CN1554748A - 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 - Google Patents
通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1554748A CN1554748A CNA2003101221446A CN200310122144A CN1554748A CN 1554748 A CN1554748 A CN 1554748A CN A2003101221446 A CNA2003101221446 A CN A2003101221446A CN 200310122144 A CN200310122144 A CN 200310122144A CN 1554748 A CN1554748 A CN 1554748A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- megalokaryocyte
- preparation
- heparin
- tpo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途，主要涉及一种高效培养和定向诱导干细胞分化成巨核细胞的培养扩增体系。该体系采用脐带血和骨髓干细胞作为种子细胞，以血小板生成素(TPO)，白介素11(IL－11)和肝素组合的无血清培养基为巨核细胞扩增的主要成分。按照本发明技术制备的巨核细胞制剂，含有大量的巨核祖细胞和成熟的巨核细胞以及CD34+细胞，具有治疗血小板减少、改善干细胞移植后造血功能的作用。本发明为再生障碍性贫血、肿瘤病人大剂量放化疗及自/异体干细胞移植后以及其它原因引起的血小板减少症和全血细胞减少提供全新而有效的细胞治疗制剂。
Description
技术领域
本发明涉及制备巨核细胞制剂的方法，尤其是以造血组织(脐带血和骨髓等)来源的干细胞为种子，以血小板生成素(TPO)，白介素11(IL-11)和肝素组合为巨核细胞扩增刺激因子的扩增体系，通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途。
背景技术
血小板是体内维持正常血液凝固和血管壁完整性所必须的血细胞，其数量的异常会导致血液和血栓性疾病的发生。血小板减少的发生率较高，患者因反复出血需经常性治疗，严重危害其身心健康，并给患者带来很重的经济负担，出血严重时甚至可危及生命。自体或异体造血干细胞(HSC)移植是治疗白血病、淋巴瘤、实体肿瘤、代谢性和严重自身免疫疾病等严重危害人类健康疾病的最有效的方法之一。但干细胞移植后的主要并发症之一是骨髓抑制期因血小板显著减少而致出血，导致患者死亡。再生障碍性贫血虽然表现全血减少，但血小板减少的治疗最为困难。干细胞移植后和再生障碍性贫血的血小板减少，治疗上血小板输注是其主要对症治疗手段，但由于价格昂贵，反复输注可因产生血小板抗体而最终“无效输注”。一些血小板生成刺激因子如血小板生成素(TPO)，尽管已进入临床试验，但患者使用TPO后体内产生中和抗体，而且可以出现骨髓纤维化和骨髓增生性紊乱等副作用。人们正在着力探寻新的方法，如采集造血干细胞体外扩增的巨核细胞输注以加速血小板的恢复，迄今，巨核细胞体外扩增的I/II期的临床实验结果显示能帮助病人恢复血小板，没有明显的副作用，而且可减少自体骨髓抑制的移植物抗宿主病，从而越来越受到人们关注。但迄今报道的扩增体系均使用多种细胞因子的组合，不仅价格昂贵，而且其中部分因子尚无获得临床许可，因此临床适用性不强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供可以治疗血细胞减少和血小板减少性疾病的巨核细胞的制备方法及用途，这些巨核细胞的种子细胞来自包括脐带血在内的造血组织，经体外诱导分化扩增的巨核细胞直接静脉内注射，在体内发挥很好的作用。本发明提供的制备方法，可以将干细胞从自体或异体的造血组织血中分离出来，制备成巨核细胞治疗产品；所制备的巨核细胞产品可以通过静脉移植治疗大剂量放、化疗和其他原因引起的血小板减少性症；制备的细胞治疗产品可以用作基因治疗载体，转染促巨核细胞生成的基因，进行基因治疗和研究巨核细胞生成机制。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法，是以包括脐带血、骨髓在内的造血组织中分离提取的干细胞为种子细胞，在包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的无血清培养基中定向扩增。
所述的培养基中含有血小板生成素(TPO)：50-200ng/ml，白介素-11(IL-11)：12.5-200ng/ml，肝素(Heparin)：5-100IU/ml。
