CN1554363A - 一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物的制备工艺，(1)选用HbsAb阳性、其它各种指标均为阴性的正常胎盘；(2)取上述胎盘用胶体磨匀浆；(3)将上述匀浆直接连续均匀加热灭活；(4)离心澄清收集上清液；再超滤收获滤液即为具有特异免疫活性的原液。本发明采用胶体磨胎盘匀浆；并将匀浆直接连续均匀加热灭活，而不影响制品活性；所提取的抗乙肝胎盘特异因子具有特异免疫活性，可用作治疗乙肝的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗体(HBsAb)阳性的人胎盘中提取的、针对乙型肝炎病毒的特异免疫活性因子，即抗乙肝胎盘特异因子提取物及其制备工艺。
背景技术
胎盘又名“紫河车”，其性温、味甘咸，入肺、肝、肾三经，有养血益精的功效，民间常用其煮烂食之，治疗虚损、赢瘦、咳喘、盗汗、遗精、阳痿等多种病症。在现代临床免疫学上有增强抵抗力和调节免疫力的作用。Y.KaTo曾报道用HbsAb阳性供者的白细胞制成特异性转移因子治疗慢性乙型肝炎取得较好疗效。
人胎盘属人体的临时性器官，简单易得，提取工艺简单。提取物主要成份为多肽及核苷酸，特异免疫活性明显，质量稳定、可控，无毒副作用，临床效果好。
我国HBV感染较为普遍，据有关权威机构统计，HbsAg携带者占总人口数的8％。发病总人数达3000万人，是危害人民健康的重要疾病。该发明转换有较大的社会和经济效益。
发明内容
本发明目的在于从HbsAb阳性胎盘中提取一种具有高效价特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物，作为药品用于治疗乙型肝炎。
本发明的另一个目的在于提供一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物的制备工艺。
为实现上述目的，本发明包括以下步骤：(1)选用HBsAb阳性、丙肝抗体(抗-HCV)、艾滋病抗体(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝指标(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均为阴性的正常胎盘；(2)取上述胎盘用胶体磨匀浆；(3)将上述匀浆直接连续均匀加热灭活；(4)离心，收集上清液；再超滤收获滤液即为具有特异免疫活性的原液。
本发明的具体步骤为：
1、选用HbsAb阳性，丙肝抗体、(抗-HCV)艾滋病抗体(抗-HIV)，梅毒及其它乙肝标(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均为阴性正常的胎盘；
2、初加工：取胎盘去除筋膜、脐带，将胎盘组织用注射用水冲洗、沥干、剪碎、称重，置无菌容器内，-20℃冻存；
3、匀浆调配：取上述胎盘组织解冻，用胶体磨匀浆，加注射用水冲洗胶体磨，冲洗液与组织匀浆混合，再与1.8％氯化钠液或水混匀，使氯化钠含量达0.9％，胎盘组织与水之比为1∶2～5；
4、病毒灭活：将上述匀浆置60℃±1.0℃，连续均匀水浴10小时，灭活；
5、离心澄清：匀浆灭活后经3000～10000rpm，离心30～70min收集上清液；
6、超滤：将上清液经100kD的中空纤维柱超滤，滤出液再用10kD的中空纤维柱超滤，收获滤液即为具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子原液。
本发明将所得的原液以生理盐水或注射用水调配，并以0.22μm的微孔滤膜除菌，其收获液为半成品；分装入瓶即为成品。
上述制备工艺提取的具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物，为澄清液体，其平均非粘附细胞指数≥50％；其HPLC指纹图谱显示出本提取物在10.0～28min保留时间内应有三个连续组份；以峰面积计算，这三个连续组份总含量≥90％；其中第三组份以峰面积计算的含量为55±10％；无分子量大于10kD的成份出现。
采用乙肝标志物全阴性胎盘提取的正常胎盘因子为对照药物，经体内及离体实验均能观察到用上述工艺提取的抗乙肝胎盘特异因子具有特异及非特异免疫活性，实验结果如下：
