CN101150955B - 递送包括ndga化合物的儿茶酚丁烷的口服制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗疾病的组合物、试剂盒和方法，其中组合物包括儿茶酚丁烷，其包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，例如，四-O-甲基NDGA。本发明还提供了适宜于将本发明化合物经口服途径给药于动物的增溶剂和赋形剂。

Description

递送包括NDGA化合物的儿茶酚丁烷的口服制剂

相关申请的交叉引用 

本申请要求于2005年1月27日递交的美国专利临时申请60/647,495和60/647,648的优先权，通过全文引用将其并入到本文中。本申请还与和本申请同时递交的，代理人案号标记为682714-10WO，题目为“包括NDGA化合物的儿茶酚丁烷的注射动物的制剂”的国际专利申请相关，通过引用其公开内容的全文将其并入到本文中。 

技术领域

本申请涉及儿茶酚丁烷，如NDGA衍生物的组合物及其对动物，例如人用药的给药方法，用于治疗疾病，例如癌症或其它增生性或炎症性疾病、代谢性疾病或神经退化性疾病。 

背景技术

通过在实验动物中瘤内注射或局部用药儿茶酚丁烷例如去甲二氢愈创木酸(“NDGA”)的治疗性给药对所述化合物进行了测试。例如，Jordan等人在US 5,008,294中描述了NDGA对人乳腺癌细胞MX-1的效应，所述MX-1在第0天被皮下植入小鼠(实施例2)。在第1天，以单独的瘤内注射对含有肿瘤的小鼠进行NDGA不同剂量的注射。在另一个实验中，Jordan等人将人乳腺细胞MX-1注射入小鼠皮内，并在第23天后通过NDGA的局部用药治疗动物(实施例7)。 

Huang等人在US 6,214,874中描述了NDGA的某些衍生物(即“NDGA衍生物”)。在一实验中，用永生化小鼠细胞系，C3细胞注射小鼠，并通过瘤内单独注射M₄N或与G₄N结合来进行治疗，两者都是NDGA衍生物。 

如果获得这些抗肿瘤化合物的口服制剂，可以在不需要住院的情况下更方便地用药，特别是自我用药，将是令人期待的。本发明提供了这些令人期待的益处。 

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种或多种新型的儿茶酚丁烷和/或NDGA化合物，例如NDGA衍生物的口服制剂，以通过对需要治疗的受试对象进行所述制剂的口服给药以治疗疾病。 

另一个目的是提供如上述的安全的，并在用药于包括人在内的动物时具有很小相反的副作用的制剂。 

另一个目的是提供上述的一种或多种在商业上具有合理稳定性期间的制剂。 

另一个目的是提供上述的一种或多种在商业上具有在对动物用药的循环中合理的半衰期的制剂。 

根据上述的本发明的一个或多个目的，提供了本发明的实施方案，举例如下： 

一种对动物口服给药的组合物，其包括活性药物成分和制药学可接受的载体，其中活性药物成分包括儿茶酚丁烷，并且载体包括至少一种增溶剂和赋形剂，所述赋形剂选自：(a)非DMSO的水溶性的有机溶剂，如果当水溶性的有机溶剂是丙二醇，丙二醇在没有白矿脂，没有黄原胶(xanthan gum，也称为xantham gum和xanthum gum)，没有丙三醇或糖胶中的至少一种的情况下存在，当水溶性的有机溶剂是聚乙二醇时，聚乙二醇在没有抗坏血酸或丁羟甲苯(“BHT”)时存在，并且在聚乙二醇是聚乙二醇400时，聚乙二醇400在没有聚乙二醇8000时存在；(b)环糊精；(c)离子、非离子或两性分子表面活性剂，如果表面活性剂是非离子表面活性剂，非离子表面活性剂在没有黄原胶的情况下存在；(d)修饰的纤维素；(e)水不溶性脂类，如果水不溶性脂类是蓖麻油，蓖麻油在没有蜂蜡或棕榈蜡的情况下存在；以及(a)-(e)载体中任意的结合物。 

受试对象所罹患疾病的治疗方法，所述方法包括：(a)提供本发明的组合物；以及(b)对受试对象进行口服给药，其中组合物包括有效剂量的活性药物成分。 

用于疾病治疗的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的组合物和其应 用的说明书。 

附图说明

结合说明书附图将更好地理解上文的概述以及下文的本发明的详细说明。为了阐明本发明，在附图中显示了优选的实施方案。但是应当理解的是，本发明并不限于所示出的精确方案和手段。 

在附图中： 

图1包括图1A和1B，并描述了C-33A细胞系和Hela细胞系经M₄N处理后的细胞增殖实验的结果。图1A示出了M₄N处理后的细胞存在的数量与不经M₄N处理的细胞存在的数量的比例，其中所提供的M₄N的量在DMSO制剂中在0μM至80μM的范围内。图1B示出了M₄N处理后的细胞存在的数量与不经M₄N处理的细胞存在的数量的比例，其中所提供的M₄N的量在HP-β-CD/PEG制剂(“CPE”制剂)中在0μM至80μM的范围内。 

图2包括图2A和2B，并示出了在不存在M₄N，或存在着不同浓度的M₄N的DMSO制剂(图2A)或HP-β-CD/PEG制剂(图2B)时，基于C-33A细胞和Hela细胞死亡细胞百分比的细胞死亡测定。M₄N的浓度的变化范围从0μM至80μM。 

图3是斯普拉-道来大鼠口服在不同液体增溶剂和/或赋形剂(“载体”)中500mg/kg单一剂量的M₄N之后0.5小时、1小时、2小时或3小时时间点的M₄N吸收柱状图。在所有载体中M₄N以约60mg/mL的浓度存在。载体包括：(a)HP-β-CD(500mg/mL)+HPMC(5mg/mL)；(b)HP-β-CD(500mg/mL)+CMC(5mg/mL)；(c)TPGS(200mg/mL)；(d)TPGS(100mg/mL)+PEG 400(50％v/v)；(e)Tween_20；(f)PEG400(50％v/v)+Tween_20(50％v/v)；(g)PEG 400(33％v/v)+Tween_20(33％v/v)+薄荷油(33％)；(h)薄荷油(50％)+PEG 400(50％v/v)；(h)薄荷油(50％)+Tween_20(50％v/v)；(i)薄荷油(50％)+芝麻油(50％)。 

图4示出了比格犬(beagle dog)口服粉末形式的或在不同固体载 体中的100mg/kg单一剂量的M₄N之后0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、6小时或8小时时间点的M₄N吸收，所述剂型如下：(a)M₄N粉末；(b)冻干的HP-β-CD(81％)+M₄N(185mg/g)；(c)TPGS(20％)+M₄N(133mg/g)；(d)大豆油(95％)+蜂蜡(5％)+M₄N(200mg/g)；以及(d)橄榄油(95％)+蜂蜡(5％)+M₄N(200mg/g)。 

图5包括图5A和5B，并示出了比格犬在口服100mg/kg单一剂量之后在0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时或36小时时间点对丙三醇单油酸酯中非微粉化的M₄N的吸收。图5A是非对数级。图5B是对数级。 

图6包括图6A和6B，并示出了比格犬在口服100mg/kg单一剂量之后在0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时或36小时时间点对丙三醇单油酸酯中微粉化的M₄N的吸收。图6A是非对数级。图6B是对数级。 

图7包括图7A和7B，并示出了雄性比格犬在口服75mg/kg单一剂量之后在0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时或36小时时间点在不同载体中的M₄N的不同浓度的血清水平。图7B详细显示了所使用的载体的缩写，M₄N的用药浓度，以及是否对被禁食的狗进行用药或喂食的说明。图7A显示了非对数级的数据。图7B显示了对数级的数据。 

图8包括图8A和8B，并示出了雌性比格犬在口服75 mg/kg单一剂量之后在0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、16小时、24小时或36小时时间点在不同载体中的M₄N的不同浓度的血清水平。图8B详细显示了所使用的载体的缩写，M₄N的用药浓度，以及是否对被禁食的狗进行用药或喂食的说明。图8A显示了非对数级的数据。图8B显示了对数级的数据。 

具体实施方式

本发明提供了用于治疗疾病的新型的组合物、试剂盒和方法，所述疾病包括肿瘤和银屑病，高血压，肥胖，I或II型糖尿病，包括但 不限于疼痛、阿尔茨海默病、休克的中枢神经系统疾病或神经退化型疾病，炎症性疾病，癌前病变，发育异常，包括诸如HIV、HTLV、HPV、HSV、HBV、EBV、水痘-带状疱疹、腺病毒、细小病毒、JC病毒或其它的病毒感染的感染性疾病。本发明提供了新型的用于治疗疾病的组合物、试剂盒和方法，所述疾病包括：包括肿瘤和银屑病的增生性疾病，高血压，肥胖，I或II型糖尿病，中枢神经系统疾病或神经退化型疾病，包括但不限于疼痛、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森氏病、痴呆、休克，以及炎症性疾病，癌前病变，发育异常，感染性疾病，包括诸如人类免疫缺陷病毒(“HIV”)、人类嗜T淋巴细胞病毒(“HTLV”)、人类乳头瘤病毒(“HPV”)、单纯疱疹病毒(“HSV”)、乙肝病毒(“HBV”)、爱泼斯坦-巴尔病毒(“EBV”)、水痘-带状疱疹、腺病毒、细小病毒、雅各布-克罗伊茨费尔特病毒(“JC病毒”)或其它的病毒感染。 

本发明提供了含儿茶酚丁烷的新型组合物，所述儿茶酚丁烷包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，例如，溶解于某种制药学上可接受的增溶剂中的M₄N，所述增溶剂可以与其它稀释剂、赋形剂等(统称为“载体”)组成适宜于对受试对象例如人用药的制剂，以用于治疗疾病。这样的制剂适宜于口服用药。适宜的制药学可接受载体包括下列的至少一种：(a)非DMSO的水溶性有机溶剂，例如，聚乙二醇(“PEG”)，例如PEG300、PEG400或PEG400单月桂酸酯，丙二醇(“PG”)，聚乙烯吡咯酮(“PVP”)，乙醇，苯甲醇或二甲基乙酰胺；(b)环糊精或经修饰的环糊精，例如，羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)或磺丁基醚-β-环糊精(“SBE-β-CD”)；(c)离子、非离子或双亲性表面活性剂，例如，聚氧化乙烯去水山梨糖醇月桂酸酯(亦称为聚山梨醇酯)，其为非离子表面活性剂，例如，可获得的商品称为Tween_20或Tween_80的聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(“TPGS”)，丙三醇单油酸酯(也称为丙三醇基单油酸)，酯化的脂肪酸或氧化乙烯与蓖麻油以摩尔比35∶1的反应产物，可获得的商品称为克列莫佛(Cremophor)_EL；(d)经修饰的纤维素，例 如乙基纤维素(“EC”)，羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)，甲基纤维素(“MC”)或羧甲基纤维素(“CMC”)；和(e)水不溶性脂质，例如，蜡、油、或脂肪乳化液，例如，英托利匹特(Intralipid_)。优选地，当使用PG时，在没有白矿脂，没有黄原胶，以及没有丙三醇或糖胶中的至少一种时，使用PG。优选地，当使用PEG时，在没有维生素C或BHT时，使用PEG；当使用非离子表面活性剂时，在没有黄原胶时使用非离子表面活性剂；当油为蓖麻油时，在没有蜂蜡或棕榈蜡时，使用蓖麻油。 

在本发明的一个实施方案中，将本文的化合物溶解或溶解和稀释在不同的载体中以形成在动物体内给药的液体组合物。例如，在该实施方案的一个方面，这里的活性药物成分(“APT”)化合物溶解于水溶性的有机溶剂中例如PEG300，PEG400，或PEG400单月桂酸酯(“PEG化合物”)或溶解于PG中。在另一个实施方案中，本文的化合物溶解于经修饰的环糊精，例如，HP-β-CD或SBE-β-CD。在另一个实施方案中，这里的化合物溶解和/或稀释于含PEG化合物和HP-β-CD的组合制剂中。在一个进一步的实施方案中，本文的化合物溶解于经修饰的纤维素例如HPMC，CMC或EC中。在另一个实施方案中，本文的化合物溶解于含经修饰的环糊精和经修饰的纤维素两者的另一种组合制剂中，例如HP-β-CD和HPMC，或HP-β-CD和CMC。 

在另一个实施方案中，本文的化合物溶解于离子、非离子或两亲表面活性剂例如Tween_20，Tween_80，TPGS或酯化的脂肪酸。例如，这里的化合物可以只溶解于TPGS，或只溶解于Tween_20，或者溶解于诸如TPGS和PEG400，或者Tween_20和PEG400的结合物中。 

在另一个实施方案中，这里的化合物溶解于诸如蜡、脂肪乳化液例如Intralipid_或油的水溶性脂质中。例如，这里的化合物可以只溶解于薄荷油中，或薄荷油与Tween_20和PEG400的结合物中，或薄荷油与PEG400的结合物中，薄荷油与Tween_20的结合物中，薄荷油与芝麻油的结合物中。 

当然，在上述的实施中，乙基纤维素可以被替代或者加入乙基纤维素替代HPMC或CMC；在上述的实施中，PEG300或PEG400单月桂酸酯可以被替代或者加入PEG300或PEG400单月桂酸酯替代PEG400；在上述的实施中，Tween_80可以被替代或者加入Tween_80替代Tween_20。在上述的实施中，其它油例如玉米油，橄榄油，大豆油，矿物油或丙三醇可以被取代或者被添加以替代薄荷油或芝麻油。 

可以进行进一步的加热，在制备所述组合物中的任一种组合物的过程中，为达到本文组合物的完全溶解或获得所述组合物均一分布的悬浮液，加热温度在约30℃到约90℃。 

在一个更进一步的实施方案中，这里的API化合物可以没有伴随载体也可以使用载体以固态形式口服给药。在一个实施方案中，如在上述的实施例中，本文的化合物首先溶解于液体载体，并且接着被制成固态组合物作为口服组合物给药。例如这里的化合物溶解于经修饰的环糊精例如HP-β-CD，并且组合物被冻干以产生适宜于口服给药的粉末。 

