ES2606332T3 - Formulaciones orales para la administración de butanos catecólicos incluyendo compuestos de NDGA - Google Patents

Abstract

Composición para la administración oral a un animal que comprende un principio activo farmacéutico y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el principio activo farmacéutico comprende tetra-O-metil- NDGA, y el portador comprende polietilenglicol, una ciclodextrina y opcionalmente al menos uno de un agente de solubilización y un excipiente seleccionado del grupo que consiste en: (a) un disolvente orgánico soluble en agua distinto de DMSO; siempre que cuando el disolvente orgánico soluble en agua sea propilenglicol, el propilenglicol esté en ausencia de vaselina blanca, en ausencia de goma xantana y en ausencia de al menos uno de glicerina o glicina, cuando el disolvente orgánico soluble en agua sea polietilenglicol, el polietilenglicol esté presente en ausencia de ácido ascórbico o hidroxitolueno butilado, y cuando el polietilenglicol sea polietilenglicol 400, el polietilenglicol 400 esté presente en ausencia de polietilenglicol 8000; (b) un tensioactivo iónico, no iónico o anfipático, siempre que cuando el tensioactivo sea un tensioactivo no iónico, el tensioactivo no iónico esté presente en ausencia de goma xantana; (c) una celulosa modificada; (d) un lípido insoluble en agua, siempre que cuando el lípido insoluble en agua sea aceite de ricino, el aceite de ricino esté presente en ausencia de cera de abejas o cera de carnauba; y una combinación de cualquiera de los portadores (a) - (d).

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones orales para la administracion de butanos catecolicos incluyendo compuestos de NDGA

Esta solicitud se refiere a una composicion para la administracion oral a un animal que comprende tetra-O-metil- NDGA. La solicitud tambien se refiere a una composicion para su uso en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, cancer u otras enfermedades proliferativas o inflamatorias, enfermedades metabolicas o enfermedades neurodegenerativas.

Los butanos catecolicos tales como acido nordihidroguayaretico (“NDGA”) se han sometido a prueba para determinar sus aplicaciones terapeuticas en animales de experimentacion mediante inyeccion intratumoral o aplicacion topica de tales compuestos. Por ejemplo, Jordan et al. en el documento US 5.008.294 describieron el efecto de NDGA sobre carcinoma de mama humano, MX-1, que se implanto por via subcutanea en ratones en el dfa 0 (ejemplo 2). A los ratones que conteman tumores se les inyectaron diversas dosis de NDGA en el dfa 1, en una inyeccion intratumoral individual. En otro experimento, Jordan et al. inyectaron un adenocarcinoma de mama humano, MX-1, por via intradermica en ratones y trataron a los animales mediante aplicacion topica de NDGA despues del dfa 23 (ejemplo 7).

Huang et al. describieron las pruebas de determinados derivados de NDGA (es decir, “derivados de NDGA”) en el documento US 6.214.874. En un experimento, se les inyecto a los ratones una lmea celular inmortal de raton, celulas C3, y se trataron mediante inyeccion intratumoral con M4N solo o en combinacion con G4N, siendo ambos derivados de NDGA.

El documento WO9917761 (A1) da a conocer formulaciones que comprenden acido nordihidroguayaretico (NDGA) y un vehnculo anfffilo para reducir los niveles de trigliceridos, acido graso libre o glicerol en suero en animales.

El documento WO9815184 (A1) da a conocer un agente terapeutico no toxico que tiene actividad farmacologica que comprende un extracto concentrado producido extrayendo material vegetal de Larrea tridentata y anadiendo un agente reductor tal como acido ascorbico para reducir la quinona de NDGA toxica, que se produce de manera natural en el material vegetal, al propio NDGA.

Sena deseable si se descubriese una formulacion oral de estos compuestos anticancengenos que pudiese permitir una administracion mas facil, especialmente autoadministracion sin necesidad de hospitalizacion. La presente invencion proporciona estos beneficios deseables.

Por tanto, uno de los objetos de la presente invencion es proporcionar una o mas formulaciones orales de butanos catecolicos y/o compuestos de NDGA novedosas, tales como derivados de NDGA, para el tratamiento de enfermedades mediante la administracion oral de tales formulaciones a sujetos que necesitan tal tratamiento.

Otro de los objetos es proporcionar formulaciones como anteriormente que son seguras y tienen pocos efectos secundarios adversos cuando se administran a animales, incluyendo seres humanos.

Otro de los objetos es proporcionar formulaciones tales como una o mas de las anteriores que tienen un periodo de estabilidad comercialmente razonable.

Otro de los objetos es proporcionar formulaciones tales como una o mas de las anteriores que tienen una semivida en circulacion comercialmente razonable tras la administracion a animales.

Segun los uno o mas objetos anteriores de la invencion, se proporcionan realizaciones de la presente invencion tal como se ejemplifica a continuacion:

La presente invencion se refiere a una composicion para la administracion oral a un animal que comprende un principio activo farmaceutico y un portador farmaceuticamente aceptable, en la que el principio activo farmaceutico comprende tetra-O-metil-NDGA, y el portador comprende polietilenglicol, una ciclodextrina y opcionalmente al menos uno de un agente de solubilizacion y un excipiente seleccionado del grupo que consiste en: (a) un disolvente organico soluble en agua distinto de DMSO; siempre que cuando el disolvente organico soluble en agua sea propilenglicol, el propilenglicol este en ausencia de vaselina blanca, en ausencia de goma xantana y en ausencia de al menos uno de glicerina o glicina, cuando el disolvente organico soluble en agua sea polietilenglicol, el polietilenglicol este presente en ausencia de acido ascorbico o hidroxitolueno butilado, y cuando el polietilenglicol sea polietilenglicol 400, el polietilenglicol 400 este presente en ausencia de polietilenglicol 8000; (b) un tensioactivo ionico, no ionico o anfipatico, siempre que cuando el tensioactivo sea un tensioactivo no ionico, el tensioactivo no ionico este presente en ausencia de goma xantana; (c) una celulosa modificada; (d) un lfpido insoluble en agua, siempre que cuando el lfpido insoluble en agua sea aceite de ricino, el aceite de ricino este presente en ausencia de cera de abejas o cera de carnauba; y una combinacion de cualquiera de los portadores (a) - (d).

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la composicion de la invencion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a la composicion de la invencion para su uso en el tratamiento

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de una enfermedad proliferativa, hipertension, obesidad, diabetes, una enfermedad del sistema nervioso central, una enfermedad neurodegenerativa, dolor, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia, enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular, una enfermedad inflamatoria, neoplasia premaligna, displasia o una infeccion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un kit que comprende la composicion de la invencion e instrucciones para el uso del mismo.

Las realizaciones preferidas se exponen en las reivindicaciones dependientes.

El sumario anterior, asf como la siguiente descripcion detallada de la invencion, se comprenderan mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invencion, en los dibujos se muestran realizaciones que se prefieren actualmente.

En los dibujos:

La figura 1 comprende las figuras 1A y 1B y representa los resultados de ensayos de proliferacion celular realizados para la lmea celular C-33A y la lmea celular HeLa tras tratamiento con M4N. La figura 1A es una representacion grafica de la razon del numero de celulas presentes tras el tratamiento con M4N con respecto al numero de celulas presentes en ausencia de tratamiento con M4N, en donde M4N se proporciono en cantidades que variaban desde 0 |iM hasta 80 |iM en una formulacion de DMSO. La figura 1B es una representacion grafica de la razon del numero de celulas presentes tras el tratamiento con M4N con respecto al numero de celulas presentes en ausencia de tratamiento con M4N, en donde M4N se proporciono en cantidades que variaban desde 0 |iM hasta 80 |iM en una formulacion de HP-p-CD/PEG (formulacion de “CPE”).

La figura 2 comprende las figuras 2A y 2B y es una representacion grafica de mediciones de muerte celular basandose en el porcentaje celulas muertas para celulas C-33A y celulas HeLa en ausencia o presencia de concentraciones variables de M4N en una formulacion de DMSO (figura 2A) o en una formulacion de HP-p-CD/PEG (figura 2B). Las concentraciones de M4N variaban desde 0 |iM hasta 80 |iM.

La figura 3 es un histograma que muestra la absorcion de M4N en ratas Sprague-Dawley a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 2 h y 3 h tras la administracion oral de una unica dosis de 500 mg/kg de M4N en diferentes agentes de solubilizacion lfquidos y/o excipientes (“portador”). M4N estaba presente a una concentracion de aproximadamente 60 mg/ml en todos los portadores. Los portadores incluyen: (a) HP-p-CD (500 mg/ml) + HPMC (5 mg/ml); (b) HP-p- CD (500 mg/ml) + CMC (5 mg/ml); (c) TPGS (200 mg/ml); (d) TPGS (100 mg/ml) + PEG 400 (50% en v/v); (e) Tween® 20; (f) PEG 400 (50% en v/v) + Tween® 20 (50% en v/v); (g) PEG 400 (33% en v/v) + Tween® 20 (33% en v/v) + aceite de menta piperita (33%); (h) aceite de menta piperita (50%) + PEG 400 (50% en v/v); (h) aceite de menta piperita (50%) + Tween® 20 (50% en v/v); (i) aceite de menta piperita (50%) + aceite de sesamo (50%).

La figura 4 es una representacion grafica de la absorcion de M4N por perros Beagle a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h y 8 h tras la administracion oral de una unica dosis de 100 mg/kg de M4N en forma de polvo o en diferentes portadores solidos, tal como sigue: (a) polvo de M4N; (b) HP-p-CD liofilizado (81%) + M4N (185 mg/g); (c) TPGS (20%) + M4N (133 mg/g); (d) aceite de soja (95%) + cera de abejas (5%) + M4N (200 mg/g); y (d) aceite de oliva (95%) + cera de abejas (5%) + M4N (200 mg/g).

La figura 5 comprende las figuras 5A y 5B y es una representacion grafica de absorcion de M4N no micronizado en monooleato de glicerol por perros Beagle a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 36 h tras la administracion oral de una unica dosis de 100 mg/kg. La figura 5A esta a una escala no logantmica. La figura 5B esta a una escala logantmica.

La figura 6 comprende las figuras 6A y 6B y es una representacion grafica de absorcion de M4N micronizado en monooleato de glicerol por perros Beagle a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 36 h tras la administracion oral de una unica dosis de 100 mg/kg. La figura 6A esta a una escala no logantmica. La figura 6B esta a una escala logantmica.

La figura 7 comprende las figuras 7A y 7B y es una representacion grafica de niveles en suero de M4N en diversos portadores a diversas concentraciones por perros Beagle macho a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h y 36 h tras la administracion oral de una unica dosis oral de 75 mg/kg. Las abreviaturas del portador usado, concentracion de M4N administrada, y una indicacion de si la administracion era a perros que ayunaron o que se alimentaron se muestran mejor en la figura 7B. La figura 7A presenta los datos a una escala no logantmica. La figura 7B presenta los datos a una escala logantmica.

La figura 8 comprende las figuras 8A y 8B y es una representacion grafica de niveles en suero de M4N en diversos portadores a diversas concentraciones por perros Beagle hembra a puntos de tiempo de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 24 h y 36 h tras la administracion oral de una unica dosis oral de 75 mg/kg. Las abreviaturas del portador usado, concentracion de M4N administrada, y una indicacion de si la administracion era a perros que ayunaron o que se alimentaron se muestran mejor en la figura 8B. La figura 8A presenta los datos a una escala no logantmica. La figura 8B presenta los datos a una escala logantmica.

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La presente invencion proporciona una composicion novedosa, un kit y composicion para su uso en el tratamiento de enfermedades, incluyendo enfermedades proliferativas tales como cancer y psoriasis, hipertension, obesidad, diabetes, tipo I o tipo II, enfermedades del sistema nervioso central o trastornos neurodegenerativos incluyendo dolor, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, y enfermedad inflamatoria, neoplasia premaligna o displasia, infeccion incluyendo infecciones virales tales como VIH, VLTH, VPH, VHS, VHB, VEB, varicela-zoster, adenovirus, parvovirus, virus de CJ u otros. Las enfermedades incluyen enfermedades proliferativas tales como cancer y psoriasis, hipertension, obesidad, diabetes tipo I o tipo II, enfermedades del sistema nervioso central o enfermedades neurodegenerativas incluyendo dolor, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Parkinson, demencia, accidente cerebrovascular, y enfermedad inflamatoria, neoplasia premaligna o displasia, infeccion incluyendo infecciones virales tales como virus de la inmunodeficiencia humana (“VIH”), virus linfotropico de celulas T humanas (“VLTH), virus del papiloma humano (“VPH”), virus de herpes simple (“VHS”), virus de la hepatitis B (“VHB”), virus de Epstein-Barr (“VEB”), varicela-zoster, adenovirus, parvovirus, virus de Creutzfeldt- Jakob (“virus de CJ”) u otros.

La presente invencion proporciona una composicion novedosa que contiene tetra-O-metil-NDGA que se disuelve en determinados agentes de solubilizacion farmaceuticamente aceptables, que junto con otros diluyentes, excipientes y similares (de manera colectiva, “portador”) constituyen formulaciones apropiadas para su administracion a sujetos, tales como seres humanos, para el tratamiento de enfermedades. Tales formulaciones son adecuadas para la administracion oral. Un portador farmaceuticamente aceptable adecuado incluye al menos uno seleccionado de: (a) un disolvente organico soluble en agua distinto de DMSO, tal como polietilenglicol (“PEG”), por ejemplo, PEG 300, PEG 400 o monolaurato de PEG 400, propilenglicol (“PG”), polivinilpirrolidona (“PVP”), etanol, alcohol bendlico o dimetilacetamida; (b) un tensioactivo ionico, no ionico o anfipatico, tal como monolaurato de polioxietileno-sorbitano (tambien conocido como polisorbato), que es un tensioactivo no ionico, por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80, disponible comercialmente como Tween® 20 o Tween® 80, succinato de d-alfa-tocoferil-polietilenglicol 1000 (“TPGS”), monooleato de glicerol (tambien conocido como monooleato de glicerilo), un acido graso esterificado o un producto de reaccion entre oxido de etileno y aceite de ricino en una razon molar de 35:1, disponible comercialmente como Cremophor® EL; (c) una celulosa modificada, tal como etilcelulosa (“EC”), hidroxilpropilmetilcelulosa (“HPMC”), metilcelulosa (“MC”) o carboximetilcelulosa (“CMC”); y (d) un lfpido insoluble en agua, tal como una cera, aceite o una emulsion de grasa, por ejemplo Intralipid®. La ciclodextrina puede ser una ciclodextrina no modificada o una ciclodextrina modificada tal como hidroxipropil-p-ciclodextrina (“HP-p-CD”) o sulfobutil eter-p-ciclodextrina (“SBE- P-CD”).

En una realizacion de la invencion, los compuestos en el presente documento se disuelven o disuelven y diluyen en diferentes portadores para formar una composicion lfquida oral para su administracion a animales. Por ejemplo, en un aspecto de la realizacion, el presente compuesto de principio activo farmaceutico (“API”) se solubiliza y/o diluye en una formulacion de combinacion que contiene un compuesto de PEG y HP-p-CD.

Aun en otra realizacion, los compuestos en el presente documento se disuelven en tensioactivos ionicos, no ionicos o anfipaticos tales como Tween® 20, Tween® 80, TPGS o un acido graso esterificado. Por ejemplo, los presentes compuestos pueden disolverse en TPGS solo, o Tween® 20 solo, o en combinaciones tales como TPGS y PEG 400, o Tween® 20 y PEG 400.

En una realizacion adicional, los presentes compuestos se disuelven en un lfpido insoluble en agua tal como una cera, emulsion de grasa, por ejemplo Intralipid®, o aceite. Por ejemplo, los presentes compuestos pueden disolverse en aceite de menta piperita solo, o en combinaciones de aceite de menta piperita con Tween® 20 y PEG 400, o aceite de menta piperita con PEG 400, o aceite de menta piperita con Tween® 20, o aceite de menta piperita con aceite de sesamo.

Por supuesto, puede sustituirse o anadirse etilcelulosa en lugar de la HPMC o CMC en los ejemplos anteriores; puede sustituirse o anadirse PEG 300 o monolaurato de PEG 400 en lugar de PEG 400 en los ejemplos anteriores; puede sustituirse o anadirse Tween® 80 en lugar de Tween® 20 en los ejemplos anteriores; y puede sustituirse o anadirse otros aceites tales como aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite mineral o glicerol, en lugar del aceite de menta piperita o aceite de sesamo en los ejemplos anteriores.

Ademas, puede aplicarse calentamiento, por ejemplo, calentamiento hasta una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 90°C, en el transcurso de la formulacion de cualquiera de estas composiciones para lograr la disolucion de los compuestos en el presente documento o para obtener una suspension uniformemente distribuida de los presentes compuestos.

En una realizacion, los compuestos en el presente documento se disuelven en primer lugar en un portador lfquido como en los ejemplos anteriores, y posteriormente se preparan para dar una composicion solida para su administracion como una composicion oral.

En una realizacion adicional, los presentes compuestos se disuelven o suspenden en una disolucion de TPGS, con calentamiento segun sea apropiado para obtener una disolucion o suspension uniformemente distribuida. Tras enfriarse, la composicion se vuelve cremosa y es adecuada para la administracion oral.

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Aun en otra realizacion, los presentes compuestos se disuelven en aceite y se anade cera de abejas para producir una composicion solida cerea.

Incluso aun en una realizacion adicional de la invencion, los compuestos en el presente documento se solubilizan en celulosas modificadas tales como EC. Las celulosas modificadas tales como etilcelulosa pueden diluirse en etanol (“EtOH”) antes de su uso.

La presente invencion tambien proporciona lfpidos insolubles en agua como solubilizantes para los presentes compuestos. Los lfpidos insolubles en agua incluyen, por ejemplo, aceites asf como composiciones de emulsion de grasa mixtas tales como Intralipid® (Pharmacia & Upjohn, ahora Pfizer), usado segun la recomendacion del fabricante. Por ejemplo, la dosificacion para adultos se recomienda que no exceda los 2 g de grasa/kg de peso corporalMa (20 ml, 10 ml y 6,7 ml/kg de Intralipid® al 10%, al 20% y al 30%, respectivamente). Se cree que Intralipid® al 10% contiene en 1.000 ml: 100 g de aceite de soja purificado, 12 g de fosfolfpidos de huevo purificados, 22 g de glicerol anhidro, agua para inyeccion c.s.p. 1.000 ml. El pH se ajusta con hidroxido de sodio hasta pH de aproximadamente 8. Intralipid® al 20% contiene en 1.000 ml: 200 g de aceite de soja purificado, 12 g de fosfolfpidos de huevo purificados, 22 g de glicerol anhidro, agua para inyeccion c.s.p. 1.000 ml. El pH se ajusta con hidroxido de sodio hasta pH de aproximadamente 8. Intralipid® al 30% contiene en 1.000 ml: 300 g de aceite de soja purificado, 12 g de fosfolfpidos de huevo purificados, 16,7 g de glicerol anhidro, agua para inyeccion c.s.p. 1.000 ml. El pH se ajusta con hidroxido de sodio hasta pH de aproximadamente 7,5. Estos productos Intralipid® se almacenan a temperatura ambiente controlada por debajo de 25°C y no deben congelarse.

En general, en la preparacion de las formulaciones orales, los compuestos en el presente documento se solubilizan en primer lugar antes de que se anadan otros excipientes de modo que se produzcan composiciones de mayor estabilidad. Las formulaciones inestables no son deseables. Las formulaciones lfquidas inestables forman frecuentemente precipitados cristalinos o disoluciones bifasicas. Las formulaciones solidas inestables frecuentemente parecen granulosas y grumosas y a veces contienen lfquidos fluidos. Una formulacion solida optima parece suave, homogenea, y tiene un pequeno intervalo de temperatura de fusion. En general, las proporciones de excipientes en la formulacion pueden influir en la estabilidad. Por ejemplo, demasiado poco agente espesante tal como cera de abejas puede dejar la formulacion demasiado fluida.

Por tanto, en general, para las formulaciones lfquidas de la presente invencion, los excipientes usados deben ser buenos disolventes del API M4N. En otras palabras, los excipientes deben poder disolver el API sin calentamiento. Los excipientes tambien deben ser compatibles entre sf independiente del API de manera que puedan formar una disolucion, suspension o emulsion estable. Ademas, en general, para las formulaciones solidas de la presente invencion, los excipientes usados tambien deben ser buenos disolventes del API para evitar grumos y formulaciones no uniformes. Para evitar formulaciones solidas que tienen una textura demasiado fluida o heterogenea, que no son deseables, los excipientes deben ser compatibles entre sf de manera que formen un solido homogeneo suave, incluso en ausencia del API.

Los terminos usados en el presente documento tienen su significado de diccionario comun y tal como se usa por los expertos en la tecnica a menos que se disponga lo contrario. En particular, la presente invencion puede entenderse mejor a la luz de las siguientes definiciones, que se usan con otros terminos tal como se definen en otra parte en el presente documento:

El termino “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento en referencia a una concentracion o dosis significa el numero especificado hasta ± del 10% al 20%.

El termino “principio activo farmaceutico,” “API” o la referencia a los “compuestos” en el presente documento significa tetra-O-metil-NDGA.

El “tampon” adecuado para su uso en el presente documento incluye cualquier tampon convencional en la tecnica, tal como, por ejemplo, Tris, fosfato, imidazol y bicarbonato.

Un “portador” tal como se usa en el presente documento se refiere a una carga, un diluyente, un vehfculo, un excipiente, un agente de solubilizacion, un material de encapsulacion o agente auxiliar de formulacion de cualquier tipo convencional, solido, semisolido o lfquido no toxico, y abarca todos los componentes de la composicion distintos del principio activo farmaceutico. El portador puede contener agentes adicionales tales como agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Otros materiales tales como antioxidantes, humectantes, estabilizadores de la viscosidad, y agentes similares pueden anadirse segun sea necesario.

