した(Ｌoeffler and Ｂehr,Ｍethods in Ｅnzymology,217:599-618,1993)。サブコンフルエントな細胞の培地を吸引して３００μｌの新鮮な最小培地（３％ＦＣＳ補充済みＩＭＤＭ）で置き換えた。ＣＯＳ細胞をpＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰのみで（０.３５μｇ／ウェル）、またはpＢＣ12/ＣＭＶ/t2（Ｔat機能をコ−ド、（０.１７５μｇ／ウェル））＋pＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰ（０.３５μｇ／ウェル）で、または緩衝液のみ（ＤＮＡ対照試料なし）で形質移入した。プレ−トを１２から１５時間インキュベーションして、その後で７００μｌの完全培地（１０％ＦＣＳ補充済みＩＭＤＭ）を加えた。次いで細胞を４８時間インキュベーションし、その後で、ＣＯＳ細胞培養上清の２５０μｌのアリコットをを除去して６５℃で５分間加熱し、選択的に内在性ホスファタ−ゼを不活化した（ＳＥＡＰは熱に安定である）。次いで試料を微量遠心管で２分間遠心した。１００μｌの２ＸＳＥＡＰアッセイ緩衝液（１.０Ｍジエタノ−ルアミンpＨ9.8;０.５ｍＭＭgＣl₂;１０ｍＭＬ-ホモアルギニン）を、試料のアリコット１００μｌに加えた。この溶液を混合して、９６穴の平底面培養皿（Ｃorning社）に移した。マルチピペッタ−を使用して２０μｌの、予め暖めておいた基質溶液（１ＸＳＥＡＰアッセイ緩衝液に溶解した、１２０ｍＭのp-ニトロフェニルリン酸塩）を、反応混合物が含まれているそれぞれのウェルに分配した。ＥＬ3401マイクロプレ−トリ−ダ−（Ｂio-tek Ｉnstrument社）を使用し、それぞれの測定ごとに５秒間の自動振動を行い、反応物のＡ₄₀₅を６０分間、３７℃で５分間おきに測定した。吸光度を、以前に記載されているようにして、ＳＥＡＰのｍＵに変換して（Ｂerger et al.,Ｇene 66:1-10,1988）、時間に対してプロットした。

これらの結果は、一時間後のＳＥＡＰ誘導に関して、対照（ＤＮＡなし）のレベル、または非選択遺伝子（ＨＩＶ/ＳＥＡＰ）のみの誘導と比較して、ほぼ６５倍もの増加を示した。

向流クロマトグラフィ−によるアッセイ先導性のメキシコ・ハマビシ抽出物活性組成物の単離： 上記したように、メキシコ・ハマビシ抽出物の、差動分画と、向流クロマトグラフィ−（ＣＣＣ）による精製により、二つの主要な成分が単離された（表１）。Ｇrと呼ばれる、６.８ｍgの成分はＳiＯ₂ＴＬＣの緑の画分より単離された。全回収率は、元の植物粉末に基づくと、約０.０５１％であった。成分Ｌo、９.３ｍgが、黄色い画分（Ｙe）より単離された。