在另一个实施方案中，这里的化合物溶解于或悬浮于TPGS溶液中，伴以加热以适宜于获得均一分布的溶液或悬浮液。加以冷却，组合物变为乳脂状并适宜于口服给药。 

在另一个实施方案中，这里的化合物溶解于油，并且加入蜂蜡以产生蜡状固态组合物。 

在本发明的另一个实施方案中，本文的化合物溶解于经修饰的诸如EC的纤维素中。诸如乙基纤维素的经修饰的纤维素在使用前可以用乙醇(“EtOH”)稀释。 

本发明还提供了水不溶性脂质作为这里的化合物的溶剂。所述水不溶性脂质包括：例如油以及混合的脂肪乳化液组合物例如Intralipid_(Pharmacia&Upjohn公司，现在的Pfizer公司)，根据生产商的推荐使用。例如推荐成人剂量不超过2g脂肪/公斤体重/天(分别为20mL，10mL和6.7mL/kg的Intralipid_10％，20％和30％)。可 以确保在1,000mL Intralipid_10％中含有：纯化的大豆油100g，纯化的卵磷脂12g，无水丙三醇22g，余量为注射用水补至1,000mL。用氢氧化钠调整pH至约为8。1,000mL Intralipid_20％中含有：纯化的大豆油200g，纯化的卵磷脂12g，无水丙三醇22g，余量为注射用水补至1,000mL。用氢氧化钠调整pH至约为8。1,000mL Intralipid_30％中含有：纯化的大豆油300g，纯化的卵磷脂12g，无水丙三醇16.7g，余量为注射用水补至1,000mL。用氢氧化钠调整pH至约为7.5。这些Intralipid_产品存放于控制在25℃以下的室温中并不被冷冻。 

总之，为制备口服制剂，本文的化合物在添加其它赋形剂之前首先被溶解以产出高稳定性的组合物。不稳定的制剂是不理想的。不稳定的液体制剂不断形成晶体沉淀或两相溶液。不稳定的固体制剂不断出现颗粒和团块，并且有时含有稀的液体。优化的固体制剂显现为光滑、均匀，并具有小的融化温度范围。总之，制剂中赋形剂的比例可以影响稳定性。例如，过于少的硬化剂如蜂蜡可以导致制剂过于松软。 

因此，总体来说，对于本发明的液体制剂，所使用的赋形剂应该是API或本文化合物，诸如M₄N的良好溶剂。或者说，赋形剂应该能够不用加热而溶解API，赋形剂也应该独立于API彼此之间兼容以使它们可以形成稳定的溶液、悬浮液或乳液。另外，总体来说，对于本发明的固体制剂，所使用的赋形剂应该是API的良好溶剂以避免结块或形成不均一的制剂。为避免固体制剂过于松软或质地不均一，这种情况是不符合需要的，赋形剂彼此之间应该相容以使它们可以形成光滑的均一固体，即使是在没有API的情况下。 

本发明也提供了与含API制剂类似但不含API的“安慰剂”，这些安慰剂用于确定制剂中不同组分或赋形剂的相容性。 

本文所使用的术语具有其在字典上的原义，并被本领域技术人员所使用，除非提供了其它含义。特别是，根据以下定义可以更好地理解本发明，所述定义与本文其它处所定义的术语结合使用。 

本文述及浓度或剂量所使用的术语“大约”意味着具体的数值高至±10％到20％。 

术语“活性药物组分”“API”或本文述及的“化合物”意指一种或多种式I的儿茶酚丁烷或诸如NDGA衍生物的NDGA化合物，其存在于本文的药物组合物中。 

本文所使用的“二氧亚烃基”是指亚甲基或被取代的二氧亚甲基或乙烯或被取代的二氧乙烯。 

在述及本文使用的式I或式II中的R-基时“未被取代或取代的氨基酸残基或其盐”是指氨基酸或被取代的氨基酸，其通过在C-末端上的至少一个H与式I或式II中的芳香基连接，其中氨基酸或被取代的氨基酸包括但不限于：甘氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸盐、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸盐、氨基乙酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、5-羟基赖氨酸、4-羟基脯氨酸、甲状腺氨酸、3-甲基组氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、氨基己二酸、γ-羧基谷氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸化酪氨酸、N-甲基精氨酸、N-乙酰赖氨酸，以及N，N-二甲基-取代氨基酸，或上述任一种的盐，例如卤盐。 

适宜于本文使用的“缓冲液”包括本领域任何常规的缓冲液，例如，Tris、磷酸、咪唑、和重碳酸盐。 

本文所使用的“载体”是指非毒素固体、半固体或液体填料，稀释剂、载色剂、赋形剂、增溶剂、胶囊材料或任何常规类型的制剂辅料，并包括所有非活性药物成分的组合物组分。载体可以包括诸如润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂的附加因子。需要时可以添加诸如抗氧化剂、湿润剂、粘性稳定剂，或近似因子的其它材料。 

本文所使用的“儿茶酚丁烷”是指式I的化合物： 

其中，R₁和R₂各自独立地代表-H、低级烃基、低级酰基、低级亚烃基；或者-R₁O和-R₂O各自独立地代表未取代的或取代的氨基酸残基或其盐；R₃、R₄、R₅、R₆、R₁₀、R₁₁、R₁₂和R₁₃各自独立地代表-H或低级烃基；并且R₇、R₈和R₉各自独立地代表-H、-OH、低级烷氧基、低级酰氧基，或未取代的或取代的氨基酸残基或其盐，或者任何的两个邻近的基团一起可以是二氧亚烃基。 

本文所使用的“环糊精”是指未修饰的环糊精或经修饰的环糊精，包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和含对其修饰的经修饰的环糊精，例如HP-β-CD或SBE-β-CD。环糊精通常具有6(α-环糊精)、7(β-环糊精)、和8(γ-环糊精)糖，每个糖高至3个取代物，并且可以有0到24个一级取代物(一级取代物被定义为直接与环糊精环连接的取代物)。在本发明中所使用的修饰或未修饰的环糊精可以具有适当数字和位置的一级取代物或其它修饰。 

本文所使用的NDGA的“衍生物”是指“NDGA衍生物”(见下文)。 

本文所使用的术语“疾病”包括应用本发明组合物对其产生治疗效果的所有疾病、状况、感染、综合征或紊乱。这些疾病包括例如，但不限于，癌症，银屑病和其它增生性疾病，包括风湿性关节炎、骨关节炎、溃疡性结肠炎、克隆氏(Crohn′s)病的炎症性疾病，动脉硬化症，慢性阻塞性肺疾病(“COPD”)，高血压，肥胖，糖尿病，疼痛，休克和/或其它的神经性紊乱或神经退化性疾病或状况，包括阿兹海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症(“ALS”)和诸如上皮内瘤或发育异常的癌前病变，以及传染病。 

本文所使用的“G₄N”或“四-N，N-二甲基甘胺酰NDGA”或“四二甲基甘胺酰NDGA”是式II中的NDGA衍生物，其中R₁₄、R₁₅、R₁₆ 和R₁₇各自独立地代表固体形式或液体形式的-O(C＝O)CH₂N(CH₃)₂或-O(C＝O)CH₂N⁺(CH₃)₂·Cl^-；并且R₁₈和R₁₉各自代表-CH₃。 

本文所使用的“低级酰基”是指C₁-C₆酰基，优选为C₁-C₃酰基。 

本文所使用的“低级烃基”是指C₁-C₆烃基，优选为C₁-C₃烃基。 

本文所使用的“M₄N”或“四-O-甲基NDGA”是式II中的NDGA衍生物，其中R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇各自独立地代表-OCH₃，并且R₁₈和R₁₉各自为-CH₃。 

本文所使用的“经修饰的纤维素”是指包括对纤维素分子的一个或多个修饰，并包括，例如EC、HPMC、CMC和MC。 

本文所使用的“NDGA”是指去甲二氢愈创木酸，并具有下列结构式： 

本文所使用的“NDGA化合物”是指单独或全部为NDGA和/或任何一种或多种NDGA衍生物。 

本文所使用的“NDGA衍生物”是指具有结构式II的NDGA衍生物： 

其中R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇各自独立地代表-OH、低级烷氧基、低 级酰氧基，或未取代的或取代的氨基酸残基或其制药学上可接受的盐；并且R₁₈和R₁₉各自独立地代表-H，或低级烃基，其中R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇不同时为-OH。因此，该术语包括NDGA的甲基化衍生物的化合物，例如，四-O-甲基NDGA(M₄N)，三-O-甲基NDGA(M₃N)，双-O-甲基NDGA(M₂N)和单-O-甲基NDGA(M₁N)。可选择地，NDGA衍生物可以是在其中NDGA的羟基或甲基中的一个或多个氢被取代的化合物，例如，其中R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇各自独立地代表低级烷氧基、酰氧基，或氨基酸，或被取代的氨基酸或其盐；并且R₁₈ 和R₁₉各自独立地代表-H或诸如低级烃基的烃基。该术语包括，例如，在其中R₁₄、R₁₅、R₁₆和R₁₇各自独立地代表-OCH₃或-O(C＝O)CH₃或双取代的氨基酸残基的化合物，例如，N，N-二甲基取代的氨基酸残基，例如，-O(C＝O)CH₂N(CH₃)₂或-O(C＝O)CH₂N⁺(CH₃)₂·Cl^-；并且R₁₈ 和R₁₉各自独立地代表-H，或低级烃基，例如，-CH₃或-CH₂CH₃。 

如本文所使用的，“百分比”，“百分率”或符号“％”是指在组合物中所示的组分基于存在于组合物的载体的量的百分比，涉及重量/重量(w/w)，重量/体积(w/v)或体积/体积(v/v)，如所显示的任何具体的组分，所有的都基于存在于组合物中的载体的量。因此，不同类型的载体可以如所显示的，以高至100％的量存在，所述载体不排除API的存在，所述API的量可以显示为％或存在于组合物中的具体值，或存在的mg/g的具体数值，或存在的mg/mL的具体数值，其中，％或mg/g或mg/mL基于存在于组合物中的总的载体的量。载体的某些类型可以结合组成载体的100％而存在。 

本文所使用的“制药学上可接受的载体”是针对受药者以使用量或浓度的非毒素，并且与制剂的其它组分相容。例如，包含该儿茶酚丁烷、NDGA或NDGA衍生物的制剂载体优选地不包括氧化剂和其它已知的对其有害的化合物。制药学可接受的载体包括增溶剂。合适的制药学可接受载体包括，但不限于，水、葡萄糖、丙三醇、盐、乙醇、缓冲液、聚氧乙烯蓖麻油(Cremaphor_EL)、磷酸盐缓冲液、PEG300、PEG400、经修饰的环糊精，以及所有以上述及物质的结合 物。 

术语“制药学可接受赋形剂”包括载色剂、佐剂，或稀释剂或其它辅助物质，例如本领域常规的，公众易于获得的，并且对于受药者使用剂量或浓度是无害的，并且与制剂的其它组分是相容的。例如，制药学可接受辅助物质包括pH调节和缓冲因子、渗透压调节因子、稳定因子、湿润因子等。 

本文所使用的术语“增溶剂”是指在其中溶解有一种或多种儿茶酚丁烷或NDGA化合物，例如NDGA衍生物。增溶剂也可以是载体或制药学可接受载体。 

术语“受试对象”“宿主”，和“病人”在本文可互换使用来指使用本组合物治疗的动物，包括，但不限于，猿、人、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、山羊、农场哺乳动物、运动哺乳动物和宠物哺乳动物。 

在本文述及儿茶酚丁烷或NDGA衍生物所使用的“基本纯化”的化合物是指基本没有非儿茶酚丁烷、NDGA化合物或NDGA衍生物的物质(统称为“非NDGA物质”)。基本没有是指至少约50％不是非NDGA物质，优选地至少约70％，更为优选地是至少约80％，更为优选地是至少90％，更为优选地是至少约95％的非NDGA物质。 

如本文所使用的，术语“治疗”“在治疗”等是指获得理想的药理学和/或生理学效果。效果可以依据完全或部分阻止状况或疾病或其综合征是预防性的，或可以依据部分或完全治愈状况或疾病和/或归因于状况或疾病副作用而是治疗性的。受试对象的“治疗”包括，例如，哺乳动物，部分是人的疾病的任何治疗，并包括：(a)在易于罹患该疾病但在患病时还不能诊断出的受试对象中阻止疾病的发生；(b)抑制疾病的发展或进行，例如抑制其发展；以及(c)减轻、缓和或改善疾病，例如引起疾病的衰退或去除。 

在本发明的进一步描述之前，应该理解，本发明不限于所描述的具体实施方案，同样可以进行变化。也应该理解本文所使用的术语只是用于描述具体的实施方案，并不意在限制，本发明的范围只由所附的权利要求所限制。 

在提供数值的范围之处，应该理解中间每个数值，到下限单位的1/10，除非上下文清晰地另有所指，在该范围的上限和下限之间以及在所述范围内任何其它所述的或中间的值，都被包括在本发明内。较小范围的上限和下限可以各自被包括在所述较小范围内，并且也被包括在本发明内，在所述范围内受限于任何特定的被排除的限制。在所述范围包括一个或两个限度之处，本发明也包括了排除了一个或两个限度的范围，所述范围具有限度。 

必须说明的是，在本文使用的本文使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括多个指示物，除非上下文另有指示。因此，例如，就“acompound”而言包括多个这样的化合物，并且就“the NDGA compound”而言包括一个或多个的NDGA化合物，例如NDGA衍生物，以及本领域技术人员所知道的其的等同物。 

本文所提及的所有出版物，包括专利、专利申请，和杂志文献通过引用其全文及在其中所被引用的文献被并入到本文，所述在其中所被引用的文献也通过引用全文被并入到本文中。 

本文所讨论的出版物各自都是在本申请的提交日之前公开的。在这里不能认为是承认本发明迟于这种在先发明的出版物。另外，所提供的出版日期可以与实际出版日期不同，所述出版日期可能需要单独确保。在权利要求书之前的参考文献对本申请文件中所提到的参考文献的引用进行了详细的说明。 

在下文仅是通过实施例描述本发明，不能被理解为对本发明的任何限制。 

儿茶酚丁烷的制备 

可通过本领域任何公知的方法制备本发明的儿茶酚丁烷。例如，可以参照在US5,008,294中所描述的内容制备这种化合物。 

NDGA衍生物的制备 

可通过任何商业化来源购买NDGA，例如，Alexis BiochemicalsCorp.公司，圣迭戈，加利弗尼亚，美国(产品目录：第LKT-N5669号)，或A.G.Scientific，Inc公司，圣迭戈，加利弗尼亚，美国(产品目录：第 N1071号)，或Cayman Chemical Company公司，安阿伯市，密歇根，美国(产品目录：第70300号)。 