(一)对小鼠免疫器官和免疫细胞的影响
材料和方法
1.实验动物及分组Balb/C纯系小鼠30只，雄性，随机分成3组，分别为特异因子组和HBsAg+特异因子组及生理盐水对照组。
2.给药 按上述分组在注射特异因子前3天一次给小鼠注射HBsAg 1μg，然后每天分别给小鼠腹腔注射不同药物或生理盐水，剂量为0.2ml/只，共给七次，第八天实验。
3.细胞计数及分类 动物称重，眼眶取血，在2小时内计数白细胞并分类，用脂酶(ANAE)染色作T细胞计数。胞浆中有紫红色颗粒者为ANAE阳性细胞，即T细胞。以有1～3个明显颗粒者为T-样细胞(主要代表CD4)，有弥散细点者为Thy-样细胞(主要代表CD8)。
4.胸腺指数和脾指数的计算取小鼠胸腺和脾脏，用分析天平称重。比较各组间胸腺和脾脏的重量及胸腺指数(胸腺重mg/体重g)和脾指数(脾重mg/体重g)。
5.实验和结果
(1)胸腺 特异因子组的胸腺重量和胸腺指数均较对照组高，尤以HBsAg+特异因子明显，而且重量与指数相一致，见表1。
表1 特异因子对小鼠胸腺的影响
组别 动物数 胸腺重(mg) 胸腺指数
生理盐水 10 49.7±16.9 2.38±0.51
特异因子 10 68.5±20.1 2.91±0.71
HBsAg+特异因子 10 74.3±18.5* 3.43±0.67*
*P＜0.01
(2)脾脏 特异因子和HBsAg+特异因子组的脾重和脾指数与对照组无差别，见表2。
表2特异因子对小鼠脾脏的影响
组别 动物数 脾重(mg) 脾指数
生理盐水 10 132.4±35.5 5.57±1.42
特异因子 10 133.9±37.7 5.43±1.66
HBsAg+特异因子 10 129.1±32.1 5.55±1.31
(3)白细胞数 特异因子和HBsAg+特异因子组的白细胞总数和淋巴细胞均较生理盐水对照组高，特别是HBsAg+特异因子组淋巴细胞增加较明显，见表3。
表3特异因子对小鼠血白细胞数的影响
组别 动物数 白细胞数 淋巴细胞数
生理盐水 10 4487±1489 3255±991
特异因子 10 5454±1130 3875±1301
HBsAg+特异因子 10 5577±1356 4773±1008*
*P＜0.01
(4)特异因子对淋巴细胞亚群的影响HBsAg+特异因子组的小鼠血中ANAE阳性细胞比对照组明显增多，而且增多的主要是CD4细胞，而CD8细胞无明显变化。HBsAg+特异因子组的CD4细胞显著高于单纯特异因子组及生理盐水组P＜0.01，见表4。
表4小鼠淋巴细胞亚群的变化
组 别 动物数 淋巴细胞总数 阳性数 T-样 Thy-样
生理盐水 10 3287±532 2043±391 1089±157 955±193
特异因子 10 3792±597 2602±419 1427±125 1175±224
HBsAg+特异因子 10 4520±504* 3799±437* 2844±207* 955±210
*P＜0.01
6.结论
小鼠经HBsAg刺激，再注射特异因子后，可使外周淋巴细胞增多，主要是T-样细胞增多，特异因子对免疫小鼠胸腺作用明显，但脾重及脾指数则无变化，表明了特异因子的非特异免疫及针对HBV的特异免疫活性。
(二)特异因子对特异性淋巴细胞转化的影响
1.实验动物及分组
Balb/C纯系小鼠，8周龄，雄性。随机分为3组，实验组腹腔注射特异因子，剂量为0.2ml/日/只，连续7天给药；对照组腹腔注射正常胎盘因子和生理盐水，第10天实验。
2.淋巴细胞转化试验
无菌条件下取小鼠脾脏，每组3只小鼠脾脏混合、磨碎，以含有10％小牛血清的培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为8.0×106/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100ul，分别用不同剂量HBsAg或HBsAg和ConA共同刺激，于37℃，5％CO2孵箱温育。在3、5、7天加入MTT(四甲基偶氮唑兰)染料，2小时后加入助溶剂，再温育12～18小时后用酶联仪测定，结果以OD值表示。
3.抗原刺激剂量的选择