所述的培养基中最佳浓度是：TPO，50ng/ml；IL-11，50ng/ml；肝素，25IU/ml。
通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法：用CD34+分离试剂盒从脐血或骨髓中分离CD34+细胞，接种于培养瓶或培养袋中，在添加了包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的培养液的无血清培养基中培养7天，细胞总数扩增5.3±3.25倍，其中(40.86±15.02)％CD41a+为巨核祖细胞和成熟巨核细胞，还含有(39.98±25.47)％的CD34+干祖细胞，培养10天后，细胞数扩增36.1±8.63倍，其中(69.26±16.88)％为巨核祖细胞和成熟巨核细胞，还含有(2.835±1.29)％的CD34+干祖细胞。
上述制备的巨核细胞制剂在治疗放化疗后、干细胞移植及其他原因引起的血小板减少症的药物中的用途。
所述的巨核细胞制剂，经静脉输入到辐射动物体内可进入骨髓，可显著增加动物生存率，帮助动物恢复血小板及其它血细胞，应用于治疗各种原因导致的血小板减少症。
1、脐带血CD34阳性细胞的制备
a、脐血标本的处理：收集足月妊娠的新鲜CB标本，脐血采集量为50-80ml，通过重力将尽可能多的脐血收集于含有20ml CPD-A(citrate-phosphate-adeninel)抗凝剂(Baxter HealthCare，Deerfield，IL)的采血袋中。按5∶1比例加入6.0％的羟乙基淀粉(终浓度1.2％)，离心沉淀红细胞，收集富含有核细胞的血浆，再用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)。
b、CD34阳性细胞的制备：取Ficoll分选出的单个核细胞，采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置，应用MACS CD34+细胞单选试剂盒(Miltenyi Biotec Inc，Sunnyvale，CA)按其说明进行分选CD34+细胞。首先在单个核细胞中加入阻断剂及免疫磁珠标记的CD34抗体，4℃孵育30min，然后将分离柱放在MACS磁场中，CD34+细胞通过磁力作用留在分离柱中，将分离柱移出磁场，洗出CD34+细胞，为提高CD34+细胞的纯度可二次过柱。取出2×105细胞标记PE-抗人CD34抗体，2×105细胞标记PE-抗人IgG1抗体作为阴性对照，检测CD34+细胞纯度，经过两次分选后的脐血CD34+细胞纯度可达95％以上。
2、巨核祖细胞体外诱导扩增
a、巨核祖细胞的体外诱导扩增：新鲜分离的脐血CD34+细胞(1×105/ml)接种在终体积为1ml的24孔培养板中，包含TPO，TPO+IL-11，TPO+IL-11+肝素的无血清培养基(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)中，细胞在37℃，5％CO2潮湿环境的孵箱中培养，每3.5天半量换液，在第7、10、14天取出细胞做胎盘兰计数总细胞扩增倍数、细胞染色、免疫组化、巨核祖细胞集落形成分析、抗体检测及电镜分析。
b、细胞染色及免疫组化分析：取培养7、10、14天的细胞(2×105cells)离心去培养液，用PBS洗两次，使细胞离心到涂有多聚赖氨酸的载波片表面，风干2-3分钟，加入May-Grunwald(Sigma)染液5min，PBS(PH7.2，0.1M)洗1-5min，1∶20稀释Giemsa(Sigma)复染15-20min，双蒸水冲洗，风干，镜下观察。
免疫组化分析，细胞涂片后，在甲醇：丙酮(1∶1)固定液固定90s，加入生物素—鼠抗人CD41在37℃孵育40min，TBS缓冲液(50ml 0.5MTris-HCL与50ml 9％NaCL定容在400ml双蒸水中)洗3-4次，加碱性磷酸酶—链霉卵白素，37℃孵育30min，TBS缓冲液洗3-4次，固红显色10min，Mayer苏木素复染1hr，0.5％氨水返蓝5s，自来水冲净晾干，镜下观察，细胞核呈蓝色，胞膜或胞浆呈红色标记的为阳性细胞；无红色标记的为阴性细胞。
c、流式细胞仪检测抗体：取培养7、10、14天的细胞(2×105cells)离心去培养液，用PBS洗一次，PE-鼠抗人CD41a，FITC-CD34，FITC-CD61单克隆抗体与细胞在4℃下孵育30min，离心去上清并用PBS洗二次，将细胞固定在0.5ml 1％多聚甲醛中，流式细胞仪(Becton Dickinson FACSVantage)测定CD34+，CD41a+，CD61+，CD34/CD41a+，CD41a/CD61+的表达，CellQuest3.3软件分析结果。