メキシコ・ハマビシの葉と花からの抽出物による、Ｔat-ＴＲＳ活性の阻害：ＳＥＡＰアッセイで試験した複数の植物抽出物のなかでは、メキシコ・ハマビシである、ラレア・トリデンタタ（Ｌarrea tridentata）の葉と花からの抽出物のみが、ＨＩＶのＴatタンパク質に関しての顕著な阻害活性を示した。メキシコ・ハマビシは、図３に示されているように、ＳＥＡＰ発現に関して、用量−反応性阻害を示した。簡単に言うと、上記したリポスペルミン法を使用して、３つ一組のＣＯＳ細胞の試料を、pＢＣ12/ＨＩＶ/ＳＥＡＰとpＣＢ12/ＣＭＶ/t2（Ｔat機能をコ−ドしている）との２：１の比の混合物で形質移入した。形質移入後、細胞を１２−１５時間インキュベーションした。メキシコ・ハマビシの抽出物ストック溶液（１０ｍg／ｍl）は、カルシウム／マグネシウム−フリ−ＰＢＳと１０％ＤＭＳＯで調製して、マイレックス−ＧＳ２２μｍフィルタ−（ミリポア）で滅菌した。適切な濃度のメキシコ・ハマビシ抽出物を、ＤＭＳＯの最終濃度が０.２％になるようにして、形質移入細胞へ加えて、４８時間インキュベーションした。ＳＥＡＰ分析用に２５０μｌのアリコットをＣＯＳ細胞培養上清より除去して、６５℃で５分間加熱して内在性ホスファタ−ゼを選択的に不活化し（ＳＥＡＰは熱に対して安定）、微量遠心管で２分間遠心した。１００μｌの２ＸＳＥＡＰアッセイ用緩衝液（１.０Ｍジエタノ−ルアミンpＨ9.8,0.5ｍＭＭgＣl₂,10ｍＭＬ-ホモアルギニン）を１００μｌの試料のアリコットへ加えた。この溶液を混合して９６穴の平底面培養皿（Ｃorning）へ移した。２０μｌの予め暖めておいた基質溶液（１ＸＳＥＡＰアッセイ用緩衝液に溶解した、１２０ｍＭp-ニトロフェニル-リン酸塩）を、反応物が含まれているそれぞれのウェルへ、マルチピペッタ−で分配した。反応物のＡ₄₀₅を、６０分間３７℃で５分間ごとに、各測定前の５秒間自動振動付きＥＬ３４０ｉマイクロプレ−トリ−ダ−（Ｂio-tekＩnstruments社）で測定した。ＳＥＡＰ発現の阻害率を以下のようにして、３０分時に計算した：
阻害率（％）＝１００−［（ＣＴ⁺−Ｃ⁺）／（ＣＴ^-−Ｃ^-）Ｘ100］:
ここで、
Ｃ^-：対照試料（ＤＮＡなし、薬剤なし）
ＣＴ^-：対照試料（＋ＤＮＡ、薬剤なし）
Ｃ⁺：薬剤処理済み試料（ＤＮＡなし、＋薬剤）
ＣＴ⁺：薬剤処理済み試料（＋ＤＮＡ、＋薬剤）
図３で示されるように、この阻害は２０μｇ／ｍlの濃度で始まり、６００μｇ／ｍlで最大の阻害活性になった。この粗物質に対しての、推定のＥＣ₅₀（５０％阻害率を示す濃度）は１１０μｇ／ｍlであった。活性成分の精製が進むにつれて、活性成分の活性度に上昇が見られ、これは元の全粗抽出物（２１％）と比較して、有機相（ＯＧ）では３倍（６８％）になった。

ＨＩＶの細胞病変性効果の阻害： Ｔatのトランスアクティベ−ションを阻害する化合物は原理的に、ＨＩＶの複製を阻害するはずである。そのため国立癌研究所（ＮＣＩ）において、可溶性フォルマザン（formazan）アッセイ（Ｗeislow et al.,ＪＮＣＩ81:577-586,1989）を利用して、ＨＩＶ-1の細胞病変性効果の阻害に関して、メキシコ・ハマビシの抽出物が試験された。おおまかに言うと次のとおりである。ＣＥＭ-ＳＳ細胞（ＡＴＣＣ,Ｒockville,ＭＤ）をＨＩＶ-産生Ｈ９細胞と共培養する。ウイルスを宿主細胞ＣＥＭ-ＳＳに感染、複製させて、ほとんどのＣＥＭ-ＳＳ細胞を１週間で殺傷する。もし薬剤がＨＩＶの産生を阻害するならば、ＣＥＭ-ＳＳ細胞はＨＩＶ−誘導性の細胞死から保護されることになる。よってテトラゾリウム（ＸＴＴ）試薬は、生細胞により代謝的に還元され、４５０nｍで比色法により測定可能な有色のフォルマザン産物を生ずる。