采用经HBsAg腹腔免疫三次的小鼠脾细胞作为致敏的淋巴细胞，用不同剂量HBsAg刺激进行淋转试验，找出最适抗原刺激剂量用于试验。
4.实验结果
(1)抗原刺激剂量的选择 选择不同浓度的HBsAg刺激致敏小鼠脾细胞5天，结果见表5。
表5抗原剂量与淋巴细胞转化
HbsAg浓度(μg/ml)
组 别 0.0 0.1 1.0 2.0
实验组 0.464±0.029 0.473±0.019 0.547±0.038 0.661±0.033*
对照组 0.418±0.037 0.403±0.037 0.431±0.047 0.422±0.021
注：n＝3*免疫鼠的0.0组与2.0μg组相比P＜0.05
结论：免疫小鼠的淋巴细胞转化在抗原剂量为2.0μg/ml时明显高于对照组(P＜0.05)，而正常鼠淋巴细胞的转化与刺激原(HBsAg)无关。因而，选择2.0μg/ml为实验用抗原刺激量。
(2)特异因子对小鼠特异性淋巴细胞转化的影响以2.0μg/ml的HBsAg为刺激原，比较注射特异因子(特异)和注射正常胎盘因子(正常)及生理盐水(生盐)小鼠的淋巴细胞在不同时间的转化值，并计算刺激指数(SI)，结果见表6。
表6特异因子对小鼠淋巴细胞特异性转化的影响
组别 刺激时间(天) 对照组 抗原组 SI
生盐 0.293±0.083 0.308±0.024 1.05
正常 3 0.342±0.039 0.371±0.017 1.08
特异 0.377±0.018 0.444±0.022 1.17
生盐 0.493±0.032 0.517±0.042 1.05
正常 5 0.665±0.028 0.735±0.061 1.15
特异 0.720±0.017 1.494±0.055 2.08
生盐 0.422±0.014 0.441±0.036 1.05
正常 7 0.478±0.021 0.485±0.023 1.01
特异 0.450±0.031 0.853±0.042 1.90
注：n＝3
结论：注射特异因子的小鼠，其脾细胞在HBsAg刺激下，5～7天后表现出抗原特异的淋转活性(SI为1.90～2.08)。而注射正常胎盘因子的小鼠，其脾细胞则无该现象，表明了特异因子的HBV特异免疫活性。
(3)特异因子对非特异激原(ConA)刺激小鼠淋巴细胞转化的影响将注射特异因子和正常胎盘因子的小鼠淋巴细胞用定量HBsAg与ConA(1μg/ml)共同刺激，孵育3天后观察结果，见表7。
表7特异因子对ConA刺激小鼠淋转的影响
HBsAg剂量(μg/ml)
组别 0.0 2.0 4.0
盐水组 0.691±0.027 0.717±0.032 0.713±0.025
正常组 0.736±0.042 0.742±0.010 0.745±0.035
特异组 1.433±0.037* 1.451±0.023* 1.429±0.027*
注：n＝3 *与正常组及盐水组比较P＜0.01
结论
特异因子使小鼠淋巴细胞对ConA的反应明显增强，表明其具有较强的非特异免疫活性。特异因子是由HBsAb阳性胎盘提取的一种免疫调节剂，小鼠经注射后可使其淋巴细胞再次接触HBsAg时，发生特异性转化增殖反应。表明特异因子能将对HBsAg特异细胞免疫活性转移给正常受体，使后者获得抗乙肝病毒的免疫信息。
(三)白细胞移动抑制试验
1.实验动物及给药方法
Balb/C纯系小鼠12只，8周龄，雄性，随机分为3组，腹腔注射特异因子，剂量为0.2ml/只/日，连续给药7天。
2.琼脂平板的配制
取1.0g琼脂糖加Hank’s液90.0ml，煮沸溶化、待冷至47℃左右，加入已预热到40℃的灭活小牛血清10ml，混匀，即约为1％的琼脂糖，迅速取5ml注入备好的无菌平皿(直径为5cm)中。待琼脂凝固后用直径为3.0mm的打孔器在平皿中打孔。
3.试验方法
将小鼠断颈处死，用新洁尔灭消毒皮肤，打开腹腔，注入Hank’s液与10U/ml的肝素5～10ml，洗吸腹腔巨噬细胞(包括淋巴细胞)，1000rpm离心5min，弃上清，用Hank’s液洗2～3次，用细胞培养液调节细胞浓度至1.0×107/ml，冰浴保存。同时取小鼠脾脏研磨制成1.0×107/ml淋巴细胞悬液，两种细胞悬液等量混合后分成三等份，分别加入等量的培养液极其配制的HbsAg，使HbsAg的浓度分别为0、2、4μg/ml，混匀后加入琼脂糖孔内，每孔10ul，每组3个复孔。将琼脂糖板放入湿盒，置于37℃5％CO2培养箱中，孵育24小时。慢慢浸入沸水中3～5分钟，取出浸入冷蒸馏水中将琼脂糖漂洗干净，温箱干燥，于镜下测量每孔细胞移动的直径(每孔2～4条直径的均值)。