d、巨核细胞集落形成分析
巨核细胞集落形成分析试剂盒(Mega-Cult-C；Stem CellTechnologies，Vancouver，Canada)用来鉴定巨核祖细胞生长所形成的细胞集落，按其操作说明使用。简言之，5×103纯化的CD34+及扩增7、10天的细胞种入无血清(包含TPO 50ng/ml，IL-3 10ng/ml，IL-6 10ng/ml，胶原1.1mg/ml)的双层培养板中，细胞在37℃孵箱中孵育10-12天后，细胞经脱水、固定、及免疫组化分析。巨核细胞集落用抗GP II b/IIIa抗体及碱性磷酸酶检测系统(APAAP)检测，细胞核用Evan’s Blue复染，阳性克隆根据其大小判定，小(3-10细胞/集落)，中等(11-20细胞/集落，21-50细胞/集落)，大(＞50细胞/克隆)。
e、巨核细胞透射电镜及血小板过氧化物酶(PPO)检测
将培养7天，10天，14天的细胞(1×106cells)收集，用PBS(0.1M，PH7.2)洗两遍，2.5％戊二醛4℃固定2-3hr后，再用1％的锇酸固定2hr，丙酮梯度脱水，环氧丙烷，812环氧树脂浸透，60℃聚合，超薄切片，枸橼酸铅，醋酸铀双染，电镜观察。
电镜PPO检测：将培养7天，10天，14天的细胞(2×106cells)收集，用生理盐水洗两次，孵育液(DAB，Ring/Tris缓冲液，3％H2O2)孵育90min，离心，2.5％
戊二醛4℃固定2hr，常规包埋，超薄切片，枸橼酸铅，醋酸铀双染，电镜观察。
f、非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)体内细胞移植
实验
NOD/SCID小鼠(雄性，8-10周，20-25g，中国医学科学院实验动物研究所)饲养于SPF级层流架中。经Cs源照射(275cGy)后随机分为两组，一组为尾静脉注射PBS组，另一组为尾静脉注射扩增的巨核祖细胞组，移植均在放射完4小时内，移植1×107/100ul的巨核祖细胞(CD34+细胞经TPO+IL-11+Heparin扩增7天)，在移植后的第7天，14天，21天，28天分别测小鼠的外周血象、流式细胞仪检测外周血人的血小板(人CD41a/鼠CD41)及骨髓中人细胞(人CD41a、人CD45)的含量。
g、统计学分析：用SPSS统计分析软件进行分析，本发明结果均以均值±标准差(％±SD)表示。差异显著性采用t检验。
按照本发明提供的制备技术，可以将干细胞从自体或异体的造血组织血中分离出来，制备成巨核细胞治疗产品；
按照本发明制备技术制备的巨核细胞产品可以通过静脉移植治疗大剂量放、化疗和其他原因引起的血小板减少性症；
按照本发明制备技术制备的细胞治疗产品可以用作基因治疗载体，转染促巨核细胞生成的基因，进行基因治疗和研究巨核细胞生成机制。
附图说明
图1a是不同因子组合巨核细胞总细胞及各表面标记扩增倍数(扩增7天)。
图1b是不同因子组合巨核细胞总细胞及各表面标记扩增倍数(扩增10天)。
图2a是不同因子组合扩增的巨核细胞集落分析(扩增7天)。
图2b是不同因子组合扩增的巨核细胞集落分析(扩增10天)。
图3a是巨核细胞大克隆(＞50个)的巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)。
图3b是中等大小克隆(11-20个)的巨核祖细胞集落分析(CFU-MK)。
图4是巨核细胞分化过程中的细胞表面标记的变化(流式细胞仪分析)。
图5是May-Grunwald-Giemsa染色的巨核细胞，左边为4倍体的巨核细胞，右边为多倍体巨核细胞，箭头为巨核细胞。
图6是巨核细胞透射电镜及组化电镜(培养10天)，左边为透射电镜，右边为组化电镜(血小板过氧化物酶检测)。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。
实施例1：巨核细胞的体外诱导扩增
取新鲜分离的脐血CD34+细胞(1×105/ml)接种在终体积为含有本发明的血小板生成素(TPO)+重组人白细胞介素-11(rhIL-11)+肝素(Heparin)组合的无血清培养基中，其中含TPO：50ng/ml，IL-11：50ng/ml，Heparin：25IU/ml，在37℃，5％CO2潮湿环境的孵箱中培养，每3.5天半量换液，在第7、10、14天作各种分析。同时采用TPO单独(50ng/ml)和TPO(50ng/ml)+IL-11(50ng/ml)组合的二种无血清培养扩增方法作为对照，以评估TPO+IL-11+肝素组合的无血清培养扩增体系制备巨核细胞产品的效果。扩增过程中细胞总数、不同阶段的祖细胞及巨核细胞的扩增倍数等结果见表1、表2和图1a、图1b、图2a、图2b、图3a、图3b、和图4。