実際には、３つ一組のＣＥＭ-ＳＳ細胞（５０００）を９６穴マイクロタイタ−プレ−トにまいた。１００μｌの最終容量(カルシウム／マグネシウムフリ−ＰＢＳ、５％ＤＭＳＯ)の、試験化合物を適切な濃度で加えた。５分後に５００倍感染性のＨＩＶ-1を産生するＨ９細胞、または正常なＨ９細胞を、適切な濃度の薬剤を含むウェルに加えた。マイクロタイタ−プレ−トを、湿度９５％/ＣＯ₂５％で、３７℃で６日間インキュベーションして、その後にＸＴＴとＮ-メチルフェナゾニウムメトサルフェ−ト（Ｎ-methylphenazolium methosulfate,ＰＭＳ）の混合物５０μｌを加えた。プレ−トを再び４時間インキュベーションして発色させた（ＸＴＴフォルマザン産生）。プレ−トを密封し、その内容物を自動振動装置で混合し、試料のＯＤ₄₅₀をマイクロプレ−トリ−ダ−で決定した。それぞれの値は３回の決定の平均を表す。非感染細胞とＨＩＶ-1感染細胞との間の２つ一組の値の平均値には、試験化合物存在下において顕著な違いが見られなかった。対照的に、試験化合物存在下、または非存在下での、ＨＩＶ-1感染細胞間には顕著な違い（p<0.05）が見られた。

この実験の結果を表２にまとめた。成分Ｇrの濃度０.７５μｇ／ｍlで、平均して５８％の対ＨＩＶ保護（細胞生存度）が得られ、一方、薬剤フリ−の、ＨＩＶ感染試料では生存度は１５％であった。０.１８７μｇ／ｍlもの低い濃度において成分Ｌoは、ＨＩＶ細胞病変性効果に関しての更に強い阻害活性を示した。
細胞生存度は８７％であって、これは、処理していない対照試料のもの（８９％）と非常に近い値であり、薬剤フリ−のＨＩＶ感染試料の生存度１４％と対照的であった。上記化合物は使用した濃度においては、細胞毒性がなかった。

クレオソートブッシュ抽出物の活性成分の構造解明： 精製された植物活性成分の化学的な特徴付けは、主としてマススペクトル、並びにＨ−およびＣ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって行われた。成分Ｌｏは、四つの関連した化合物（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３およびＬ４）の混合物であることがわかった。該混合物の夫々のピークの解析および特徴付けは、マススペクトル分析器（ＭＳ）に取り付けられた、分析用の非破壊的キャピラリー架橋５％フェニルメチルシロキサン（ＨＰ−５）カラムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって達成された。このＧＣ研究によって、第一の化合物（Ｌ１）は当該混合物の６％に対応し；第二の化合物（Ｌ２）は当該混合物の７６％に対応し（ＭＷ＝３１６）；また第三の化合物（Ｌ３）は当該混合物の９％に対応する（ＭＷ＝３５８）ことが明らかになった。これらの化合物の溶出時間（分）は、各ピーク上に示されている（図４）。

成分Ｇｒは１５の化合物からなっている。該混合物の各ピークの解析および特徴付けは、マススペクトル分析器（ＭＳ）に取り付けられた、分析用の非破壊的キャピラリー架橋５％フェニルメチルシロキサン（ＨＰ−５）カラムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって達成された。このＧＣ研究により、１５の化合物のうちの四つ（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３およびＧ４）はリガンドであり、構造的にはＬ化合物に関連していることが明らかになった。これらの化合物の溶出時間（分）は夫々のピーク上に示されている（図５）。

これらの８種類の化合物（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３およびＧ４）の構造を以下に説明する。

Ｌ１はＣ₁₈Ｈ₂₂Ｏ₄の組成を有しており、以前に知られている化学物質、即ち、１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン（ノルジヒドロカイアレ酸、ＮＤＧＡ、メルクインデックス、第１０版、＃6534）として同定されている。Ｌ１の構造式は下記の通りである。

Ｌ２はＣ₁₉Ｈ₂₄Ｏ₄の組成を有しており、３−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡ、または１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとして同定されている。３−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡの構造式は下記の通りである。

Ｌ３もまたＣ₁₉Ｈ₂₄Ｏ₄の組成を有しており、４−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡ、または１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとして同定されている。４−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡはまた、Ｍalachi4:5-6またはＭaｌ４としても知られている。４−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡの構造式は下記の通りである。