可通过任何常规的方法制备NDGA衍生物及其制剂。例如，可根据美国专利5,008,294；美国专利6,291,524；Hwu，J.R等人(1998)或McDonald，R.W等人(2001)中所描述的内容制备NDGA衍生物。 

在本发明的一个实施方案中，如下制备NDGA衍生物，四-O-甲基NDGA，也被称为内消旋-1，4-双(3，4-二甲氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，或M₄N：在反应烧杯中制备含NDGA和氢氧化钾的甲醇溶液。之后将硫酸二甲酯加入到反应烧瓶中，并使反应进行下去。最后用水对反应淬火，使产物沉淀。通过过滤分离沉淀物，并在真空炉干燥。之后将化合物溶解在二氯甲烷和甲苯的溶液中，并且之后通过氧化铝柱纯化。通过旋转蒸发移去溶剂，并将固体重悬于异丙醇并通过过滤分离。在真空炉中干燥过滤饼状物。通过将过滤饼状物在异丙醇回流使产生的四-O-甲基NDGA(M₄N)结晶，并通过过滤重新分离晶体。 

在本发明的一些实施方案中，本发明的某些NDGA衍生物，例如G₄N，也被称为内消旋-1，4-双(3，4-二甲氧基苯)-2R，3S-二甲基丁烷或四-二甲基甘胺酰NDGA，或其盐酸盐，以及具有氨基酸取代物的类似化合物，也可以按照常规方法制备，例如根据美国专利6,417,234中描述的内容制备。 

治疗组合物的制备 

本发明提供了包括药物组合物的组合物，所述药物组合物包括儿茶酚丁烷，所述儿茶酚丁烷包括NDGA化合物和NDGA衍生物作为活性药物成分(“API”)，和制药学上可接受的载体或赋形剂。通常，本发明的组合物将包括从少于约0.1％到高达约99％的API，即儿茶酚丁烷，其在本文包括NDGA化合物和NDGA衍生物；可选择地，本发明将包括约2％到约90％的API。 

本发明还提供组合物，在所述组合物中包括儿茶酚丁烷，其包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，如M₄N，所述儿茶酚丁烷以约 1mg/mL到约200mg/mL的浓度存在，或约10mg/mL到约175mg/mL，或约20mg/mL到约150mg/mL，或约30mg/mL到约125mg/mL，或约40mg/mL到约100mg/mL，或约50mg/mL到约75mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，NDGA化合物以约1mg/mL，约2mg/mL，约2.5mg/mL，约5mg/mL，约10mg/mL，约15mg/mL，约20mg/mL，约25mg/mL，约30mg/mL，约35 mg/mL，约40mg/mL，约45mg/mL，约50mg/mL，约55mg/mL，约60mg/mL，约75mg/mL，约80mg/mL，约90mg/mL，约100mg/mL，约120mg/mL，约125mg/mL，约150mg/mL，约175mg/mL或约200mg/mL的浓度存在于本文的组合物中。 

本发明另外提供组合物，在所述组合物中包括儿茶酚丁烷，其包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，如M₄N，所述儿茶酚丁烷以约1mg/g到约250mg/g的范围的浓度存在，或可选择地，约20mg/g到约200mg/g，或约40mg/g到约180mg/g，或约60mg/g到约160mg/g，或约80mg/g到约130mg/g，或约50mg/g到约100mg/g的浓度存在。在一个实施方案中，该化合物以约133mg/g，约185mg/g，约200mg/g，和约250mg/g的浓度存在本文的组合物中。组合物中的API的示范剂量包括，但不限于，20mg/g，约50mg/g，约75mg/g，约100mg/g，约120mg/g，约130mg/g，约140mg/g，约150mg/g，约175mg/g或约200mg/g。 

可选择地表示，本发明的组合物的其它实施方案可以包括少于约0.1mg到约200mg或更多的API，例如约10mg，约20mg，约25mg，约30mg，约40mg，约50mg，约60mg，约75mg，约100mg或约200mg的API。 

在本发明的一个实施方案中，提供了含API和载体的组合物，其中API是儿茶酚丁烷，并且载体含有增溶剂和/或溶解API的赋形剂，其中增溶剂和/或赋形剂包含至少一种，但可以含有多种的下列物质：(a)水溶性有机溶剂，例如，PG(丙二醇)或PEG(聚乙二醇)化合物，其中PEG化合物是，例如，PEG300、PEG400或PEG400单月桂酸酯；(b)环糊精，例如经修饰的环糊精；(c)离子、非离子或两性表 面活性剂，例如Tween_20、Tween_80或TPGS、丙三醇单油酸酯和酯化的脂肪酸；(d)经修饰的纤维素，例如EC、HPMC、MC或CMC；以及(e)水不溶性的脂质，例如，油、蜡或脂肪乳剂，例如Intralipid_，如果当组合物含有蓖麻油时，其不含有蜂蜡或棕榈蜡；以及前述(a)-(e)因子的混合物。 

在一个实施方案中，本发明提供了如上的组合物，所述组合物是适合于口服给药的液体组合物。在另一个实施例中，本发明提供了如上的组合物，所述组合物是适合于口服给药的固体组合物。 

在另一个实施方案中，本发明提供例如上的组合物，当所述组合物含有丙二醇，其也不含有(a)丙三醇或氨基乙酸其中之一；或(b)白矿脂；或(c)黄原胶。 

在另一个实施方案中，本发明提供了如上的组合物，当所述组合物含有非离子表面活性剂时，其也不含有黄原胶。 

在另一个实施方案中，本发明提供了如上的组合物，当所述组合物含有PEG400时，其也不含有PEG8000或BHT。 

在优选的水溶性有机溶剂中有乙醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺、PVP、PG和PEG化合物，例如PEG300、PEG400，或PEG400单月桂酸酯。 

在本发明组合物中的PEG化合物以约5％到约100％的量提供，或以约5％到约60％，或约10％到约90％，或约20％到约80％，或30％到约70％，或约40％到约60％的量提供，所有的浓度是体积/体积(v/v)百分比。PG可以以约2.5％到约100％(v/v)的浓度存在。 

本发明组合物中的PEG化合物的浓度可取决于还存在的增溶剂或稀释剂而变化。例如，本发明的PEG300、PEG400或PEG400单月桂酸酯的浓度可以是约5％，约10％，约12.5％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，或约95％，所有浓度以体积/体积(v/v)的百分比给出。 

本发明也提供环糊精中的二茶酚丁烷或NDGA化合物的组合物，所述环糊精包括经修饰的环糊精。本文的环糊精可是α-环糊精、β-环 糊精、γ-环糊精，并且经修饰的环糊精可以包括例如，HP-β-CD和SBE-β-CD。在一个实施方案中，本发明的组合物含有浓度在约5％到约80％，或约10％到约70％，或约20％到约60％，或约30％到约50％，所有浓度以重量/体积(w/v)的百分比给出。 

在另一个实施方案中，经修饰的环糊精，例如HP-β-CD，以约12.5％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％或约75％的浓度存在于所述组合物中，所有浓度以重量/体积(w/v)的百分比给出。 

可以单独使用或与本发明的组合物中的其它组分结合使用的另一种制药学上可接受的载体或赋形剂是离子、非离子或两性表面活性剂，例如，Cremophor_EL，聚山梨醇酯，它们是非离子表面活性剂，例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，商业上可获得的例如Tween_20或Tween_80，TSGS，在许多的其它种类中是两性表面活性剂。合适的表面活性剂的进一步的例子包括，但不限于，丙三醇单油酸酯，和酯化的脂肪酸，例如通常通过植物油的酯基转移反应制得，可以从美国新泽西州Paramus的Gattefosse Corp公司获得几个品种和等级，如Labrafil_，Labrasol_，和Gelucire_。表面活性剂可以任何所需的有效剂量存在，例如以约1％(v/v)到约100％(v/v)，优选地约9％(v/v)到约80％(v/v)，并且更优选地，约10％(v/v)到约50％(v/v)存在。作为具体的实施例，非离子表面活性剂的优选浓度是以约9％(v/v)到约100％(v/v)的Tween_20，和约33％(v/v)到约100％(v/v)的Tween_80。表面活性剂的所有百分比是体积百分比(v/v)。 

可以单独使用或与本发明的组合物中的其它组分结合使用的另一种制药学上可接受的载体或赋形剂是经修饰的纤维素，例如EC、HPMC、MC和CMC。经修饰的纤维素可以以任何所需的有效剂量存在，例如以约0.1％到约25％，或约0.5％到约7.5％，或约1.0％到约5％的浓度存在。作为具体的实施例，EC可以约5％到约20％的浓度存在；HPMC可以以约0.5％到约1％的浓度存在；MC可以以约1％到约3％的浓度存在，CMC可以以约1％到约4％的浓度存在。经修饰 的纤维素的百分比为每体积重量(w/v)。 

在另一个实施方案中，本发明提供了如上的组合物，所述组合物包括PEG化合物，例如，PEG400，例如，以及表面活性剂，例如Tween_20，作为增溶剂和/或赋形剂。 

可以单独使用或与本发明的组合物中的其它组分结合使用的另一种制药学上可接受的载体或赋形剂是水不溶性的脂质，例如油、脂肪乳剂或蜡。水不溶性的脂质载体可以以任何需要的有效剂量存在，例如以约10％到约100％，或约15％到约85％，或约25％到约75％的浓度存在。 

油的非限制性的例子包括玉米油、橄榄油、薄荷油、大豆油、芝麻油、矿物油和丙三醇。在一个实施方案中，所述油以约10％(v/v)到约100％(v/v)的浓度存在。混合的脂肪乳剂组合物是可以获得的，例如上文描述的Intralipid_乳剂。在不同的实施方案中，混合的脂肪乳可以以约10％(w/v)到约30％(w/v)的浓度存在，优选为20％(w/v)。合适的蜡的非限制性的例子包括蜂蜡和棕榈蜡。在一个实施方案中，所述蜡以约5％(w/w)到约50％(w/w)的浓度存在。 

水不溶性载体可以与任意的或更多的水溶性载体，例如PEG化合物，和表面活性剂，例如Tween_20或Tween_80结合使用。作为更进一步的例子，本发明组合物包括增溶剂和/或赋形剂的结合，例如油和表面活性剂，如薄荷油和Tween_20或油和PEG化合物，例如薄荷油和PEG400。 

在另一个实施方案中，本发明的组合物包括油、表面活性剂和PEG化合物，例如，薄荷油、Tween_20、和PEG400化合物。 

作为进一步的例子，本发明组合物包括油的结合或油和蜡的结合，例如薄荷油和芝麻油，大豆油和蜂蜡或橄榄油和蜂蜡。蜂蜡可以在约5％到50％(w/w)的浓度范围内存在。 

可选择地，在另一个实施方案中，Tween_80可代替Tween_20，以及PEG300或PEG400单月桂酸酯可代替PEG400，并且任何的油可代替薄荷油、大豆油和橄榄油。 

其它的赋形剂包括丙三醇单油酸酯和不同类型的酯化的脂肪酸，例如Labrafil_、Labrasol_和Gelucire_产品。这些物质通常被归类于表面活性剂或乳剂，但是Labrasol_，和Gelucire_产品也被用作生物可利用度增强剂。 

Labrafil_、以及特别是Labrafil_M 1944 CS，可以被用作API，例如M₄N的赋形剂，其中溶解的API的浓度为约5mg/mL到约500mg/mL。最终产物可以是溶液、悬浮液或固体。 

Labrasol_可以被用作API，例如M₄N的赋形剂，其中溶解的API的浓度为约1mg/mL到约500mg/mL。最终产物可以是溶液、悬浮液或固体。 

Gelucire_，以及特别是Gelucire_44/14，可以被用作API，例如M₄N的赋形剂，其中溶解的API的浓度为约0.1mg/mL到约500mg/mL。最终产物可以是溶液、悬浮液或固体。 

各种的载体组分的结合物可以被用作API，如上文所述。这种实施方案的一个非限定的例子是10mg/ml M₄N位于25％(w/v)PEG 300，30％(w/v)HP-β-CD中，载体的平衡液是注射入动物的“适合于注射的水”(“WFI”，是指在制药工业上经验证的级别)。在此优选的实施方案中，HP-β-CD具有6-8次的取代，但是在其它实施方案中的其它取代也处于本发明的范围之内，如上所述。 

而且，其它的赋形剂和添加剂，例如生物可利用度增强剂，可以与本发明组合物中的任意的所述载体结合使用，合适的生物可利用度增强剂包括，例如，但不限于，丁子香酚、肉桂醛、卵磷脂、柚皮素、柚皮苷和胡椒碱(piperin)(也被称为piperine)，以及上文已述及的物质。 

应该理解的是，只要本文的儿茶酚丁烷被溶解并被保持在溶液、悬浮液中，或被保持在所述组合物的半固体或固体形式中，可以将本文的一种或多种增溶剂或稀释剂或赋形剂加入到组合物中以优化将此组合物递送到需要这种治疗的受试对象中。 

在这里，其它的适于应用的制药学可接受的载体或赋形剂在许多 出版物上都被描述过。有用的载体或赋形剂的例子，例如在Gennaro，A.R.(2003)；Ansel，H.C.等人.(2004)；Rowe，R.C.等人.(2003)；和Garg，S.等人.(2001)中描述过。 

液体形式的组合物可以包括缓冲液，所述缓冲液可以根据儿茶酚丁烷或NDGA化合物，例如NDGA衍生物的需要用途进行选择，而且液体形式的组合物也可以包括其它的适宜于需要用途的其它物质。本领域技术人员可以容易地选择合适的缓冲液，许多种在本领域都是公知的，适宜于所需用途。 

治疗方法 

含有儿茶酚丁烷的组合物，其包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，在许多疾病中具有治疗剂的用途或用于治疗需要该种治疗的受试对象，在所述疾病中可以使用所述的儿茶酚丁烷。 