表1.TPO单独诱导脐血CD34+细胞时总细胞的扩增倍数及巨核细胞表面标记所占的百分比例
(a)扩增7天时
| MK7D | ||||||
| Cell fold | CD34+ | CD41a+ | CD34+/41a+ | CD61+ | CD41/CD61+ | |
| TPO50 | 4.6±2.31 | 20.1±12.1 | 49.1±12.1 | 5.61±4.36 | 38.8±13.6 | 37.9±15.8 |
| TPO100 | 10.2±5.41 | 9.99±3.78 | 50.7±8.94 | 2.67±1.79 | 43.9±11.4 | 38.9±9.37 |
| TPO200 | 10.1±3.35 | 10.2±3.67 | 50±5.19 | 2.66±1.48 | 34.2±9.65 | 33.2±9.41 |
(b)扩增10天时
| MK10D | ||||||
| Cell fold | CD34+ | CD41a+ | CD34+/41a+ | CD61+ | CD41/CD61+ | |
| TPO50 | 37.4±13 | 3.39±1.9 | 75.5±8.81 | 0.79±0.58 | 78.2±5.41 | 72.5±8.78 |
| TPO100 | 49.3±7.5 | 3.61±0.73 | 75.1±10.1 | 0.96±0.38 | 77.6±6.28 | 73.5±9.7 |
| TPO200 | 41.8±9.05 | 2.4±0.68 | 61.1±28.7 | 0.74±0.19 | 74.2±6.59 | 70.4±9.98 |
表2.TPO与IL-11，TPO、IL-11、肝素联合时巨核细胞各标记所占的百分比例
(a)扩增7天时
| 7D | TPO(50) | TPO+IL-11(50) | T+IL-11+H(0，25) | T+IL-11+H(3，25) |
| Cell fold | 4.6±2.31 | 6.74±1.35 | 5.3±3.25 | 5.8±1.1 |
| CD34+ | 20.1±12.2 | 25.3±12.41 | 39.98±25.47 | 35.81±22.37 |
| CD41a+ | 49.9±12.1 | 38.22±18.14 | 40.86±15.02 | 33.74±12.2 |
| CD34+/41a+ | 5.61±4.36 | 10.03±4.79 | 36.31±6.39 | 12.42±3.41 |
| CD61+ | 38.8±13.6 | 34.18±17.15 | 33±13.02 | 29.98±14.42 |
| CD41/CD61+ | 37.9±15.8 | 25.07±15.13 | 29.97±15.36 | 24.79±19.67 |
| CD42b | 34.27 |
(b)扩增10天时
| 10D | TPO(50) | TPO+IL-11(50) | T+IL-11+H(0，25) | T+IL-11+H(3，25) |
| Cell fold | 37.4±13 | 47.73±13.45 | 36.1±8.63 | 45.87±8.81 |
| CD34+ | 3.39±1.9 | 3.767±2.92 | 2.835±1.29 | 2.73±1.48 |
| CD41a+ | 75.5±8.81 | 62.98±12.88 | 69.26±16.88 | 72.5±15.44 |
| CD34+/41a+ | 0.79±0.58 | 0.823±0.36 | 0.92±0.33 | 0.44±0.26 |
| CD61+ | 78.2±5.41 | 71.24±10.9 | 68.095±11.93 | 82.02±8.57 |
| CD41/CD61+ | 72.5±8.78 | 67.59±11.68 | 61.39±21.45 | 73.69±12.67 |
| CD42b | 88.81±2.56 | 69.39±15.76 | 61.29±17.61 | 69.22±19.57 |
TPO(50ng/ml)单独作用时，第7天细胞总数分别扩增4.6±2.31倍，CD41a/CD34+细胞扩增4.01±1.69倍，CD41a+细胞扩增21.3±3.73倍，CD61+细胞扩增21.4±3.92倍，CD41a/CD61+细胞扩增11.7±2.72倍；TPO(50ng/ml)与IL-11(50ng/ml)联合作用时，7天计数细胞总数扩增6.74±1.35倍，CD41a/CD34+细胞扩增10.51±4.79倍，比TPO(50ng/ml)单独作用时增加了2.62倍，CD34+细胞扩增1.49±1.04倍，较TPO(50ng/ml)单独作用时增加了1.84倍，CD41a+细胞扩增24.28±15.02倍，CD61+细胞扩增27.69±17.15倍，CD41a/CD61+细胞扩增20.74±15.73倍，没有比TPO(50ng/ml)单独作用时增加；