Ｌ４はＣ₂₁Ｈ₂₆Ｏ₅の組成を有しており、３−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡ、または１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−４−（３−メトキシ−４−アセトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとして同定されている。３−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡの構造式は下記の通りである。

Ｇ１は分子量３４４およびＣ₂₁Ｈ₂₂Ｏ₄の組成を有しており、３，３´，４−トリ−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡ、または１−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−４−（３，４−ジメトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとして同定されている。３，３´，４−トリ−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡは下記の構造式を有している。

Ｇ２は分子量３４４およびＣ₂₁Ｈ₂₂Ｏ₄の組成を有しており、３，４，４´−トリ−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡ、または１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（３，４−ジメトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとして同定されている。３，４，４´−トリ−Ｏ−メチル−ＮＤＧＡは下記の構造式を有している。

Ｇ３およびＧ４は夫々、分子量３７４およびＣ₂₂Ｈ₂₈Ｏ₅の組成を有している。Ｇ３は、３´，４−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡ（Ｇ３ａ）、または３，３´−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡ（Ｇ３ｂ）の何れかである。３´，４−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡはまた、１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（３−アセトキシ−４−メトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとしても知られており、下記の構造式を有している。
Ｇ３ａ：

３，３´−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡはまた、１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（３−メトキシ−４−アセトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとしても知られており、下記の構造式を有している。
Ｇ３ｂ：

同様にして、Ｇ４は、４，４´−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡ（Ｇ４ａ）、または３，４´−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡ（Ｇ４ｂ）の何れかである。４，４´−ジ−Ｏ−メチル−３−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡはまた、１−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−４−（３−アセトキシ−４−メトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとしても知られており、下記の構造式を有している。
Ｇ４ａ：

３，４´−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−アセチル−ＮＤＧＡはまた、１−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−４−（３−メトキシ−４−アセトキシフェニル）−２，３−ジメチルブタンとしても知られており、下記の構造式を有している。
Ｇ４ｂ：

上記で述べた単離および精製の手順に加えて、開示された夫々のＮＤＧＡ誘導体は、イケヤ等の方法（Ｉkeya et.al.,Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.27(7): 1583-1588,1979）に従って、ＮＤＧＡのメチル化および／またはアシル化による化学合成によって製造してもよい。

成分Ｌｏおよび成分Ｌｏからの二つの純粋な化合物（Ｌ２およびＬ３）の大規模精製： 植物材料バッチの大規模ＣＣＣ分画を開始して、大量の成分Ｌｏを生じさせた。合計１００ｇの植物粉末を、まず７００ｍｌのヘキサンで５回処理した。ヘキサン可溶物（１．１７ｇ）を廃棄した。ヘキサン不溶物（ＨＩ画分）を乾燥し、これを８００ｍｌのクロロホルム：メタノールで連続的に浸出することにより３回抽出した。これによって２０ｇの全抽出物（Ｔｅｘ）を得、これを先のバッチ式微分抽出(batch differential extraction)で得たＨＩ画分７．６ｇと混合した。こうして得られた組成植物材料の２７．６ｇの全体を、１０ｇおよび１７．６ｇの二つのバッチに分割した。これらのバッチは、最初は、比率が６：４：５：５のヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：0.5％ＮａＣｌの溶媒系を、上相（有機相）を可動相として用いることにより、大容量の多用途交差軸ＣＰＣ（versatile Ｃross-Ａxis ＣＰＣ；Ｓhinomiya et al.,Ｊ.Ｃhromatogr.644:215-229,1993）上で別々に運転された。各画分はＴＬＣパターンに従って独自にプールされた。二つのＣＣＣ操作から四つの主要な画分が同定され、画分緑（Ｇｒ）（１．１２ｇ）、画分Ｌｏ（２．８７ｇ）、画分Ｅｎｄ（１．７８ｇ）および最後に静止相ＳＰ（２０．８４ｇ）と表示された。画分Ｌｏの全体の２．８７ｇは、大モデルのトリプレットＣＰＣ中において、水相を移動相に用いたヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ₂Ｏ（比率は７：３：５：５）によって更に分画された。溶出の順序およびＴＬＣパターンに従って、ＬＹＩ（０．３７５ｇ）；ＬＹＩＩ（０．１１３ｇ）；ＬＹＩＩＩ（０．２８０ｇ）；およびＬＹＩＶ（２．
８０ｇ）と表示された四種類の画分が同定された。これらの画分は、１０μｇ／ｍlの濃度で抗Ｔａｔ−ＴＲＳ活性について試験された。この試験結果に基づいて、ＬＹＩが更なる精製のために選択された。