本发明提供了治疗疾病的方法和组合物，例如增生性疾病，例如良性或恶性的肿瘤，银屑病，癌前病变和新生肿瘤，例如上皮内瘤，或发育异常。本发明也提供了糖尿病的治疗，包括I型和II型糖尿病，肥胖和由其引起的并发症，包括心血管疾病，休克和高血压。本发明进一步提供了炎症性疾病的治疗，包括风湿性关节炎，骨关节炎，多发性硬化症，溃疡性结肠炎，克隆氏病，慢性阻塞性肺疾病(COPD)和其它免疫系统相关性疾病。另外本发明提供了神经性疾病的治疗，包括中枢神经系统疾病或神经退化型疾病，例如，阿尔茨海默病，痴呆，肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和帕金森氏病。在另一个实施方案中，本发明提供了感染性疾病的治疗，例如病毒感染，包括需要用于转录或复制的Sp1结合的病毒。这种需要Sp1结合的病毒的例子包括：HIV、HTLV、HPV、HSV、EBV、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、细小病毒和JC病毒。 

根据受试方法，各种的动物宿主都是可以治疗的，包括人和非人动物。通常这样的宿主是“哺乳动物(mammals)”或“哺乳动物(mammalian)”，其中这些术语被广泛地用于描述在哺乳动物纲内的有机体，包括食肉动物目(例如狗和猫)，啮齿动物目(例如豚鼠， 和大鼠)，以及其它哺乳动物，包括牛、山羊、马、绵羊、兔、猪，和灵长类(例如，人、黑猩猩，和猴)。在许多实施方案中，宿主可以是人。动物模型对实验研究是相关的，例如提供用于人类疾病治疗的模型。另外，本发明对于兽医疾病也是可以应用的。 

制剂、剂量，和给药途径 

在本发明的一个实施方案中，将本发明组合物的有效剂量用于宿主，其中“有效剂量”是指足以产生所需结果的剂量。在一些实施方案中，例如，所需结果至少是抑制新生肿瘤或发育异常。 

本发明另外提供了组合物，在所述组合物中活性药物成分，例如，儿茶酚丁烷，包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，例如M₄N，以小于1mg/kg动物体重到约600mg/kg动物体重的口服剂量被用药于动物，例如人。可选择地，可以1mg/kg，或50mg/kg，或100mg/kg，或150mg/kg，或200mg/kg，或250mg/kg，或300mg/kg，或350mg/kg，或400mg/kg，或450mg/kg，或500mg/kg，或550mg/kg的剂量处理动物。可以一次或在一定的天数或周数或月数的时间内重复对动物给药。可选择地，根据受试对象的健康状况、受试对象的易感性、要被治疗疾病的程度、受试对象的年龄等，这样的剂量可以扩展到一定的时期。 

在一个实施方案中，通过首先将活性药物成分溶解在增溶剂中，需要时伴以搅拌和加热来制备这里的治疗组合物。将其它的赋形剂加入到溶解的混合物中以产生出理想的基于质地和稳定性需要的特性。在另一个实施方案中，活性药物成分可以不实际溶解于增溶剂中，但是可以简单地均匀分散于悬浮液中。在另一个实施方案中，溶解的组合物可以被冷冻并以粉末形式使用。最后的口服组合物可以是液体溶液或悬浮液，或可以是固体粉末、片剂，或胶囊。 

如上所指出的，要被给药的适合的剂量取决要被治疗的受试对象，例如受试对象的一般健康状况、受试对象的年龄、疾病的状态或状况、受试对象的体重、疾病的程度例如肿瘤的大小。通常约0.1mg到约500mg或更少可被给药于儿童，以及约0.1mg到约5克或更少可被 给药于成人。活性因子可被单独，或通常更多种，多重给药。给定的因子的优选剂量可以容易地被本领域技术人员通过各种方法确定。其它的有效剂量可以被本领普通技术人员的其中之一通过常规实验建立剂量响应曲线而容易地确定。因子的剂量应该当然地根据具体使用的因子而变化。 

活性因子用药的频率，结合剂量，将由护理者基于年龄、体重、疾病状态和病人的反应来确定。因此，每天、每周、每月可以一次或多次使用因子，或者根据惯例适当使用。因子可以被间断给药，例如一定的天数、周数或月数期间，之后不再用药，直到经过一段时间后，例如3或6个月，并且之后再次在一定的天数、周数或月数的期间用药。 

在制药学剂量形式中，活性因子可以单独使用，或与其它的药物活性因子或包括其它小分子、抗体或蛋白治疗性物质适当的联合，或结合物。 

另外，如果需要，载体或赋形剂可以包括小量的辅助性物质，例如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂。制备这种剂量形式的实际方法对于本领域技术人员是公知的，或者是显而易见的。参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed(雷明顿制药科学，第20版)，Mack Publishing Co.(Mack出版公司)Rawlins EA，(1997)。要被应用的组合物或制剂将在任何情况下都包含足以在被治疗的受试对象中达到理想状态的API的量。 

本发明包括含有多个或单位剂量的活性因子的试剂盒。在该试剂盒中，容器除了包括多个或单位剂量的组合物，所述组合物包括儿茶酚丁烷，其包括NDGA化合物，例如NDGA衍生物，所述容器将是放入了描述药物在治疗相关病理学状况中的用法和伴随的益处的说明书的信息包装。可选择地，用于本发明组合物用药的用药器具也包括在每一个试剂盒中。 

以下提出的实施例本质上是示范性的，并不被看做是限制本发明的。 

实施例1  含在HP-β-CD和/或PEG 300中的M₄N的制剂的制备。 

在本实施例中，根据PCT/US2004/016117的描述制备M₄N并在增溶剂中增溶。生成的溶液可选择地与赋形剂和/或稀释剂混合。增溶剂和赋形剂可以交换使用或彼此结合使用。使用的一种增溶剂或赋形剂是从Research Diagnostics，Inc公司(产品目录号RDI-82004HPB，批号H3N188P)(Flanders，新泽西，美国)获得的内毒素-可控的羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)。所使用的另一种增溶剂或赋形剂是PEG300，从Spectrum Chemicals，Inc公司(产品目录号P0108，批号TB1228)(Gardena，加利弗尼亚，美国)获得。 

在本发明的一个实施方案中，HP-β-CD和PEG 300以单一制剂的形式存在。为制备这些制剂，M₄N首先溶于PEG 300以形成M₄N的PEG300溶液(“M₄N/PEG 300”)。M₄N/PEG 300溶液之后被加入到预先制备的HP-β-CD溶液以形成在HP-β-CD和PEG 300中的M₄N溶液(以下，称为“CPE”制剂)。 

当制备HP-β-CD溶液时，必须考虑到体积膨胀。例如，对于40％(w/v)HP-β-CD溶液，应该考虑到0.7mL/g(即增加每克HP-β-CD移除0.7mL的水)。 

作为增溶剂和/或赋形剂使用的100mL的40％HP-β-CD溶液按照以下制备：65 mL的WFI被放置于含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。将约40克的HP-β-CD缓慢加入到搅动的WFI，使用刮勺将HP-β-CD引导至烧杯中央以阻止HP-β-CD结晶粘附到烧杯壁上。HP-β-CD溶液被搅拌24小时直到目测到HP-β-CD完全溶解。测定生成的溶液大约为93mL。将大约7mL的WFI加入到该生成的溶液以达到100mL，生成约40％HP-β-CD的最终溶液。最终溶液被搅拌1小时，室温存放，并避光。制备该修饰的环糊精溶液的方法可以放大或缩小以获得理想的体积或浓度。也可以类似地制备其它浓度或其它经修饰的环糊精溶液，例如，通过将HP-β-CD替代为其它经修饰的环糊精，在上述的步骤中调整为适当的浓度。 

根据如下制备10mL的在40％HP-β-CD中的浓度为10mg/mL的M₄N溶液。将约10mL的40％HP-β-CD加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下，将约10mg M₄N缓慢加入到烧杯中央的40％HP-β-CD。M₄N/40％HP-β-CD混合物搅拌2小时，或直到所有的M₄N均匀地悬浮，不存在任何的团块。M₄N/40％HP-β-CD混合物可选择地在80℃被加热约30分钟。(或更长，如果需要大体积的溶液，例如，100mL的M₄N/HP-β-CD，80℃1小时)，或更长，如果需要保证M₄N的完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/HP-β-CD混合物或溶液任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。最终的M₄N/40％HP-β-CD溶液被存放于室温并避光。该方法可以放大或缩小以获得需要的M₄N的体积或浓度。也可以类似地制备含有存在于其它环糊精溶液中的M₄N的制剂，例如，通过在上述步骤中将HP-β-CD替代为其它环糊精。在表1中显示的结果显示存在于冷却后的大于7天的40％HP-β-CD环糊精制剂中浓度为1mg/mL和10mg/mL的溶液的M₄N。 

如下制备在PEG 300中浓度为25mg/mL的M₄N的100mL溶液。约100mL的PEG 300被加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下以阻止M₄N粘附到烧杯壁上，将约2.5g M₄N缓慢加入到烧杯中央的PEG 300。M₄N/PEG 300混合物被搅拌24小时，或直到所有的M₄N溶解或均匀地悬浮，不存在任何的团块。M₄N/PEG 300混合物可选择地在约60℃被加热约30分钟。(或更长，如果需要更大的体积，例如500 mL的M₄N/PEG 300混合物，在60℃加热1小时)，或者更长，如果需要保证M₄N的完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/PEG 300混合物或溶液任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。在观察到所有的M₄N都溶解后，立即应用所产生的M₄N/PEG300溶液，否则，在48小时的有效期内，可能形成另外的结晶或其它沉淀。如果形成结晶，M₄N/PEG 300溶液可以再次在磁性盘上在60℃ 加热伴以搅拌约1小时，直至所有的M₄N重新溶解回溶液。最后的M₄N/PEG 300溶液室温储存并避光。该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积和浓度。可以类似地制备含有在其它PEG中的M₄N的制剂，例如，通过在上述的方法中用PEG 400或PEG 400单月桂酸酯替代PEG 300。 

含有50％PEG 300(v/v)，20％HP-β-CD(w/v)和12.5mg M₄N的制剂的100mL储存液的制备是：将50mL的40％预先制备的HP-β-CD溶液(根据前述方法制备)加入到放置在磁性盘上，含搅拌棒的玻璃烧杯中，搅拌棒以中等速度搅拌，并缓慢加入50mL的预先制备的M₄N/PEG 300溶液(根据前述方法制备)，例如，以每分钟约10mL的速度。使用吸液管将M₄N/PEG 300加入到烧杯的中央，以防止其粘附到烧杯壁上，并保证完全地溶解。将M₄N/PEG 300加入到HP-β-CD溶液，起初显示为白色溶液，但是最后在持续混合后变为清晰。为制备理想的M₄N/PEG 300和HP-β-CD体积和浓度，该配方可以适当地被放大或缩小。可以使用0.22μm PVDF膜，例如，从Millipore公司(产品目录号SCGV T05 RE)(Billerica，马萨诸塞州，美国)获得的预先灭菌的真空驱动设置的无菌瓶顶过滤膜，对储存液过滤除菌。过滤过程由真空力驱动，并且将过滤物收集在预先灭菌的250mL的玻璃瓶内。之后瓶被紧密地密封，在室温储存并避光。可以通过在前文描述的方法中将PEG 300替代为PEG 400或PEG 400单月桂酸酯，类似地制备M₄N/PEG 400或M4N/PEG 400单月桂酸酯在HP-β-CD中的储存液。 

以前述方式制备的M₄N/PEG300/HP-β-CD，M₄N/PEG400/HP-β-CD或M₄N/PEG 400单月桂酸酯/HP-β-CD储存液，在体外使用或给药于动物之前可以被稀释。如果需要稀释，例如，稀释液可以优选地在WFI中稀释，替代盐水，以降低渗透压。为制备100mL的1∶1稀释在WFI中的储存液，将约50mL的储存液加入玻璃小瓶中。将约50mL的WFI加入到在小瓶中的50mL的储存液以形成稀释溶液。玻璃小瓶被密封，并且通过震荡和颠倒小瓶几次使稀释液混合。 使用0.22μm PVDF膜，例如，从Millipore公司(产品目录号SCGVT05 RE)(Billerica，马萨诸塞州，美国)获得的预先灭菌的真空驱动设置的无菌瓶顶过滤膜，对稀释液过滤除菌。过滤过程由真空力驱动，并且将过滤物收集在预先灭菌的250mL的玻璃瓶内。之后瓶被紧密地密封，在室温储存并避光。该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积和稀释，例如1∶2或1∶4的稀释。 

适合用作安慰剂对照的，包括50％PEG 300和20％HP-β-CD的制剂可以如下制备。为制备安慰剂量或对照制剂的100mL溶液，约50 mL的40％HP-β-CD被加入到放置在磁性盘上，含搅拌棒的玻璃烧杯中，磁性盘被设置在中等速度搅拌HP-β-CD溶液。约50mL的PEG 300通过吸液管被缓慢加入到玻璃烧杯中的50mL的HP-β-CD的烧杯中央以防止PEG 300粘附在烧杯壁上。混合物被搅拌约1小时直至完全混合。使用0.22μm PVDF膜经真空力驱动过滤对安慰剂进行过滤除菌。将过滤物收集在预先灭菌的250mL的玻璃瓶内。瓶被紧密地密封，在室温储存并避光。该配方可以根据需要被放大或缩小以获得需要的浓度和体积量。另外，如果需要，可以将PEG 300替代为PEG 400或PEG 400单月桂酸酯。 

M₄N在根据前述的或近似的方法制备的，含HP-β-CD和/或PEG300，PEG400的制剂中，以及在含HP-β-CD和丙二醇(“PG”)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羧基甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或Tween_80的制剂中的溶解性结果，以及所产生的制剂的特性在表1-5中显示，其中，N代表“否”，Y代表“是”。 

表1.作为增溶剂和/或赋形剂的经修饰的环糊精 

[0144] 

[0145] 

[0146] 

[0147] 

[0148] 所有制剂在4℃保持24小时，然后5000rpm离心5分钟，不形成可见沉淀。含有50％PEG 300，20％HP-β-CD，12.5mg/mL M₄N储存液的制剂在4℃至少保持4个月。以1∶1或1∶2同样储存的稀释液液在4℃至少保持4个月。 

表2.在PEG 300和HP-β-CD中的M₄N的制剂 

表3.在PEG 400和HP-β-CD中的M₄N的制剂 

[0153] 

表4.在PEG300中的M₄N制剂的稳定性 

表5.在PEG400中的M₄N制剂的稳定性 

近似地，M₄N可以被溶解在其它增溶剂中，例如，水溶性有机溶剂，包括乙醇、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，丙二醇或丙三醇。 