4.计算方法：
5.结果
以2.0μg/ml与4.0μg/ml HBsAg刺激无统计学差异，但二者MI均小于40％，结果见表8。
表8特异因子体内诱导的巨噬细胞移动抑制因子测定结果
HBsAg浓度 移动直径(mm) MI(％)
(μg/ml)
0 6.23±0.404 0
2 1.27±0.153 20.3±1.14
4 1.33±0.252 21.4±3.47
6.结论
正常小鼠腹腔注射特异因子，其淋巴细胞用HBsAg刺激，可释放出移动抑制因子，使巨噬细胞的移动明显受抑，表明特异因子具有对HBV抗原的特异免疫活性。
(四)特异因子诱导的白细胞的粘附抑制反应
1.实验动物及给药方法
Balb/C纯系小鼠12只，8周龄，雄性，随机分为3组，腹腔注射特异因子，剂量为0.2ml/只/日，连续给药7天。
2.方法
(1)体内给药法小鼠断颈处死后消毒，用Hank’s液洗出腹腔巨噬细胞，再取出脾脏制成单细胞悬液。用Tris-NH4Cl溶解红细胞后计数，将两种细胞液等浓度混合后配成1.0×107/ml单细胞悬液，接种入平底小瓶，每瓶0.1ml；加不同浓度HBsAg0.1ml；最后加1640营养液补足到0.4ml，每组设3个复瓶，直立放置在37℃CO2％孵箱内。1小时后，吸取上层细胞悬液，计数未粘附的细胞。按下列公式计算白细胞粘附抑制指数(LAI)
(2)体外过继法 收集正常小鼠腹腔巨噬细胞及脾细胞，配成1×107/ml，选择不同稀释倍数的特异因子体外过继，37℃孵育1小时后，用培养液洗去特异因子，以2μg/ml的HBsAg刺激，重新悬浮并按(1)方法进行。
3.结果
(1)体内注射特异因子的小鼠巨噬细胞粘附抑制结果 用不同浓度抗原刺激，每剂量3个复瓶，以3个不加抗原瓶的平均值为对照，选择1～4μg/ml抗原均可显示对小鼠巨噬细胞粘附的抑制作用，见表9。
表9 特异因子体内诱导小鼠淋巴细胞粘附抑制因子的结果
实验组细胞均数 对照组细胞均数 LAI细胞指数
HBsAg(μg/ml)
(×104/ml) (×104/ml)
1 11.3 4.7 140.4
2 18.7 297.9
4 9.7 106.4
(2)特异因子体外对产生白细胞粘附抑制的影响用2倍或4倍稀释的特异因子体外过继的淋巴细胞，在抗原刺激下可以产生粘附抑制作用，抑制指数大于30。原液可能对细胞的活性有影响，结果见表10。
表10特异因子体外对小鼠淋巴细胞粘附抑制因子的影响
实验组细胞均数 对照组细胞均数 指数
特异因子
(×104/ml) (×104/ml)
原液 37.7 31.7 18.9
2× 39.3 9.0 336.7
4× 35.3 8.3 325.3
4.结论
结果表明：不论是体内还是体外，特异因子均可致敏正常小鼠淋巴细胞，遇到HBgAg时产生特异免疫反应。进一步表明了特异因子针对HBV的特异免疫活性。
(五)特异因子对HBsAg诱生γ-干扰素的影响
1.实验动物及分组
取Balb/c纯系雄性小鼠，8周龄，随机分成对照组和实验组。实验组腹腔注射特异因子，剂量为0.2ml/只/日，对照组以生理盐水代替特异因子，连续给药7天，第8天试验。
2.γ-干扰素的诱生
无菌条件下取脾脏制成8.0×106/ml脾细胞悬液，接种到24孔细胞培养板中，每孔1ml，同时将1640培养液、ConA(4.0μg/ml)液、HBsAg(4.0μg/ml)液和ConA与HBsAg混合液等四种刺激原各1ml分别加到不同孔内，使其刺激原的终浓度分别为0、ConA2.0μg/ml、、HbsAg2.0μg/ml及ConA与HbsAg各2.0μg/ml，37℃5％CO2孵箱培养，于第48h和第72h各收集部分上清液，置于-20℃冰箱内，供测干扰素。
3.γ-干扰素测定
将培养24～48h的L929细胞经胰酶消化后，调整细胞浓度为5×105/ml，接种于48孔细胞板，100μl/孔，分别加入对倍稀释的鼠标准γ-干扰素和待测样品，100μl/孔。37℃CO2孵箱培养长成单层后(约2～3h)，用1∶200稀释VSV病毒攻击，100μl/孔，继续培养24～48h，待未加干扰素的对照孔里细胞全部死亡后，用结晶紫溶液染色，肉眼观察结果，与标准干扰素比较并换算出每毫升待测样品中干扰素的单位数。