Ｌｏ成分のＬＹＩ画分からの純粋なＬ２化合物およびＬ３化合物の単離： 親水性のより小さい画分ＬＹＩが、先に改良された条件、即ち、トリプレットＣＰＣと、ヘキサン：ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ：10ｍＭＮａＣｌの溶媒系（比率は１：４：４：２）との条件を用いた更なる精製のために選択された。これによって、ＮＭＲおよびマススペクトルで試験したときに、１４８ｍｇの均一なＬ３および１０９．３ｍｇの純粋なＬ２の調製品が得られた。Ｌ３（Ｍalachi4:5-6）およびＬ２の構造は上記で述べた通りである。

化合物Ｌ２およびＬ３は、以前に同定された化学物質である１，４−ビス−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２，３−ジメチルブタン（ノルジヒドロカイアレ酸、ＮＤＧＡ、メルクインデックス、第１０版、＃6534）の誘導体である。ＮＤＧＡの構造式は、既述したＬ１の構造式と同じであり、下記の通りである。

ＮＤＧＡおよびその誘導体の抗ＨＩＶ活性(Ｔａｔに調節されたＨＩＶトランス活性化の阻害)は、以前は知られていなかった。ＮＤＧＡおよび誘導体Ｍalachi４の抗ＨＩＶトランス活性化能の比較が図６に示されている。簡単にいえば、サブコンフルーエントなＣＯＳ細胞の複製サンプルを、上記のリポスペルミン法を用いて、プラスミドｐＢＣ１２／ＨＩＶ／ＳＥＡＰおよびｐＢＣ１２／ＣＭＢ／ｔ２（Ｔａｔ機能をコードする）で共トランスフェクトした。次いで、１２時間〜１５時間、細胞をインキュベートした。試験サンプルは、先ず１０％ＤＭＳＯ／カルシウム−マグネシウムを含まないＰＢＳ中で可溶化され、最終ＤＭＳＯ濃度０．２％の適切な濃度で、形質転換された細胞に添加された。サンプルは４８時間インキュベートされ、その後、２５０μｌのアリコートをＣＯＳ細胞培養上清から取り出し、図３に示すような標準的な試験でＳＥＡＰを分析した。ＳＥＡＰ発現のパーセント阻害は、３０分の時点で次のようにして計算された。

％阻害＝１００−［（ＣＴ⁺−Ｃ⁺）／（ＣＴ^-−Ｃ^-)×１００］
但し、
Ｃ^- ： 対照サンプル（ＤＮＡなし、薬物なし）
ＣＴ^-： 対照サンプル（＋ＤＮＡ、薬物なし）
Ｃ⁺ ： 薬物処理したサンプル（ＤＮＡなし、＋薬物）
ＣＴ⁺： 薬物処理したサンプル（＋ＤＮＡ、＋薬物）
各点は、二回の測定の平均を表している。Ｍａｌ４およびＮＤＧＡのＥＣ_50Sの間に顕著な相違はみられず、夫々８μｇ／ｍｌ（２５μＭ）および６μｇ／ｍｌ（２０μＭ）であった。このＥＣ_50Sは、Ｔａｔ調節されたＨＩＶトランス活性化が未処理対照細胞のそれの５０％にまで減少するような、その化合物の阻害濃度として定義される。

表３において、Ｍａｌ４およびＮＤＧＡによる、ＨＩＶプロモータ活性のトランス活性化阻害を比較した。

化合物ＮＤＧＡおよびＭａｌ４は、図６に記載されたようにして試験された。対照サンプルは４回繰り返して実行された。パーセント阻害は３０分後に測定去れ、ＯＤ₄₀₅値は、次の通りであった。