实施例2.在DMSO或PEG 300/HP-β-CD结合物的制剂中的M₄N对培养中的肿瘤的增生和死亡的效应。 

在10％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中的M₄N(以下，称为“CPE制剂”)，在30％(w/v)HP-β-CD和25％(v/v)PEG 300中的M₄N(以下，称为“CPE 25/30制剂”)，以及在27％(w/v)HP-β-CD和33％(v/v)PEG 300中的M₄N(以下，称为“CPE 33/27制剂”)被检测其对两种不同的肿瘤细胞系的效应：HPV-18阳性人宫颈癌细胞系的HeLa细胞，以及HPV-阴性人宫颈癌细胞系的C-33A细胞的细胞死亡 和增生的效果。DMSO中的M₄N也进行平行检测。两种肿瘤细胞系以M₄N递增的剂量伴以DMSO或CPE制剂进行处理72小时：0μM，20μM，40μM，60μM和80μM。每一制剂被加入到生长培养基(含有L-谷酰胺的最小必需培养基，补以10％的胎牛血清，1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸溶液，和1,000 IU/mL青霉素/1,000μg/mL链霉素溶液)至1％。对照细胞在相同条件下生长，并且不进行处理。处理或不处理72小时后，使用台盼蓝排除法，对每个样品中的细胞总数和活细胞数进行计数。分析每个样品中的细胞增殖率和死亡细胞百分比。实验结果显示在图1、图2和表6到表12。 

图1是表示被处理的细胞数/未被处理的细胞数的比例对应于处理C-33A细胞和HeLa细胞的在DMSO制剂或CPE制剂中的M₄N的递增浓度的曲线图。图2是表示死亡细胞的百分比对应于处理培养中的两种肿瘤细胞系C-33A细胞和HeLa细胞的在DMSO制剂或CPE制剂中的M₄N的递增浓度的曲线图。 

结果显示，根据测定的死亡细胞的％，与未处理的对照相比，在没有M₄N时单独的DMSO对所检测的两种肿瘤细胞系具有显著的抗增殖效应和一些毒素效应。与此相比，单独的CPE制剂，与未处理的对照相比，对两种肿瘤细胞系具有显著的抗增殖效应和很小的毒素效应。 

与在同样制剂中的非M₄N处理对照相比(即M₄N为0μg/mL或0μM)，经处于DMSO制剂或CPE制剂中的M₄N的处理后，两种细胞系的细胞增殖率都降低。事实上，抗增殖效应显示出在CPE制剂中的M₄N的剂量依赖性。在CPE制剂中，例如，发现约20μM或7.2μg/mL的M₄N对两种肿瘤细胞类型在细胞增生上足以引起约50％的抑制。在CPE制剂中的M₄N的浓度的进一步增加导致对两种细胞类型的抗增殖效应的进一步的增加。 

总之，在DMSO制剂或CPE制剂中较高浓度的M₄N剂量对C-33A细胞和HeLa细胞都诱导更高百分比的细胞死亡。但是，在DMSO制剂中的M₄N比在CPE制剂中相应浓度的M₄N对细胞更有毒性。当 在DMSO中的M₄N的所检测的最高浓度(80μM或28.7μg/mL)促使细胞种群中约40％的细胞死亡。在该实验中，在CPE制剂中的M₄N的同样的浓度促使细胞种群中仅约20％的细胞死亡。 

发现在两种细胞系中可以重复这些结果。本研究的数据显示在CPE制剂中的M₄N具有阻止细胞增殖的能力，与在DMSO制剂中的M₄N相似，同时比DMSO制剂诱导更小的细胞毒性。 

从连续的时间点收集数据以检测CPE制剂在时间上的有效性。数据显示在2-8℃储存12个月的时期以后，CPE制剂和新制备的一样有效。细胞在CPE被储存的12个月期间保持近似的生存能力。细胞死亡和增殖率保持在相同的范围内。 

收集数据以比较最初的CPE制剂和新制备的CPE 25/30制剂。研究在0和第3个月进行以检测制剂在期间的有效性，以及检测新制剂与老制剂的关系如何。数据显示CPE 25/30制剂在限制肿瘤细胞生长上与最初的CPE制剂具有有效。在使用CPE制剂或CPE 25/30制剂，以不同的药物浓度处理的HeLa细胞之间，细胞的生存能力近似。甚至在整个期间内细胞的死亡和增殖保持在同样的范围。 

收集信息，在0时间点比较最初的CPE制剂与CPE 33/27制剂对HeLa细胞的作用。数据显示CPE 33/27对HeLa细胞在细胞生存能力、死亡细胞百分比和增殖率上具有同样的效应。 

表6.在DMSO或CPE制剂中的M₄N对C-33A细胞的效应 

[0171] 

表7.在DMSO或CPE制剂中的M₄N对Hela细胞在0时间点的效应 

表8.在DMSO或CPE制剂中的M₄N对Hela细胞在第9个月的效应 

[0176] 

表9.在DMSO或CPE制剂中的M₄N对Hela细胞在第12个月的效应 

表10.CPE制剂和CPE25/30制剂在Hela细胞中的比较 

[0181] 

表11.CPE制剂和CPE25/30制剂在Hela细胞中在第3个月的比较 

表12.CPE制剂和CPE33/25制剂在Hela细胞中在0时间点的比较 

[0186] 

实施例3.可以使用多个批次(lot)的M₄N并产生同样的结果 

检测不同批次的M₄N以显示不同批次药物的效力。用M₄N递增剂量：0μM，20μM，40μM，60μM和80μM伴以CPE制剂处理HeLa细胞72小时。每一制剂被加入到生长培养基(含有L-谷酰胺的最小必需培养基，补以10％的胎牛血清，1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸溶液，和1,000 IU/mL青霉素/1,000μg/mL链霉素溶液)至1％。对照细胞在在相同条件下生长，并且不进行处理。处理或不处理72小时后，使用台盼蓝排除法，对每个样品中的细胞总数和活细胞数进行计数。分析每个样品中的细胞增殖率和死亡细胞百分比。实验结果显示在表13和14。这些结果显示不管所使用的M₄N的批次，药物的效力保持相同。 

表13.用不同批次的M₄N处理HeLa细胞(lot EM1001) 

表14.用不同批次的M₄N处理HeLa细胞(lot EM1002) 

[0193] 

实施例4.在经修饰的纤维素中的M₄N的溶解性 

用作增溶剂和/或赋性剂的50％HP-β-CD(w/v)和0.5％羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)(w/v)的10mL溶液如下制备：5.9mL WFI被放置于含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。将5克的HP-β-CD缓慢加入到搅动的WFI，使用刮勺将HP-β-CD引导至烧杯中央。HP-β-CD溶液被搅拌24小时直到目测到HP-β-CD完全溶解。测定生成的溶液大约为9.4mL。将大约0.6mL的WFI加入到该生成的溶液达到10mL，以生成50％HP-β-CD(w/v)的溶液。将50mg的HPMC加入到50％HP-β-CD的溶液并搅拌约1小时，或者直至目测到HPMC完全溶解。最终溶液被搅拌约1小时，之后室温存放，并避光。制备修饰的环糊精溶液伴以修饰的纤维素的方法可以放大或缩小以获得HP-β-CD/HPMC溶液理想的体积或浓度。也可以近似地制备其它浓度或其它经修饰的环糊精溶液，例如，通过将HP-β-CD替代为其它经修饰的环糊精，在上述的步骤中调整为适当的浓度。也可以类似地制备其它的修饰的环糊精/修饰的纤维素溶液，例如，在前述的方法中，通过将HP-β-CD替换为其它的修饰的环糊精，或将HPMC替换为修饰的纤维素。 

在50％HP-β-CD/0.5％HPMC中M₄N浓度为约10mg/mL的10mL溶液如下制备。将约10mL的50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下，将约100mg的M₄N在烧杯中央缓慢加入到50％HP-β-CD/0.5％HPMC中。M₄N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物被搅拌24小时，或直到所有的M₄N完 全悬浮，没有团块存在。M₄N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物在约90℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500 mL M₄N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物，在90℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。最终的M₄N/50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液被存放于室温并避光。当90℃加热时，M₄N以1mg/mL和10mg/mL的浓度被溶解在该50％HP-β-CD/0.5％HPMC制剂中，并且在冷却后在室温下在溶液中保持稳定性大于7天。即使在90℃，M₄N在50mg/mL的浓度也不溶解于同样的制剂。 

前述方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积和浓度。可以类似地制备含有在其它环糊精/纤维素溶液的M₄N的制剂，  例如，通过将前述的方法中的HP-β-CD替代为其它的环糊精，或将HPMC替代为其它的修饰的纤维素。 

用作增溶剂和/或赋形剂的在乙醇中的5％乙基纤维素(“EC”)(w/v)的10mL溶液如下制备：10mL的100％乙醇(“EtOH”)放置在含搅拌棒的玻璃烧杯中，覆盖以圆形的Teflon_盖。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。500mg的EC被缓慢加入到搅动的乙醇中，用刮勺将EC引导至烧杯中央以阻止EC粉末粘附到烧杯壁上。EC溶液被搅拌约2小时，或直至目测到EC完全溶解。最后的溶液被室温储存，并避光。 

制造修饰的纤维素溶液的制备方法可以被放大或缩小以获得理想的体积或浓度。也可以类似地制备其它的修饰的纤维素，例如，在前述方法中将EC替换为其它的修饰的纤维素。 

在5％EC(w/v)中M₄N浓度为约20mg/mL的10mL溶液(“EC制剂”)如下制备。约10mL的5％EC制剂如前述制备，被加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌，并覆盖以圆形的Teflon_盖。为防止粘附至烧杯壁，将约200mg的M₄N在烧杯中央，借助刮勺的帮助，缓慢加入到5％的EC 制剂中。M₄N/EC混合物被搅拌2小时直到所有的M₄N完全溶解，或均匀地悬浮，没有任何团块存在。M₄N/EC混合物在约60℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500mL M₄N/EC混合物，在60℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/EC混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。最终的M₄N/EC溶液被存放于室温并避光。 

前述方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积和浓度，并且加热温度可以增加或降低以达到M₄N的溶解。可以类似地制备含有位于其它的修饰的纤维素中的M₄N的制剂，例如，HPMC，MC，和CMC。表15显示了在修饰的纤维素中的M₄N的溶解性的结果。 

结果显示M₄N在2.3％(w/v)HPMC中以所检测的任何浓度或加热到90℃都不可溶。M₄N以10mg/mL的浓度在1％(w/v)HPMC中形成悬浮液。该悬浮液在室温下在短于2天的时间内是稳定的。 

在HP-β-CD(50％w/v)和HPMC(0.5％w/v)存在时，M₄N在90℃被溶解，经冷却以1mg/mL和10mg/mL的浓度被保持在溶液中。该溶液在室温下长于7天的期间是稳定的。M₄N在同样的HP-β-CD(50％w/v)和HPMC(0.5％w/v)组合物中在50mg/mL的浓度即使加热至90℃也不溶解。 

在另一个实验中，在不加热的情况下，M₄N在HP-β-CD(50％w/v)和HPMC(0.5％w/v)组合物中在所有被检测的浓度，即1mg/mL，10mg/mL，20mg/mL和50mg/mL形成了悬浮液，这些悬浮液在室温下长于7天的期间内是稳定的。 

表15的结果也显示M₄N在EC制剂中不加热以1mg/mL是可溶的，溶液在室温长于3天是稳定的。M₄N在40℃，10mg/mL的浓度下是可溶的，并在冷却后保持在溶液中，该溶液在室温长于3天是稳定的。M₄N在EC制剂中，在60℃，20mg/mL的浓度下是可溶的，并在冷却后保持在溶液中，该溶液在室温长于3天是稳定的。M₄N在EC制剂中，在60℃，30mg/mL的浓度下是可溶的，但是在冷却后不 被保持在溶液中。M₄N在EC制剂中的更高浓度，例如，50mg/mL或100mg/mL的水平，在90℃是可溶的，但是经冷却不被保持在溶液中。 

M₄N在1％低粘度的CMC中以10mg/mL和20mg/mL水平也形成悬浮液。这些悬浮液在室温下短于2天的时间是稳定的。 

表15.M₄N在含修饰的纤维素的制剂中的溶解性 

[0209] 

实施例5.M₄N在水不溶性脂质中和在水溶性有机溶剂中的溶解性。 

在芝麻油中M₄N浓度为约50mg/mL的10mL溶液如下制备。将约10mL的芝麻油加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下，将约500mg的M₄N在烧杯中央缓慢加入到芝麻油中，以防止粘附到烧杯壁上。M₄N/芝麻油混合物被搅拌约2小时，或直到所有的M₄N溶解，或均匀悬浮，没有团块存在。M₄N/芝麻油混合物在约60℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500mL M₄N/芝麻油混合物，在60℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/芝麻油混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。如果形成结晶，M₄N/ 芝麻油混合物可被再次在60℃加热1小时，在热的磁性盘上伴以搅拌，直到所有的M₄N重新溶解回溶液。最终的M₄N/芝麻油混合物被存放于室温并避光。 

前述方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积或浓度，并且增高或降低加热温度，以达到M₄N的溶解。可以类似地制备含有位于其它水不溶性脂质中的M₄N的制剂，例如，在前述方法中，将芝麻油替代为玉米油、橄榄油、大豆油、薄荷油或其它增溶剂，以及它们的结合物。结果显示于表16。 

在95％橄榄油和5％蜂蜡中M₄N浓度为约200mg/g的10mL混合物如下制备。将约7.6mL的橄榄油加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下，将约2g的M₄N在烧杯中央缓慢加入到橄榄油中，以防止粘附到烧杯壁上。M₄N/橄榄油混合物被搅拌约2小时，或直到所有的M₄N溶解，或均匀悬浮，没有团块存在。M₄N/橄榄油混合物可选择地在约60℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500mL M₄N/橄榄油混合物，在60℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/橄榄油混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。如果形成结晶，M₄N/橄榄油混合物可被再次在60℃加热约1小时，在热的磁性盘上伴以搅拌，直到所有的M₄N重新溶解回溶液。将约400mg的白色蜂蜡加入到含搅拌棒的璃烧杯中。烧杯也被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。蜂蜡在约50℃被加热约30分钟。(或更长，如果需要更大的量)，或者直到所有的蜂蜡被熔化。之后M₄N/橄榄油溶液被加入到约400mg的熔化的蜂蜡中，并搅拌，并在约50℃加热约30分钟，或直到所有的M₄N/橄榄油/蜂蜡混合物溶解或均匀混合。从烧杯中拿出搅拌棒，并使M₄N/橄榄油/蜂蜡混合物冷却。最后的M₄N/橄榄油/蜂蜡混合物在室温储存并避光。 

