CN107028982A - 人胎盘乙型肝炎特异免疫活性多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂的制备方法，其中利用乙型肝炎病毒(HBV)表面抗体(HBsAb)阳性的人胎盘，提取人胎盘中分子量在10kd以下的小分子物质，包括多肽、核酸等物质，制备成为注射制剂，包括注射液和冻干粉针。本发明还提供通过上述方法获得的生物制剂，并利用蛋白组学的方法，对其中的多肽进行初步的分析，发现23种多肽成分，并获得23种多肽的氨基酸序列。本发明还提供上述生物制剂在治疗肝炎、肝硬化和肝癌中的应用。

Description

人胎盘乙型肝炎特异免疫活性多肽

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，更具体地，本发明提供一种新的含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂的制备方法以及通过该方法获得的生物制剂。本发明还提供上述生物制剂在治疗乙型肝炎中的应用。

背景技术

胎盘(placenta)是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。胎盘由羊膜(amniotic membrane)、叶状绒毛膜(chorionfrondosum)和底蜕膜构成。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。在活体内，胎盘还产生多种维持妊娠的激素，是一个重要的内分泌器官。

妊娠分娩之后，胎盘为临床医学的废弃物。但中医将其归入中药的范畴，名为“紫河车”，其性温、味甘咸，入肺、肝、肾三经，有养血益精的功效。民间常用其煮烂食之，治疗虚损、羸瘦、咳喘、盗汗、遗精、阳痿等多种病症。

人胎盘的成分较复杂，还含有干扰素(interferon)，有抑制多种病毒对人细胞的作用，含有的巨球蛋白称为β抑制因子(β-inhibitor)，能抑制流感病毒。胎盘中含有与血液凝固有关的成分，有类似凝血因子Ⅻ的纤维蛋白稳定因子；尿激酶抑制和纤维蛋白溶酶原活化物。人胎盘中还含有许多激素：促性腺激素(gonadotropin)A和B，催乳素(lactogen)，促甲状腺激素(thyrotropin)，催产素样物质，多种甾体激素和雌酮(estrone)，雌二醇(estradiol)，雌三醇(estriol)，孕甾酮(progesterone)，睾丸甾酮(testosterone)，去氧皮质甾酮(deoxycorticosterone)，11-去氢皮质甾酮(11-dehydrocorticosterone)(化合物A)，可的松(cortisone)(化合物B)，17-羟皮质甾酮(17-hydroxycorticosterone)(化合物F)，四氢皮质甾酮(tetrahydrocorticosterone)，4-孕烯-20，21-二醇-3，11-二酮(4-pregnen-20,21-diol-3,11-dione)，绒毛膜促腺激素(chorionicgonadotropin)等及促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropichormone)等。人胎盘中还含有多种有应用价值的酶，如溶菌酶(lysozyme)，激肽酶(kininase)，组胺酶(histaminase)，催产素酶(oxytocinase)，清蛋白酶，α-球蛋白酶，β-球蛋白酶，γ-球蛋白酶等。此外，尚含有红胞生成素，磷脂(phospholipid)，β-内啡肽(β-endorphin)，氨基多糖体(系由8分子乙酰氨葡萄糖、6分子甘露糖所组成)。胎盘乳原(多肽化合物)含多种氨基酸，并含微量维生素B12，乙酰胆碱及碘等。

胎盘免疫调节肽是一种可透析、可超滤的多肽,含有16种氨基酸，分子量为6000以下的小分子物质,疗效与转移因子相似。安全、无毒副作用并对BALB/C小鼠具有促进生长、发育的功能；可使95.2％的PHA皮试阴性者转阳；使因温育37℃而降低的玫瑰花结形成率恢复至活性花结水平,经164例临床应用研究证明,本品可不同程度地提高患者的细胞免疫功能,是一种比较满意的免疫调节剂。(彭立义等：胎盘免疫调节肽的鉴定与临床应用。济南军区总医院免疫科；济南军区总医院免疫科；新药与临床：1990年03期)。

于2013年，韩国Yonsei大学利用正常人和先兆性子痫病人的胎盘组织作为研究对象，用蛋白组学的分析方法，对人胎盘组织中蛋白质和多肽做了分析，结果发现人胎盘组织中含有4239种特异性蛋白质，219种N-末端链接的多糖肽(N-linked glycopeptides)，592种特异性的磷酸蛋白肽(phosphopeptides)，66种13染色体特异性蛋白质。28种为先兆性子痫特异性蛋白(preeclampsia-specific proteins)。(Lee HJ et al:ComprehensiveGenome-Wide Proteomic Analysis of Human Placental Tissue for the Chromosome-Centric Human Proteome Project.J Proteome Res.2013Feb 14.)。但这些特异性蛋白质和多肽的生物学效用还有待进步研究。