Una “ciclodextrina” tal como se usa en el presente documento significa una ciclodextrina no modificada o una ciclodextrina modificada, e incluye a-ciclodextrina, p-ciclodextrina, y-ciclodextrina y cualquier ciclodextrina modificada que contenga modificaciones en la misma, tal como HP-p-CD o SBE-p-CD. La ciclodextrina tiene normalmente 6 (a- ciclodextrina), 7 (p-ciclodextrina) y 8 (y-ciclodextrina) azucares, hasta tres sustituciones por azucar, y por tanto son posibles de 0 a 24 sustituciones primarias (las sustituciones primarias se definen como sustituciones conectadas directamente al anillo de ciclodextrina). Las ciclodextrinas modificadas o no modificadas usadas en la presente invencion pueden tener cualquier numero y ubicacion apropiados de sustituciones primarias u otras modificaciones.

El termino “enfermedad” tal como se usa en el presente documento incluye todas las enfermedades, estados, infecciones, smdromes o trastornos para los que la aplicacion de la presente composicion produce un efecto terapeutico. Tal “enfermedad” incluye por ejemplo, cancer, psoriasis y otras enfermedades proliferativas, trastornos inflamatorios incluyendo artritis reumatoide, osteoartritis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, 5 enfermedad pulmonar obstructiva cronica (“EPOC”), hipertension, obesidad, diabetes, dolor, accidente cerebrovascular y/u otros trastornos neuronales o enfermedades o estados neurodegenerativos, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis multiple, esclerosis lateral amiotrofica (“eLa”) y estados premalignos tales como neoplasia intraepitelial o displasia, y enfermedades infecciosas.

“M4N” o “tetra-O-metil-NDGA” tal como se usa en el presente documento es un derivado de NDGA de formula II en la 10 que R14, R15, R16 y R17 representan cada uno independientemente -OCH3, y R18 y R19 son cada uno -CH3.

Una “celulosa modificada” tal como se usa en el presente documento significa una celulosa que contiene una o mas modificaciones en la molecula de celulosa e incluye, por ejemplo EC, HPMC, CMC y MC.

“NDGA” tal como se usa en el presente documento significa acido nordihidroguayaretico y tiene la siguiente formula:

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15 “Derivado de NDGA” tal como se usa en el presente documento significa un derivado de NDGA que tiene una formula II

imagen2

Tal como se usa en el presente documento, “por ciento”, “porcentaje” o el sfmbolo “%” significa el tanto por ciento del componente indicado en la composicion basandose en la cantidad del portador presente en la composicion, en 20 peso/peso (p/p), peso/volumen (p/v) o volumen/volumen (v/v), tal como se indica con respecto a cualquier componente particular, todos basandose en la cantidad del portador presente en la composicion. Por tanto, pueden estar presentes diferentes tipos de portadores en una cantidad de hasta el 100% tal como se indica, lo cual no excluye la presencia del API, cuya cantidad puede indicarse como un % o como un determinado numero de mg presentes en la composicion o un determinado numero de mg/g presentes, o un determinado numero de mg/ml 25 presentes, en los que el %, o mg/g, o mg/ml se basan en la cantidad del portador total presente en la composicion. Determinados tipos de portadores pueden estar presentes en combinacion para constituir el 100% del portador.

Un “portador farmaceuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento no es toxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y es compatible con otros componentes de la formulacion. Por ejemplo, el portador para una formulacion que contiene tetra-O-metil-NDGA, preferiblemente no 30 incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son perjudiciales para el mismo. Un portador farmaceuticamente aceptable comprende un agente de solubilizacion. Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, agua, dextrosa, glicerol, solucion salina, etanol, tampon, Cremaphor® EL, solucion salina tamponada con fosfato, PEG 300, PEG 400, ciclodextrina modificada y combinaciones de los mismos, todos tal como se expusieron anteriormente.

35 El termino “excipiente farmaceuticamente aceptable” incluye vehuculos, adyuvantes o diluyentes u otras sustancias auxiliares, tales como las convencionales en la tecnica, que estan facilmente disponibles para el publico, y que no

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son toxicas para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y son compatibles con otros componentes de la formulacion. Por ejemplo, las sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables incluyen agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizadores y agentes humectantes.

El termino “agente de solubilizacion” tal como se usa en el presente documento significa una composicion en la que se disuelve tetra-O-metil-NDGA. Un agente de solubilizacion tambien puede ser un portador o un portador farmaceuticamente aceptable.

Los terminos “sujeto”, “huesped” y “paciente”, se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a un animal que esta tratandose con las presentes composiciones, incluyendo, simios, seres humanos, felinos, canidos, equinos, bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, animales mairnferos de granja, animales mamfferos para el deporte y mascotas mamfferas.

Un compuesto “sustancialmente purificado” en referencia a los butanos catecolicos o derivados de NDGA tal como se usa en el presente documento es uno que esta sustancialmente libre de materiales que no son el butano catecolico, compuestos de NDGA o derivados de NDGA (de manera colectiva, “materiales que no son NDGA”). Por sustancialmente libre quiere decirse libre al menos aproximadamente al 50% de materiales que no son NDGA, preferiblemente libre al menos aproximadamente al 70%, mas preferiblemente al menos aproximadamente al 80%, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente al 90% y todavfa mas preferiblemente libre al menos aproximadamente al 95% de materiales que no son NDGA.

Tal como se usan en el presente documento, los terminos “tratamiento”, “tratar”, y similares, se refieren a obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser profilactico en cuanto a prevenir completa o parcialmente un estado o una enfermedad o un smtoma de la misma y/o puede ser terapeutico en cuanto a la curacion parcial o completa para un estado o una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible al estado o la enfermedad. El “tratamiento” de un sujeto cubre, por ejemplo, cualquier tratamiento de una enfermedad en un mai^ero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) impedir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que todavfa no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir el desarrollo o la progresion de la enfermedad, tal como, detener su desarrollo; y (c) aliviar, paliar o mejorar la enfermedad, tal como, por ejemplo, provocar la regresion o remision de la enfermedad.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, debe entenderse que cada valor intermedio, hasta la decima parte de la unidad del lfmite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el lfmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se abarcan dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos, y tambien quedan abarcados dentro de la invencion, sujetos a cualquier lfmite excluido espedficamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos de los lfmites, intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los lfmites incluidos tambien se incluyen en la invencion.

Debe observarse que tal como se usa en el presente documento, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un compuesto” incluye una pluralidad de tales compuestos.

Las citas a referencias mencionadas en el texto de esta solicitud se identifican mas completamente en la bibliograffa que precede a las reivindicaciones.

Tetra-O-metil-NDGA, tambien conocido como meso-1,4-bis(3,4-dimetoxifenil)-2,3-dimetilbutano, o M4N, se prepara tal como sigue: se prepara una disolucion que contiene NDGA e hidroxido de potasio en metanol en un matraz de reaccion. Entonces se anade sulfato de dimetilo al matraz de reaccion y se permite que la reaccion avance. Finalmente se extingue la reaccion con agua, provocando que el producto precipite. Se afsla el precipitado mediante filtracion y se seca en un horno a vacfo. Entonces se disuelve el compuesto en una disolucion de cloruro de metileno y tolueno y posteriormente se purifica mediante una columna de alumina. Se eliminan los disolventes mediante evaporacion rotatoria y se resuspende el solido en isopropanol y se afsla mediante filtracion. Se seca la torta de filtro en un horno a vacfo. Se cristaliza el tetra-O-metil-NDGA (M4N) resultante sometiendo a reflujo la torta de filtro en isopropanol y se vuelven a aislar los cristales mediante filtracion.

Preparacion de las composiciones terapeuticas

La presente invencion proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmaceuticas, que comprenden tetra- O-metil-NDGA, como principios activos farmaceuticos (“API”), y portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables. Normalmente, las composiciones de la presente invencion contendran desde menos de aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 99% del API; opcionalmente, la presente invencion contendra de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 90% del API.

La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones en las que M4N esta presente en concentraciones de 1 mg/ml a 200 mg/ml, o de 10 mg/ml a 175 mg/ml, o de 20 mg/ml a 150 mg/ml, o de 30 mg/ml a 125 mg/ml, o de 40 mg/ml a 100 mg/ml, o de 50 mg/ml a 75 mg/ml. En una realizacion, M4N esta presente en las composiciones en el presente documento a una concentracion de 1 mg/ml, 2 mg/ml, 2,5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml,

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25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml 60 mg/ml 75 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml o 200 mg/ml.

La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones en las que M4N esta presente en concentraciones en el intervalo de aproximadamente 1 mg/g a 250 mg/g, u opcionalmente de 20 mg/g a 200 mg/g, o de 40 mg/g a 180 mg/g, o de 60 mg/g a 160 mg/g, o de 80 mg/g a 130 mg/g, o de 50 mg/g a 100 mg/g. En una realizacion, los presentes compuestos estan presentes en las composiciones en el presente documento a una concentracion de 133 mg/g, 185 mg/g, 200 mg/g y 250 mg/g. Las cantidades a modo de ejemplo del API en la composicion incluyen 20 mg/g, 50 mg/g, 75 mg/g 100 mg/g, 120 mg/g, 130 mg/g, 140 mg/g, 150 mg/g, 175 mg/g o 200 mg/g.

Expresado alternativamente, otras realizaciones de la composicion de la presente invencion pueden contener de menos de 0,1 mg a 200 mg o mas del API, tal como 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 75 mg, 100 mg o 200 mg del API.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion segun lo anterior que es una composicion lfquida que es adecuada para la administracion oral. En otra realizacion, la invencion proporciona una composicion segun lo anterior que es una composicion solida que tambien es adecuada para la administracion oral.

Entre los disolventes organicos solubles en agua preferidos estan etanol, alcohol bendlico, dimetilacetamida, PVP, PG y compuestos de PEG tales como: PEG 300, PEG 400, o monolaurato de PEG 400. El compuesto de PEG en las presentes composiciones se proporciona en una cantidad del 5% al 100%, o del 5% al 60%, o del 10% al 90%, o del 20% al 80%, o del 30% al 70%, o del 40% al 60%, siendo todas las concentraciones un porcentaje en volumen/volumen (v/v). PG puede estar presente a una concentracion del 2,5% al 100% (v/v).

La concentracion de los compuestos de PEG en las presentes composiciones puede variar dependiendo de que otros solubilizantes o diluyentes o excipientes estan tambien presentes. Por ejemplo, el PEG 300, PEG 400 o monolaurato de PEG 400 de la presente invencion puede estar a una concentracion del 5%, el 10%, el 12,5%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, o el 95%, facilitandose todas de tales concentraciones como porcentaje en volumen/volumen (v/v).

La presente invencion tambien proporciona composiciones de tetra-O-metil-NDGA en una ciclodextrina, que incluye ciclodextrinas modificadas. Las ciclodextrinas en el presente documento pueden ser a-ciclodextrina, p-ciclodextrina, y-ciclodextrina, y las ciclodextrinas modificadas pueden incluir HP-p-CD y SBE-p-CD, por ejemplo. En una realizacion, la presente composicion contiene una ciclodextrina modificada en una concentracion del 5% al 80%, o del 10% al 70%, o del 20% al 60%, o del 30% al 50%, facilitandose todas de tales concentraciones como porcentaje en peso/volumen (p/v).

Aun en otra realizacion, las ciclodextrinas modificadas, tales como HP-p-CD, estan presentes en las composiciones a una concentracion del 12,5%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70% o el 75%, facilitandose todas de tales concentraciones como porcentaje en peso/volumen (p/v).

Otro portador o excipiente farmaceuticamente aceptable que puede usarse solo o con otros en la composicion de la presente invencion es un tensioactivo ionico, no ionico o anfipatico, tal como Cremophor® EL, polisorbatos, que son tensioactivos no ionicos, por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80, disponibles comercialmente como Tween® 20 o Tween® 80, TSGS, que es un tensioactivo anfipatico, entre muchos otros. Los ejemplos adicionales de tensioactivos adecuados incluyen monooleato de glicerol y un acido graso esterificado, tal como los que se producen normalmente mediante transesterificacion de aceites vegetales, disponibles en varias calidades y variedades como Labrafil®, Labrasol® y Gelucire®, de Gattefosse Corp., Paramus, Nj, EE.UU. El tensioactivo puede estar presente en cualquier cantidad eficaz deseada, tal como a una concentracion de aproximadamente el 1% (v/v) a aproximadamente el 100% (v/v), preferiblemente de aproximadamente el 9% (v/v) a aproximadamente el 80% (v/v), y mas preferiblemente, de aproximadamente el 10% (v/v) a aproximadamente el 50% (v/v). Como ejemplos espedficos, concentraciones preferidas de un tensioactivo no ionico son Tween® 20 a una concentracion de aproximadamente el 9% (v/v) a aproximadamente el 100% (v/v) y Tween® 80 de aproximadamente el 33% (v/v) a aproximadamente el 100% (v/v). Todos los porcentajes del tensioactivo son porcentajes en volumen (v/v).

Otro portador o excipiente farmaceuticamente aceptable que puede usarse solo o con otros en la composicion de la presente invencion es una celulosa modificada, tal como EC, HPMC, MC y CMC. La celulosa modificada puede estar presente en cualquier cantidad eficaz deseada, tal como una concentracion de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 25%, o de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 7,5%, o de aproximadamente el 1,0% a aproximadamente el 5%. Como ejemplos espedficos, EC puede estar presente a una concentracion de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%; HPMC puede estar presente a una concentracion de

aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 1%; MC puede estar presente a una concentracion de

aproximadamente el 1% a aproximadamente el 3%; y CMC puede estar presente a una concentracion de

aproximadamente el 1% a aproximadamente el 4%. Los porcentajes de celulosa modificada son en peso por

volumen (p/v).

En otra realizacion, la presente invencion proporciona una composicion segun lo anterior que contiene un compuesto

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de PEG, tal como PEG 400, por ejemplo, y un tensioactivo, tal como Tween® 20, por ejemplo, como agente de solubilizacion y/o excipiente.

Otro portador o excipiente farmaceuticamente aceptable que puede usarse solo o con otros en la composicion de la presente invencion es un lfpido insoluble en agua, tal como un aceite, emulsion de grasa o cera. Los portadores de ifpido insoluble en agua pueden estar presentes en cualquier cantidad eficaz deseada, tal como una concentracion de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 100%, o de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 85%, o de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75%.

Los ejemplos de aceites incluyen aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de menta piperita, aceite de soja, aceite de semilla de sesamo, aceite mineral y glicerol. En una realizacion, el aceite esta presente a una concentracion de aproximadamente el 10% (v/v) a aproximadamente el 100% (v/v). Estan disponibles composiciones de emulsion de grasa mixtas, tales como emulsion Intralipid®, tal como se describio anteriormente. En diversas realizaciones, las emulsiones de grasa mixtas pueden estar presentes a una concentracion de aproximadamente el 10% (p/v) a aproximadamente el 30% (p/v); y preferiblemente de aproximadamente el 20% (p/v).

Ejemplos de ceras adecuadas son cera de abejas y cera de carnauba. En una realizacion, la cera esta presente a una concentracion de aproximadamente el 5% (p/p) a aproximadamente el 50% (p/p).

Los portadores insolubles en agua pueden usarse en combinacion con cualquiera o mas de los portadores solubles en agua, tales como compuestos de PEG y los tensioactivos, tales como Tween® 20 o Tween® 80. Como ejemplo adicional, la presente composicion contiene una combinacion de agente de solubilizacion y/o excipiente tal como, por ejemplo, aceite y tensioactivo, como aceite de menta piperita y Tween® 20 o aceite y un compuesto de PEG, tal como aceite de menta piperita y PEG 400.

En una realizacion adicional, la composicion de la invencion contiene aceite, un tensioactivo y un compuesto de PEG, tal como, por ejemplo, aceite de menta piperita, Tween® 20 y un compuesto de PEG 400.

Como ejemplo adicional, la presente composicion incluye una combinacion de aceites o aceite y cera, tal como, por ejemplo, aceite de menta piperita y aceite de sesamo, aceite de soja y cera de abejas o aceite de oliva y cera de abejas. La cera de abejas puede estar presente a una concentracion en el intervalo de entre aproximadamente el 5% y el 50% (p/p).

Alternativamente, en otras realizaciones, Tween® 20 puede sustituirse por Tween® 80, y PEG 400 puede sustituirse por PEG 300 o monolaurato de PEG 400, y el aceite de menta piperita, aceite de soja y aceite de oliva pueden sustituirse por cualquiera de los aceites.

Aun otros excipientes incluyen monooleato de glicerol y diversos tipos de acidos grasos esterificados, tales como los productos Labrafil®, Labrasol® y Gelucire®. Estos normalmente se clasifican como tensioactivos o emulsionantes, pero los productos Labrasol® y Gelucire® tambien se usan como agentes que potencian la biodisponibilidad.

Labrafil®, y particularmente Labrafil® M 1944 CS, puede usarse como excipiente con un API, tal como M4N, con el API disuelto en una concentracion de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml. El producto final puede ser una disolucion, suspension o solido.

Labrasol® puede usarse como excipiente con un API, tal como M4N, con el API disuelto en una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml. El producto final puede ser una disolucion, suspension o solido.

Gelucire®, y particularmente Gelucire® 44/14, puede usarse como excipiente con un API, tal como M4N, con el API disuelto en una concentracion de aproximadamente 30 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml. El producto final es un solido.

Monooleato de glicerol puede usarse como excipiente con un API, tal como M4N, con el API disuelto en una concentracion de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml. El producto final puede ser una disolucion, suspension o un solido.

Pueden usarse combinaciones de los diversos componentes de portador con el API, tal como se indico anteriormente. Un ejemplo de una realizacion de este tipo es una composicion de M4N 10 mg/ml en el 25% (p/v) de PEG 300, el 30% (p/v) de HP-p-CD, siendo el resto del portador “agua adecuada para inyeccion” en animales (“WFI”, que designa una calidad reconocida de agua en la industria farmaceutica). En esta realizacion preferida, la HP-p-CD tiene de 6 a 8 grados de sustitucion, pero otras sustituciones en otras realizaciones estan bien dentro del alcance de esta invencion, tal como se indico anteriormente.

Aun otros excipientes y aditivos, tales como agentes que potencian la biodisponibilidad, pueden usarse en combinacion con cualquiera de los portadores, en las composiciones de la presente invencion. Los agentes que potencian la biodisponibilidad adecuados incluyen, por ejemplo, eugenol, cinamaldehndo, lecitina, naringenina, naringina y piperina, ademas de los mencionados anteriormente.

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Debe entenderse que siempre que los butanos catecolicos en el presente documento se disuelvan y permanezcan en disolucion, suspension o se mantengan en una forma semisolida o solida de la composicion, uno o mas de los solubilizantes o diluyentes o excipientes en el presente documento pueden anadirse a la composicion para optimizar la administracion de la misma a un sujeto que necesita tal tratamiento.

Otros portadores o excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados para su uso en el presente documento se describen en una variedad de publicaciones. Se describen ejemplos de portadores o excipientes utiles en, por ejemplo, Gennaro, A.R. (2003); Ansel, H.C. et al. (2004); Rowe, R.C. et al. (2003); y Garg, S. et al. (2001).

Las composiciones en forma lfquida pueden incluir un tampon, que se selecciona segun el uso deseado de tetra-O- metil-NDGA y tambien pueden incluir otras sustancias apropiadas para el uso previsto. Los expertos en la tecnica pueden seleccionar facilmente un tampon apropiado, una amplia variedad de los cuales se conocen en la tecnica, adecuado para un uso previsto.

Metodos terapeuticos

Las composiciones que contienen tetra-O-metil-NDGA encuentran uso como agentes terapeuticos o para el tratamiento en sujetos que necesitan tal tratamiento en cualquiera de varias enfermedades en las que pueden usarse tetra-O-metil-NDGA.

La presente invencion proporciona una composicion para su uso en el tratamiento de enfermedad incluyendo, por ejemplo, enfermedades proliferativas tales como cancer benigno y maligno, psoriasis y estados premalignos y neoplasia, tal como neoplasia intraepitelial, o displasia. La presente invencion tambien proporciona tratamiento de diabetes, incluyendo diabetes tipo I y tipo II, obesidad y complicaciones que resultan de las mismas, incluyendo enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular e hipertension. La presente invencion proporciona ademas el tratamiento de enfermedades inflamatorias incluyendo artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis multiple, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y otras enfermedades asociadas al sistema inmunitario. Adicionalmente, la presente invencion proporciona el tratamiento de enfermedades neurologicas, incluyendo enfermedades del sistema nervioso central y enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, demencia, esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y enfermedad de Parkinson. En una realizacion adicional, la presente invencion proporciona el tratamiento de infecciones, tales como infecciones virales incluyendo virus que requieren union a Sp1 para la transcripcion o replicacion. Los ejemplos de tales virus que requieren union a Sp1 incluyen: VIH, VLTH, VPH, VHS, VHB, VEB, virus de la varicela-zoster, adenovirus, parvovirus y virus de CJ.

Puede tratarse una variedad de huespedes animales segun los metodos objeto, incluyendo seres humanos y animales no humanos. Generalmente tales huespedes son “mairnferos”, usandose estos terminos de manera amplia para describir organismos que estan dentro de la clase Mammalia, incluyendo los ordenes carmvoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, cobayas y ratas), y otros mai^eras, incluyendo reses, cabras, caballos, ovejas, conejos, cerdos y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpances y monos). En muchas realizaciones, los huespedes seran seres humanos. Los modelos animales son de interes para investigaciones experimentales, tales como proporcionar un modelo para el tratamiento de enfermedad humana. Ademas, la presente invencion tambien puede aplicarse a la atencion veterinaria.

Formulaciones, dosificaciones y vfas de administracion

En una realizacion de la invencion, se administra una cantidad eficaz de la presente composicion al huesped, en la que una “cantidad eficaz” significa una dosificacion suficiente para producir un resultado deseado. En algunas realizaciones, por ejemplo, el resultado deseado es al menos una inhibicion de la progresion de la neoplasia o displasia.