4.实验结果
(1)HBsAg诱导对照组小鼠脾细胞产生干扰素 选择不同刺激原对盐水组小鼠脾淋巴细胞刺激48h和72h，收取上清液测定其诱生干扰素的含量。结果显示HBsAg不能诱导小鼠脾细胞产生γ-干扰素，反而抑制ConA诱生干扰素，见表11。
表11 对照组小鼠脾细胞诱生γ-干扰素的水平
测定结果(u/ml)
组别 刺激原 1 2 3 4 x±s P值
0 18.5 13.5 8.2 16.8 14.3±4.5
｝＞0.05
诱 HBsAg 6.7 18.2 0.0 12.4 9.3±7.8
生 ConA 250.0 250.0 124.0 73.7 174.4±89.6
48h ｝＜0.05
ConA+HBsAg 55.7 32.0 133.0 125.0 86.4±50.2
0 13.5 6.7 0.0 15.7 9.0±7.1
}＞0.05
诱 HBsAg 0.0 21.6 7.5 0.0 7.3±10.2
生 ConA 75.3 129.0 189.5 153.0 136.7±47.9
72h ｝＜0.05
ConA+HBsAg 48.0 63.6 40.0 69.0 55.1±13.5
(2)HbsAg诱导实验组小鼠脾细胞产生干扰素 选择不同刺激原对实验组小鼠脾淋巴细胞刺激48h和72h，收取上清液测定其诱生干扰素的含量。结果显示：以HbsAg诱导48h对ConA诱生细胞产生γ-干扰素无影响；诱导72h可产生γ-干扰素且明显高于无刺激原组。HbsAg对ConA诱导实验组小鼠脾细胞产生γ-干扰素具有明显地协同作用(表12)。
表12实验组小鼠脾细胞诱生γ-干扰素的水平
测定结果(u/ml)
组别 刺激原 1 2 3 4 x±s P值
0 11.7 26.6 112.0 34.0 23.1±9.5
｝＞0.05
诱 HBsAg 32.4 13.2 21.8 24.7 23.0±7.9
生 ConA 125.0 52.7 137.4 48.9 91.0±46.7
48h ｝＞0.05
ConA+HBsAg 96.0 267.1 40.0 39.6 110.7±107.5
0 14.9 12.5 5.6 8.0 10.3±4.2
}＜0.01
诱 HBsAg 49.0 22.4 36.7 23.3 32.9±12.6
生 ConA 31.4 28.7 46.6 22.5 32.3±10.2
72h }＜0.01
ConA+HBsAg 95.4 112.0 110.0 105.4 105.7±7.4
实验组小鼠脾细胞以HBsAg诱导72h可以产生γ-干扰素，并且HbsAg对ConA诱导实验组小鼠脾细胞产生γ-干扰素具有明显地协同作用；而对照组则不能。也表明了胎盘特异因子针对HBV的特异免疫活性。
本发明采用胶体磨胎盘匀浆；并将匀浆直接60±1.0℃连续均匀加热灭活，而不影响制品活性；所提取的抗乙肝胎盘特异因子具有特异免疫活性，可用作治疗乙肝的药物。
附图说明
图1为本发明提取物抗乙肝胎盘特异因子的HPLC指纹图谱。
具体实施方式
1、选用HBsAb阳性，丙肝抗体(抗-HCV)、艾滋病抗体(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝标(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均为阴性正常的胎盘；
2、初加工：取胎盘去除筋膜、脐带，将胎盘组织用注射用水冲洗、沥干、剪碎、称重，置无菌容器内，-20℃冻存；
3、匀浆调配：取上述胎盘组织解冻，用胶体磨匀浆，加注射用水冲洗胶体磨，冲洗液与组织匀浆混合，再与1.8％氯化钠液或水混匀，使氯化钠含量达0.9％，胎盘组织与水之比为1∶3；
4、病毒灭活：将上述匀浆置60℃，连续均匀水浴10小时，灭活；
5、离心澄清：匀浆灭活后经3000-10000rpm，4℃离心60min收集上清液；
6、超滤：将上清液经100kD的中空纤维柱超滤，滤出液再用10kD的中空纤维柱超滤，收获滤液即为具有特异免疫活性的原液。