该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积或浓度。可以类似地制备含有位于其它水不溶性脂质中的M₄N的制剂，例如， 在前述方法中，通过将橄榄油替换为玉米油、芝麻油、大豆油、卵磷脂，或其它增溶剂或它们的结合物，并将蜂蜡替代为石蜡、PEG 3350，或其它硬化剂或它们的结合物。同样，如果需要，可以包括与任意的载体、生物可利用度促进剂结合，例如，丁子香酚、肉桂醛、卵磷脂、柚皮素、柚皮苷和胡椒碱(piperin)(也被称为piperine)。结果见表16。 

在85％橄榄油和15％Tween_20中的M₄N浓度为约60mg/mL的10mL溶液如下制备。将约8.5mL的芝麻油加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。将约1.5mL的Tween_20缓慢加入到烧杯中央。在刮勺的帮助下，将约600mgM₄N在烧杯中央缓慢加入到芝麻油/Tween_20混合物中，以防止M₄N粘附到烧杯壁上。M₄N/芝麻油/Tween_20混合物被搅拌约2小时，或直到所有的M₄N溶解，或均匀悬浮，没有团块存在。M₄N/芝麻油/Tween_20混合物在约60℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500mL M₄N/芝麻油/Tween_20混合物，在60℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/橄榄油混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。最后的M₄N/芝麻油/Tween_20混合物在室温储存并避光。在储存期间如果形成结晶，M₄N/芝麻油/Tween_20混合物可被再次在60℃加热，在热的磁性盘上伴以搅拌，直到所有的M₄N重新溶解回溶液。 

该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N的体积或浓度，并且加热温度可以增加或降低以达到M₄N的溶解。可以类似地制备含有位于其它水不溶性脂类结合非离子表面活性剂、离子表面活性剂或水溶性有机溶剂中的M₄N的制剂，例如，在前述方法中，通过将芝麻油或Tween_20替换为玉米油、橄榄油、大豆油、薄荷油、Tween_80、TPGS、卵磷脂、PEG 300、PEG 400、PEG 400单月桂酸酯、丙三醇、PVP、PG，或其它增溶剂或它们的结合物。M₄N在水不溶性脂质中的溶解性的结果显示在表16。 

可以近似地制备含有位于其它水不溶性脂质结合非离子、离子或 两性表面活性剂或水溶性有机溶剂中的M₄N的制剂，例如，在前述方法中，通过将芝麻油替换为玉米油、橄榄油、大豆油、薄荷油，或矿物油，并且将Tween_20替换为Tween_80、TPGS、卵磷脂、PEG300、PEG400、PEG 400单月桂酸酯、丙三醇、PVP、PG、或其它增溶剂或其结合物。M₄N在水不溶性脂质中的溶解性以及该组合物的稳定性的结果显示于表16。对于本文清澈的液体溶液而言的稳定性是指其在溶液中形成结晶的沉淀的时间。稳定的溶液是在长的时间内清澈，没有颗粒。 

表16显示，例如，当在60℃加热时，M₄N在玉米油中以高达100mg/mL的浓度是可溶的，并且，除了在100mg/mL的水平外，冷却后，M₄N以低的浓度保持在溶液中，溶液在1和10mg/mL的浓度下稳定性大于3天，在20、40、和50mg/mL的水平的稳定性短于3天，在60mg/mL的水平短于1天。另外，M₄N在橄榄油中以30mg/mL的水平在60℃是可溶的，但是在冷却后，不保持在溶液内。 

在芝麻油中，M₄N以10mg/mL的水平在室温是可溶的。在60℃，M₄N的浓度达到50mg/mL是可溶的，并在冷却后被保持在溶液中。10mg/mL和20mg/mL的溶液在室温稳定性超过3天，并且50mg/mL的溶液在室温的稳定性短于1天。 

在薄荷油中，M₄N在1mg/mL和125mg/mL之间是可溶的。在达到20mg/mL的浓度，M₄N不用加热是可溶的。这些组合物在室温的稳定性超过3天。M₄N在高达125mg/mL水平的较高浓度，以40℃加热是可溶的，并且在冷却后保持在溶液中。这些M₄N在薄荷油中的较高浓度，40mg/mL的组合物在室温的稳定性超过3天。 

M₄N在以60℃加热时，也以高达50mg/mL的浓度溶于大豆油。在其中，仅10mg/mL浓度经冷却保持在溶液中，该溶液保持稳定超过7天。 

当以60℃加热，M₄N以高达200mg/mL的浓度也溶于矿物油。10mg/mL和50mg/mL的组合物经冷却保持在溶液中。在其中，10mg/mL的溶液在室温稳定性超过7天。 

在50％薄荷油和50％PEG300的结合物中，当以35℃加热时，M₄N在高达125mg/mL的浓度是可溶的。当以35℃加热，在40mg/mL和60mg/mL之间的水平，M₄N保持在冷却后的溶液中，并且在室温的稳定性超过7天。在60％薄荷油和40％PEG 300的结合物中，当以40℃加热，M₄N在60mg/mL是可溶的，经冷却也保持在溶液中。该组合物在室温的稳定性超过3天。 

当薄荷油与PEG 400彼此以50％结合时，当加热40℃时，M₄N可溶解至125mg/mL。在M₄N的浓度在40mg/mL和60mg/mL之间时，化合物经冷却保持在溶液中，并且组合物在室温的稳定性超过7天。在60％薄荷油和40％PEG 400的结合物中，以40℃加热，M₄N可以60mg/mL溶解。 

在50％薄荷油和50％Tween_20中，以40℃加热，M₄N在所检测的高达125mg/mL是可溶的。在其中，M₄N以40mg/mL和60mg/mL的浓度保持在冷却后的溶液中。 

在另一个结合中，例如薄荷油和芝麻油各以50％结合，M₄N在所检测的高达60mg/mL的浓度是可溶的。M₄N以20mg/mL在室温下是可溶的，组合物在室温的稳定性超过3天。M₄N的40mg/mL和60mg/mL溶液经冷却保持在溶液内，在室温下稳定性超过3天。 

在另一个含有33％薄荷油、33％Tween_20和33％PEG 400的结合中，在以40℃加热时，M₄N在60mg/mL是可溶的，并且经冷却保持在溶液中。这些组合物的稳定性超过3天。 

表16也显示了，例如，M₄N可以溶于大豆油，并且当与蜂蜡结合时，可以制备入蜡样固体内。另外，M₄N可以溶于橄榄油，并且可以加入蜂蜡将组合物转变为蜡样固体。 

表16.M₄N在水不溶性脂类中的溶解性 

[0231] 

[0232] 

[0233] 

[0234] 

[0235] 

[0236] 

表17显示了M₄N在水溶性有机溶剂，乙醇，PG，PEG 300，PEG400，PEG 400单月桂酸酯，丙三醇，PVP，以及它们的某种结合物中的溶解性。 

表17.M₄N在水溶性有机溶剂中的溶解性 

[0240] 

[0241] 

实施例6.M₄N在非离子表面活性剂量中的溶解性 

用作增溶剂和/或赋形剂的20％TPGS(w/v)的10mL溶液如下制备：8mL的WFI被放置于含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在热的磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。WFI在约95℃被加热5分钟。将2克的TPGS加入到另一玻璃烧杯中，在约40℃被加热15分钟，或者直到所有TPGS融化。融化的TPGS被缓慢加入到接近沸腾的WFI，使用刮勺将TPGS引导至烧杯中央以阻止任何的TPGS粘附到烧杯壁上。20％的TPGS溶液被搅拌24小时，或者直到目测到TPGS完全溶解。最终溶液被室温存放，并避光。 

该制备TPGS的方法可以被放大或缩小以获得理想体积或浓度的TPGS溶液。可以结合其它的非离子表面活性剂、离子表面活性剂、两性表面活性剂、水溶性有机溶剂，或在前述的方法中的其它增溶剂来类似地制备其它TPGS溶液。结果显示在表18。 

在Tween_20中以约60mg/mL浓度的M4N的10mL溶液如下制备。约10mL的Tween_20被缓慢加入到含搅拌棒的玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等的速度搅拌。在刮勺的帮助下，将约600mg的M₄N在烧杯中央缓慢加入到Tween_20中，以防止M₄N粘附到烧杯壁上。M₄N/Tween_20混合物被搅拌约2小时，或直到所有的M₄N溶解，或均匀悬浮，没有团块存在。M₄N/Tween_20混合物在约60℃被加热约30分钟。(或者更长，如果需要更大体积的溶液，例如，500mL M₄N/Tween_20混合物，在60℃加热1小时)，或更长，如果需要确保M₄N完全溶解。将烧杯对着白色背景观察M₄N/Tween_20混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。最后的M₄N/Tween_20混合物在室温储存并避光。如果形成结晶，M₄N/Tween_20混合物可被再次在60℃ 加热约1小时，在热的磁性盘上伴以搅拌，或直到所有的M₄N重新溶解回溶液。 

该方法可以被放大或缩小以获得需要的体积或浓度的M₄N，加热温度可以增加或降低以获得M₄N的溶解。可以类似地制备含有位于其它的非离子表面活性剂、离子表面活性剂或两性分子中的M₄N的制剂，例如，通过将前述的方法中的Tween_20替换为Tween_80、其它的增溶剂，或其结合物。M₄N在Tween_20、Tween_80，以及Tween_20和PEG 400的结合物中的溶解性的结果显示在表18。 

表18显示了M₄N在Tween_20或Tween_80中在室温下以1mg/mL的浓度是可溶的。M₄N在Tween_20溶液(“M₄N/Tween_20”)中的稳定性在室温下超过7天，同时M₄N在Tween_80溶液(“M₄N/Tween_80”)中的稳定性超过3天的观察。更高温度的M₄N在Tween_20或Tween_80中在50℃是可溶的。另外，在Tween_20中达到60mg/mL的浓度时，在Tween_80中达到50mg/mL的浓度时，冷却后，M₄N保持在溶液中，同时，在Tween_20中，在80mg/mL和100mg/mL的浓度水平时，经冷却，M₄N变为不溶。观察到10mg/mL和20mg/mL的M₄N/Tween_20溶液在室温的稳定性超过7天。观察到40mg/mL和80mg/mL M₄N/Tween_20溶液在室温的稳定性短于3天。对于M₄N/Tween_80溶液，观察到10mg/mL溶液在室温的稳定性长于3天，同时，50mg/mL溶液在室温的稳定性短于1天。 

结果也显示M₄N在50％Tween_20和50％PEG 400的结合物中以M₄N达到所检测的60mg/mL的浓度，在65℃加热，是可溶的。经冷却，M₄N保持在这些制剂的溶液中，溶液在室温的稳定性超过3天。 

在不同的加热温度，增加的加热时间，冷却的方法和时间，以及药物增加的浓度下，检测PEG 400和Tween_20的结合物。 

制备10mL的溶液：首先将10mL的丙三醇单油酸酯(“Glymo”)加入到玻璃烧杯中。烧杯被放置在磁性盘上，并且设置搅拌棒以中等 的速度搅拌。加热至60℃30分钟以使全部药物溶解。将烧杯对着白色背景观察混合物任何未溶解的M₄N的存在，再对着黑色背景检查颗粒的存在。Glymo混合物伴以加热被冷却至室温，并且混合物成为悬浮液。将其在室温储存并避光。悬浮液在两周内保持稳定，之后开始分离。震荡可以使其重新结合。 

表18.M₄N在非离子表面活性剂中的溶解性 

[0253] 

[0254] 

[0255] 

[0256] 

[0257] 

[0258] 

[0259] 

[0260] 

[0261] 

[0262] 

[0263] 

实施例7 

实施例6的47.5％(v/v)Tween_20，47.5％(Wv)PEG 400，2.5％(w/v)PEG 3350，2.5％(w/v)蜂蜡(见表18)的融化温度由几种如下不同的M₄N浓度确定： 

实施例8.含有在HP-β-CD中的M₄N的制剂的冻干 

在HP-β-CD中的以约185mg/g(w/w)浓度的120mg M₄N的冻干粉如下制备。等摩尔量的HP-β-CD和M₄N被用于增加HP-β-CD和M₄N之间的络合率。在1.5mL尺寸的聚丙烯管中将约98mg的 HP-β-CD和约22.2mg的M₄N混合在一起。将约0.2mLWFI加入到含有HP-β-CD/M₄N粉末混合物的聚丙烯管中的混合物中，并涡旋1分钟以产生HP-β-CD/M₄N在水中的悬浮液。HP-β-CD/M₄N悬液在-20℃被冷冻24小时。之后HP-β-CD/M₄N悬浮液在真空60℃以1,400rpm离心约2小时以去除悬浮液中所有的水分。HP-β-CD/M₄N混合体的干粉约重120mg。HP-β-CD/M₄N粉混合体之后可以被溶解或重悬于水或其它增溶剂中。最终的M₄N/HP-β-CD粉混合体在室温储存并避光。该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N体积或浓度。可以类似地制备含有M₄N伴以其它环糊精的制剂，例如，通过将前述方法中的HP-β-CD替换为其它的环糊精。表1显示的结果描述了由约81.5％HP-β-CD和18.5％M₄N组成的HP-β-CD/M₄N悬浮液冻干后获得了HP-β-CD/M₄N粉混合体。 

在HP-β-CD/HP中的以约150mg/g(w/w)浓度的400mg M₄N的冻干粉如下制备。将如前述制备的，约1mL的50％HP-β-CD/0.5％HPMC溶液加入到1.5mL尺寸的聚丙烯管中。将约60mg M₄N加入到含HP-β-CD/HPMC悬液的聚丙烯管中，并涡旋1分钟以产生HP-β-CD/HPMC/M₄N悬浮液。HP-β-CD/HPMC/M₄N悬浮液在-20℃被冷冻24小时。之后将HP-β-CD/HPMC/M₄N悬浮液在真空60℃以1,400rpm离心约5小时以从悬浮液去除所有的水分。HP-β-CD/HPMC/M₄N混合体的干粉重约400mg。HP-β-CD/HPMC/M₄N粉混合体之后可以被重溶解或重悬于水或其它增溶剂中。最终的M4N/HP-β-CD/HPMC粉混合体以室温储存并避光。该方法可以被放大或缩小以获得需要的M₄N体积或浓度。可以类似地制备含有M₄N伴以其它环糊精的制剂，例如，通过将前述方法中的HP-β-CD替换为其它的环糊精，或者将HPMC替换为其它的修饰的纤维素。表15显示的结果描述了由约84％HP-β-CD，1％HPMC和15％M₄N组成的HP-β-CD/HPMC/M₄N悬浮液冻干后获得了HP-β-CD/HPMC/M₄N粉混合体。 