La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones en las que se administra M4N a animales a una dosis oral de menos de 1 mg/kg a 600 mg/kg de peso de los animales, tales como seres humanos, por ejemplo. Opcionalmente, los animales pueden tratarse con 1 mg/kg, o 50 mg/kg, o 100 mg/kg, o 150 mg/kg, o 200 mg/kg, o 250 mg/kg, o 300 mg/kg, o 350 mg/kg, o 400 mg/kg, o 450 mg/kg, o 500 mg/kg, o 550 mg/kg. Una dosis de este tipo puede administrarse una vez o repetidamente a lo largo de un periodo de dfas o semanas o meses. Alternativamente, una dosis de este tipo tambien puede extenderse a lo largo de un periodo de tiempo, dependiendo de la salud del sujeto, la sensibilidad del sujeto, la magnitud de la enfermedad que va a tratarse, la edad del sujeto y similares.

En una realizacion, las composiciones terapeuticas en el presente documento se producen disolviendo en primer lugar el principio activo farmaceutico en un agente de solubilizacion, con agitacion y calentamiento segun sea necesario. Se anaden otros excipientes a la mezcla solubilizada para crear las proporciones deseadas en cuanto a requisitos de textura y estabilidad. En otra realizacion, el principio activo farmaceutico no puede disolverse realmente en el agente de solubilizacion sino que simplemente puede distribuirse uniformemente en una suspension. En una realizacion adicional, la composicion solubilizada puede liofilizarse y usarse en forma de polvo. Las composiciones orales finales pueden estar en forma de una disolucion o suspension lfquida o pueden ser una capsula, comprimido, o polvo solido.

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Tal como se indico anteriormente, la dosis apropiada que va a administrarse depende del sujeto que va a tratarse, tal como la salud general del sujeto, la edad del sujeto, el estado de la enfermedad o la afeccion, el peso del sujeto, la magnitud de la enfermedad, tal como el tamano del tumor, por ejemplo. Generalmente, pueden administrarse de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg o menos a un nino y pueden administrarse de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 gramos o menos a un adulto. El agente activo puede administrarse en una dosis individual o, mas normalmente, dosis multiples. Las dosificaciones preferidas para un agente dado pueden determinarse facilmente por los expertos en la tecnica mediante una variedad de medios. Otras dosificaciones eficaces pueden determinarse facilmente por un experto habitual en la tecnica a traves de ensayos de rutina estableciendo curvas de respuesta a la dosis. La cantidad de agente variara, por supuesto, dependiendo del agente particular usado.

La frecuencia de administracion del agente activo, como con las dosis, se determinara por el cuidador basandose en la edad, el peso, el estado patologico, el estado de salud y la receptividad del paciente. Por tanto, los agentes pueden administrarse una o mas veces al dfa, a la semana, al mes o segun sea apropiado tal como se determine convencionalmente. Los agentes pueden administrarse de manera intermitente, tal como durante un periodo de dfas, semanas o meses, despues no mas hasta que haya pasado cierto tiempo, tal como 3 o 6 meses, y entonces se administran de nuevo durante un periodo de dfas, semanas o meses.

En formas de dosificacion farmaceuticas, los agentes activos pueden administrarse solos o en asociacion apropiada, asf como en combinacion, con otros agentes terapeuticos o agentes farmaceuticamente activos incluyendo otras moleculas pequenas, anticuerpos o agentes terapeuticos proteicos.

Ademas, si se desea, el portador o excipiente puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes o agentes emulsionantes. Se conocen metodos reales de preparacion de tales formas de dosificacion, o resultaran evidentes, para los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Mack Publishing Co. Rawlins EA, (1997). La composicion o formulacion que va a administrarse, en cualquier caso, contendra una cantidad del API adecuada para lograr el estado deseado en el sujeto que esta tratandose.

En la presente invencion se incluyen kits con dosis multiples o unitarias del agente activo. En tales kits, ademas de los envases que contienen las dosis multiples o unitarias de las composiciones que contienen tetra-O-metil-NDGA, habra un prospecto de caracter informativo con instrucciones que describen el uso, y los beneficios que conlleva, de los farmacos en el tratamiento de un estado patologico de interes. Opcionalmente, en cada kit se incluye un aplicador para la administracion de la presente composicion.

Ejemplo 1. Formulaciones que contienen M4N en HP-p-CD y/o PEG 300.

En este ejemplo, se preparo M4N tal como se describe en el documento PCT/US2004/016117 y se solubilizo en un agente de solubilizacion. La disolucion resultante se mezclo opcionalmente con un excipiente y/o un diluyente. El agente de solubilizacion y el excipiente pueden usarse de manera intercambiable o en combinacion entre su Un agente de solubilizacion o excipiente usado era hidroxipropil-p-ciclodextrina controlada mediante endotoxina (“HP-p- CD”) obtenida de Research Diagnostics, Inc. (n.° de cat. RDI-82004HPB, n.° de lote H3N188P) (Flanders, NJ, EE.UU.). Otro agente de solubilizacion o excipiente usado era PEG 300, obtenido de Spectrum Chemicals, Inc. (n.° de cat. P0108, n.° de lote TB1228) (Gardena, CA, EE.UU.).

En una realizacion de la invencion, HP-p-CD y PEG 300 estaban presentes en una formulacion individual. Para preparar esta formulacion, en primer lugar se disolvio M4N en PEG 300 para formar una disolucion de M4N en PEG 300 (“M4N/PEG 300”). Entonces se anadio la disolucion de M4N/PEG 300 a una disolucion preparada anteriormente de HP-p-CD para formar una disolucion de M4N en un PEG 300 y HP-p-CD (a continuacion en el presente documento, una “formulacion de CPE”).

Cuando se prepara la disolucion de HP-p-CD, debe tenerse en cuenta una expansion de volumen. Por ejemplo, para una disolucion de HP-p-CD al 40% (p/v), debe tenerse en cuenta una expansion de volumen de 0,7 ml/g (es decir, 0,7 ml de agua desplazados por gramo de HP-p-CD anadido).

Se preparo una disolucion de 100 ml de HP-p-CD al 40% para su uso como agente de solubilizacion y/o excipiente tal como sigue: se colocaron 65 ml de WFI en un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente cuarenta (40) gramos de HP-p-CD lentamente a la WFI con agitacion, usando una espatula para dirigir la HP-p-CD al centro del vaso de precipitados para impedir que los cristales de HP-p-CD se pegaran a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la disolucion de HP-p-CD durante aproximadamente 24 h o hasta que la HP-p-CD se disolvio completamente tras inspeccion visual. La disolucion resultante media aproximadamente 93 ml. Se anadieron aproximadamente 7 ml de WFI a esta disolucion resultante para obtener 100 ml, produciendo una disolucion final de HP-p-CD aproximadamente al 40%. Se agito la disolucion final durante aproximadamente 1 h, se almaceno a temperatura ambiente y se protegio de la luz. Puede aumentarse o reducirse a escala este metodo de preparacion de la disolucion de ciclodextrina modificada para obtener el volumen o la concentracion deseados. Pueden prepararse de manera similar otras concentraciones u otras

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disoluciones de ciclodextrina modificada, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD por otras ciclodextrinas modificadas, ajustadas para las concentraciones apropiadas en el procedimiento descrito anteriormente.

Se prepararon 10 ml de una disolucion de M4N a una concentracion de aproximadamente 10 mg/ml en HP-p-CD al 40% tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 10 ml de la disolucion de HP-p-CD al 40% a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 10 mg de M4N lentamente a la HP-p-CD al 40% en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula. Se agito la mezcla de M4N/HP-P-CD al 40% durante 2 h o hasta que todo el M4N se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Opcionalmente se calento la mezcla de M4N/HP-P-CD al 40% a 80°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 80°C para 100 ml de la mezcla de M4N/HP-P-CD), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla o disolucion de M4N/HP-P-CD para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se almaceno la disolucion de M4N/HP-P-CD al 40% final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otras disoluciones de ciclodextrina, tal como, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD en el procedimiento descrito anteriormente por otras ciclodextrinas. Los resultados mostrados en la tabla 1 demuestran que M4N permanecio en disolucion tras enfriar a concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml en la formulacion de HP-p- CD al 40% durante mas de 7 dfas.

Se prepararon 100 ml de una disolucion de M4N a una concentracion de aproximadamente 25 mg/ml en PEG 300 tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 100 ml de PEG 300 a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 2,5 g de M4N lentamente al PEG 300 en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/PEG 300 durante 24 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Opcionalmente se calento la mezcla de M4N/PEG 300 a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/PEG 300), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla o disolucion de M4N/PEG 300 para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Tras observarse que se habfa disuelto todo el M4N, se uso la disolucion de M4N/PEG 300 resultante inmediatamente o antes de que pasaran 48 h, de lo contrario pueden formarse cristales u otros precipitados. Si se formaron cristales, podfa calentarse la disolucion de M4N/PEG 300 de nuevo a 60°C durante aproximadamente 1 h, con agitacion, sobre una placa magnetica caliente hasta que todo el M4N se disolvio de nuevo en la disolucion. Se almaceno la disolucion de M4N/PEG 300 final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otros PEG, tal como, por ejemplo, sustituyendo PeG 300 en el procedimiento descrito anteriormente por PEG 400 o monolaurato de PEG 400.

Se preparo una disolucion madre de 100 ml de una formulacion que contema PEG 300 al 50% (v/v), HP-p-CD al 20% (p/v) y 12,5 mg de M4N anadiendo 50 ml de la disolucion de HP-p-CD preparada anteriormente al 40% (preparada tal como se describio anteriormente) a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion sobre una placa magnetica, agitando la barra de agitacion a velocidad media, y anadiendo lentamente 50 ml de la disolucion de M4N/PEG 300 preparada anteriormente (preparada tal como se describio anteriormente), por ejemplo, a una velocidad de aproximadamente 10 ml por min. Se anadio M4N/PEG 300 usando una pipeta al centro del vaso de precipitados para impedir que se pegara a las paredes del vaso de precipitados y para garantizar disolucion completa. La adicion de M4N/PEG 300 a la disolucion de HP-p-CD aparecio inicialmente como una disolucion blanca, pero finalmente se volvio transparente tras el mezclado continuo. Puede aumentarse o disminuirse a escala esta formula segun sea apropiado para producir el volumen o la concentracion deseados de M4N/PEG 300 y HP-p-CD. Se esterilizo mediante filtracion la disolucion madre usando una membrana de PVDF de 0,22 |im, tal como una membrana de filtro en la parte superior del frasco, de desecho, impulsada por vado, esterilizada anteriormente, obtenida de Millipore (n.° de cat. SCGV T05 RE) (Billerica, MA, EE.UU.). El procedimiento de filtracion se impulso mediante fuerza de vacfo y el filtrado se recogio en frascos de vidrio de 250 ml esterilizados anteriormente. Entonces se sellaron hermeticamente los frascos, se almacenaron a temperatura ambiente y se protegieron de la luz. Puede prepararse de manera similar una disolucion madre de M4N/PEG 400 o M4N/monolaurato de PEG 400 en HP-p-CD sustituyendo PEG 300 por PEG 400 o monolaurato de PEG 400 en el procedimiento descrito anteriormente.

La disolucion madre de M4N/PEG 300/HP-p-CD, M4N/PEG 400/HP-p-CD o M4N/monolaurato de PEG 400/HP-p-CD preparada de la manera anterior puede diluirse antes de su uso in vitro o para la administracion a animales. Si la dilucion es necesaria, preferiblemente se diluye la disolucion madre en WFI, en lugar de solucion salina, por ejemplo,

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para mantener la osmolaridad baja. Para preparar 100 ml de una dilucion 1:1 de la disolucion madre en WFI, se anadieron aproximadamente 50 ml de la disolucion madre a un vial de vidrio. Se anadieron aproximadamente 50 ml de WFI a los 50 ml de la disolucion madre en el vial para formar una disolucion diluida. Se cerro el vial de vidrio y se mezclo bien la disolucion diluida agitando e invirtiendo el vial unas cuantas veces. Se esterilizo mediante filtracion la disolucion diluida usando una membrana de PVDF de 0,22 |im, tal como una membrana de filtro en la parte superior del frasco, de desecho, impulsada por vado, esterilizada anteriormente, obtenida de Millipore (n.° de cat. SCGV T05 RE) (Billerica, MA, EE.UU.). El procedimiento de filtracion se impulso mediante fuerza de vado y se recogio el filtrado en frascos de vidrio de 250 ml esterilizados anteriormente. Entonces se sellaron hermeticamente los frascos, se almacenaron a temperatura ambiente y se protegieron de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o las diluciones requeridas, tales como diluciones de 1:2 o 1:4, por ejemplo.

Puede prepararse una formulacion adecuada para su uso como control con placebo que contiene PEG 300 al 50% y HP-p-CD al 20% tal como sigue. Para preparar 100 ml de disolucion de la formulacion de placebo o control, se anaden aproximadamente 50 ml de HP-p-CD al 40% a un vaso de precipitados de vidrio que contiene una barra de agitacion sobre una placa magnetica. Se ajusta la placa magnetica para agitar la disolucion de HP-p-CD a velocidad media. Se anaden aproximadamente 50 ml de PEG 300 lentamente a los 50 ml de HP-p-CD en el vaso de precipitados de vidrio mediante pipeta al centro del vaso de precipitados para impedir que el PEG 300 se pegue a las paredes del vaso de precipitados. Se agita la mezcla durante aproximadamente 1 h o hasta que se completa el mezclado. Esta formulacion de placebo se esteriliza mediante filtracion usando un filtro de membrana de PVDF de 0,22 |im impulsado mediante la fuerza de vado. Se recoge el filtrado en frascos de vidrio de 250 ml esterilizados anteriormente. Se sellan hermeticamente los frascos de vidrio, se almacenan a temperatura ambiente y se mantienen protegidos de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala esta formula segun se requiera para producir las cantidades de concentracion y volumen deseadas. Ademas, puede sustituirse PEG 300 por PEG 400 o monolaurato de PEG 400, segun se desee.

Los resultados de la solubilidad de M4N en formulaciones que contienen HP-p-CD y/o PEG 300, PEG 400, y en formulaciones que contienen HP-p-CD y propilenglicol (“PG”), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),

carboximetilcelulosa (CMC), polivinilpirrolidona (PVP) o Tween® 80 preparadas segun los procedimientos anteriores o similares asf como las caractensticas de las formulaciones resultantes se muestran en las tablas 1 - 5, en las que N representa “No” y S representa “Sr.

Tabla 1. Ciclodextrinas modificadas como excipientes y/o agentes de solubilizacion

Excipientes

Concentracion de excipiente (en p/v a menos que se especifique lo contrario) Concentracion de farmaco (en mg/ml a menos que se especifique lo contrario) Disolucion tras rotacion Disolucion tras calentamiento a X°C Disolucion tras enfriamiento Estabilidad a temperatura ambiente

a-CD

15% 1 N N a 90°

10 N N a 90°

50 N N a 90°

100 N N a 90°

p-CD

1,50% 1 N N a 90°

10 N N a 90°

6 D

5% 1 N N a 90°

HP-p-CD

50% 1 N S a 90° S > 7 dfas

10 N S a 90° S > 7 dfas

20 N N a 90°

50 N N a 90°

100 N N a 90°

40% 1 N S a 80° S > 7 dfas

10 N S a 80° S > 7 dfas

12 N N a 80°

14 N N a 80°

16 N N a 80°

20 N N a 80°

50 N N a 80°

100 N N a 80°

30% 1 N S a 90° S > 7 dfas

10 N S a 90° S < 3 dfas

20 N N a 90°

50 N N a 90°

100 N N a 90°

20% 1 N S a 90° S > 7 dfas

10 N N a 90°

81,5% (p/p), liofilizado 185 mg/g polvo

HP-p-CD

50% en solucion salina 10 N S a 90° S >7 dfas

20% en solucion salina 1 N

10 N

50 N

HP-p-CD y propilenglicol (PG)

HP-p-CD al 40%, PG al 2,5% (v/v) 1 N N a 80°

10 N N a 80°

HP-p-CD y CMC

HP-p-CD al 50%, CMC al 0,5% 1 Suspension > 7 dfas

20 Suspension > 7 dfas

60 Suspension > 7 dfas

HP-p-CD y PVP

HP-p-CD al 50%, PVP al 1,25% (p/v) 1 N S a 90° S < 3 dfas

10 N N

50 N N

HP-p-CD al 40%, PVP al 1% (p/v) 1 N N

10 N N

HP-p-CD y PEG 300

HP-p-CD al 27%, PEG 300 al 33% (v/v) 13,3 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 23%, PEG 300 al 43% (v/v) 12,9 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 20%, PEG 300 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 15%, PEG 300 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S < 7 dfas

HP-p-CD al 12,5%, PEG 300 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S < 1 dfa

HP-p-CD al 13%, PEG 300 al 67% (v/v) 16,7 N S a 60° N

HP-p-CD al 19,3 N S a 60° N

10%, PEG 300 al 77% (v/v)

HP-p-CD al 10%, PEG 300 al 25% (v/v) 6,25 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 6,7%, PEG 300 al 16,7% (v/v) 4,17 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 5%, PEG 300 al 12,5% (v/v) 3,13 N S a 60° S < 7 dfas

HP-p-CD y PEG 400

HP-p-CD al 32%, PEG 400 al 20% (v/v) 10 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 30%, PEG 400 al 25% (v/v) 12,5 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 27%, PEG 400 al 33% (v/v) 13,3 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 23%, PEG 400 al 43% (v/v) 12,9 N S a 60° S > 7 dfas

HP-p-CD al 20%, PEG 400 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S < 7 dfas

HP-p-CD al 15%, PEG 400 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S < 3 dfas

HP-p-CD al 12,5%, PEG 400 al 50% (v/v) 12,5 N S a 60° S < 1 dfa

HP-p-CD al 40%, PEG 400 al 5% (v/v) 10 N S a 60° N

HP-p-CD y Tween® 80

HP-p-CD al 27%, Tween® 80 al 33% _____(v/v)_____ 13,3 N S a 60° N

Todas las formulaciones soportan 4°C durante 24 h y 5 min de centrifugacion a 5000 rpm sin formar precipitados visibles. La formulacion que contiene disolucion madre de PEG 300 al 50%, HP-p-CD al 20%, M4N 12,5 mg/ml soporta 4°C durante al menos 4 meses. Diluciones de la misma disolucion madre preparadas en diluciones de 1:1 o 1:2 tambien soportan 4°C durante al menos 4 meses.

5 Tabla 2. Formulaciones de M4N en PEG 300 y HP-p-CD

Disoluciones madre sin diluir

Para cada 10 mg de M4N Para cada 50 mg de M4N Para cada 100 mg de M4N

PEG 300

HP-p- CD M4N (mg/ml) PEG 300 en ml HP-p- CD PEG 300 en ml (mg) HP-p- CD PEG 300 en ml (mg) HP-p- CD

(v/v)

(p/v) (mg) (mg) (mg) (mg)

50%

15% 12,5 0,4 (450) 120 2,0 (2250) 600 4,0 (4500) 1200

50%

20% 12,5 0,4 (450) 160 2,0 (2250) 800 4,0 (4500) 1600

43%

23% 12,9 0,33 (375) 178 1,67 (1875) 890 3,33 (3746) 1780

33%

27% 13,3 0,25 (281) 200 1,25 (1406) 1000 2,5 (2813) 2000

Tabla 3. Formulaciones de M4N en PEG 400 y HP-p-CD

Disoluciones madre sin diluir

Para cada 10 mg de M4N Para cada 50 mg de M4N Para cada 100 mg de M4N

PEG 400 (v/v)

HOP-p- CD (p/v) M4N (mg/ml) PEG 400 en ml (mg) HP-p- CD (mg) PEG 400 en ml (mg) HP-p- CD (mg) PEG 400 en ml (mg) HP-p- CD (mg)

50%

20% 12,5 0,4 (450) 160 2,0 (2250) 800 4,0 (4500) 1600

43%

23% 12,9 0,33 ml (375) 178 1,67 (1875) 890 3,33 (3746) 1780

33%

27% 13,3 0,25 (281) 200 1,25 (1406) 1000 2,5 (2813) 2000

25%

30% 12,5 0,20 (225) 240 1,0 (1125) 1200 2,0 (2250) 2400

20%

32% 10,0 0,20 (225) 320 1,0 (1125) 1600 2,0 (2250) 3200

Tabla 4. Estabilidad de formulaciones de M4N en PEG 300

Formulacion

PEG 300 (v/v) HP-p-CD (p/v) M4N (mg/ml) Estabilidad a temperatura ambiente

A

50% 15% 12,5 > 3 dfas

B

50% 20% 12,5 > 5 meses

C

43% 23% 12,9 > 5 meses

D

33% 27% 13,3 > 5 meses

Tabla 5. Estabilidad de formulaciones de M4N en PEG 400

Formulacion

PEG 400 (v/v) HP-p-CD (p/v) M4N (mg/ml) Estabilidad a temperatura ambiente

E

50% 20% 12,5 > 6 dfas

F

43% 23% 12,9 > 5 meses

G

33% 27% 13,3 > 5 meses

H

25% 30% 12,5 > 5 meses

I

20% 32% 10,0 > 5 meses

De manera similar, puede solubilizarse el M4N en otros agentes de solubilizacion, tales como disolventes organicos 5 solubles en agua incluyendo etanol, polivinilpirrolidona (PVP), propilenglicol o glicerol.