Ｃ^-： 対照サンプル（ＤＮＡなし、薬物なし）：０．０９１
ＣＴ^-： 対照サンプル（＋ＤＮＡ、薬物なし）：０．８０５
Ｍａｌ４処理されたＣＥＭ−ＳＳ細胞の培養物における生存細胞の測定としての、ＸＴＴホルマザン産生の定量が図７に示されている。ＥＣ₅₀は、感染した培養物中でのＸＴＴホルマザン産生を、非感染の非処理培養細胞中におけるそれの５０％にまで増加させる（保護する）、Ｍａｌ４の濃度（例えば１３．４μＭ）を表している。ＩＣ₅₀は、非感染培養物中でのＸＴＴホルマザン産生を、非感染の非処理対照細胞中におけるそれの５０％にまで減少させる、Ｍａｌ４の阻害濃度または有毒濃度（例えば３２５μＭ、見積り）を表している。非処理の感染された細胞におけるＸＴＴホルマザンのレベルは、非処理かつ非感染の対照細胞におけるレベルの９％であった。ＨＩＶ−１細胞変成効果の可溶性−ホルマザン試験は、文献（Ｗeislow et al.,ＪＮＣＩ81:577-586,1989）に記載の方法に従って行われた。

現在のところ最も実際的で且つ好ましいと思われる態様に関連して本発明を説明してきたが、本発明はこの開示された態様に限定されるものではなく、添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の変形および均等な構成をもカバーするものとして理解されるべきである。

従って、請求の範囲に定義された本発明の新規な側面を逸脱することなく、ＮＤＧＡ誘導体およびＴａｔトランス活性の抑制方法における変形を行い得ることが理解されるべきである。

図１は、ＨＩＶのライフサイクルと、Ｔａｔ−ＴＲＳ阻害剤を含む潜在的治療剤の異なった作用部位を図示的に示している。基本的な転写ステップは１で示されており、ウイルス調節タンパク依存性のトランス活性化ステップは２で示されている。 図２は、標準的なＳＥＡＰ試験における分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現の誘導を示している。 図３は、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）試験における、クレオソートブッシュ全抽出物によるＴａｔ−ＴＲＳ活性の阻害を示している。 図４は、分析用の非破壊性キャピラリー架橋５％フェニルメチルシロキサン（ＨＰ−５）カラムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による、成分Ｌｏ中の植物由来のＨＩＶ・Ｔａｔ阻害剤の分析を示している。成分Ｌｏは、四つの成分の混合物である。溶出の時間（分）は各ピークについて出現する。 図５は、分析用の非破壊的キャピラリー架橋５％フェニルメチルシロキサン(analytical non-destructive capillarycross-linked 5％ phenylmethylsiloxane)（ＨＰ−５）カラムを用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による、成分Ｇｒ中の植物由来ＨＩＶ・Ｔａｔ阻害剤の分析を示している。成分Ｇｒは複雑な混合物である。溶出の時間（分）は各ピークについて出現する。 図６は、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）試験における、植物由来の単一化合物であるＭalachi4:5-6（Ｍａｌ ４）およびＮＤＧＡによる、Ｔａｔ誘導ＳＥＡＰ発現の阻害を示している。 図７は、二つの別々の実験における、ＨＩＶに感染し若しくは感染しないＣＥＭ−ＳＳ細胞のＭａｌ４処理培養における生存細胞の測定としての、ＸＴＴホルマザン産生の定量を示している。Ｍａｌ４処理されていない感染細胞についてのＸＴＴホルマザン産生パーセントは、実験１については８．９％であり、実験２については７．５％である。実験１では、非感染細胞は●・・・・・・●で表されており、感染細胞は×…×で表されている。実験２では、非感染細胞は●・・・・・・●で表されており、感染細胞は×…×で表されている。ＥＣ₅₀は４．２５μｇ／ｍｌまたは１３．４μＭであることが分かった。ＩＣ₅₀は１００μｇ／ｍｌまたは３２５μＭと見積もられた。

Claims (1)

1. ＨＩＶ・ＴＡＴトランス活性化を抑制するための化合物。

Images