实施例9.经液体制剂的口服给药后M₄N在斯普拉-道来大鼠中 的吸收 

10组雄性大鼠(n＝每组5只)(年龄＝8-10周)经口服强饲法给以在赋形剂中的单剂量500mg/kg的M₄N以确定优选的口服液体赋形剂。在给药前，动物被禁食过夜。如表19显示，使用如前述制备的制剂，所检测的赋形剂/制剂是：(a)HP-β-CD+HPMC；(b)HP-β-CD+CMC；(c)TPGS；(d)TPGS+PEG 400；(e)Tween_20；(f)PEG 400+Tween_20；(g)PEG 400+Tween_20+薄荷油；(h)薄荷油+PEG 400；(i)薄荷油+Tween_20；(j)薄荷油+芝麻油。在以下时间点从每个动物的颈静脉采集血液：用药前，用药后0.5，1，2和3小时。M₄N在血清中的浓度由LC/MS/MS确定，LC是指液相色谱法，MS是指质谱法。该方法经LC分离M₄N，之后用两轮连续的MS检测和定量进行了分析。 

如图3和表20所示，M₄N的吸收在赋形剂制剂之间变化。PEG 400+Tween_20吸收最大，其高于PEG 400+Tween_20+薄荷油，其高于薄荷油+Tween_20，其高于薄荷油+PEG 400，其高于薄荷油+芝麻油，其高于或等于Tween_20，其高于或等于HP-β-CD+CMC，其高于HP-β-CD+HPMC，其高于TPGS，其高于TPGS+PEG 400。 

在表20中，4种制剂显示为稳定的悬浮液：HP-β-CD+HPMC，HP-β-CD+CMC，TPGS，和TPGS+PEG 400。判定悬浮液为“稳定”的标准是，悬浮液的内容物不显示出沉淀(组分不从悬液中沉淀至烧杯的杯底)。在大鼠研究中的其它制剂是清澈的液体溶液，不是悬浮液，并且没有任何漂浮的成分。 

表19.口服制剂的吸收研究 

[0276] 

[0277] 

表20.M₄N经口服送药在大鼠^a中的吸收 

^an＝5只雄性/组 

^b数值表示为平均数±标准误 

实施例10.M₄N经口服给药在比格犬中的吸收 

5组狗(n＝每组2只，1只雄性，1只雌性)(年龄＝约6-9个月)给以在赋形剂中的单剂量100mg/kg的M₄N以确定优选的口服固体赋形剂。在口服给药前，M₄N位于在赋形剂中的组合物被灌囊为12号的硬质凝胶胶囊。动物在用药前被禁食。所检测的赋形剂/制剂被列在表19中，它们是(a)无赋形剂，其中M₄N被灌囊；(b)HP-β-CD；(c)TPGS；(d)大豆油+蜂蜡；和(e)橄榄油+蜂蜡。在以下时间点从每个动物的颈静脉采集血液：用药前，用药后0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，4小时，6小时和8小时。M₄N在血清中的浓度由液相色谱 法结合串联质谱法(LC/MS/MS)确定。 

如图4所示，M₄N的吸收根据赋形剂/制剂而变化。含橄榄油+蜂蜡的制剂吸收最大，其高于含HP-β-CD的制剂，其高于含TPGS的制剂，其高于含大豆油+蜂蜡的制剂，其高于不含赋形剂的M₄N。 

尽管前述的实施例结合M₄N进行说明，但是对其它的NDGA衍生物或其它的儿茶酚丁烷的重量和体积进行适当的调整以达到合适的浓度。 

实施例11.采集样品以确定微粉化和非微粉化的M₄N在对狗口服用药后的药物动力学。 

本研究的目的是评价当使用微粉化和非微粉化的形式经强饲法对比格犬口服给药M₄N的药物动力学特征。检测的项目以60mg/mL的浓度被制备在丙三醇单油酸酯中。在表21中概括了研究设计。 

表21.在狗中检测的非微粉化和微粉化M₄N的研究设计 

M  雄性 

F  雌性 

注意：在阶段之间有大约7天的洗脱期。 

在用药前，以及用药后0.25小时，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，和36小时收集颈静脉的血(大约2mL)到不含抗凝剂的Monoject 2 mL红顶管中。 

在两种试剂用药后出现了M₄N的吸收。在表22中列出了平均药物动力学参数，其中C_max是M₄N吸收的最大浓度，并且AUC代表曲 线下的面积，与M₄N总吸收相关。与非微粉化的M₄N相比，微粉化的M₄N具有较高的吸收。但是，在非微粉化的M₄N给药后，浓度曲线趋向于更为一致(图5A和5B，非对数和对数级别，各自显示非微粉化的M₄N的吸收；以及，图6A和6B，非对数和对数级别，各自显示微粉化的M₄N的吸收。 

表22.下列M₄N给药的平均药物动力学参数 

实施例11.两种M₄N制剂在比格犬中口服给食给药/禁止静脉给药/口服给药的药物动力学的比较 

本研究的目的是评价在给食或禁食情况下口服给药(通过强饲法或胶囊)，或静脉给药时，将预制备的M₄N以单一剂量75mg/kg给药后所达到的血清水平。3只狗/性别被给以丙三醇单油酸酯中的EM-1421(“Glymo”)，在Tween_20/PEG400/柚皮苷(“TPN”)中的M₄N，或在20％羟丙基-β-环糊精(HPβCD)，50％PEG 300(“CPE”)中的 M₄N。Glymo和TPN也以非浓缩(60mg/mL)或浓缩(300mg/g，w/w)给药，如图7B和8B中的图例所示。 

所有的动物在整个研究中都存活。临床观察包括腹泻，呕吐，和共济失调(在1只雌犬中静脉给药后出现了共济失调，并持续了约1小时)。 

M₄N的血清水平根据制剂和状况变化很大。表23总结了这些发现。在浓缩的Glymo或TPN给药后，血清水平最低。在TPN(非浓缩，禁食的条件)用药后，C_max最高(表23及图7A和8A，非对数级分别显示雄犬和雌犬口服给药M₄N后的血清水平)。在Glymo给药后AUCs最高(非浓缩，禁食状况)(表23及图7B和8B，对数级各自显示雄犬和雌犬口服给药M₄N后的血清水平)。口服给药Glymo(非浓缩，禁食状况)后，AUCs达到静脉给药的AUCs的35％(雄性)和47％(雌性)，其中静脉给药假设为100％(表23)。 

表23.被配制的M₄N在狗以单一剂量的75mg/kg给药后的药物动力学 

[0303] 

实施例12.M₄N对大鼠口服(强饲)重复给药的药物动力学研究 

本研究的目的是提供在10种不同的赋形剂制剂中的M₄N的500mg/kg给药的、药物动力学。50只Crl：(CD)SD雄性和雌性大鼠被分为10个剂量组，每组每性别5只大鼠。制备具有如下载体的样品对以下组别的对象给药。 

[0307] 

每种M₄N制剂经强饲法在3种情况下口服给药。M₄N的浓度是60mg/mL，用药时根据最近的体重，以8.33mL/kg的用药体积给药。在72小时的洗脱(恢复)期后，禁食过夜，大鼠被第一次给药(研究的第一天)。在研究的第5天，对经过1周的洗脱(恢复)期的非禁食大鼠进行检测项目的第2次给药。在第6天，大鼠给以高脂肪餐(约10％的脂肪含量，而标准餐为约5％)。在第12天，非禁食鼠被第三次给药。每天至少观察两次大鼠的生存能力，而且在适应期每周进行临床观测和一般特征的观察。在用药前，并且在用药后第一个4小时以约每小时的间隔，以及在给药第一天的正常工作日的结束时，和在给药以后的天中约2个小时检察对大鼠的临床观测和死亡。在未用药的天中和在用药后的天中每天记录一次这些观测。在适应期至少每周，在用药期至少每天记录体重，最后处死时称重。在用药期间和处死时记录饲料消耗值(饲料剩余值)。在研究的第1、5和12天，从每只研究的大鼠的尾侧静脉收集血标本(每只约0.5mL)。每一次血液采集的时间记录在原始记录中。在研究的第1、5和12天在以下时间点：用药前，用药后15分钟，用药后1和4小时从每只大鼠采集血液标本。标本被转移至血清分离管中并旋转离心。产生的血清被转移至标记有实验号码、赞助研究号码、大鼠号码、组号码、用药水平、研究天数、采集间隔、采集日期、种名、代数和储存条件的聚丙烯管中。所有样品被立即在干冰上冷冻并保持冷冻(-68℃-78℃)直至取出分析。 

所有的大鼠都活至预定的处死时间。在PEG 400/Tween_20/薄荷油(组IX)给药的5只雌性大鼠中的4只出现了尿污染了腹部皮毛。该 指征出现在第2-3天，并不再持续。除了PEG 400/Tween_20/薄荷油(组IX)大鼠外，每一组中至少一些鼠中仅仅出现了软的或液体粪便的临床观测。所有组在研究中平均都有体重增加。在第6到13天高脂肪膳食喂食雌性大鼠和雄性大鼠的体重增加总是要低于第1到6天进行标准膳食喂食的体重增加。除了在PEG 400/Tween_20和PEG400/Tween_20/PEG 3350/蜂蜡用药组(分别是组I和X)中雌性大鼠在第6到13天体重增加有降低以外，在各组中体重增加都基本相当。在整个研究中各组的饲料消耗值都绝对和相对等量。在尸体检验中没有观察到毛重损失和所检测的项目试剂有关联。从所有的载体都发生M₄N的吸收。禁食后，高脂肪膳食的大鼠的血液水平总是高于标准膳食的大鼠所达到的水平。在PEG 400/Tween_20/柚皮苷组用以高脂肪膳食后出现了最高的吸收。在PEG 400/Tween_20/柚皮苷组用以标准膳食后出现了最高的吸收。在PEG 400/Tween_20/薄荷油组在禁食后出现了最高的吸收。通常在用药后一个小时内达到了最高的暴露水平，除丙三醇单油酸酯制剂外，其显示出在用药后的4小时继续升高。 

总之，所有检测的项目制剂都没有致死率，所有的组都体重增加。通常的临床观测是软和液体的大便，但是对任何载体发生的饲料消耗没有影响。在给大鼠以高脂肪膳食时，M₄N的血液水平总是较高。除丙三醇单油酸酯制剂外，在用药后1小时内出现暴露峰值。 

实施例13.在8个健康男性受试对象中，在人的0阶段，¹⁴C标记的M₄N的三交叉微剂量药物动力学研究 

该研究被设计为，不论是在喂食或禁食条件下的单独口服剂量或者单独静脉内给药(在表24中各自为配方A-C)，对人施以亚治疗剂量，评价M₄N的吸收。该研究是在健康男性受试对象的目标人群中的三交叉研究设计，并且由大约35个小时持续时间的3个研究阶段组成，每阶段在用药之间由至少7天的最短期间间隔开。在每个研究期间的阶段中，药物动力学血液标本在用药后特定的时间点采集，并且在预先设定的时间间隔收集尿。受试对象在用药后24小时在完成研究特定程序后可以离开临床单位。 

在本研究中，M₄N以100μg的量给人用药。M₄N被稍微用¹⁴C(每100μg 3.3kBq)标记，并给健康志愿者用药。每一个M₄N的口服用药由在0号的凝胶胶囊中的0.1mg的¹⁴C标记的M₄N和376.8mg的丙三醇单油酸酯组成。M₄N单独的静脉灌输由用水稀释成1mL用于静脉注射的制剂由0.1mg/mL ¹⁴C标记的M₄N，30％(w/v)HP-β-CD，和25％(v/v)PEG组成。在从每个受试对象收集血液后，使用加速器质谱法(AMS)对标本的¹⁴C含量进行分析以确定在T_max时间M₄N的最大浓度(C_max)，与在检测时间(AUC_o-t)和总体(AUC_0-∞)的M₄N的总体吸收相关的曲线下总面积(AUC)，每一标本的最终半衰期，以及与M₄N静脉给药相比，M₄N口服给药的相对和总体生物可利用度(F_rel和F)。表24中显示了¹⁴C的药物动力学参数的中值±SD。在用药之间的期间后，对保持在受试对象体内的任何残留M₄N进行M₄N的基线水平的校正，以不抬高任何后续用药M₄N水平。 

表24.¹⁴C的药物动力学参数的中值±SD值(经校正的基线) 

^a中值 

配方A：在高脂肪早餐后，以单独的口服剂量给药的100μg¹⁴C-标记的M₄N(3.3 kBq)。 

配方B：在禁食过夜后，以单独的口服剂量给药的100μg¹⁴C-标记的M₄N(3.3kBq) 

配方C：在禁食过夜后，以1mL静脉给药溶液给药的100μg¹⁴C-标记的M₄N(3.3kBq)。 

对于口服给药，在高脂肪早餐后给予100μg ¹⁴C-标记的M₄N用药后，总¹⁴C的C_max值(C_max＝5.94±1.33pmol/L)低于禁食过夜后的口服给药(C_max＝9.29±1.40pmol/L)。在进食的受试对象中T_max出现时间趋向于迟于禁食的受试对象。在进食的受试对象中，C_max出现的时间T_max 高度可变，用药后在1.5到24小时的范围内。在禁食的受试对象中，T_max通常在用药后1小时出现(0.50到2.00小时的范围)。在进食的受试对象中的AUC_0-t值通常低于禁食的受试对象。 

在10个受试对象中的8个，在静脉给药后，最大浓度(C_max＝10.31±1.77pmol/L)如同所预期的，出现在第一次取样时间(用药后0.08小时)。在两个受试对象中，T_max为用药后0.17小时。在进食的受试对象中，单独口服给药后血浆总¹⁴C浓度的AUC_0-t值略微低于静脉给药后的AUC_0-t值。与此相反，在禁食的受试对象中，单独的口服给药后相应的AUC_0-t值略微高于静脉给药后的AUC_0-t值。 