Ejemplo 2. Efecto de M4N en DMSO o formulacion de combinacion de PEG 300/ HP-p-CD sobre la proliferacion y muerte de celulas tumorales en cultivo

Se sometio a prueba M4N en HP-p-CD al 10% (p/v) y PEG 300 al 25% (v/v) (a continuacion en el presente documento, la “formulacion de CPE”), M4N en HP-p-CD al 30% (p/v) y PEG 300 al 25% (v/v) (a continuacion en el 10 presente documento, la “formulacion de CPE 25/30”) y M4N en HP-p-CD al 27% (p/v) y PEG 300 al 33% (v/v) (a continuacion en el presente documento, la “formulacion de CPE 33/27”) para determinar sus efectos sobre la muerte y la proliferacion celulares sobre dos lmeas de celulas tumorales diferentes: HeLa, una lmea de celulas de cancer de cuello uterino humano positivas para VPH-18, y C-33A, una lmea de celulas de cancer de cuello uterino humano negativas para VPH. Tambien se sometio a prueba en paralelo M4N en DMSO. Se trataron ambas lmeas de celulas 15 tumorales con cantidades crecientes de M4N: 0 |iM, 20 |iM, 40 |iM, 60 |iM y 80 |iM, durante 72 h con el DMSO o la formulacion de CPE. Cada formulacion se anadio hasta un total del 1% del medio de crecimiento (medio esencial mmimo con L-glutamina complementado con suero bovino fetal al 10%, piruvato de sodio 1 mM, disolucion de aminoacidos no esenciales 1 x y disolucion de penicilina 1.000 Ul/ml/estreptomicina 1.000 |ig/ml). Se hicieron crecer las celulas control en las mismas condiciones y se dejaron sin tratar. Tras 72 h de tratamiento o sin tratamiento, se 20 conto el numero total de celulas y el numero de celulas vivas en cada muestra, usando el metodo de exclusion de azul de tripano. Se analizaron la tasa de proliferacion celular y el porcentaje de celulas muertas en cada muestra.

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Los resultados de este experimento se muestran en la figura 1, la figura 2 y las tablas 6 a 12.

La figura 1 es una representacion grafica de la razon del numero de celulas tratadas/numero de celulas no tratadas representado frente a concentraciones crecientes de M4N o bien en la formulacion de DMSO o bien en la formulacion de CPE para el tratamiento de las celulas C-33A y las celulas HeLa. La figura 2 es una representacion grafica del porcentaje de celulas muertas representado frente a concentraciones crecientes de M4N y o bien en la formulacion de DMSO o bien en la formulacion de CPE para el tratamiento de las dos lmeas de celulas de cancer, celulas C-33A y HeLa en cultivo.

Los resultados muestran que DMSO solo, en ausencia de M4N, tiene un efecto antiproliferativo significativo y cierto efecto toxico, tal como se mide mediante el % de celulas muertas, sobre ambas lmeas de celulas tumorales sometidas a prueba en comparacion con los controles no tratados. Por el contrario, la formulacion de CPE sola tiene un efecto antiproliferativo y muy poco efecto toxico sobre las dos lmeas de celulas tumorales en comparacion con los controles no tratados.

Se redujo la tasa de proliferacion celular en ambas lmeas celulares tras el tratamiento con M4N o bien en la formulacion de DMSO o bien en la formulacion de CPE, en comparacion con los controles no tratados con M4N (es decir, 0 |ig/ml o 0 M de M4N) en la misma formulacion. De hecho, el efecto antiproliferativo parecfa depender de la dosis de M4N en la formulacion de CPE. En la formulacion de CPE, por ejemplo, se encontro que aproximadamente 20 |iM o 7,2 |ig/ml de M4N eran suficientes para provocar una inhibicion de aproximadamente el 50% en la proliferacion celular para ambos tipos de celulas tumorales. Aumentos adicionales en la concentracion de M4N en la formulacion de CPE dieron como resultado aumentos adicionales en el efecto antiproliferativo para ambos tipos de celulas.

En general, dosis mayores de M4N o bien en la formulacion de DMSO o bien en la formulacion de CPE indujeron porcentajes mayores de muerte celular tanto para las celulas C-33A como para las celulas HeLa. Sin embargo, M4N en la formulacion de DMSO era mas toxico para las celulas que las concentraciones correspondientes de M4N en la formulacion de CPE. Mientras que la concentracion mas alta de M4N sometida a prueba (80 |iM o 28,7 |ig/ml) en la formulacion de DMSO promovio la muerte celular en aproximadamente el 40% de la poblacion celular, la misma concentracion de M4N en la formulacion de CPE promovio la muerte celular en solo aproximadamente el 20% de la poblacion celular en este experimento.

Se encontro que estos resultados eran reproducibles en ambas lmeas celulares. Los datos de este estudio indican que M4N en la formulacion de CPE tiene capacidad para detener la proliferacion celular, similar a M4N en la formulacion de DMSO, al tiempo que induce menos toxicidad celular que la formulacion de DMSO.

Se recogieron los datos de puntos de tiempo continuados para someter a prueba la eficacia de la formulacion de CPE a lo largo del tiempo. Los datos mostraron que tras un periodo de doce meses de almacenamiento a 2-8°C, la formulacion de CPE es tan eficaz como cuando es nueva. La viabilidad de las celulas permanecio similar a lo largo de los doce meses durante los que se almaceno la formulacion de CPE. Las tasas de muerte y de proliferacion celular permanecieron dentro del mismo intervalo.

Se recogieron datos para comparar la formulacion de CPE original con la nueva formulacion de CPE 25/30. Se realizaron estudios a 0 y 3 meses para someter a prueba la eficacia de la formulacion a lo largo del tiempo asf como para someter a prueba como de bien funciona la nueva formulacion en relacion con la antigua. Los datos mostraron que la formulacion de CPE 25/30 es tan eficaz en la inhibicion del crecimiento de celulas tumorales como la formulacion de CPE original. La viabilidad celular era similar entre las celulas HeLa tratadas con diversas concentraciones de farmaco usando o bien la formulacion de CPE o bien la formulacion de CPE 25/30. La muerte y la proliferacion celulares permanecieron dentro del mismo intervalo a lo largo del tiempo.

Se recogio informacion comparando la formulacion de CPE original con la formulacion de CPE 33/27 a tiempo cero en celulas HeLa. Los datos mostraron que CPE 33/27 tema los mismos efectos sobre celulas HeLa en viabilidad celular, porcentaje de celulas muertas y tasa de proliferacion.

Tabla 6. Efecto de M4N en DMSO o la formulacion de CPE sobre celulas C-33 A

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

95,4 4,6 1,00

DMSO 0 |iM

82,0 18,0 0,47

DMSO 20 |iM

82,6 17,4 0,20

DMSO 40 |iM

67,0 33,0 0,15

DMSO 60 |iM

60,4 39,6 0,14

DMSO 80 |iM

56,7 43,3 0,11

CPE 0 |iM

92,8 7,2 0,79

CPE 20 |iM

93,0 7,0 0,43

CPE 40 |iM

89,1 10,9 0,43

CPE 60 |iM

89,4 10,6 0,22

CPE 80 uM | 77,5 |_______22,5________|_______0,15

Tabla 7. Efecto de M4N en DMSO o la formulacion de CPE sobre celulas HeLa a tiempo 0

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

97,7 2,3 1,00

DMSO 0 |iM

93,7 6,3 0,43

DMSO 20 |iM

90,1 9,9 0,25

DMSO 40 |iM

86,8 13,2 0,25

DMSO 60 |iM

63,9 36,1 0,13

DMSO 80 |iM

61,4 38,6 0,02

CPE 0 uM

96,3 3,7 1,03

CPE 20 |iM

95,6 4,4 0,52

CPE 40 uM

90,6 9,4 0,28

CPE 60 uM

80,4 19,6 0,13

CPE 80 uM

78,5 21,5 0,13

Tabla 8. Efecto de M4N en DMSO o la formulacion de CPE sobre celulas HeLa a los 9 meses

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

95,7 4,2 1,00

DMSO 0 uM

94,9 5,1 0,76

DMSO 20 uM

89,3 10,7 0,19

DMSO 40 uM

91,2 8,8 0,14

DMSO 60 uM

67,5 32,5 0,03

DMSO 80 uM

50,0 50,0 0,02

CPE 0 uM

95,6 4,4 0,72

CPE 20 uM

68,7 31,3 0,24

CPE 40 uM

72,8 27,2 0,10

CPE 60 uM

86,4 13,6 0,09

CPE 80 uM

88,1 11,9 0,08

Tabla 9. Efecto de M4N en DMSO o la formulacion de CPE sobre celulas HeLa a los 12 meses

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

92,1 7,9 1,00

DMSO 0 uM

90,5 9,5 0,77

DMSO 20 uM

87,4 12,6 0,23

DMSO 40 uM

86,4 13,7 0,04

DMSO 60 uM

64,6 35,4 0,04

DMSO 80 uM

76,5 23,6 0,15

CPE 0 uM

95,6 4,4 1,50

CPE 20 uM

96,8 3,3 0,74

CPE 40 uM

95,0 5,0 0,21

CPE 60 uM

75,0 25,0 0,05

CPE 80 uM

52,8 47,2 0,03

Tabla 10. Comparacion de la formulacion de CPE y la formulacion de CPE 25/30 en celulas HeLa

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

93,5 6,6 1,00

CPE 0 uM

92,3 7,8 0,92

CPE 20 uM

93,5 6,6 0,33

CPE 40 uM

76,7 23,4 0,08

CPE 60 uM

44,5 55,6 0,03

CPE 80 uM

43,4 56,7 0,04

CPE 25/30 0 uM

90,7 9,3 0,81

CPE 25/30 20 uM

90,7 9,4 0,34

CPE 25/30 40 uM

89,1 11,0 0,31

CPE 25/30 60 uM

77,3 22,8 0,12

CPE 25/30 80 uM

54,8 45,2 0,07

Tabla 11. Comparacion de la formulacion de CPE y la formulacion de CPE 25/30 en celulas HeLa a los 3 meses

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

95,8 4,2 1,00

CPE 0 uM

95,0 5,0 0,91

CPE 20 uM

91,0 9,0 0,39

CPE 40 uM

83,5 16,5 0,09

CPE 60 uM

56,9 43,1 0,03

CPE 80 uM

71,0 29,0 0,03

CPE 25/30 0 uM

93,4 6,6 0,87

CPE 25/30 20 uM

88,1 11,9 0,39

CPE 25/30 40 uM

86,6 13,4 032

CPE 25/30 60 uM

76,9 23,1 0,11

CPE 25/30 80 uM

64,4 35,6 0,04

Tabla 12. Comparacion de la formulacion de CPE y la formulacion de CPE 33/27 en celulas HeLa a tiempo cero

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

95,0 5,0 1,00

CPE 0 uM

96,4 3,6 1,11

CPE 20 uM

88,1 11,9 0,35

CPE 40 uM

74,2 25,9 0,14

CPE 60 uM

73,9 26,2 0,10

CPE 80 uM

78,4 21,6 0,11

CPE 33/27 0 uM

95,4 4,7 0,92

CPE 33/27 20 uM

89,2 10,9 0,43

CPE 33/27 40 uM

86,4 13,6 0,19

CPE 33/27 60 uM

70,7 29,3 0,10

CPE 33/27 80 uM

75,0 25,0 0,09

Ejemplo 3. Pueden usarse multiples lotes de M4N y crear los mismos resultados

Se sometieron a prueba diversos lotes de M4N para mostrar la eficacia del farmaco de diferentes lotes. Se trataron 5 celulas HeLa con cantidades crecientes de M4N: 0 uM, 20 uM, 40 uM, 60 uM y 80 uM, durante 72 h con la formulacion de CPE. Cada formulacion se anadio hasta un total del 1% del medio de crecimiento (medio esencial mmimo con L-glutamina complementado con suero bovino fetal al 10%, piruvato de sodio 1 mM, disolucion de aminoacidos no esenciales 1 x y disolucion de penicilina 1.000 Ul/ml/estreptomicina 1.000 ug/ml). Se hicieron crecer las celulas control en las mismas condiciones y se dejaron sin tratar. Tras 72 h de tratamiento o sin tratamiento, se 10 conto el numero total de celulas y el numero de celulas vivas en cada muestra, usando el metodo de exclusion de azul de tripano. Se analizaron la tasa de proliferacion celular y el porcentaje de celulas muertas en cada muestra. Los resultados de este experimento se muestran en las tablas 13 y 14. Este resultado muestra que independientemente del lote de M4N usado, la eficacia del farmaco sigue siendo la misma.

Tabla 13. Tratamiento de celulas HeLa con diversos lotes de M4N (lote EM1001)

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

96,2 3,7 1,00

CPE 0 uM

96,2 3,8 0,92

CPE 20 uM

94,9 5,1 0,25

CPE 40 uM

73,7 26,3 0,10

CPE 60 uM

44,4 55,6 0,01

CPE 80 uM

59,8 40,2 0,01

15 Tabla 14. Tratamiento de celulas HeLa con diversos lotes de M4N (lote EM1002)

Tratamiento

% de viabilidad % de celulas muertas Tasa de proliferacion

Ninguno

95,9 4,1 1,00

CPE 0 uM

96,1 3,8 0,65

CPE 20 uM

88,0 12,0 0,32

CPE 40 uM

74,2 25,8 0,11

CPE 60 uM

41,9 58,1 0,05

CPE 80 uM

40,3 59,7 0,03

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Ejemplo 4. Solubilidad de M4N en celulosas modificadas (ejemplo de referencia)

Se preparo una disolucion de 10 ml de HP-p-CD al 50% (p/v) e hidroxipropilmetilcelulosa (“HPMC”) al 0,5% (p/v) para su uso como agente de solubilizacion y/o excipiente tal como sigue: se colocaron 5,9 ml de WFI en un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron lentamente cinco gramos de HP-p-CD al WFI con agitacion, usando una espatula para dirigir la HP-p-CD hacia el centro del vaso de precipitados. Se agito la disolucion de HP-p-CD durante aproximadamente 24 h o hasta que la HP-p-CD se disolvio completamente tras inspeccion visual. La disolucion resultante media aproximadamente 9,4 ml. Se anadieron aproximadamente 0,6 ml de WFI a esta disolucion resultante hasta alcanzar 10 ml, para producir una disolucion de HP-p-CD al 50% (p/v). Se anadieron cincuenta miligramos de HPMC a la disolucion de HP-p-CD al 50% y se agito durante aproximadamente 1 h o hasta que la HPMC se disolvio tras inspeccion visual. Se agito la disolucion final durante aproximadamente 1 h y entonces se almaceno a temperatura ambiente, protegida de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este metodo de preparacion de ciclodextrinas modificadas con celulosas modificadas para obtener el volumen o la concentracion deseados de la disolucion de HP-p-CD/HPMC. Pueden prepararse de manera similar otras disoluciones de ciclodextrina modificada/celulosa modificada, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD por otras ciclodextrinas modificadas, o HPMC por otras celulosas modificadas, en el procedimiento descrito anteriormente.

Se prepararon 10 ml de una disolucion de M4N a una concentracion de aproximadamente 10 mg/ml en HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 10 ml de la disolucion de HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 100 mg de M4N lentamente a la HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula. Se agito la mezcla de M4N/HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% durante 24 h o hasta que todo el M4N se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Se calento la mezcla de M4N/HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% a aproximadamente 90°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 90°C para 500 ml de la mezcla de M4N/HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5%), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla de M4N/HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se almaceno la disolucion de M4N/HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz. Se disolvio M4N en esta formulacion de HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5% a las concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml cuando se calento a 90°C y permanecio en disolucion tras enfriarse, con estabilidad a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas. M4N no se disolvio en la misma formulacion a la concentracion de 50 mg/ml ni siquiera a 90°C.

Puede aumentarse o disminuirse a escala el procedimiento anterior para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otras disoluciones de ciclodextrina/celulosa, tal como, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD en el procedimiento descrito anteriormente por otras ciclodextrinas, o sustituyendo HPMC por otras celulosas modificadas.

Se prepararon 10 ml de una disolucion de etilcelulosa (“EC”) al 5% en etanol (p/v) para su uso como excipiente y/o agente de solubilizacion tal como sigue: se colocaron 10 ml de alcohol etflico (“EtOH”) al 100% en un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion, cubierto por una cubierta de Teflon® redonda. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron lentamente quinientos (500) miligramos de EC al etanol con agitacion, usando una espatula para dirigir el EC al centro del vaso de precipitados para impedir que el polvo de EC se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la disolucion de EC durante aproximadamente 2 h o hasta que el EC se disolvio completamente tras inspeccion visual. Se almaceno la disolucion final a temperatura ambiente, y se protegio de la luz.

Puede aumentarse o disminuirse a escala este metodo de preparacion de disoluciones de celulosa modificada para obtener el volumen o la concentracion deseados. Pueden prepararse de manera similar otras disoluciones de celulosa modificada, por ejemplo, sustituyendo EC por otras celulosas modificadas, en el procedimiento descrito anteriormente.

Se prepararon 10 ml de una disolucion de M4N a una concentracion de aproximadamente 20 mg/ml en EC al 5% (p/v) (la “formulacion de EC”) tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 10 ml de la formulacion de EC al 5%, preparada tal como se describio anteriormente, a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media, y se cubrio con una cubierta de Teflon® redonda. Se anadieron aproximadamente 200 mg de M4N lentamente a la formulacion de EC al 5% en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/EC durante 2 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Se calento la mezcla de M4N/EC a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se

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deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/EC), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla o disolucion de M4N/EC para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se almaceno la disolucion de M4N/EC final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz.

Puede aumentarse o disminuirse a escala el procedimiento anterior para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N y puede aumentarse o disminuirse la temperatura de calentamiento para lograr la disolucion de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otras celulosas modificadas, tal como, por ejemplo, HPMC, MC y CMC. Los resultados de la solubilidad de M4N en las celulosas modificadas se exponen en la tabla 15.

Los resultados muestran que M4N no era soluble en HPMC al 2,3% (p/v) a ninguna de las concentraciones sometidas a prueba o tras el calentamiento hasta 90°C. M4N formo una suspension en HPMC al 1% (p/v) a la concentracion de 10 mg/ml. Esta suspension era estable a temperatura ambiente durante menos de 2 dfas.

En presencia de HP-p-CD (50% en p/v) y HPMC (0,5% en p/v), se solubilizo M4N a 90°C y permanecio en disolucion tras enfriarse a las concentraciones de 1 mg/ml y 10 mg/ml. Estas disoluciones eran estables a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas. M4N no se disolvio en la misma composicion de HP-p-CD (50% en p/v) y HPMC (0,5% en p/v) a la concentracion de 50 mg/ml ni siquiera tras el calentamiento hasta 90°C.

En otro experimento, M4N formo suspensiones en ausencia de calor en la composicion de HP-p-CD (50% en p/v) y HPMC (0,5% en p/v) a todas las concentraciones sometidas a prueba, es decir, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml y 50 mg/ml. Estas suspensiones eran estables a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas.

Los resultados en la tabla 15 tambien muestran que M4N era soluble a 1 mg/ml en la formulacion de EC sin aplicacion de calor, siendo la disolucion estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas. M4N era soluble a la concentracion de 10 mg/ml a 40°C y permanecio en disolucion tras enfriarse, siendo esta disolucion estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas. M4N era soluble en la formulacion de EC a la concentracion de 20 mg/ml a 60°C y permanecio en disolucion tras enfriarse, siendo esta disolucion estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas. M4N a la concentracion de 30 mg/ml era soluble en la formulacion de EC a 60°C, pero no permanecio en disolucion tras enfriarse. Concentraciones mayores de M4N, tales como a los niveles de 50 mg/ml o 100 mg/ml, eran solubles en la formulacion de EC a 90°C, pero no permanecieron en disolucion tras enfriarse.

M4N tambien formo suspensiones en CMC de baja viscosidad al 1% a los niveles de 10 mg/ml y 20 mg/ml. Estas suspensiones eran estables a temperatura ambiente durante menos de 2 dfas.

Tabla 15. Solubilidad de M4N en formulaciones que contienen celulosas modificadas

Excipientes

Concentracion de excipiente (en p/v a menos que se declare lo contrario) Concentracion de farmaco (en mg/ml a menos que se declare lo contrario) Disolucion tras rotacion Disolucion tras calentamiento Disolucion tras enfriamiento Tiempo de estabilidad a temperatura ambiente

HPMC

2,3% 1 N N a 90°C

10 N N a 90°C

50 N N a 90°C

100 N N a 90°C

1% 10 suspension < 2 dfas

HP-p-CD y HPMC

HP-p-CD al 50%, HPMC al 0,5% 1 N S a 90°C S > 7 dfas

10 N S a 90°C S > 7 dfas

50 N N a 90°C

HP-p-CD al 50%, HPMC al 0,5% 1 Suspension > 7 dfas

10 Suspension > 7 dfas

20 Suspension > 7 dfas

50 Suspension > 7 dfas

HP-p-CD al 84%, HPMC al 1%, liofilizado 150 mg/g polvo

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EC

5% en EtOH 1 S > 3 dfas

10 N S a 40°C S > 3 dfas

20 N S a 60°C S > 3 dfas

30 N S a 60°C N

50 N S a 90°C N

100 N S a 90°C N

MC

2% 1 N N a 90°C

(Baja viscosidad)

10 N N a 90°C

CMC

1% 1 N N a 90°C

(Alta viscosidad)

10 N N a 90°C

CMC

4% 1 N N a 90°C

(Baja viscosidad)

10 N N a 90°C

1% 10 suspension < 2 dfas

20 suspension < 2 dfas

Ejemplo 5. Solubilidad de M4N en Kpidos insolubles en agua y en disolventes organicos solubles en agua (ejemplo de referencia)

Se preparo una disolucion de 10 ml de M4N a una concentracion de aproximadamente 50 mg/ml en aceite de sesamo tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 10 ml de aceite de sesamo a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 500 mg de M4N lentamente al aceite de sesamo en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/aceite de sesamo durante aproximadamente 2 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Se calento la mezcla de M4N/aceite de sesamo a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/aceite de sesamo), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla o disolucion de M4N/aceite de sesamo para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Si se formaron cristales, podfa calentarse la disolucion de M4N/aceite de sesamo de nuevo a 60°C durante aproximadamente 1 h, con agitacion, sobre una placa magnetica caliente hasta que todo el M4N se disolvio de nuevo en la disolucion. Se almaceno la disolucion de M4N/aceite de sesamo final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz.