在TPO(50ng/ml)和IL-11(50ng/ml)的扩增体系中，第0天加入肝素(25Iu/ml)，7天总体细胞倍数CD41a+，CD61+，CD41a/CD61+扩增没有比单因子及双因子的扩增体系增加，CD34+细胞为无肝素组的1.24倍，CD41a/CD34+细胞肝素组为无肝素组的2.85倍，扩增达到29.93±6.39倍，与双因子组相比差异显著(P＝0.002，＜0.01)第3天加入肝素时，CD34+细胞为无肝素组的1.22倍，CD41a+，CD61+，CD41a/CD61+、CD41a/CD34+扩增无明显变化。
TPO(50ng/ml)单独作用第10天时，细胞总数分别扩增37.4±13倍，CD41a/CD34+细胞扩增4.6±2.49倍，CD41a+细胞扩增251.4±95.7，CD61+细胞扩增336.2±147.5倍，CD41a/CD61+细胞扩增171.7±68；再加入IL-11(50ng/ml)后，10天细胞总数扩增47.73±13.45倍，CD34+、CD41a/CD34+细胞分别扩增了2.33±1.64、6.11±0.36倍，较TPO(50ng/ml)单独作用时增加了1.42、1.33倍，CD41a+、CD61+、CD41a/CD61+细胞分别扩增了283.32±12.88、408.69±10.9、216.51±11.68倍，较TPO(50ng/ml)单独作用时增加了1.13、1.22、1.26倍；在上述体系中0天加入肝素，第10天CD41a+、CD61+、CD41a/CD61+较没有比无肝素的其它二组增加，3天加入肝素，10天CD34+、CD41a/CD34+、CD41a/CD61+较无肝素组没有增加，CD41a+、CD61+较无肝素组增加1.11、1.11倍，肝素在第5天，7天加入对巨核祖细胞的扩增没有明显作用。
扩增后进行巨核细胞集落(CFU-MK)分析，发现TPO(50ng/ml)单独作用后7天，巨核祖细胞集落中的小集落(3-10个)扩增了96.44±19.73倍，中等集落中(11-20个)扩增了117.72±36.33倍，(20-50个)扩增了67.49±29.9倍，大集落(＞50个)扩增了32.95±3.56倍；加入IL-11(50ng/ml)后，小集落(3-10个)扩增了73.17±18.8倍，中等集落中(11-20个)扩增了82.42±24.4倍，(20-50个)扩增了99.74±14.21倍，大集落(＞50个)扩增了70.92±18.79倍；加入肝素(25Iu/ml)后，7天巨核细胞集落中，小集落(3-10个)扩增了99.11±17.92倍，中等集落中(11-20个)扩增了132.74±32.11倍，(20-50个)扩增了123.5±39.62倍，大集落(＞50个)扩增了84.02±41.8倍。
TPO(50ng/ml)单独作用后10天后，巨核细胞集落中的小集落(3-10个)扩增了270.8±23.56倍，中等集落中(11-20个)扩增了31.28±10.32倍，(20-50个)扩增了9.58±5.63倍，大集落(＞50个)扩增了3.68±1.36倍；加入IL-11(50ng/ml)后，小集落(3-10个)扩增了326.87±25.64倍，中等集落中(11-20个)扩增了32.48±13.26倍，(20-50个)扩增了11.38±7.89倍，大集落(＞50个)扩增了11.2±5.63倍；加入肝素(25u/ml)后，7天巨核细胞集落中的小集落(3-10个)扩增了369.17±34.16倍，中等集落中(11-20个)扩增了134.68±23.6倍，(20-50个)扩增了34.71±15.3倍，大集落(＞50个)扩增了26.6±10.1倍。
如图5所示，取TPO+IL11+肝素组合扩增后的细胞作May-Grunwald-Giemsa染色，发现多倍体的巨核细胞，其数量随培养天数的增加而增加。免疫组化分析巨核细胞随培养天数的增加而增多，10天为(60-70)％，14天时达(80-90)％。透射电镜及血小板过氧化物酶(PPO)检测发现，培养10天，14天的透射电镜显示培养的巨核细胞有正常的巨核细胞形态，胞浆出现界膜，血小板过氧化物酶(PPO)实验显示细胞核膜、内质网为阳性，线粒体及颗粒为阴性，细胞外形不规则，有伪足、突起，94％以上为巨核细胞，如图6。
实施例2.脐带血CD34阳性细胞体外扩增的巨核细胞产品的应用
1)本实例取正常分娩的脐带血，采用磁珠亲和柱(MACS)分离法分离CD34+细胞，加入含TPO+IL-11+Heparin的无血清培养基中定向扩增7天，收集巨核细胞，制成1×107/100ul备用。