本研究制剂非常适宜于口服和静脉内给药。没有严重或剧烈的副反应，也没有与与副作用相关的研究治疗的中断。没有发现有临床的生命体征或心电图的重大改变。 

总之，关于本研究，在进食和禁食的状态下，口服用药后M₄N有非常明显的吸收。在有食物的情况下，吸收率和吸收度低于禁食状态，并且在进食状态下C_max出现的时间被延长。这些结论基于的假设是在吸收前，¹⁴C-标记的M₄N口服给药的剂量不降解。 

实施例14.M₄N在水溶性有机溶剂中的溶解性的附加研究 

如在表25中所描述的，评价M₄N在水溶性有机溶剂结合物中的溶解性长至48小时。室温孵育2、24和48小时后，用反相-HPLC(“RP-HPLC”)分析样品以定量M₄N的溶解性。为制备M₄N样品，将溶解于丙酮中的200μL的100mg/mL的M₄N放于1.5mL聚丙烯微管中。在室温使溶剂蒸发48小时直至样品完全干燥。 

在15mL聚丙烯离心管中制备水相溶性有机溶剂制剂。每一种制剂制备10mL。加入的每种溶剂根据各自在25℃时密度而得的重量。在短暂混合后，每一制剂经0.45μm无表面活性剂的醋酸纤维素(“SFCA”)过滤入新鲜的15mL管中。制剂在室温保存备用。 

将400μL的每一种溶剂结合物(表25，其中Benz＝苯甲醇；Crem＝Cremophor_EL；DMA＝二甲基乙酰胺；T80＝Tween_80)加入到微管中，以得到M₄N的最大溶解度50mg/Ml。在室温孵育2、24和48小时后用RP-HPLC评价M₄N的溶解性。在每一个时间点，样品以13,000rpm离心2分钟以沉淀任何固体的M₄N。如表25所指出的，所检测的制剂有超过一半的状况可以溶解M₄N大于10mg/Ml的浓度。检测不出M₄N于2和48小时在丙三醇中的溶解性。 

表25.M₄N在水相溶的有机溶剂中长达48小时的溶解性 

[0330] 

[0331] 实施例15.M₄N在水合溶液中的溶解性 

如前述的实施例14，评价M₄N在含羟丙基HP-β-CD或磺丁基醚β-环糊精(SE-β-CD)(Captisol_，CyDex，Inc公司，Lenexa，堪萨斯，美国)的水合溶液中的溶解性。基于重量体积比制备10种HP-β-CD和SE-β-CD的50％溶液。如实施例14所述及的，制备要在样品中使用的M₄N。在OHAUS Analytical Plus Balance天平称取1.0g和5.0g之间的任一化合物放入10mL的容量瓶。每一样品伴以适量到10mL的注射用水(WFI)。在40℃孵育1小时后，制剂经0.45μm SFCA过滤入新鲜的15mL管中。制剂在室温保存备用。 

如表26所示，M₄N在WFI，0.9％盐水，5％右旋糖(D5W)中的溶解性在研究全程都低于RP-HPLC的检测低限。对作为HP-β-CD和Captisol_的浓度和时间的函数的M₄N的增高的溶解性进行记录。 

表26.M₄N在水合溶液中长达48小时的溶解性 

[0336] 

使用水相溶性有机溶剂的超过20种的制剂的状态可以溶解M₄N到大于10mg/mL的浓度。在WFI，0.9％盐水，D5W中的M₄N的溶解性低于RP-HPLC方法的检测限度。M₄N的溶解性作为HP-β-CD和Captisol_浓度和时间的函数而增加。 

实施例16.M₄N在羟丙基β-环糊精中的溶解性 

根据Higuchi和Connors(1965)报道的方法评价在不同的HP-β-CD浓度时M₄N的水合溶解性。简而言之，精确称量M₄N，并以超过其水合溶解性的量加入，在室温与递增浓度的HP-β-CD水合溶液(0-350mmol/L)轻柔旋转(～12rpm)48小时。之后，M₄N/HP-β-CD溶液经0.45μm SFCA过滤并用RP-HPLC分析。 

尽管大多数药物/环糊精复合体被认为是包含物复合体，并且复合体聚集能够以胶束样的结构溶解药物。相-溶解性曲线没有证实包含物复合体的形成，只证明了环糊精递增的浓度如何影响药物的溶解性。M₄N/HP-β-CD复合体的形成是非线性的，但是在本实施例的实验中没有研究化学计量学(以及稳定性常数)的精确测定，但是可以通过其它方法例如核磁共振法或电势测定法进行测定。 

实施例17.M₄N在HP-β-CD/PEG 300缓冲溶液中的稳定性 

在60℃孵育后，评价在15mM缓冲液中的10mg/mL M₄N(40％HP-β-CD：40mg/mL M₄N PEG300以75∶25的比例配制)的稳定性。 

根据重量体积比制备被缓冲的HP-β-CD的40％溶液。如实施例14所述及的，制备要在样品中使用的M₄N。在OHAUS Analytical PlusBalance天平称取2.0g的HP-β-CD放入5mL的容量瓶。将100mM缓冲液的1mL加入到每个烧杯中。每一样品伴以适量到5mL的WFI。在40℃孵育1小时后，制剂经0.45μm SFCA过滤入新鲜的15mL管 中。制剂在室温保存备用。 

将750μL的40％HP-β-CD缓冲溶液放入1.5mL的聚丙烯微管中。将250μL的40mg/mL M₄N PEG 300加入到每个微管中以具有10mg/mL M₄N的溶解性。在轻柔倒置样品管后，使用Orion，Model 420ApH计测定每一溶液的pH。取出原始的等份用于RP-HPLC分析。之后将检测样品放入Precision 60℃恒温箱中。用RP-HPLC评价M₄N的稳定性。在每一个时间点，将样品以13,000rpm离心2分钟以去除任何固体的M₄N。 

如表27所示，在60℃孵育14天后，观察到不同M₄N溶液的浓度略有下降。RP-HPLC数据没有显示样品杂质度的增加，样品杂质度的增加可以说明M₄N浓度的大幅下降。但是，观察到样品杂质度依赖于pH变化，但是这些杂质度只占总峰面积的不到0.1％。在孵育期间，观察到，即使有明显的样品pH变化也很小(表27)。 

表27.M₄N在HP-β-CD/PEG溶液中长达14天于60℃的稳定性 

[0348] 在60℃孵育14天后，不考虑M₄N在复原中的损失所指示的明显的样品pH或缓冲，观察到稳定性的下降。 

实施例18.M₄N在11-14mg/mL PEG300/HP-β-CD溶液中的稳定性。 

为保持生产规格，本研究检测了PEG300/HP-β-CD结合物在M₄N目标浓度改变时，其24小时室温的稳定性。在100％PEG 300中以在60℃时33-56mg/mL的药物浓度如下制备M₄N原料的储存样品。 

在60℃至少孵育2小时后，使用实施例14和17提出的方法，将M₄N块状药物溶解于PEG 300至33、44、48、52、55和56mg/mL(w/w)。需要强烈涡旋和混合以保证M₄N的溶解高于44mg/mL。M₄N储存溶液经0.45μm SFCA过滤，并在制备的30分钟内使用。个别地，在无菌WFI中制备40％(w/v)HP-β-CD的溶液并过滤。40％HP-β-CD储存液和M₄N/PEG 300的储存液的结合物在1.5mL聚丙烯微管中结合。在室温孵育的第2和24小时评价M₄N的溶解性。 

将M₄N储存液的需要量加入到40％HP-β-CD中以产生表28所列出的药物和赋形剂的最终浓度。在室温下轻微转动样品(-12rpm)。在保温的第2和第24小时，样品以13,000rpm离心2分钟，并且取出50μL的等分试样用于RP-HPLC分析。不考虑目标M₄N或制剂，24小时孵育后，观察到即使有变化也很小(表28)。 

表28 M₄N在11-14mg/mL PEG300/HP-β-CD溶液中的稳定性 

[0355] 

在室温孵育24小时后，含有被制备到25％PEG 300和30％HP-β-CD中，终浓度为11-14mg/mL之间的M₄N的检测样品是稳定的。 

实施例19.40mg/mL M₄N/PEG300的稳定性 

于30℃、45℃和60℃孵育评价溶解于100％PEG 300的40mg/mLM₄N的长达24小时的稳定性。根据实施例18所提出的方法，在60℃制备PEG 300中的40mg/mL M₄N的储存液。之后，取出等分试样在适当的温度下孵育。在整个孵育过程中，以450rpm旋转样品。在全程收集眼睛观察和RP-HPLC的数据。如表29所示，在30℃孵育6小时后，在40mg/mL M₄N/PEG 300制剂中观察到微小结晶，在24小时后出现的更多。结晶的形成与可溶性的M₄N的损失相一致(表30)。根据眼睛观察和RP-HPLC分析评价，在45℃和60℃孵育的40mg/mL M₄N/PEG 300样品在24小时孵育后是稳定的(表29和30)。在任何孵育温度下，没有观察到杂质峰的量和类型有变化。 

表29.40mg/mL M₄N/PEG 300稳定性样品的视觉外观 

表30.40mg/mL M₄N/PEG 300稳定性样本的RP-HPLC分析 

[0363] 

在30℃孵育6小时后，在40mg/mL M4N/PEG300制剂中观察到微小结晶。在24小时后，观察到更多结晶，以及根据RP-HPL分析的测定，溶解的M₄N有超过5％的损失。 

根据眼睛观察和RP-HPLC分析，40mg/mL M4N/PEG 300样品在45℃和60℃孵育24小时后是稳定的。 

本领域技术人员将理解到，在不脱离本发明的一般概念，可以对上述实施方案进行改变。因此应当懂得，本发明不被所公开的具体实施方案所限制，但是其意在覆盖如所附权利要求所定义的，在本发明的精神和范围内的变型。 

参考文献 

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Claims (40)

1.一种用于对动物口服给药的组合物，所述组合物包括活性药物成分和制药学可接受的载体，其特征在于，活性药物成分为四-O-甲基NDGA，并且载体包括环糊精和至少一种增溶剂和赋形剂，所述增溶剂和赋形剂选自下述组：（a）非DMSO的水溶性的有机溶剂；如果当水溶性的有机溶剂是丙二醇，则没有白矿脂，没有黄原胶，没有丙三醇或糖胶中的至少一种，当水溶性的有机溶剂是聚乙二醇时，聚乙二醇在没有抗坏血酸或丁羟甲苯时存在，并且在聚乙二醇是聚乙二醇400时，聚乙二醇400在没有聚乙二醇8000时存在；（b）离子、非离子或两性分子表面活性剂，如果表面活性剂是非离子表面活性剂，非离子表面活性剂在没有黄原胶的情况下存在；（c）修饰的纤维素；（d）水不溶性脂类，如果水不溶性脂类是蓖麻油，蓖麻油在没有蜂蜡或棕榈蜡的情况下存在；以及（a）-（d）载体中任意的组合。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括0.1mg到200mg的活性药物成分。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括10mg，20mg，25mg，30mg，40mg，50mg，60mg,75mg，100mg或200mg的活性药物因子。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述活性药物成分以1mg/mL到200mg/mL或1mg/g到250mg/g的浓度存在。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述活性药物成分以1mg/mL，2mg/mL，2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，12.5mg/mL，15mg/mL，20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，55mg/mL，60mg/mL，75mg/mL，100mg/mL，125mg/mL，150mg/mL或175mg/mL的浓度存在。

6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述活性药物成分以20mg/g，50mg/g，75mg/g，100mg/g，120mg/g，130mg/g，140mg/g，150mg/g，175mg/g或200mg/g的浓度存在。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述水溶性的有机溶剂选自包括聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮，乙醇，苯甲醇和二甲基乙酰胺的组。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述水溶性的有机溶剂为聚乙二醇。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇以5%(v/v)到100%(v/v)的浓度存在。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇以20%(v/v)到80%(v/v)的浓度存在。

11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇以50%(v/v)的浓度存在。

12.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇以40%(v/v)的浓度存在。

13.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇以33%(v/v)的浓度存在。

14.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇是PEG 300。

15.根据权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述PEG300以10%(v/v)，20%(v/v)，30%(v/v)，40%(v/v)或50%(v/v)的浓度存在。

16.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇是PEG 400。

17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述PEG400以10%(v/v)，20%(v/v)，30%(v/v)，40%(v/v)或50%(v/v)的浓度存在。

18.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇是PEG 400单月桂酸酯。

19.根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述PEG 400单月桂酸酯以20%(v/v)到50%(v/v)的浓度存在。

20.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述环糊精包括未修饰的环糊精或修饰的环糊精。

21.根据权利要求20所述的组合物，其特征在于，修饰的环糊精是羟丙基-β-环糊精和磺丁基醚-β-环糊精。

22.根据权利要求20所述的组合物，其特征在于，修饰的环糊精以5%(w/v)到80%(w/v)的浓度存在。

23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于，修饰的环糊精以15%(w/v)，20%(w/v)，25%(w/v)，30%(w/v)，35%(w/v)，40%(w/v)或50%(w/v)的浓度存在。

24.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自包括聚山梨醇酯，维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯，酯化的脂肪酸，和氧化乙烯与蓖麻油以摩尔比35:1的反应产物的组。

25.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂以5%(v/v)到100%(v/v)的浓度存在。

26.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂以30%(v/v),40%(v/v)或50%(v/v)的浓度存在。

27.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。

28.根据权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。

29.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是酯化的脂肪酸。

30.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述修饰的纤维素选自包括乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素和羧甲基纤维素的组。

31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述修饰的纤维素以0.1%(w/v)到10%(w/v)的浓度存在。

32.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述水不溶性脂类选自包括水不溶性脂质油、蜡和脂肪乳液中的至少一种。

33.根据权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述水不溶性脂类是脂肪乳液。

34.根据权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述脂肪乳液以10%到30%的浓度存在。

35.根据权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述脂肪乳液以20%的浓度存在。

36.根据权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述水不溶性脂类是油。

37.根据权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述油选自包括玉米油，橄榄油，薄荷油，大豆油，芝麻油，矿物油和丙三醇的组中的至少一种。

38.根据权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述油以10%到100%的浓度存在。

39.根据权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述油是薄荷油。

40.根据权利要求39所述的组合物，所述组合物进一步包括芝麻油。

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