Puede aumentarse o disminuirse a escala el procedimiento anterior para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N y puede aumentarse o disminuirse la temperatura de calentamiento para lograr la disolucion de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otros lfpidos insolubles en agua, tal como, por ejemplo, sustituyendo aceite de sesamo en el procedimiento descrito anteriormente por aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de menta piperita, u otros agentes de solubilizacion, y combinaciones de los mismos. Los resultados se muestran en la tabla 16.

Se preparo una mezcla de 10 g de M4N a una concentracion de aproximadamente 200 mg/g en el 95% de aceite de oliva y el 5% de cera de abejas tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 7,6 ml de aceite de oliva a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 2 g de M4N lentamente al aceite de oliva en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/aceite de oliva durante aproximadamente 2 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Opcionalmente se calento la mezcla de M4N/aceite de oliva a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/aceite de oliva), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla de M4N/aceite de oliva para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Si se formaron cristales, podfa calentarse la disolucion de M4N/aceite de oliva de nuevo a 60°C durante aproximadamente 1 h, con agitacion, sobre una placa magnetica caliente hasta que todo el M4N se disolvio de nuevo en la disolucion. Se anadieron aproximadamente 400 mg de cera de abejas blanca a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Tambien se coloco el vaso de precipitados sobre

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una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se calento la cera de abejas a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba una cantidad mayor), o hasta que toda la cera de abejas se habfa fundido. Entonces se anadio la disolucion de IVUN/aceite de oliva a aproximadamente 400 mg de cera de abejas fundida y se agito y se calento a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 30 min o hasta que toda la mezcla de IVUN/aceite de oliva/cera de abejas se habfa disuelto o se habfa mezclado uniformemente. Se retiro la barra de agitacion del vaso de precipitados y se permitio que se enfriara la mezcla de VUN/aceite de oliva/cera de abejas. Se almaceno la mezcla de VUN/aceite de oliva/cera de abejas final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz.

Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otros lfpidos insolubles en agua, tal como, por ejemplo, sustituyendo aceite de oliva en el procedimiento descrito anteriormente por aceite de mafz, aceite de sesamo, aceite de soja, aceite de menta piperita, lecitina, u otros agentes de solubilizacion, y combinaciones de los mismos, y sustituyendo cera de abejas por parafina, PEG 3350, u otros agentes espesantes, y combinaciones de los mismos. Tambien, si se desea, en combinacion con cualquiera de los portadores, puede incluirse un agente que potencia la biodisponibilidad, tal como eugenol, cinamaldeMdo, lecitina, naringenina, naringina y piperina, por ejemplo. Los resultados se muestran en la tabla 16.

Se prepararon 10 ml de una disolucion de M4N a una concentracion de aproximadamente 60 mg/ml en el 85% de aceite de sesamo y el 15% de Tween® 20 tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 8,5 ml de aceite de sesamo a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 1,5 ml de Tween® 20 lentamente hacia el centro del vaso de precipitados. Se anadieron aproximadamente 600 mg de M4N lentamente a la mezcla de aceite de sesamo/Tween® 20 en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20 durante aproximadamente 2 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Se calento la mezcla de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20 a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20 para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se almaceno la disolucion de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20 final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz. Si se formaron cristales durante el almacenamiento, pudo calentarse de nuevo la disolucion de M4N/aceite de sesamo/Tween® 20 a 60°C, con agitacion, sobre una placa magnetica caliente hasta que todo el M4N se disolvio de nuevo en la disolucion.

Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N y puede aumentarse o disminuirse la temperatura de calentamiento para lograr la disolucion de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otros lfpidos insolubles en agua combinados con tensioactivos no ionicos, tensioactivos ionicos o disolventes organicos solubles en agua, tal como, por ejemplo, sustituyendo aceite de sesamo o Tween® 20 en el procedimiento descrito anteriormente por aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de menta piperita, Tween® 80, TPGS, lecitina, PEG 300, PEG 400, monolaurato de PEG 400, glicerol, PVP, PG u otros agentes de solubilizacion, y combinaciones de los mismos. Los resultados de la solubilidad de M4N en lfpidos insolubles en agua se exponen en la tabla 16.

Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otros lfpidos insolubles en agua combinados con tensioactivos no ionicos, ionicos o anfipaticos o disolventes organicos solubles en agua, tal como, por ejemplo, sustituyendo aceite de sesamo en el procedimiento descrito anteriormente por aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de menta piperita, o aceite mineral y sustituyendo Tween® 20 por Tween® 80, TPGS, lecitina, PEG 300, PEG 400, monolaurato de PEG 400, glicerol, PVP, PG u otros agentes de solubilizacion, y combinaciones de los mismos. Los resultados de la solubilidad de M4N en lfpidos insolubles en agua y la estabilidad de tales composiciones se exponen en la tabla 16. La estabilidad en referencia a las disoluciones lfquidas transparentes en el presente documento se refiere al tiempo que tarda en formarse una precipitacion cristalizada en la disolucion. Una disolucion estable es una que es transparente y esta libre de materiales particulados durante un periodo de tiempo prolongado.

La tabla 16 muestra, por ejemplo, que M4N era soluble en aceite de mafz cuando se calento a 60°C a concentraciones de hasta 100 mg/ml y, excepto al nivel de 100 mg/ml, M4N a concentraciones menores permanecio en disolucion tras enfriarse, siendo las disoluciones estables durante mucho mas de 3 dfas a las concentraciones de 1 y 10 mg/ml, durante menos de 3 dfas a los niveles de 20, 40 y 50 mg/ml y durante menos de 1 dfa al nivel de 60 mg/ml. Ademas, M4N era soluble en aceite de oliva a 60°C al nivel de 30 mg/ml pero no permanecio en disolucion tras enfriarse.

En aceite de sesamo, M4N era soluble a temperatura ambiente al nivel de 10 mg/ml. A 60°C, M4N era soluble hasta la concentracion de 50 mg/ml, y permanecio en disolucion tras enfriarse. Las disoluciones de 10 mg/ml y 20 mg/ml eran estables a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas, la disolucion de 30 mg/ml era estable a temperatura

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ambiente durante menos de 3 dfas, y la disolucion de 50 mg/ml era estable a temperature ambiente durante menos de 1 dfa.

En aceite de menta piperita, M4N era soluble a entre 1 mg/ml y 125 mg/ml. A concentraciones de hasta 20 mg/ml, M4N era soluble sin calentamiento. Estas composiciones eran estables a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas. M4N era soluble a mayores concentraciones, hasta el nivel de 125 mg/ml, tras el calentamiento a 40°C y permanecio en disolucion tras enfriarse. De estas mayores concentraciones de M4N en aceite de menta piperita, la composicion de 40 mg/ml era estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas.

M4N tambien se solubiliza en aceite de soja a concentraciones de hasta 50 mg/ml tras el calentamiento a 60°C. De estas, solo la concentracion de 10 mg/ml permanecio en disolucion tras enfriarse, y esta disolucion permanecio estable durante mas de 7 dfas.

M4N tambien era soluble en aceite mineral cuando se calento a 60°C a concentraciones de hasta 200 mg/ml. Las composiciones de 10 mg/ml y 50 mg/ml permanecieron en disolucion tras enfriarse. De estas, la disolucion de 10 mg/ml era estable durante mas de 7 dfas a temperatura ambiente.

En una combinacion del 50% de aceite de menta piperita y el 50% de PEG 300, M4N era soluble hasta 125 mg/ml cuando se calento a 35°C. Entre los niveles de 40 mg/ml y 60 mg/ml, M4N permanecio en disolucion tras enfriarse y era estable a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas. En una combinacion del 60% de aceite de menta piperita y el 40% de PEG 300, M4N era soluble a 60 mg/ml tras el calentamiento a 40°C y permanecio en disolucion tras enfriarse. Esta composicion era estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas.

Cuando se combino aceite de menta piperita con PEG 400 al 50% cada uno, M4N se solubilizo hasta 125 mg/ml cuando se calento a 40°C. A concentraciones de 40 mg/ml y 60 mg/ml de M4N, el compuesto permanecio en disolucion tras enfriarse y las composiciones eran estables a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas. En una combinacion del 60% de aceite de menta piperita y el 40% de PEG 400, M4N se solubilizo a 60 mg/ml tras el calentamiento a 40°C.

En una combinacion del 50% de aceite de menta piperita y el 50% de Tween® 20, M4N era soluble hasta 125 mg/ml sometido a prueba tras el calentamiento a 40°C. De estas, M4N permanecio en disolucion tras enfriarse a las concentraciones de 40 mg/ml y 60 mg/ml.

En otra combinacion, tal como aceite de menta piperita y aceite de sesamo, cada uno al 50%, M4N era soluble hasta la concentracion de 60 mg/ml sometida a prueba. M4N era soluble a 20 mg/ml a temperatura ambiente, siendo la composicion estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas. Las disoluciones de 40 mg/ml y 60 mg/ml de M4N permanecieron en disolucion tras enfriarse, y eran estables durante mas de 3 dfas a temperatura ambiente.

Aun en otra combinacion, que contiene el 33% de aceite de menta piperita, del 33% de Tween® 20 y el 33% de PEG 400, M4N era soluble a 60 mg/ml cuando se calento a 40°C, y permanecio en disolucion tras enfriarse. Estas composiciones eran estables durante mas de 3 dfas.

La tabla 16 tambien muestra, por ejemplo, que M4N puede solubilizarse en aceite de soja y prepararse dando lugar a un solido cereo cuando se combina con cera de abejas. Ademas, M4N tambien puede solubilizarse en aceite de oliva y puede anadirse cera de abejas para convertir la composicion en un solido cereo.

Tabla 16. Solubilidad de M4N en lfpidos insolubles en agua

Excipientes

Concentracion de excipiente (en v/v a menos que se declare lo contrario) Concentracion de farmaco (en mg/ml a menos que se declare lo contrario) Disolucion tras rotacion Disolucion tras calentamiento Disolucion tras enfriamiento Tiempo de estabilidad a temperatura ambiente

Aceite de mafz

100% 1 N S a 60°C S > 3 dfas

10 N S a 60°C S > 3 dfas

20 N S a 60°C S < 3 dfas

40 N S a 60°C S < 3 dfas

50 N S a 60°C S < 3 dfas

60 N S a 60°C S < 1 dfa

100 N S a 60°C N

Aceite de oliva

100% 30 N S a 60°C N

Aceite de sesamo

100% 10 S > 3 dfas

20 N S a 60°C S > 3 dfas

30 N S a 60°C S < 3 dfas

50 N S a 60°C S < 1 dfa

Aceite de menta piperita

100% 1 S > 3 dfas

10 S > 3 dfas

20 S > 3 dfas

40 N S a 40°C S > 3 dfas

60 N S a 40°C S < 3 dfas

100 N S a 40°C S < 1 dfa

125 N S a 40°C S < 1 dfa

Aceite de soja

100% 10 N S a 60°C S > 7 dfas

30 N S a 60°C N

50 N S a 60°C N

Aceite mineral

100% 10 N S a 60°C S > 7 dfas

50 N S a 60°C S < 1 dfa

100 N S a 60°C N

200 N S a 60°C N

Aceite de oliva, aceite de soja

El 80% de aceite de oliva, el 20% de aceite de soja 60 N S a 70°C N

Aceite de sesamo, Tween® 20 y glicerol

El 75% de aceite de sesamo, el 9% de Tween® 20, el 16% de glicerol 24,3 N S a 60°C S < 7 dfas

El 10% de emulsion de aceite en el 90% de solucion salina 2,4 S <1 dfa

Aceite de sesamo y Tween® 20

El 89% de aceite de sesamo, el 11% de Tween® 20 29 N S a 60°C S > 7 dfas

El 10% de emulsion de aceite en el 90% de solucion salina 2,9 S <3 dfas

El 85% de aceite de sesamo, el 15% de Tween® 20 40 N S a 45°C N

El 85% de aceite de sesamo, el 15% de Tween® 20 60 N S a 55°C N

Aceite de menta piperita, PEG 300

El 50% de aceite de menta piperita, el 50% de PEG 300 40 N S a 35°C S > 7 dfas

60 N S a 35°C S > 7 dfas

125 N S a 35°C N

El 60% de aceite de menta piperita, el 40% de PEG 300 60 N S a 40°C S > 3 dfas

Aceite de menta piperita, PEG 400

El 50% de aceite de menta piperita, el 50% de PEG 400 40 N S a 40°C S > 7 dfas

60 N S a 40°C S > 7 dfas

100 N S a 40C N

125 N S a 40°C N

El 60% de aceite de menta piperita, el 40% de PEG 400 60 N S a 40°C N

Aceite de menta piperita y Tween® 20

El 50% de aceite de menta piperita, el 50% de Tween® 20 40 N S a 40°C S > 3 dfas

60 N S a 40°C S > 3 dfas

125 N S a 40°C N

Aceite de menta piperita, PEG 400, glicerol

El 40% de aceite de menta piperita, el 40% de PEG 400, el 20% de glicerol 52 N S a 40°C N

El 45% de aceite de menta piperita, el 45% de PEG 400, el 10% de glicerol 59 N S a 40°C N

Aceite de menta piperita y aceite de sesamo

El 50% de aceite de menta piperita, el 50% de aceite de sesamo 20 S > 3 dfas

40 N S a 40°C S > 3 dfas

60 N S a 40°C S > 3 dfas

Aceite de menta piperita, Tween® 20, PEG 400

El 33% de aceite de menta piperita, el 33% de Tween® 20, el 33% de PEG 60 N S a 40°C S > 3 dfas

400

Aceite de soja, cera de abejas

El 50% de aceite de soja, el 50% de cera de abejas (p/p) 100 mg/g N S a 60°C solido cereo

El 75% de aceite de soja, el 25% de cera de abejas (p/p) 200 mg/g N S a 60°C solido cereo

El 90% de aceite de soja, el 10% de cera de abejas (p/p) 200 mg/g N S a 60°C solido cereo

El 95% de aceite de soja, el 5% de cera de abejas (p/p) 200 mg/g N S a 60°C solido cereo

Aceite de oliva, cera de abejas

El 90% de aceite de oliva, el 10% de cera de abejas (p/p) 200 mg/g N S a 60°C solido cereo

El 95% de aceite de oliva, el 5% de cera de abejas (p/p) 200 mg/g N S a 60°C solido cereo

Cinamaldehn do, aceite de oliva, cera de abejas

Cinamalde- Mdo al 0,4% (v/v), cera de abejas al 5% (p/v), aceite de oliva al 94,5% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C Solido cremoso

Eugenol, cera de abejas, aceite de oliva

Eugenol al 0,5% (v/v) 100 mg/ml N S a 50°C Solido cremoso

Aceite de Camelia

100% 50 mg/ml N S a 60°C N >7 dfas

100 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

La tabla 17 muestra los resultados obtenidos para la solubilidad de M4N en disolventes organicos solubles en agua EtOH, PG, PEG 300, PEG 400, monolaurato de PEG 400, glicerol, PVP, y determinadas combinaciones de los mismos.

Tabla 17. Solubilidad de M4N en disolventes organicos solubles en agua

Excipientes

Concentracion de excipiente (en v/v a menos que se indique lo contrario) Concentracion de farmaco (en mg/ml) Disolucion tras rotacion Disolucion tras calentamiento Disolucion tras enfriamiento Tiempo de estabilidad a temperatura ambiente

Etanol

100% 1 S > 3 dfas

10 N N a 37°C

PVP

15% (p/v) 1 N N a 90°C

10 N N a 90°C

Propilenglicol

100% (p/v) 1 N S a 55°C S < 1 dfa

10 N S a 55°C S < 1 dfa

20 N S a 55°C S < 1 dfa

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PEG 400

100% 25 N S a 50°C S < 7 dfas

30 N S a 50°C S < 3 dfas

40 N S a 50°C S < 1 dfa

50 N S a 60°C S < 1 dfa

100 N S a 60°C N

5% 10 N N a 50°C

Monolaurato de PEG 400

100% 20 N S a 50°C S > 3 dfas

50 N S a 50°C S < 1 dfa

PEG 300

100% 25 N S a 50°C S < 7 dfas

30 N S a 50°C S < 3 dfas

40 N S a 50°C S < 1 dfa

50 N S a 60°C S < 1 dfa

100 N S a 60°C N

33% 10 N N a 50°C

Glicerol

100% 1 N S a 70°C N

10 N S a 70°C N

20 N S a 70°C N

Propilenglicol y etanol

Propilenglicol al 40% (p/v), etanol al 10% _____(v/v)_____ 10 N N

Ejemplo 6. Solubilidad de M4N en tensioactivos no ionicos (ejemplo de referencia)

Se preparo una disolucion de 10 ml de TPGS al 20% (p/v) para su uso como agente de solubilizacion y/o excipiente tal como sigue: se colocaron 8 ml de WFI en un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica caliente y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se calento el WFI a aproximadamente 95°C durante 5 minutos. Se anadieron dos gramos de TPGS lentamente a otro vaso de precipitados de vidrio, y se calento a aproximadamente 40°C durante 15 minutos, o hasta que todo el TPGS se habfa fundido. Se anadio lentamente el TPGS fundido al WFI casi en ebullicion, usando una espatula para dirigir el TPGS al centro del vaso de precipitados para impedir que cualquier TPGS se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la disolucion de TPGS al 20% durante aproximadamente 24 h o hasta que el TPGS se disolvio completamente tras inspeccion visual. Entonces se almaceno la disolucion final a temperatura ambiente, y se protegio de la luz.

Puede aumentarse o disminuirse a escala este metodo de preparacion de TPGS para obtener el volumen o la concentracion deseados de la disolucion de TPGS. De manera similar pueden prepararse otras disoluciones de TPGS en combinacion con otros tensioactivos no ionicos, tensioactivos ionicos, tensioactivos anfipaticos, disolventes organicos solubles en agua, u otros agentes de solubilizacion en el procedimiento descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 18.

Se preparo una disolucion de 10 ml de M4N a una concentracion de aproximadamente 60 mg/ml en Tween® 20 tal como sigue. Se anadieron aproximadamente 10 ml de Tween® 20 a un vaso de precipitados de vidrio que contema una barra de agitacion. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se anadieron aproximadamente 600 mg de M4N lentamente al Tween® 20 en el centro del vaso de precipitados con la ayuda de una espatula para impedir que el M4N se pegara a las paredes del vaso de precipitados. Se agito la mezcla de M4N/Tween® 20 durante 2 h o hasta que todo el M4N se habfa disuelto o se habfa suspendido uniformemente sin ningun grumo presente. Se calento la mezcla de M4N/Tween® 20 a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 min (o mas tiempo si se deseaba un volumen de disolucion mayor, por ejemplo, 1 h a 60°C para 500 ml de la mezcla de M4N/Tween® 20), o mas tiempo segun sea necesario para garantizar la disolucion completa de M4N. Se observo la mezcla o disolucion de M4N/Tween® 20 para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se almaceno la disolucion de M4N/Tween® 20 final a temperatura ambiente y se mantuvo protegida de la luz. Si se iban a formar cristales, podfa calentarse la disolucion de M4N/Tween® 20 de nuevo a 60°C durante aproximadamente 1 h, con agitacion, sobre una placa magnetica caliente o hasta que todo el M4N se habfa disuelto de nuevo en la disolucion.

Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N y puede aumentarse o disminuirse la temperatura de calentamiento para lograr la disolucion de M4N.

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Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N en otro tensioactivo no ionico, tensioactivos ionicos o moleculas anfffilas, tal como, por ejemplo, sustituyendo Tween® 20 en el procedimiento descrito anteriormente por Tween® 80, otros agentes de solubilizacion y combinaciones de los mismos. Los resultados de la solubilidad de M4N en Tween® 20, Tween® 80 y una combinacion de Tween® 20 y PEG 400 se muestran en la tabla 18.

La tabla 18 muestra que M4N era soluble en Tween® 20 o Tween® 80 a una concentracion de 1 mg/ml a temperatura ambiente. La disolucion de M4N en Tween® 20 (“M4N/Tween® 20”) era estable a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas, mientras que la disolucion de M4N en Tween® 80 (“M4N/Tween® 80”) era estable durante mas de 3 dfas de observacion. Concentraciones mayores de M4N eran solubles en Tween® 20 o Tween® 80 a 50°C. Ademas, M4N permanecio en disolucion tras enfriar a concentraciones de hasta 60 mg/ml en Tween® 20 o hasta 50 mg/ml en Tween® 80, mientras que se volvfa insoluble tras enfriar a los niveles de 80 mg/ml y 100 mg/ml en Tween® 20. Se observo que las disoluciones de M4N/Tween® 20 de 10 mg/ml y 20 mg/ml eran estables a temperatura ambiente durante mas de 7 dfas. Se observo que las disoluciones de M4N/Tween® 20 de 40 mg/ml y 80 mg/ml eran estables a temperatura ambiente durante menos de 3 dfas. Para las disoluciones de M4N/Tween® 80, se observo que la disolucion de 10 mg/ml era estable a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas mientras que la disolucion de 50 mg/ml era estable a temperatura ambiente durante menos de 1 dfa.

Los resultados tambien muestran que M4N era soluble en una combinacion del 50% de Tween® 20 y el 50% de PEG 400, hasta una concentracion de 60 mg/ml de M4N sometida a prueba cuando se calento a 65°C. M4N permanecio en disolucion en estas formulaciones tras enfriarse, siendo las disoluciones estables a temperatura ambiente durante mas de 3 dfas.

Se sometieron a prueba combinaciones de PEG 400 y Tween® 20 a diversas temperaturas de calentamiento, a la cantidad de tiempo que se le anadio calor, el metodo y tiempo de enfriamiento y la concentracion de farmaco anadido.