济南军区肝病研究所张光曙教授所领导和主持的研究小组，通过三十年的临床研究发现利用乙肝病毒表面抗原抗体阳性的人胎盘作为转移因子和核糖核酸制备的材料，制备分子量在8000以下的胎盘转移因子，在全国共21个研究单位，观察1560病例，发现该转移因子来治疗慢性乙型肝炎，以及与乙肝病毒感染相关的肝硬化和肝癌获得相当好的临床疗效。同时，用于丙型肝炎(115例)也有治疗效果，对癌症病人免疫系统的增强作用十分明显。

CN1049119C公开了一种抗乙肝胎盘转移因子注射液的制备方法，该方法工艺复杂，在制备过程中需要添加36％的甲醛作为灭活剂，存在显著的毒副作用。

CN1299763C公开了一种抗乙肝人体胎盘转移因子粉针剂的制备方法，该方法在制备时需要2-5次冻融(耗时24-50h)，制备时间长，并且在胎盘转移因子离心后的上清液需要用NaOH调pH，造成制备工艺稳定性和可重复性差。

CN1554363A公开了一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物及其制备工艺，该工艺对胎盘的初加工和匀浆有效成分的浸提都是在常温下进行。

发明内容

本发明是在现有抗乙肝胎盘转移因子制备方法的基础上对上述原有生产工艺加以改进和完善。

本发明是基于以下出人意料的发现：胎盘离体后于0～4℃除去空气分别冷冻保存；制备时不再需要2-5次冻融(耗时24-50h)，显著缩短了生产时间；且在4-10℃条件下进行均质、离心操作，用0.1mol/L的氯化钠溶液浸提胎盘匀浆1h，低温条件的应用，使成品中多肽的含量较现有方法(如CN1299763C)提高了逾20％；此外，胎盘转移因子离心后的上清液不再需要用NaOH调pH，保证抗乙肝胎盘转移因子生物制品的制备的稳定性和可重复性。

另外，本发明涉及利用蛋白组学的方法对乙肝转移因子中有效多肽的分析和发现，对乙肝转移因子中的多肽进行氨基酸序列分析。发现对病人体内非特异性和特异性免疫具有调节作用，可用于治疗或辅助治疗肝炎、癌症疾病、或其他相关的疾病。

因此，本发明涉及以下各项：

1.一种含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将新鲜胎盘直接放入无菌0～4℃的保温容器中，之后将胎盘装入真空包装内并在低温(-20℃)的条件下保存；

2)将以上保存的胎盘20～30℃解冻，加入0.1％氯化钠水溶液并均质以获得匀浆；

3)将以上获得的匀浆于0～10℃恒温条件下进行有效成分浸提0.5-5小时，再将匀浆升温至55℃～65℃，连续均匀水浴5～15小时，完成病毒灭活，然后将匀浆冷却至10℃以下；

4)将以上获得的匀浆在温度为4℃～10℃、转速为3000～12000r/min的条件下离心30～100分钟，获得上清液；和

5)将以上获得的上清液进行超滤处理，获得所述含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂。

2.根据以上1所述的制备方法，所述方法在步骤5)之后还包括以下步骤：

6)将获得的提取物用生理盐水或注射用水调配，然后经过0.22μm孔径的滤芯/滤膜除菌，获得注射液半成品，和任选地：

7)将以上获得的注射液半成品配制成注射液或制成冻干粉针剂。

3.根据以上1或2所述的制备方法，其中：

1)所述胎盘是人胎盘，优选乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳性，乙型肝炎病毒(HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、性病病原体(梅毒、淋病等)均为阴性的人胎盘；和/或

2)步骤1)还包括去除胎盘附属结构(脐带和羊膜)，将所得胎盘组织用注射用水冲洗、沥干，切成小块；和/或

3)在步骤2)中在解冻后加入含有0.1mol/L(约0.6％)的氯化钠的注射用水，胎盘：盐水(重量比)＝1：2～4；和/或

4)在步骤4)中获得的上清液的pH为6.6～7.4，并且不用NaOH调节pH；和/或

5)在步骤5)中的超滤处理是如下进行：将上清液经截留分子量为80～200kD的中空超滤纤维柱超滤，所得滤液再用截留分子量为5～20kD(优选10kD)的中空超滤纤维柱超滤，收集滤液。

4.一种含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂，其可通过根据以上1～3中任一项所述的制备方法制备。

5.根据以上4中任一项的生物制剂，其中所述抗乙肝胎盘转移因子的分子量小于10kD。

6.根据以上4-5中任一项的生物制剂，其为溶液形式，并且溶液中pH为6.6～7.4，多肽含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白细胞粘附抑制指数≥50％。

7.一种生物制剂，优选通过以上所述的本发明的方法制备，其含有一种或多种(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23种)选自以下的多肽：