将所得的原液以生理盐水或注射用水调配，使其符合以下参数标准，其中PH为6.5～7.5；蛋白质反应为阴性；多肽含量≥0.5mg/ml；核糖含量≥80μg/ml；特异免疫活性即平均非粘附细胞指数≥50％；并以0.22μm的微孔滤膜除菌，其收获液为半成品；
对半成品进行检定：无菌试验为阴性；内毒素测定＜10EU/ml。
将半成品分装2mL/支，即为成品。每支装量2ml，多肽含量≥0.5mg/ml。
对成品进行检定：
1、外观：应为澄明液体，不应有异物、浑浊或沉淀。
2、化学检定：PH为6.5～7.5；蛋白质反应为阴性；多肽含量≥0.5mg/ml；核糖含量≥80μg/ml。
3、无菌试验：合格
4、热原质试验：家兔注射剂量为3ml/kg体重，合格。
5、异常毒性(小鼠试验)：合格。
6、HbsAg检测：阴性。
7、免疫活性：平均非粘附细胞指数≥50％。
8、HPLC指纹图谱(见图1)：条件：Pack Doil-200(8.0×300mm)色谱柱，以0.1M PB-0.1M Na2SO4-0.05％NaN3pH7.0的缓冲液为流动相，检测波长260nm，流速0.6mL/min，灵敏度0.08AUFS，对样品稀释20倍。
HPLC指纹图谱显示：①本品在10.0～28min保留时间内定有三个连续组份；②3组份总含量≥90％(以峰面积计算)；③第三组份含量为55±10％(以峰面积计算)；④没有出现分子量大于10kD的成份。
Claims (4)
1、一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：(1)选用HBsAb阳性、丙肝抗体(抗-HCV)、艾滋病抗体(抗-HIV)、梅毒及其它乙肝指标(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均为阴性的正常胎盘；(2)取上述胎盘用胶体磨匀浆；(3)将上述匀浆直接连续均匀加热灭活；(4)离心澄清收集上清液；再超滤收获滤液即为具有特异免疫活性的原液。
2、根据权利要求1所述的具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物的制备工艺，其特征在于包括以下的具体步骤：
(1)选用HBsAb阳性，丙肝抗体(抗-HCV)艾滋病抗体(抗-HIV)，梅毒及其它乙肝标(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)均为阴性的正常胎盘；
(2)初加工：取胎盘去除筋膜、脐带，将胎盘组织用注射用水冲洗、沥干、剪碎、称重，置无菌容器内，-20℃冻存；
(3)匀浆调配：取上述胎盘组织解冻，用胶体磨匀浆，加注射用水，冲洗胶体磨的冲洗液与组织匀浆混合再与1.8％氯化钠液或注射用水混匀，使氯化钠含量达0.9％，胎盘组织与水之比为1∶2～5；
(4)病毒灭活：将上述匀浆置60℃±1.0℃，连续均匀水浴10小时，灭活；
(5)离心澄清：匀浆灭活后经3000-10000rpm，4℃离心50min-70min收集上清液；
(6)超滤：将上清液经100kD的中空纤维柱超滤，滤出液再用10kD的中空纤维柱超滤，收获滤液即为具有特异免疫活性的原液。
3、根据权利要求1所述的具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物的制备工艺，其特征在于以生理盐水或注射用水调配所得的原液，以0.22μm的微孔滤膜除菌，其收获液为半成品；将半成品分批，并分装入瓶即为成品。
4、权利要求1所述的制备工艺提取的具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物，其特征在于为澄清液体，其特异免疫活性指标平均非粘附细胞指数≥50％；其HPLC指纹图谱显示出本提取物在10.0-28min保留时间内定有三个连续组份；以峰面积计算，这三个连续组份总含量≥90％；其中第三组份以峰面积计算的含量为55±10％；另外无分子量大于10kD的成份出现。
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2003
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