Se preparo una disolucion de 10 ml empezando con 10 ml de monooleato de glicerol (“glimo”) anadido a un vaso de precipitados de vidrio. Se coloco el vaso de precipitados sobre una placa magnetica y se ajusto la barra de agitacion para agitar a velocidad media. Se calento hasta 60°C durante 30 minutos para permitir que todo el farmaco se disolviera. Se observo la mezcla para determinar la presencia de cualquier M4N no disuelto sosteniendo el vaso de precipitados contra un fondo blanco seguido por un fondo oscuro, buscando la presencia de materiales particulados. Se enfrio la mezcla de glimo hasta temperatura ambiente con calentamiento y la mezcla se convirtio en una suspension. Se almaceno a temperatura ambiente, protegida de la luz. La suspension permanecio estable durante dos semanas y entonces comenzo a separarse. Puede recombinarse con agitacion.

Tabla 18. Solubilidad de M4N en tensioactivos no ionicos

Excipientes

Concentracion de excipiente Concentracion de farmaco (en mg/ml a menos que se declare lo contrario) Disolucion tras rotacion Disolucion tras calentamiento Disolucion tras enfriamiento Estabilidad a temperatura ambiente

TPGS

20% (p/v) 1 N S a 30°C Cremoso

10 N S a 60°C Cremoso

125 N S a 60°C Cremoso

200 N S a 60°C Cremoso

20% (p/v) 60 Suspension > 3 dfas

100 Suspension > 3 dfas

Tween® 20

100% (v/v) 1 S > 7 dfas

10 N S a 50°C S > 7 dfas

20 N S a 50°C S > 7 dfas

40 N S a 50°C S < 3 dfas

60 N S a 50°C S < 3 dfas

80 N S a 50°C N

100 N S a 50°C N

Tween® 80

100% (v/v) 1 S > 3 dfas

10 N S a 50°C S > 3 dfas

50 N S a 50°C S < 1 dfa

Tween® 20, PEG 400

Tween® 20 al 50% (v/v), PEG 30 N S a 65°C S > 3 dfas

400 al 50% (v/v)

40 N S a 65°C S > 3 dfas

50 N S a 65°C S > 3 dfas

60 N S a 65°C S > 3 dfas

Tween® 20, PEG 400, cera de abejas

Tween® 20 al 47,5% (v/v), PEG 400 al 47,5% (v/v), cera de abejas al 5% (p/v) 200 mg/g N S a 65°C Solido cereo > 3 dfas

TPGS. PEG 400

TPGS al 10% (p/v), PEG 400 al 50% (v/v) 50 suspension > 7 dfas

PEG 400, Tween® 20, cinamal- dehndo

Cinamaldehndo al 0,4% (v/v), PEG 400 al 49,8%(v/v), Tween® 20 al 49,8% (v/v) 60 mg/ml N S a 60°C S >4 dfas

Tween® 20, PEG 400, eugenol

Eugenol al 0,4% (v/v), Tween® 20 al 49,8% (v/v), PEG 400 al 49,8% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C S >2 dfas

Tween® 20, PEG 400, naringina

Naringina al 0,4% (v/v), PEG 400 al 49,8% (v/v), Tween® 20 al 49,8% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C Suspension

120 mg/ml N S a 50°C Suspension

200 mg/ml N S a 50°C Suspension

300 mg/ml N S a 50°C Suspension

PEG 400, Tween® 20, lecitina

Lecitina al 25% (p/v), PEG 400 al 37,5% (v/v), Tween® 20 al 37,5% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C S > 14 dfas

PEG 400, Tween® 20, monoes- tearato de glicerol

Monoestearato de glicerol al 3% (p/v), PEG 400 al 48,5% (v/v), Tween® 20 al 48,5% (v/v) 60 mg/ml N S a 80°C S >24 horas

PEG 400, Tween® 20, naringenina

Naringenina al 0,3% (p/v), PEG 400 al 49,8% (v/v), Tween® 20 al 49,8% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C Solido cremoso

PEG 400, Tween® 20, aceite de menta piperita, cinamalde- hndo

Cinamaldehndo al 0,4% (v/v), aceite de menta piperita al 4,6% (v/v), PEG 400 al 47,5% (v/v), Tween® 20 al 47,5% (v/v) 60 mg/ml N S a 60°C S >2 dfas

PEG 400, Tween® 20, aceite de menta piperita

Aceite de menta piperita al 5% (v/v), Tween® 20 al 47,5% (v/v), PEG 400 60 mg/ml N S a 80°C S >2 dfas

al 47,5% (v/v)

PEG 400, Tween® 20, piperina

Piperina al 0,3% (v/v), PEG 400 al 49,8%(v/v), Tween® 20 al 49,8% (v/v) 60 mg/ml N S a 55°C Suspension >9 dfas

Tween® 20, PEG 400, cera de abejas

Tween® 20 al 47,5% (v/v), PEG 400 al 47,5% (v/v), cera de abejas al 5% (p/v) 200 mg/g N S a 65°C Solido cereo > 3 dfas

Tween® 20, PEG 400, PEG 3350, cera de abejas

Tween® 20 al 47,5% (v/v), PEG 400 al 47,5% (v/v), cera de abejas al 2,5% (p/v), PEG 3350 al 2,5% (p/v) 60 mg/ml N S a 65°C S >4 dfas

Tween® 20, PEG 400, PEG 3350, cera de abejas, naringenina

Tween® 20 al 50,3% (v/v), PEG 400 al 44,6% (v/v), cera de abejas al 2,4% (p/v), PEG 3350 al 2,4% (p/v), naringenina al 0,3% (p/v) 60 mg/ml N S a 65°C S >4 dfas

Tween® 20, PEG 400, PEG 3350, cera de abejas, lecitina

Tween® 20 al 50% (v/v), PEG 400 al 40% (v/v), lecitina al 5% (p/v), PEG 3350 al 2,5% (p/v), cera de abejas al 2,5% (p/v) 60 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

TPGS, PEG 400

TPGS al 10% (p/v), PEG 400 al 50% (v/v) 50 suspension > 7 dfas

Monooleato de glicerol

100% (p/v) 0,10 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

0,25 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

1,00 N S a 60°C Suspension Permanece en

suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

5,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

10,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

12,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

15,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

17,5 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

20,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

25,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante

hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

30,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

40,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

50,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

60,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

65,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

70,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

80,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede

volver a mezclarse entre sf

100,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

200,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

300,0 N S a 60°C Suspension Permanece en suspension durante hasta 10 dfas. Puede volver a mezclarse entre sf

PEG 400, Tween® 20, monooleato de glicerol

PEG 400 al 25% (v/v), Tween® 20 al 25% (v/v), monooleato de glicerol al 50% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C N-separada en 2 fases separadas

PEG 400 al 30% (v/v), Tween® 20 al 30% (v/v), monooleato de glicerol al 40% (v/v) 60 mg/ml N S a 50°C N-separada en 2 fases separadas

Mono- estearato de glicerol

Disolucion en agua al 15% (p/v) 60 mg/ml N N

Gelucire® 44/14

100% 60 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

200 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

300 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

Labrasol®

100% 50 mg/ml N S a 60°C S > 4 dfas

60 mg/ml N S a 60°C S > 4 dfas

70 mg/ml N S a 60°C S > 4 dfas

80 mg/ml N S a 60°C S > 4 dfas

90 mg/ml N S a 60°C suspension

100 mg/ml N S a 60°C suspension

200 mg/ml N S a 60°C suspension

Labrafil®

100% 60 mg/ml N S a 60°C S > 4 dfas

200 mg/ml N S a 60°C Solido cremoso

Ejemplo 7. (Ejemplo de referencia)

Se determino el punto de fusion del Tween® 20 al 47,5% (v/v), PEG 400 al 47,5% (v/v), PEG 3350 al 2,5% (p/v),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

cera de abejas al 2,5% (p/v) del ejemplo 6 (vease la tabla 18) para varias concentraciones diferentes de M4N, tal como sigue:

Concentracion de M4N

Temperatura de fusion

0%

47,5°C

5%

47,5°C

10%

48°C

20%

55°C

30%

55°C

40%

62°C

50%

62°C

Ejemplo 8. Formulaciones liofilizadas que contienen M4N en HP-p-CD (ejemplo de referencia)

Se prepararon 120 mg de polvo liofilizado de M4N a una concentracion de aproximadamente 185 mg/g (p/p) en HP- P-CD tal como sigue. Se usaron cantidades molares iguales de HP-p-CD y M4N para aumentar la tasa de complejacion entre HP-p-CD y M4N. Se mezclaron aproximadamente 98 mg de HP-p-CD y aproximadamente 22,2 mg de M4N entre sf en un tubo de polipropileno de 1,5 ml de tamano. Se anadieron aproximadamente 0,2 ml de WFI a la mezcla en el tubo de polipropileno que contema la mezcla de polvo de HP-P-CD/M4N y se agito con vortex durante 1 minuto para producir una suspension de HP-P-CD/M4N en agua. Se congelo la suspension de HP-p- CD/M4N a -20°C durante 24 horas. Entonces se centrifugo la suspension de HP-p-CD/VUN a 1.400 rpm a vado a 60°C durante aproximadamente 2 horas para eliminar todo el agua de la suspension. El polvo seco del complejo de HP-p-CD/M4N pesaba aproximadamente 120 mg. Entonces puede disolverse o resuspenderse este complejo de polvo de HP-p-CD/M4N en agua u otros agentes de solubilizacion. Se almaceno el complejo de polvo de M4N/HP-p- CD final a temperatura ambiente y se mantuvo protegido de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N con otras ciclodextrinas, tal como, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD en el procedimiento descrito anteriormente por otras ciclodextrinas. Los resultados mostrados en la tabla 1 muestran que se obtuvo un complejo de polvo de HP-p-CD/VUN tras la liofilizacion de la suspension de HP-p-CD/VUN que consiste aproximadamente en el 81,5% de HP-p-CD y el 18,5% de M4N.

Se prepararon 400 mg de polvo liofilizado de M4N a una concentracion de aproximadamente 150 mg/g (p/p) en HP- p-CD/HPMC tal como sigue. Se anadio aproximadamente 1 ml de una disolucion de HP-p-CD al 50%/HPMC al 0,5%, preparada tal como se describio anteriormente, a un tubo de polipropileno de 1,5 ml de tamano. Se anadieron aproximadamente 60 mg de M4N al tubo de polipropileno que contema la suspension de HP-p-CD/HPMC y se agito con vortex durante 1 minuto para producir una suspension de HP-p-CD/HPMC/M4N. Se congelo la suspension de HP-p-CD/HPMC/M4N a -20°C durante 24 horas. Entonces se centrifugo la suspension de HP-p-CD/HPMC/M4N a 1.400 rpm a vacfo a 60°C durante aproximadamente 5 horas para eliminar todo el agua de la suspension. El polvo seco del complejo de HP-p-CD/HPMC/M4N pesaba aproximadamente 400 mg. Entonces puede disolverse o resuspenderse este complejo de polvo de HP-p-CD/HPMC/M4N en agua u otros agentes de solubilizacion. Se almaceno el complejo de polvo de M4N/HPMC/HP-p-CD final a temperatura ambiente y se mantuvo protegido de la luz. Puede aumentarse o disminuirse a escala este procedimiento para obtener el volumen o la concentracion requeridos de M4N. Pueden prepararse de manera similar formulaciones que contienen M4N con otras disoluciones de ciclodextrina/celulosa, tal como, por ejemplo, sustituyendo HP-p-CD en el procedimiento descrito anteriormente por otras ciclodextrinas, o sustituyendo HPMC por otras celulosas modificadas. Los resultados mostrados en la tabla 15 muestran que se obtuvo un complejo de polvo de HP-p-CD/HPMC/M4N tras la liofilizacion de la suspension de HP-p-CD/HPMC/M4N que consiste aproximadamente en el 84% de HP-p-CD, el 1% de HPMC y el 15% de M4N.

Ejemplo 9. Absorcion de M4N en ratas Sprague-Dawley tras la administracion oral de una formulacion lfquida (ejemplo de referencia)

Se expusieron diez grupos de ratas macho (n = 5 por grupo) (edad = 8-10 semanas) mediante sonda nasogastrica a una unica dosis de 500 mg/kg de M4N en excipiente para determinar el excipiente lfquido oral optimo. Los animales ayunaron durante la noche antes de la dosificacion. Los excipientes/la formulacion sometidos a prueba fueron: (a) HP-p-CD + HPMC; (b) HP-p-CD + CMC; (c) TPGS; (d) TPGS + PEG 400; (e) Tween® 20; (f) PEG 400 + Tween® 20; (g) PEG 400 + Tween® 20 + aceite de menta piperita; (h) aceite de menta piperita + PEG 400; (i) aceite de menta piperita + Tween® 20; (j) aceite de menta piperita + aceite de sesamo, tal como se muestra en la tabla 19, usando las formulaciones preparadas tal como se describio anteriormente. Se recogio sangre de cada animal por la vena yugular a los siguientes puntos de tiempo: antes de la dosis, 0,5, 1,2 y 3 h tras la dosificacion. Se determinaron las concentraciones de M4N en suero mediante CL/EM/EM, CL significa cromatograffa de lfquidos, EM significa espectrometna de masas. Este metodo analiza el M4N que se ha separado mediante CL, entonces se detecta y cuantifica mediante dos ciclos de EM consecutivos.

Tal como se muestra en la figura 3 y tabla 20, la absorcion de M4N vario entre las formulaciones de excipiente. La absorcion era la mas alta para PEG 400 + Tween® 20, que era mayor que PEG 400 + Tween® 20 + aceite de menta

piperita, que era mayor que aceite de menta piperita + Tween® 20, que era mayor que aceite de menta piperita + pEg 400, que era mayor que aceite de menta piperita + aceite de sesamo, que era mayor que o igual a Tween® 20, que era mayor que o igual a HP-p-CD + CMC, que era mayor que HP-p-CD + HPMC, que era mayor que TPGS, que era mayor que TPGS + PEG 400.

5 En la tabla 20, se indicaron cuatro formulaciones como suspensiones estables: HP-p-CD + HPMC, HP-p-CD + CMC, TPGS y TPGS + PEG 400. El criterio usado para designar a las suspensiones como “estables” era que las suspensiones no mostraron precipitacion de su contenido (los componentes no se sedimentaron en el fondo del vaso de precipitados de la suspension). Las otras formulaciones en el estudio con ratas eran disoluciones lfquidas transparentes, no suspensiones, y no teman ningun componente flotante.

10 Tabla 19. Formulaciones orales para estudios de absorcion

GRUPO

DESCRIPCION DEL ARTiCULO CONCENTRACION DE M4N

Estudio de excipientes con ratas

HP-p-CD 500 mg/ml,

1

HPMC 5 mg/ml 60 mg/ml*

HP-p-CD 500 mg/ml,

2

CMC 5 mg/ml 60 mg/ml*

3

TPGS 200 mg/ml 60 mg/ml*

TPGS 100 mg/ml

4

PEG 400 al 50% (v/v) 60 mg/ml*

5

Tween® 20 al 100% (v/v) 60 mg/ml

6

PEG 400 al 50% (v/v), Tween® 20 al 50% (v/v) 60 mg/ml

7

PEG 400 al 33% (v/v), Tween® 20 al 33% (v/v), aceite de menta piperita al 33% (v/v) 60 mg/ml

8

Aceite de menta piperita al 50% (v/v), PEG 400 al 50% (v/v) 60 mg/ml

9

Aceite de menta piperita al 50% (v/v), Tween® 20 al 50% (v/v) 60 mg/ml

10

Aceite de menta piperita al 50% (v/v), aceite de sesamo al 50% (v/v) 60 mg/ml

*Suspensiones estables

GRUPO

DESCRIPCION DEL ARTICULO CONCENTRACION DE M4N

Estudio de excipientes con perros

1

M4N polvo

2

HP-p-CD liofilizada 185 mg/g (p/p)

3

TPGS al 20% (p/v) 133 mg/g (p/p)

4

Aceite de soja al 95% (v/v), cera de abejas al 5% (p/v) 200 mg/g (p/p)

5

Aceite de oliva al 95% (v/v), cera de abejas al 5% (p/v) 200 mg/g (p/p)

Tabla 20. Absorcion de M4N en ratasa tras la administracion oral

Concentracion (ng/ml)

Excipiente/Formulacion

0,5 horas 1 hora 2 horas 3 horas

HP-p-CD + HPMC

238±39b 398±89 305±48 482±128

UP-p-CD + CMC

403±116 601±125 470±96 448±94

TPGS

127±45 222±57 216±57 156±36

TPGS + PEG 400

87±14 120±17 77±13 130±45

Tween® 20

424±138 620±211 581±149 371±61

PEG 400 + Tween® 20

1033±287 1300±425 1371±429 1598±379

PEG 400 + Tween®20 + aceite de menta piperita

557±169 1023±335 1404±719 977±546

Aceite de menta piperita + PEG 400

896±228 876±156 832±239 487±133

Aceite de menta piperita + Tween® 20

851±346 502±96 1017±683 1233±722

Aceite de menta piperita + aceite de sesamo

445±193 496±137 657±143 655±264

a n = 5 machos/grupo

b los valores se expresan como medias ± errores estandar

Ejemplo 10. Absorcion de M4N en perros Beagle tras la administracion oral (ejemplo de referencia)

Se expusieron cinco grupos de perros (n = 2 por grupo, un macho y una hembra) (edad = aproximadamente 6 - 9

meses) a una unica dosis de 100 mg/kg de M4N en excipiente para determinar el excipiente solido oral optimo. La composicion de M4N en excipiente se encapsulo en capsulas de gelatina duras de tamano 12 antes de la administracion oral. Los animales ayunaron durante la noche antes de la dosificacion. Los excipientes/formulaciones sometidos a prueba se exponen en la tabla 19 y eran: (a) sin excipiente, en el que se encapsulo M4N; (b) HP-p-CD; 5 (c) TPGS; (d) aceite de soja + cera de abejas; y (e) aceite de oliva + cera de abejas. Se recogio sangre de cada

animal por la vena yugular a los siguientes puntos de tiempo: antes de la dosis, 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h y 8 h tras la dosificacion. Se determinaron las concentraciones de M4N en suero mediante cromatograffa de lfquidos combinada con espectroscopfa de masas en tandem (CL/EM/EM).

Tal como se muestra en la figura 4, la absorcion de M4N vario dependiendo del excipiente/formulacion. La absorcion 10 era la mas alta para la formulacion que contema aceite de oliva + cera de abejas, que era mayor que la que contema HP-p-CD, que era mayor que la que contema TPGS, que era mayor que la que contema aceite de soja + cera de abejas, que era mayor que M4N sin excipiente.

Aunque los ejemplos anteriores se ilustran con M4N.

Ejemplo 11. Recogida de muestras para la determinacion de la farmacocinetica de M4N micronizado y no 15 micronizado tras la administracion oral a perros (ejemplo de referencia)

El objetivo de este estudio era evaluar el perfil farmacocinetico de M4N cuando se administra en forma micronizada o no micronizada mediante dosificacion por sonda nasogastrica en perros Beagle. Se prepararon los artfculos de prueba en monooleato de glicerol a 60 mg/ml. El diseno del estudio se resume en la tabla 21.

Tabla 21. Diseno de estudio para pruebas de M4N no micronizado y micronizado en perros

Grupo/fase

Numero de animales Artfculo de prueba Via de la dosis Nivel de dosis objetivo (mg/kg) Concentracion de dosis objetivo (mg/ml) Volumen de dosis objetivo (ml/kg)

1/1

3 M, 3 F M4N no micronizado Oral 100 60 1,67

1/2

3 M, 3 F M4N micronizado Oral 100 60 1,67

M Macho

H Hembra

Nota: Hubo un periodo de lavado de aproximadamente 7 dfas entre las fases.

20 Se recogio sangre (aproximadamente 2 ml) de una vena yugular en tubos de parte superior roja Monoject de 2 ml que no conteman anticoagulante antes de la dosis y a 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 36 h tras la dosis.

La absorcion de M4N se produjo tras la administracion de ambas formulaciones. Los parametros farmacocineticos medios se presentan en la tabla 22, en la que Cmax es la concentracion maxima de M4N absorbida y AUC representa las areas bajo la curva, en relacion con el M4N total absorbido. La absorcion era mayor tras la administracion de M4N 25 micronizado en comparacion con M4N no micronizado. Sin embargo las curvas de concentracion tendfan a ser mas constantes entre animales tras la administracion de M4N no micronizado (figuras 5A y 5B, escalas no logantmica y logantmica, respectivamente, que muestran la absorcion de M4N no micronizado; y las figuras 6A y 6B, escalas no logantmica y logantmica, respectivamente, que muestran la absorcion de M4N micronizado).

Tabla 22. Parametros farmacocineticos medios tras la administracion de M4N

EM-1421 no micronizado EM-1421 micronizado

Cmax(ng/ml)

3051 4574

Desviacion estandar

380 2088

% de CV

12,5 45,8

Tmax (h)

3,3 3,7

Desviacion estandar

1,0 0,8

% de CV

31,0 22,3

AUC0-36 h (ng*h/ml)

31470 37773

Desviacion estandar

5607 9920

% de CV

17,8 26,3

AUCinfinito

32572 40113

Desviacion estandar

5683 8809

% de CV

17,4 22,0

30 Ejemplo 11. Comparacion de farmacocinetica oral con alimentacion/en ayunas i.v./oral de dos formulaciones de M4N en perros Beagle

El fin de este estudio era evaluar los niveles en suero logrados tras una unica dosis de 75 mg/kg de M4N preformulado administrado por via oral (mediante sonda nasogastrica o capsula) en estados de alimentacion o en ayunas o administracion i.v. Se administro EM-1421 en monooleato de glicerol (“glimo”), M4N en Tween® 20/PEG 400/naringina (“TPN”), o M4N en hidroxipropil-p-ciclodextrina (HPpCD) al 20% en PEG 300 (“CPE”) al 50% a tres 5 perros/sexo. Tambien se administraron glimo y TPN sin concentrar (60 mg/ml) o concentrado (300 mg/g, p/p), tal como se indica en las leyendas de las figuras 7B y 8B.