2)非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)经Cs源照射(275cGy)后随机分为两组，一组为尾静脉注射PBS组，另一组为尾静脉注射扩增的上述巨核细胞组，注射均在照射后4小时内进行，移植1×107/100ul的巨核细胞，在移植后的第7天，14天，21天分别测小鼠的外周血象、流式细胞仪检测外周血人的血小板及骨髓中人的细胞。
3)移植巨核细胞体内实验结果
移植巨核细胞7、14、21天后，流式细胞仪检测鼠骨髓中人细胞的含量及外周血中检测人血小板的含量，移植后7天，小鼠骨髓中人CD45、CD41a未检测到，外周血中人CD41a阳性率为6.88％；14天小鼠骨髓中人CD45阳性率为0.69％，CD41a阳性率为0.24％，外周血中人CD41a阳性率为8.98％，21天小鼠骨髓中人CD45阳性率为6.15％，外周血中人CD41a阳性率为13.85％。
巨核祖细胞的移植极大地改善了血小板减少症的出现。对照组PBS组中50％小鼠死亡。而移植细胞组小鼠状态明显好于对照组，可全部长期存活。外周血象检测，第3天血小板可达56万，14天为54万，21天为98万，均明显好于对照组，14天对照组为8万，21天为16万，两组间有统计学差异(P＜0.05)；同时，移植后21天小鼠白细胞也有明显恢复，达6.2×109/L，明显好于对照组1.6×109/L。
本发明成功地建立了诱导干细胞定向分化巨核细胞的扩增体系，即以TPO加IL-11在加肝素为刺激因子的体系。使用的IL-11和肝素均为临床用药，TPO也在临床试验之中，因子组合简单经济、扩增效果显著、小鼠体内实验证实能生成血小板并明显改善照射小鼠的造血恢复，特别是血小板减少的状况，移植后小鼠可全部存活，而对照组则有50％的小鼠死亡。这种新的巨核细胞扩增体系为促进干细胞移植后病人血小板的恢复提供了新的细胞治疗制剂。
Claims (6)
1、一种通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法，是以包括脐带血、骨髓在内的造血组织中分离提取的干细胞为种子细胞，在包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的无血清培养基中定向扩增。
2、根据权利要求1所述的通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法，其特征是所述的无血清培养基中含有血小板生成素(TPO)：50-200ng/ml，白介素-11(IL-11)：12.5-200ng/ml，肝素(Heparin)：5-100IU/ml。
3、根据权利要求2所述的通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法，其特征是所述的培养基中最佳浓度是：TPO，50ng/ml；IL-11，50ng/ml；肝素，25IU/ml。
4、根据权利要求1所述的通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法，其特征是用CD34+分离试剂盒从脐血或骨髓中分离CD34+细胞，接种于培养瓶或培养袋中，在添加了包含血小板生成素(TPO)，白介素-11(IL-11)和肝素(Heparin)的无血清培养基中培养7天，细胞总数扩增5.3±3.25倍，其中(40.86±15.02)％为巨核祖细胞和成熟巨核细胞，还含有(39.98±25.47)％的CD34+干祖细胞，培养10天后，细胞数扩增36.1±8.63倍，其中(69.26±16.88)％为巨核祖细胞和成熟巨核细胞，还含有(2.835±1.29)％的CD34+干祖细胞。
5、权利要求1制备的巨核细胞制剂在治疗放化疗后、干细胞移植及其他原因引起的血小板减少症的药物中的用途。
6、根据权利要求5所述的巨核细胞制剂的用途，其特征是所述的巨核细胞制剂经静脉输入到辐射动物体内可进入骨髓，可显著增加动物生存率，帮助动物恢复血小板及其它血细胞，应用于治疗各种原因导致的血小板减少症。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2003101221446A CN1302102C (zh) | 2003-12-29 | 2003-12-29 | 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2003101221446A CN1302102C (zh) | 2003-12-29 | 2003-12-29 | 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1554748A true CN1554748A (zh) | 2004-12-15 |
| CN1302102C CN1302102C (zh) | 2007-02-28 |
Family
ID=34338625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2003101221446A Expired - Fee Related CN1302102C (zh) | 2003-12-29 | 2003-12-29 | 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1302102C (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006076627A3 (en) * | 2005-01-12 | 2007-03-08 | Massachusetts Inst Technology | Methods and compositions related to modulating the extracellular stem cell environment |
| CN101273124B (zh) * | 2005-08-25 | 2013-05-08 | 亚利桑那大学董事会 | 干细胞融合癌发生模型 |
| CN107058242A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-08-18 | 河南中医药大学 | 鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂 |
| CN112280739A (zh) * | 2008-05-06 | 2021-01-29 | 安斯泰来再生医药协会 | 用于制备衍生自多能干细胞的去核类红细胞的方法 |
| CN113502263A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-10-15 | 华南理工大学 | 一种促分化培养基及促进cd34阳性细胞分化为血小板的方法 |
| CN114634906A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-17 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种成分明确、效果确切的体外高效诱导巨核祖细胞分化体系 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1064081C (zh) * | 1994-11-04 | 2001-04-04 | 上海贝特生物技术有限公司 | 造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的扩增方法 |
-
2003
- 2003-12-29 CN CNB2003101221446A patent/CN1302102C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006076627A3 (en) * | 2005-01-12 | 2007-03-08 | Massachusetts Inst Technology | Methods and compositions related to modulating the extracellular stem cell environment |
| CN101273124B (zh) * | 2005-08-25 | 2013-05-08 | 亚利桑那大学董事会 | 干细胞融合癌发生模型 |
| CN112280739A (zh) * | 2008-05-06 | 2021-01-29 | 安斯泰来再生医药协会 | 用于制备衍生自多能干细胞的去核类红细胞的方法 |
| CN107058242A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-08-18 | 河南中医药大学 | 鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂 |
| CN107058242B (zh) * | 2017-04-10 | 2020-10-13 | 河南中医药大学 | 鼠抗人cd61单克隆抗体杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、流式检测试剂 |