Todos los animales sobrevivieron a lo largo del estudio. Las observaciones clmicas incluyeron diarrea, emesis y ataxia (se produjo ataxia en 1 hembra tras dosificacion i.v. y duro aproximadamente 1 hora).

Los niveles en suero de M4N variaron ampliamente con la formulacion y el estado. La tabla 23 resume estos 10 hallazgos. Los niveles en suero eran los mas bajos tras la administracion con TPN o glimo concentrado. Cmax era la mas alta tras la administracion de TPN (sin concentrar, estado de ayuno) (tabla 23 y las figuras 7A y 8A, escalas no logantmicas que muestran los niveles en suero de M4N administrado por via oral a perros macho y hembra, respectivamente). Las AUC eran las mas altas tras la administracion de glimo (sin concentrar, estado de ayuno) (tabla 23 y las figuras 7B y 8B, escalas logantmicas que muestran los niveles en suero de M4N administrado por via 15 oral a perros macho y hembra, respectivamente). Las AUC logradas tras la administracion oral de glimo (sin concentrar, estado de ayuno) eran del 35% (machos) y el 47% (hembras) de las AUC logradas tras la dosificacion i.v., en donde se supone que la dosificacion i.v. es el 100% (tabla 23).

Tabla 23. Farmacocinetica de M4N formulado en perros tras una unica dosis de 75 mg/kg

Formulacion

Administracion Estado Sexo Cmax (ng/ml) AUC (ng*h/ml)

CPE

i.v. Con alimentacion M 37671 134103

CPE

i.v. Con alimentacion F 40580 137547

TPN

Oral (sonda nasogastrica) En ayunas M 6256 20792

TPN

Oral (sonda nasogastrica) En ayunas F 8221 41975

TPN

Oral (sonda nasogastrica) Con alimentacion M 5712 37722

TPN

Oral (sonda nasogastrica) Con alimentacion F 3144 22758

Glimo

Oral (sonda nasogastrica) En ayunas M 5157 46938

Glimo

Oral (sonda nasogastrica) En ayunas F 5439 64362

Glimo

Oral (sonda nasogastrica) Con alimentacion M 2807 24367

Glimo

Oral (sonda nasogastrica) Con alimentacion F 5300 57168

TPN - Conc.

Oral (capsula) En ayunas M 890 7070

TPN - Conc.

Oral (capsula) En ayunas F 695 9635

TPN - Conc.

Oral (capsula) Con alimentacion M 1232 9559

TPN - Conc.

Oral (capsula) Con alimentacion F 638 5924

Glimo - Conc.

Oral (capsula) En ayunas M 1020 5092

Glimo - Conc.

Oral (capsula) En ayunas F 1001 13185

Glimo - Conc.

Oral (capsula) Con alimentacion M 1851 12890

Glimo - Conc.

Oral (capsula) Con alimentacion F 817 10074

Ejemplo 12. Estudio farmacocinetico de dosis repetida oral (sonda nasogastrica) de M4N en ratas (ejemplo de 20 referencia)

El fin de este estudio era proporcionar informacion sobre la farmacocinetica de una dosis de 500 mg/kg de M4N en diez formulaciones de excipiente diferentes. Se asignaron cincuenta ratas macho y hembra Crl:(CD)SD a diez grupos de dosificacion, cinco ratas por sexo por grupo. Se prepararon muestras que teman portadores tal como sigue que se administraron a los siguientes grupos de sujetos:

Grupo I

PEG 400/Tween® 20

Grupo II

PEG 400/Tween20®/naringina

Grupo III

PEG 400/Tween20®/naringenina

Grupo IV

PEG 400/Tween20®/monoestearato de glicerilo

Grupo V

Monooleato de glicerol

Grupo VI

PEG 400/Tween20®/piperina

Grupo VII

PEG 400/Tween20®/PEG3350/cera de abejas/naringina

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Grupo VI11

PEG 400/Tween20®/cinamaldelmdo

Grupo IX

PEG 400/Tween20®/aceite de menta piperita

Grupo X

PEG 400/Tween20®/PEG3350/cera de abeias

Cada formulacion de M4N se administro por v^a oral mediante sonda nasogastrica en tres ocasiones. La concentracion del M4N era de 60 mg/ml administrado a un volumen de dosificacion de 8,33 ml/kg, basandose en el peso corporal mas reciente. Se les dio a las ratas la primera dosis (dfa 1 de estudio) tras haber ayunado durante la noche seguido por un periodo de lavado de 72 horas (recuperacion). El dfa 5 del estudio (DS 5), se administro la segunda dosis de artmulo de prueba a ratas sin ayuno seguido por un periodo de lavado de una semana (recuperacion). El DS 6, se sometieron las ratas a una dieta alta en grasas (aproximadamente el 10% de contenido en grasa frente a aproximadamente el 5% en una dieta convencional). El DS 12, se administro la tercera dosis a las ratas que no ayunaron. Se observaron las ratas para evaluar la viabilidad al menos dos veces al dfa y para observaciones clmicas y aspecto general semanalmente durante el periodo de aclimatacion. Tambien se examinaron las ratas para observaciones clmicas, muertes antes de la dosificacion y a intervalos aproximadamente de hora en hora durante las primeras cuatro horas tras la dosificacion y al final del dfa laboral normal en el primer dfa de administracion de la dosificacion, y a aproximadamente 2 horas en dfas posteriores de administracion de la dosificacion. Tambien se registraron estas observaciones una vez al dfa en dfas sin dosificacion y durante el periodo tras la dosificacion. Se registraron los pesos corporales al menos semanalmente durante el periodo de aclimatacion, a diario durante la dosificacion y el peso final en el sacrificio. Se registraron los valores de consumo de alimento semanalmente durante el periodo de dosificacion y en el sacrificio (valor de alimento dejado). En los dfas 1, 5 y 12 del estudio, se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 0,5 ml cada una) por la vena lateral de la cola de cada rata asignada al estudio. Se registro el tiempo de cada recogida de sangre en los datos sin procesar. Se recogieron muestras de sangre de cada rata en los dfas 1, 5, y 12 del estudio a los siguientes puntos de tiempo: antes de la dosificacion, 15 minutos tras la dosificacion, y 1 y 4 horas tras la dosificacion. Se transfirieron las muestras a tubos separadores de suero y se centrifugaron en una centnfuga. Se transfirio el suero resultante a tubos de polipropileno marcados con el numero de protocolo, numero de estudio del promotor, numero de rata, numero de grupo, nivel de dosificacion, dfa de estudio, intervalo de recogida, fecha de recogida, especie, generacion y condiciones de almacenamiento. Todas las muestras se congelaron inmediatamente sobre hielo seco y se mantuvieron congeladas (de -68°C a -78°C) hasta el envfo para su analisis.

Todas las ratas sobrevivieron hasta su sacrificio programado. Se produjo una mancha de orina en el pelaje abdominal en cuatro de las cinco ratas hembra a las que se administro PEG 400/Tween® 20/aceite de menta piperita (grupo IX). Este signo se produjo en los DS 2 a 3 y no persistio. Heces blandas o lfquidas fue la unica observacion clmica que se produjo en al menos unas pocas ratas en cada grupo con la excepcion de ratas con PEG 400/Tween® 20/aceite de menta piperita (grupo IX). Todos los grupos teman ganancias de peso promedio durante el estudio. Las ganancias de peso para las ratas macho y hembra para los DS 6 a 13 cuando se alimentaron con las dietas altas en grasas siempre fueron menores que para los DS 1 a 6 cuando se alimentaron con la dieta convencional. Las ganancias de peso generalmente eran comparables entre los grupos con la excepcion de las ratas hembra en los DS 6 a 13 en los grupos de dosificacion de PEG 400/Tween® 20 y PEG 400/Tween® 20/PEG 3350/cera de abejas (grupos I y X, respectivamente) que teman ganancias de peso corporal reducidas. Los valores de consumo de alimento absoluto y relativo eran comparables entre los grupos a lo largo del estudio. No se observaron lesiones macroscopicas relacionadas con las formulaciones de artmulo de prueba en la necropsia. Se produjo la absorcion de M4N de todos los vehmulos. Los niveles en sangre de ratas con una dieta alta en grasas siempre eran mayores que los logrados con una dieta habitual o tras ayunar. La mayor absorcion se produjo en el grupo de PEG 400/Tween® 20/naringina tras la administracion de una dieta alta en grasas. La mayor absorcion se produjo en el grupo de PEG 400/Tween® 20/naringenina tras la administracion de una dieta convencional. La mayor absorcion se produjo en el grupo de PEG 400/Tween® 20/aceite de menta piperita tras un estado de ayuno. Los mayores niveles de exposicion se lograron generalmente en el plazo de una hora tras la dosis, excepto para la formulacion de monooleato de glicerol, que parecio que continuaba aumentando a las cuatro horas tras la dosis.

En conclusion, todas las formulaciones de artmulo de prueba se toleraron sin mortalidad y todos los grupos ganaron peso. Heces blandas y lfquidas fueron la observacion clmica mas comun pero no se produjo ningun efecto sobre el consumo de alimento para ningun vehmulo. Los niveles en sangre de M4N siempre fueron mayores cuando las ratas se alimentaron con la dieta alta en grasas. La exposicion pico se produjo en el plazo de una hora tras la dosificacion con la excepcion de la formulacion de monooleato de glicerol.

Ejemplo 13. Un estudio farmacocinetico de microdosis cruzado de tres vfas en seres humanos de fase 0 de M4N marcado con 14C en ocho sujetos masculinos sanos

Se diseno este estudio para evaluar la absorcion de M4N cuando se administro a seres humanos como dosis subterapeutica o bien como una unica dosis oral en estados con alimentacion y de ayuno o bien una unica dosis intravenosa (regfmenes A - C, respectivamente, en la tabla 24). El estudio era un diseno de estudio cruzado de tres vfas en una poblacion objetivo de sujetos masculinos sanos y consistio en tres periodos de estudio de aproximadamente 35 horas de duracion, cada uno separado por un periodo mmimo de al menos 7 dfas entre dosificacion. Durante el transcurso de cada periodo de estudio, se tomaron muestras de sangre para farmacocinetica en puntos de tiempo especificados tras la dosificacion y se recogio orina a lo largo de intervalos de tiempo

5

10

15

20

25

30

35

40

predefinidos. Los sujetos pudieron abandonar la unidad clmica tras completarse los procedimientos espedficos del estudio a las 24 horas tras la dosis.

En este estudio, se administro M4N a seres humanos en una cantidad de 100 |ig. M4N estaba ligeramente marcado con 14C (3,3 kBq por 100 mg) y se administro a voluntarios sanos. Cada administracion oral de M4N consistia en 0,1 mg de M4N marcado con 14C y 376,8 mg de monooleato de glicerol en una capsula de gelatina de tamano 0. La infusion intravenosa individual de M4N consistfa en M4N marcado con 14C 0,1 mg/ml, HP-p-CD al 30% (p/v) y PEG al 25% (v/v) diluido con agua hasta 1 ml para inyeccion en bolo. Tras la recogida de sangre y orina de cada sujeto, se analizaron las muestras para evaluar el contenido de 14C usando espectrometna de masas con acelerador (AMS) para determinar la concentracion maxima de M4N (Cmax) que se produjo a tiempo Tmax, el area bajo la curva (AUC) global que corresponde a la absorcion global de M4N a los tiempos de prueba (AUC0-t) y global (AUC0-J, la semivida terminal (T1/2) de cada muestra y la biodisponibilidad relativa y global (Frel y F), de la dosis oral de M4N en comparacion con la dosis i.v. de M4N. Los valores medios ± D.E. de parametros farmacocineticos para 14C se presentan en la tabla 24. Se corrigieron los valores iniciales de M4N para cualquier M4N residual que permaneda en los sujetos tras los periodos entre dosificacion para no inflar los niveles de M4N para cualquier dosificacion posterior.

Tabla 24. Valores medios ± D.E. de parametros farmacocineticos para 14C (corregidos con respecto al valor inicial)

Parametro

Regimen A (oral, con alimentacion) Regimen B (oral, en ayunas) Regimen C (intravenoso)

Cmax (pmol/l)

5,94 ± 1,33 9,29 ± 1,40 10,31 ± 1,77

Tmax (horas)

2,50a 1,00a 0,08a

AUC0-t (pmol.h/l)

88,0 ± 19,4 117,2 ± 9,2 96,6 ± 9,23

AUC0.„ (pmol.h/l)

625,6 ± 183,7 416,6 ± 142,6 707,7 ± 380,4

T1/2 (horas)

96,5 ± 20,7 50,9 ± 22,4 116,2 ± 64,0

Frel (%)

75,1 ± 16,2 - -

F (%)

91,2 ± 19,1 122,1 ± 14,5 -

aMediana

Regimen A: Regimen B: Regimen C:

100 |ig de M4N marcado con 14C (3,3 kBq) administrados como una unica dosis oral tras un desayuno con alto contenido en grasa.

100 |ig de M4N marcado con 14C (3,3 kBq) administrados como una unica dosis oral tras un ayuno durante la noche.

100 |ig de M4N marcado con 14C (3,3 kBq) administrados como una disolucion intravenosa en bolo de 1 ml tras un ayuno durante la noche.

Para las dosis orales, los valores de Cmax para 14C total eran menores tras la administracion oral de 100 |ig de M4N marcado con 14C tras un desayuno con alto contenido en grasas (Cmax=5,94 ± 1,33 pmol/l) que tras la administracion oral tras ayuno durante la noche (Cmax=9,29 ± 1,40 pmol/l). El Tmax tendfa a aparecer mas tarde en sujetos con alimentacion que en sujetos en ayuno. En sujetos con alimentacion, Tmax, el tiempo de aparicion de Cmax, era altamente variable y oscilaba entre 1,5 y 24 horas tras la dosis, y en sujetos en ayuno Tmax apareda generalmente 1 hora tras la dosis (intervalo de 0,50 a 2,00 horas). Los valores de AUC0-t eran generalmente inferiores en sujetos con alimentacion que en sujetos en ayuno.

Tras la dosis intravenosa aparecio la concentracion maxima (Cmax=10,31 ± 1,77 pmol/l), tal como se esperaba, en el primer tiempo de toma de muestras (0,08 horas tras la dosis) en ocho de los diez sujetos. En dos sujetos, el Tmax fue de 0,17 horas tras la dosis. Los valores de AUCcm para las concentraciones en plasma de 14C total fueron ligeramente menores tras la unica dosis oral en sujetos con alimentacion que tras la dosis intravenosa. A la inversa, los valores de AUC0-t correspondientes fueron ligeramente mayores tras la unica dosis oral en los sujetos en ayuno que tras la dosis intravenosa.

Las formulaciones del estudio se toleraron bien en administraciones tanto orales como intravenosas. No hubo acontecimientos adversos serios o graves y ningun sujeto abandono debido a un acontecimiento adverso relacionado con el tratamiento de estudio. No se observaron cambios clmicamente significativos en los signos vitales o ECG.

En conclusion, con respecto a este estudio, la absorcion aparente de M4N era muy alta tras la administracion oral en el estado con alimentacion y en ayuno. En presencia de alimento, la velocidad y el grado de absorcion fueron menores en comparacion con el estado en ayuno y el tiempo de aparicion de Cmax se prolongo en el estado con alimentacion. Estas conclusiones se realizan suponiendo que las dosis administradas por via oral de M4N marcado con 14C no se degradaban antes de la absorcion.

Ejemplo 14. Estudios adicionales de solubilidad de M4N en disolventes organicos solubles en agua (ejemplo de referencia)

Se evaluo la solubilidad de M4N en combinaciones de disolventes organicos solubles en agua tal como se indica en la tabla 25 hasta 48 horas. Tras 2, 24 y 48 horas de incubacion a temperatura ambiente se analizaron las muestras

mediante HPLC de fase inversa (“RP-HPLC”) para cuantificar la solubilidad de M4N. Para preparar muestras de M4N, se colocaron 200 |il de M4N 100 mg/ml disuelto en acetona en microtubos de polipropileno de 1,5 ml. Se permitio que se evaporara el disolvente a temperature ambiente durante 48 horas hasta que las muestras estaban completamente secas.

5 Se prepararon las formulaciones con disolvente organico miscible en agua en tubos de centnfuga de polipropileno de 15 ml. Se prepararon 10 ml de cada formulacion. Se anadio cada disolvente en base al peso usando su densidad respectiva a 25°C. Tras mezclado breve, se filtro cada formulacion a traves de un filtro de acetato de celulosa libre de tensioactivo (“SFCA”) de 0,45 |im a un tubo nuevo de 15 ml. Se mantuvieron las formulaciones a temperatura ambiente hasta que estuvieron listas para usarse.

10 Se anadieron 400 |il de cada combinacion de formulacion (tabla 25, en la que Benz = alcohol bendlico; Crem = Cremophor® EL; DMA = dimetilacetamida; T80 = Tween® 80) al microtubo, permitiendo una solubilidad maxima de M4N 50 mg/ml. Se evaluo la solubilidad de M4N mediante RP-HPLC a las 2, 24 y 48 horas de incubacion a temperatura ambiente. En cada punto de tiempo, se centrifugaron las muestras durante 2 minutos a 13.000 rpm para sedimentar cualquier M4N solido. Tal como se indica en la tabla 25, mas de la mitad de las condiciones de

15 formulacion examinadas pudieron solubilizar M4N hasta una concentracion de mas de 10 mg/ml. La solubilidad de M4N en glicerol a las 2 y 48 horas no pudo detectarse.

Tabla 25. Solubilidad de M4N en disolventes organicos miscibles en agua hasta 48 horas

M4N (mg/ml)

Tiempo (h)

Composicion

2 24 48

EtOH al 100%

7,20 7,22 7,91

PG al 100%

1,10 1,33 1,76

100% de PEG300

5,81 10,37 11,52

Glicerol al 100%

XXX 0,08 XXX

Crem al 100%

1,19 7,51 12,48

EtOH al 50%, PG al 50%

3,64 4,15 4,43

EtOH al 50%, PEG300 al 50%

10,94 15,07 16,61

EtOH al 50%, glicerol al 50%

1,14 1,53 1,60

EtOH al 50%, Crem al 50%

13,95 17,58 18,49

EtOH al 50%, T80 al 50%

15,91 19,28 19,68

PG al 50%, PEG300 al 50%

2,65 4,88 5,30

PG al 50%, glicerol al 50%

0,13 0,48 0,51

PG al 50%, Crem al 50%

2,94 6,33 7,20

PG al 50%, T80 al 50%

5,07 8,16 8,41

EtOH al 48%, PG al 50%, Benz al 2%

4,42 4,79 4,92

EtOH al 48%, PEG300 al 50%, Benz al 2%

14,51 15,78 16,49

EtOH al 48%, glicerol al 50%, Benz al 2%

1,25 1,66 1,73

EtOH al 48%, Crem al 50%, Benz al 2%

14,02 18,17 18,51

EtOH al 48%, T80 al 50%, Benz al 2%

16,17 19,55 19,96

EtOH al 44%, PG al 50%, DMA al 6%

4,80 5,48 2,93

EtOH al 44%, PEG300 al 50%, DMA al 6%

15,12 18,61 18,27

EtOH al 44%, glicerol al 50%, DMA al 6%

1,43 1,90 2,01

EtOH al 44%, Crem al 50%, DMA al 6%

14,85 20,42 21,08

EtOH al 44%, T80 al 50%, DMA al 6%

17,72 22,41 23,00

EtOH al 18%, PG al 30%, PEG300 al 40%, T80 al 10%, Benz al 2%

7,84 9,79 10,16

EtOH al 18%, PG al 30%, glic al 40%, T80 al 10%, Benz al 2%

0,58 1,01 1,15

EtOH al 18%, PG al 30%, Crem al 40%, T80 al 10%, Benz al 2%

8,64 11,78 11,86

EtOH al 14%, PG al 30%, PEG300 al 40%, T80 al 10%, DMA al 6%

9,40 10,55 11,30

EtOH al 14%, PG al 30%, glic al 40%, T80 al 10%, DMA al 6%

0,85 1,24 1,48

EtOH al 14%, PG al 30%, Crem al 40%, T80 al 10%, DMA al 6%

9,03 12,08 12,28

EtOH al 28%, PG al 30%, PEG300 al 30%, T80 al 10%, Benz al 2%

8,87 10,19 10,27

EtOH al 28%, PG al 30%, glic al 30%, T80 al 10%, Benz al 2%

1,86 2,22 2,53

EtOH al 28%, PG al 30%, Crem al 30%, T80 al 10%, Benz al 2%

8,98 11,35 11,28

EtOH al 24%, PG al 30%, PEG300 al 30%, T80 al 10%, DMA al 6%

9,91 10,80 10,67

EtOH al 24%, PG al 30%, glic al 30%, T80 al 10%, DMA al 6%

1,63 2,26 2,52

EtOH al 24%, PG al 30%, Crem al 30%, T80 al 10%, DMA al 6%

10,42 11,25 12,48

Ejemplo 15. Solubilidad de M4N en disoluciones acuosas (ejemplo de referencia)

Se evaluo la solubilidad de M4N en disoluciones acuosas que conternan o bien hidroxipropil HP-p-CD o bien

sulfobutil eter-p-ciclodextrina (SE-p-CD) (Captisol®, CyDex, Inc., Lenexa, KS, EE.UU.) hasta 48 horas a temperature ambiente descritas anteriormente en el ejemplo 14. Se prepararon diez disoluciones al 50% de HP-p-CD y SE-p-CD en una base de peso con respecto a volumen. Se prepare el M4N para su uso en las muestras tal como se expone en el ejemplo 14. Se pesaron entre 1,0 g y 5,0 g de cualquier compuesto en un matraz volumetrico de 10 ml en una 5 balanza Analytical Plus de OHAUS. Se anadio cantidad suficiente de agua para inyeccion (WFI) a cada muestra hasta 10 ml. Tras una incubacion de 1 hora a 40°C, se filtraron las preparaciones a traves de un filtro de SFCA de 0,45 |im a un tubo de 15 ml nuevo. Se mantuvieron las preparaciones a temperatura ambiente hasta que estuvieron listas para su uso.

Tal como se muestra en la tabla 26, la solubilidad de M4N en WFI, solucion salina al 0,9%, dextrosa al 5% (D5W) 10 estaba por debajo del lfmite de cuantificacion del metodo de RP-HPLC a lo largo de todo el transcurso de este estudio. Observese el aumento de la solubilidad de M4N como funcion de la concentracion de HP-p-CD y Captisol® y el tiempo.

Tabla 26. Solubilidad de M4N en disoluciones acuosas hasta 48 horas

M4N (mg/ml)

Tiempo (h)

Composicion

2 24 48

WFI

XXX XXX XXX

Solucion salina al 0,9%

XXX XXX XXX

D5W

XXX XXX XXX

HP-p-CD al 10%

0,35 0,45 0,46

HP-p-CD al 20%

0,66 0,91 0,88

HP-p-CD al 30%

1,38 1,97 2,02

HP-p-CD al 40%

1,89 3,01 3,23

HP-p-CD al 50%

2,52 4,95 4,98

Captisol® al 10%

0,48 0,74 0,94

Captisol® al 20%

0,76 1,45 1,39

Captisol® al 30%

1,57 2,87 2,69

Captisol® al 40%

1,42 3,90 4,15

Captisol® al 50%

1,17 4,49 6,41

Mas de 20 condiciones de formulacion que usaban disolventes organicos miscibles en agua podfan solubilizar M4N 15 hasta una concentracion de mas de 10 mg/ml. La solubilidad de M4N en WFI, solucion salina al 0,9%, D5W estaba por debajo del lfmite de deteccion del metodo de RP-HPLC. La solubilidad de M4N aumenta como funcion de la concentracion de HP-p-CD y Captisol® y el tiempo.

Ejemplo 16. Solubilidad de M4N en hidroxipropil-p-ciclodextrina (ejemplo de referencia)

Se evaluo la solubilidad acuosa de M4N a diversas concentraciones de HP-p-CD mediante el metodo indicado por 20 Higuchi y Connors (1965). Brevemente, se peso con precision M4N y se anadio en cantidades que superaban su solubilidad acuosa, se hicieron rotar suavemente (~12 rpm) a temperatura ambiente con disoluciones acuosas de HP-p-CD en concentraciones crecientes (0-350 mmol/l), durante un periodo de 48 horas. Entonces se filtraron las disoluciones de M4N/HP-p-CD a traves de un filtro de SFCA de 0,45 |im y se analizaron mediante RP-HPLC.

Aunque se cree que la mayona de los complejos de farmaco/ciclodextrina son complejos de inclusion, tambien se 25 sabe que las ciclodextrinas forman complejos de no inclusion y agregados de complejos que pueden disolver farmacos a traves de estructuras similares a micelas. Los perfiles de solubilidad en fase no verificaron la formacion de complejos de inclusion, sino que solo detallaron como influye la concentracion creciente de ciclodextrina en la solubilidad del farmaco. La formacion del complejo M4N/HP-p-CD no es lineal, pero la determinacion precisa de la estequiometria (asf como las constantes de estabilidad) no se estudio en los experimentos de este ejemplo, aunque 30 pudo determinarse mediante otros medios tales como RMN o potenciometna.

Ejemplo 17. Estabilidad de M4N en disoluciones tampon de HP-p-CD/PEG 300

Se evaluo la estabilidad de M4N 10 mg/ml (preparado en una razon de HP-p-CD al 40%:M4N en PEG 300 40 mg/ml 75:25) en disoluciones tampon 15 mM tras la incubacion a 60°C.

Se prepararon disoluciones al 40% tamponadas de HP-p-CD en una base en peso con respecto al volumen. Se 35 prepare el M4N para su uso en las muestras tal como se expone en el ejemplo 14. Se pesaron 2,0 g de HP-p-CD en matraces volumetricos de 5 ml en una balanza Analytical Plus de OHAUS. Se anadio 1 ml de una disolucion tampon 100 mM a cada matraz. Se anadio cantidad suficiente de WFI a cada muestra hasta 5 ml. Tras una incubacion de 1 hora a 40°C, se filtraron las preparaciones a traves de un filtro de SFCA de 0,45 |im a un tubo de 15 ml nuevo. Se mantuvieron las preparaciones a temperatura ambiente hasta que estuvieron listas para su uso.

5

10

15

20

25

30

Se colocaron 750 |il de disolucion tamponada de HP-p-CD al 40% en microtubos de polipropileno de 1,5 ml. Se anadieron 250 |il de M4N 40 mg/ml en PEG 300 a cada microtubo permitiendo una solubilidad de M4N 10 mg/ml. Tras inversion suave de los tubos de muestra, se midio el pH de cada disolucion usando un medidor de pH modelo 420A de Orion. Se retiro una alfcuota inicial para el analisis mediante RP-HPLC. Entonces se colocaron las muestras de prueba en un incubador Precision a 60°C. Se evaluo la estabilidad de M4N mediante RP-HPLC. En cada punto de tiempo, se centrifugaron las muestras durante 2 minutos a 13.000 rpm para sedimentar cualquier M4N solido.

Tal como se muestra en la tabla 27, se observa una ligera disminucion en la concentracion de las diversas disoluciones de M4N tras la incubacion de 14 dfas a 60°C. Los datos de RP-HPLC no revelaron un aumento de impurezas de la muestra que pudiera explicar la magnitud de la disminucion en la concentracion de M4N. Sin embargo, se observo un cambio dependiente del pH en las impurezas de M4N, aunque estas impurezas constitrnan menos del 0,1% del area del pico total. Se observan pocos o ningun cambio en el pH de la muestra aparente durante el periodo de incubacion (tabla 27).

Tabla 27. Estabilidad de M4N en disoluciones de HP-p-CD/PEG hasta 14 dfas a 60°C

Composicion

M4N (mg/ml)

Tiempo (dfas)

0

2 6 10 14

WFI, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,4 10,1 9,9 9,7 9,6

Fosfato 15 mM, pH 3, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,3 10,1 9,6 9,7 9,6

Fosfato 15 mM, pH 4, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,5 10,1 9,6 9,7 9,6

Acetato 15 mM, pH 5, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,6 10,2 9,6 9,7 9,6

Acetato 15 mM, pH 6, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,5 10,1 9,7 9,7 9,6

Fosfato 15 mM, pH 7, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,5 10,3 9,7 9,7 9,7

Fosfato 15 mM, pH 8, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,6 10,4 9,7 9,8 9,6

Fosfato 15 mM, pH 9, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,4 10,2 9,7 9,8 9,7

Borato 15 mM, pH 10, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,5 10,1 9,7 9,6 9,6

Borato 15 mM, pH 11, HP-p-CD al 30%, PEG300 al 25%

10,5 10,3 9,8 9,5 9,4

Se observo una disminucion uniforme de la estabilidad independientemente del pH de la muestra aparente o tampon, tal como se indica por una perdida en la recuperacion de M4N, tras 14 dfas de incubacion a 60°C.

Ejemplo 18. Estabilidad de M4N en disoluciones de PEG300/HP-P-CD 11-14 mg/ml

Para apoyar las especificaciones de fabricacion, este estudio examino la estabilidad a temperatura ambiente de 24 horas de combinaciones de PEG300/HP-P-CD a concentraciones objetivo de M4N variables. Se prepararon muestras madre de disoluciones madre de M4N en PEG 300 al 100% a concentraciones de farmaco de 33-56 mg/ml a 60°C tal como sigue.

Se solubilizo farmaco a granel M4N hasta concentraciones de 33, 44, 48, 52, 55 y 56 mg/ml (p/p) en PEG 300 usando el procedimiento expuesto en los ejemplos 14 y 17, tras la incubacion de al menos 2 horas a 60°C. Fueron necesarias agitacion con vortex vigorosa y mezclado para la solubilizacion completa de M4N por encima de 44 mg/ml. Se filtraron las disoluciones madre de M4N a traves de un filtro de SFCA de 0,45 |im y se usaron en el plazo de 30 minutos de la preparacion. Por separado, se preparo una disolucion de HP-p-CD al 40% (p/v) en WFI esteril y se filtro. Se combinaron combinaciones de la disolucion madre de HP-p-CD al 40% y las disoluciones madre de M4N/PEG 300 en microtubos de polipropileno de 1,5 ml. Se evaluo la solubilidad de M4N mediante RP-HPLC a las 2 y 24 horas de incubacion a temperatura ambiente.

Se anadio la cantidad requerida de disolucion madre de M4N a HP-p-CD al 40% para proporcionar las concentraciones finales de farmaco y excipientes enumeradas en la tabla 28. Se hicieron rotar las muestras suavemente (~12 rpm) a temperatura ambiente. A las 2 y 24 horas de incubacion, se centrifugaron las muestras 2 minutos a 13.000 rpm y se retiraron alfcuotas de 50 |il para el analisis mediante RP-HPLC. Independientemente del M4N o la formulacion objetivo, se observaron pocos o ningun cambio tras la incubacion de 24 horas (tabla 28).

Tabla 28. Estabilidad de M4N en disoluciones de PEG300/HP-p-CD 11-14 mg/ml

M4N mg/ml observado

Composicion

t=2 horas t=24 horas

M4N 11 mg/ml, PEG300 al 25%, HP-p-CD al 30%

11,3 11,3

M4N 12 mg/ml, PEG300 al 25%, HP-p-CD al 30%

11,8 11,6

M4N 13 mg/ml, PEG300 al 25%, HP-p-CD al 30%

12,7 12,7

M4N 14 mg/ml, PEG300 al 25%, HP-p-CD al 30%

13,5 13,5

M4N 11 mg/ml, PEG300 al 33%, HP-p-CD al 27%

11,4 11,3

M4N 11 mg/ml, PEG300 al 20%, HP-P-CD al 32%

11,5

11,4

Las muestras de prueba que conteman M4N entre 11-14 mg/ml formulado hasta una concentracion final de PEG 300 al 25% y HP-P-CD al 30% eran estables tras 24 horas de incubacion a temperatura ambiente.

Ejemplo 19. Estabilidad de M4N/PEG300 40 mg/ml (ejemplo de referencia)

Se evaluo la estabilidad de M4N 40 mg/ml disuelto en PEG 300 al 100% hasta 24 horas de incubacion a 30°C, 45°C 5 y 60°C. Se preparo una disolucion madre de M4N 40 mg/ml en PEG 300 a 60°C, siguiendo el procedimiento expuesto en el ejemplo 18. Posteriormente, se retiraron alfcuotas y se incubaron a la temperatura apropiada. Se hicieron rotar las muestras a 450 rpm durante todo el transcurso de la incubacion. Se recogieron observaciones visuales y datos de RP-HPLC todo el tiempo. Tal como se muestra en la tabla 29, tras 6 horas de incubacion a 30°C, se observaron pequenos cristales en la formulacion de M4N/PEG 300 40 mg/ml, apareciendo mas tras 24 horas. La 10 formacion de cristales coincidio con una perdida de M4N soluble (tabla 30). Las muestras de M4N/PEG 300 40 mg/ml incubadas a 45°C y 60°C eran estables tras 24 horas de incubacion tal como se evaluo mediante observaciones visuales y analisis de RP-HPLC (tablas 29 y 30). No se observaron cambios en la cantidad o los tipos de picos de impurezas a ninguna de las temperaturas de incubacion.

TABLA 29. Aspecto visual de muestras de estabilidad de M4N/PEG 300 40 mg/ml

Condiciones de incubacion

Aspecto visual

Tiempo (horas)

2

4 6 24

30°C

Transparente Transparente Pocos cristales pequenos Muchos cristales pequenos

45°C

Transparente Transparente Transparente Transparente

60°C

Transparente Transparente Transparente Transparente

15 TABLA 30. Muestras de estabilidad de M4N/PEG 300 40 mg/ml: Analisis de RP-HPLC

Condiciones de incubacion

M4N (mg/ml)

Tiempo (horas)

0

2 6 24

30°C

39.5 40,8 40,6 37,4

45°C

40,4 39,8 40,6

60°C

39,1 39,2 39,2

Tras 6 horas de incubacion a 30°C se observaron cristales pequenos en la formulacion de M4N/PEG 300 40 mg/ml. Tras 24 horas, se observaron incluso mas cristales asf como una perdida >5% de M4N soluble tal como se determino mediante analisis de RP-HPLC.

Las muestras de M4N/PEG 300 40 mg/ml incubadas a 45°C y 60°C eran estables tras 24 horas de incubacion tal 20 como se evaluo mediante observaciones visuales y analisis de RP-HPLC.

Bibliografia

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Rowe, R.C. et al. eds. (2003). Handbook of Pharmaceutical Excipients. 4a edicion. Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association.

Claims (44)

1. 5

   10

   15
2. 2.
3. 3.

   20 4.
4. 5.

   25
5. 6.
6. 7.

   30
7. 8.
8. 9. 35
9. 10. 11.

   40 12.
10. 13.
11. 14.

    45 15.
12. 16.
13. 17.
14. 18. 50

    REIVINDICACIONES

    Composicion para la administracion oral a un animal que comprende un principio activo farmaceutico y un portador farmaceuticamente aceptable, en la que el principio activo farmaceutico comprende tetra-O-metil- NDGA, y el portador comprende polietilenglicol, una ciclodextrina y opcionalmente al menos uno de un agente de solubilizacion y un excipiente seleccionado del grupo que consiste en: (a) un disolvente organico soluble en agua distinto de DMSO; siempre que cuando el disolvente organico soluble en agua sea propilenglicol, el propilenglicol este en ausencia de vaselina blanca, en ausencia de goma xantana y en ausencia de al menos uno de glicerina o glicina, cuando el disolvente organico soluble en agua sea polietilenglicol, el polietilenglicol este presente en ausencia de acido ascorbico o hidroxitolueno butilado, y cuando el polietilenglicol sea polietilenglicol 400, el polietilenglicol 400 este presente en ausencia de polietilenglicol 8000; (b) un tensioactivo ionico, no ionico o anfipatico, siempre que cuando el tensioactivo sea un tensioactivo no ionico, el tensioactivo no ionico este presente en ausencia de goma xantana; (c) una celulosa modificada; (d) un lfpido insoluble en agua, siempre que cuando el lfpido insoluble en agua sea aceite de ricino, el aceite de ricino este presente en ausencia de cera de abejas o cera de carnauba; y una combinacion de cualquiera de los portadores (a) - (d).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende de 0,1 mg a 200 mg del principio activo farmaceutico.

    Composicion segun la reivindicacion 2, en la que la composicion comprende 10 mg, 20 mg, 25 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 75 mg, 100 mg o 200 mg del agente farmaceutico activo.

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el principio activo farmaceutico esta presente a una concentracion de 1 mg/ml a 200 mg/ml o de 1 mg/g a 250 mg/g.

    Composicion segun la reivindicacion 4, en la que el principio activo farmaceutico esta presente a una concentracion de 1 mg/ml, 2 mg/ml, 2,5 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 12,5 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml o 175 mg/ml.

    Composicion segun la reivindicacion 4, en la que el principio activo farmaceutico esta presente a una concentracion de 20 mg/g, 50 mg/g, 75 mg/g, 100 mg/g, 120 mg/g, 130 mg/g, 140 mg/g, 150 mg/g, 175 mg/g o 200 mg/g.

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el disolvente organico soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en polipropilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol etflico, alcohol bendlico y dimetilacetamida.

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el polietilenglicol esta presente a una concentracion del 5% (v/v) al 100% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 8, en la que el polietilenglicol esta presente a una concentracion del 20% (v/v) al 80% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 9, en la que el polietilenglicol esta presente a una concentracion del 50% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 9, en la que el polietilenglicol esta presente a una concentracion del 40% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 9, en la que el polietilenglicol esta presente a una concentracion del 33% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el polietilenglicol es PEG 300.

    Composicion segun la reivindicacion 13, en la que el PEG 300 esta presente a una concentracion del 10% (v/v), el 20% (v/v), el 30% (v/v), el 40% (v/v) o el 50% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el polietilenglicol es PEG 400.

    Composicion segun la reivindicacion 15, en la que el PEG 400 esta presente a una concentracion del 10% (v/v), el 20% (v/v), el 30% (v/v), el 40% (v/v) o el 50% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el polietilenglicol es monolaurato de PEG 400.

    Composicion segun la reivindicacion 17, en la que el monolaurato de PEG 400 esta presente a una concentracion del 20% (v/v) al 50% (v/v).
15. 19.
16. 20. 5 21.
17. 22.

    10 23.
18. 24.
19. 25.

    15 26.
20. 27.

    20 28.
21. 29.
22. 30.
23. 31.

    25 32.
24. 33.
25. 34.

    30 35.
26. 36.
27. 37.

    35 38.
28. 39.
29. 40.

    40 41.
30. 42.

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el portador comprende una ciclodextrina no modificada o una ciclodextrina modificada.

    Composicion segun la reivindicacion 19, en la que la ciclodextrina modificada se selecciona del grupo que consiste en hidroxipropil-p-ciclodextrina y sulfobutil eter-p-ciclodextrina.

    Composicion segun la reivindicacion 19, en la que la ciclodextrina modificada esta presente a una concentracion del 5% (p/v) al 80% (p/v).

    Composicion segun la reivindicacion 21, en la que la ciclodextrina modificada esta presente a una concentracion del 15% (p/v), el 20% (p/v), el 25% (p/v), el 30% (p/v), el 35% (p/v), el 40% (p/v) o el 50% (p/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el portador comprende un tensioactivo.

    Composicion segun la reivindicacion 23, en la que el tensioactivo esta presente a una concentracion del 5% (v/v) al 100% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 24, en la que el tensioactivo esta presente a una concentracion del 30% (v/v), el 40% (v/v) o el 50% (v/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el portador comprende un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en polisorbato, succinato de d-alfa-tocoferil-polietilenglicol 1000, un acido graso esterificado y el producto de reaccion de oxido de etileno y aceite de ricino en una razon molar de 35:1.

    Composicion segun la reivindicacion 25, en la que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20 y polisorbato 80.

    Composicion segun la reivindicacion 27, en la que el tensioactivo es polisorbato 20.

    Composicion segun la reivindicacion 23, en la que el polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste en PEG 300 y PEG 400.

    Composicion segun la reivindicacion 29, en la que el tensioactivo es polisorbato 20.

    Composicion segun la reivindicacion 23, en la que el tensioactivo es un acido graso esterificado.

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el portador comprende una celulosa modificada.

    Composicion segun la reivindicacion 32, en la que la celulosa modificada se selecciona del grupo que consiste en etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa.

    Composicion segun la reivindicacion 32, en la que la celulosa modificada esta presente a una concentracion del 0,1% (p/v) al 10% (p/v).

    Composicion segun la reivindicacion 1, en la que el portador comprende un lfpido insoluble en agua.

    Composicion segun la reivindicacion 35, en la que el lfpido insoluble en agua se selecciona del grupo que consiste en al menos uno de un aceite, una cera y una emulsion de grasa, siempre que cuando la composicion contenga aceite de ricino, no contenga cera de abejas o cera de carnauba.

    Composicion segun la reivindicacion 35, en la que el lfpido insoluble en agua es una emulsion de grasa.

    Composicion segun la reivindicacion 37, en la que la emulsion de grasa esta presente a una concentracion del 10% al 30%.

    Composicion segun la reivindicacion 37, en la que la emulsion de grasa esta presente a una concentracion del 20%.

    Composicion segun la reivindicacion 31, en la que el lfpido insoluble en agua es aceite.

    Composicion segun la reivindicacion 40, en la que el aceite se selecciona de al menos uno del grupo que consiste en aceite de mafz, aceite de oliva, aceite de menta piperita, aceite de soja, aceite de semilla de sesamo, aceite mineral y glicerol.

    Composicion segun la reivindicacion 40, en la que el aceite esta presente a una concentracion del 10% al 100%.

    45 43. Composicion segun la reivindicacion 40, en la que el aceite es aceite de menta piperita.

    5

    10

    15

    20

    25
31. 44. Composicion segun la reivindicacion 43, que comprende ademas aceite de sesamo.
32. 45. Composicion segun la reivindicacion 40, que comprende ademas polisorbato 20.
33. 46. Composicion segun la reivindicacion 40, en la que el polietilenglicol se selecciona del grupo que consiste en

    PEG 300 y PEG 400.
34. 47. Composicion farmaceutica que comprende la composicion segun la reivindicacion 1.
35. 48. Composicion segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa,

    hipertension, obesidad, diabetes, una enfermedad del sistema nervioso central, una enfermedad neurodegenerativa, dolor, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, demencia, enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular, una enfermedad inflamatoria, neoplasia premaligna, displasia o una infeccion.
36. 49. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la enfermedad proliferativa es cancer o psoriasis.
37. 50. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) y esclerosis multiple.
38. 51. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la enfermedad es una neoplasia intraepitelial.
39. 52. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la infeccion es una infeccion viral.
40. 53. Composicion para su uso segun la reivindicacion 52, en la que el virus se selecciona del grupo que consiste en VIH, VLTH, VPH, VHS, VHB, VEB, virus de la varicela-zoster, adenovirus, parvovirus o virus de CJ.
41. 54. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la composicion se administra a una dosis en un intervalo de 10 mg de principio activo farmaceutico por kg de peso del sujeto a 600 mg de principio activo farmaceutico por kg de peso del sujeto.
42. 55. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la composicion se administra una o mas veces a la semana.
43. 56. Composicion para su uso segun la reivindicacion 48, en la que la composicion se administra una o mas veces al mes.
44. 57. Kit que comprende la composicion segun la reivindicacion 1 e instrucciones para el uso de la misma.