| CN113502263A (zh) * | 2021-06-09 | 2021-10-15 | 华南理工大学 | 一种促分化培养基及促进cd34阳性细胞分化为血小板的方法 |
| CN113502263B (zh) * | 2021-06-09 | 2023-05-23 | 华南理工大学 | 一种促分化培养基及促进cd34阳性细胞分化为血小板的方法 |
| CN114634906A (zh) * | 2022-01-26 | 2022-06-17 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种成分明确、效果确切的体外高效诱导巨核祖细胞分化体系 |
| CN114634906B (zh) * | 2022-01-26 | 2024-02-09 | 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) | 一种成分明确、效果确切的体外高效诱导巨核祖细胞分化体系 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1302102C (zh) | 2007-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102639694A (zh) | 制备间充质干细胞、组合物和其试剂盒的方法 | |
| CN104920340A (zh) | 一种免疫细胞保存液及其应用 | |
| CN113181215B (zh) | 一种骨髓间充质干细胞外泌体制剂及促进造血损伤恢复的用途 | |
| CN104845934A (zh) | 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法 | |
| CN104789530B (zh) | 一种增加脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法 | |
| CN111944754A (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养方法 | |
| CN107034189A (zh) | 一种造血干细胞培养方法 | |
| CN114507640B (zh) | 一种高增殖能力和高细胞毒性cik细胞的培养方法及其应用 | |
| CN1302102C (zh) | 通过扩增巨核祖细胞和成熟巨核细胞制备巨核细胞制剂的方法及用途 | |
| CN105713875A (zh) | Nk细胞的分选方法 | |
| CN1844373A (zh) | 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法 | |
| CN101182488A (zh) | 间充质干细胞的一种新用途 | |
| CN107974431B (zh) | 一种自然杀伤细胞的快速扩增方法 | |
| CN107099504A (zh) | 一种造血干细胞培养基 | |
| CN110607276A (zh) | 高效扩增脐带血nk细胞的无血清培养方法 | |
| CN111548994B (zh) | 一种细胞培养基及其培养nk细胞的方法 | |
| CN113549595A (zh) | 基于外周血的nk细胞体外培养方法 | |
| CN113502266A (zh) | 一种外周血含有cik细胞的培养方法 | |
| Ende et al. | Pooled umbilical cord blood as a possible universal donor for marrow reconstitution and use in nuclear accidents | |
| CN116832062A (zh) | 一种小分子抑制剂药物增强nk细胞抗肿瘤作用的用途及其应用 | |
| Lee et al. | A strategy for enhancing the engraftment of human hematopoietic stem cells in NOD/SCID mice | |
| CN108148805B (zh) | 一种人Tscm细胞及其制备方法和应用 | |
| CN114058584B (zh) | 一种临床用自然杀伤细胞的制备方法 | |
| CN112300992B (zh) | 一种nk细胞培养液及多级激活nk细胞的培养方法 | |
| CN107090434B (zh) | 一种提高cik细胞培养效果的血液抗凝和保存方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070228 Termination date: 20101229 |