1)、制剂指纹图谱峰-1(P1)的氨基酸序列：HAGEYGAEALE；

2)、制剂指纹图谱峰-2(P2)的氨基酸序列：EYGAEALE；

3)、制剂指纹图谱峰-3(P3)的氨基酸序列：AGEYGAEALE；

4)、制剂指纹图谱峰-4(P4)的氨基酸序列：HVDDMPNAL；

5)、制剂指纹图谱峰-5(P5)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNAL；

6)、制剂指纹图谱峰-6(P6)的氨基酸序列：EYGAEALERM；

7)、制剂指纹图谱峰-7(P7)的氨基酸序列：ADALTNAVAHV；

8)、制剂指纹图谱峰-8(P8)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNAL；

9)、制剂指纹图谱峰-9(P9)的氨基酸序列：HVDDMPNALSAL；

10)、制剂指纹图谱峰-10(P10)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNAL；

11)、制剂指纹图谱峰-11(P11)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNALSAL；

12)、制剂指纹图谱峰-12(P12)的氨基酸序列：DDMPNASAL；

13)、制剂指纹图谱峰-13(P13)的氨基酸序列：VDDMPNASAL；

14)、制剂指纹图谱峰-14(P14)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNALSAL；

15)、制剂指纹图谱峰-15(P15)的氨基酸序列：DDMPNALSALSDLHAH；

16)、制剂指纹图谱峰-16(P16)的氨基酸序列：LTNAVAHVDDMPNALSAL；

17)、制剂指纹图谱峰-17(P17)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSA；

18)、制剂指纹图谱峰-18(P18)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNAL；

19)、制剂指纹图谱峰-19(P19)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNALSAL；

20)、制剂指纹图谱峰-20(P20)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNAL；

21)、制剂指纹图谱峰-21(P21)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSAL；

22)、制剂指纹图谱峰-22(P22)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNALSAL；

23)、制剂指纹图谱峰-23(P23)的氨基酸序列：GEYGAEALERMFL。

8.根据以上4-7的生物制剂，其为注射液或冻干粉针剂形式。

9.根据以上4-8中任一项的生物制剂在制备药物或试剂盒中的应用，所述药物或试剂盒用于治疗肝炎、肝硬化和/或肝癌，优选用于治疗乙型肝炎，优选其中所述药物或试剂盒还含有另外的用于治疗乙型肝炎的药物，如拉米夫定。

10.用于治疗肝炎(优选乙型肝炎)、肝硬化和/或肝癌的药物组合物，其含有根据以上4-7中任一项的生物制剂和药学上可接受的载体。

具体实施方式

一、抗乙肝胎盘转移因子生物制品的制备

(1)人胎盘材料的预处理

产妇体检标准：病人血清学检测，乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳性；乙型肝炎病毒(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、性病病原体(梅毒、淋病等)均为阴性结果的病人。

选用乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳性，乙型肝炎病毒(HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、性病病原体均为阴性的胎盘。且患有恶性肿瘤、免疫缺陷病、急性传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿及肉眼检查外观不正常、保存运输不当而变质者均不得使用。

将新鲜人胎盘从无菌手术室获得后，直接放入无菌0～4℃的保温容器中，将胎盘处于真空包装内并在低温(-20℃)的条件下存储和运输，至GMP车间或GLP实验室。在D级洁净区，去除胎盘附属结构(脐带和羊膜)所得胎盘组织用注射用水冲洗、沥干，切成小块(约1cm²)，置无菌容器内于低温(-20℃)存储。

(2)匀浆调配

取上述冷冻的胎盘组织块，于20-30℃条件下解冻，随后加入含有0.1mol/L(约0.6％)的氯化钠的注射用水，胎盘：盐水(重量比)＝1：2～4。在温度为4～10℃的条件下，将混合物在均质机中均质10～15min。完成均质后的匀浆在高倍显微镜下观察，见不到完整的细胞。

(3)有效成分的提取和病毒的灭活处理

将上述匀浆于10℃恒温条件下，浸提有效成分1h。

再将匀浆升温至55℃～65℃，连续均匀水浴10小时，完成病毒灭活。将匀浆冷却至10℃以下。

(4)离心处理

将匀浆转移至离心容器中。在温度为4℃～10℃、转速为3000-12000r/min的条件下离心30～100分钟。检测上清液pH值，应在6.6-7.4之间。

胎盘转移因子离心后的上清液不再用NaOH调pH，如pH值低于规定的值，说明提取过程中已发生酸败，即自身发生降解或被微生物严重污染；如pH高于规定的值，说明容器未清洁彻底，即有清洁管路时用的NaOH残留。

(5)超滤处理

将上清液经80～200kD的中空超滤纤维柱超滤，滤液再用5～20kD的中空超滤纤维柱超滤，收集滤液，即抗乙肝胎盘转移因子原液。

(6)除菌处理

收集原液，将所得原液用生理盐水或注射用水稀释调配后，使溶液中pH为6.6～7.4、多肽的含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白细胞粘附抑制指数≥50％，再经过0.22μm孔径的滤芯/滤膜除菌，得注射液半成品。

(7)注射制剂的制备

注射液半成品进一步分装制成注射液或冻干粉针。

二、人胎盘乙型肝炎免疫活性多肽的蛋白组学分析，确定抗乙肝胎盘转移因子生物制品中的多肽种类。

1.样品处理。

将抗乙肝胎盘转移因子生物制品溶于含50mM DTT的pH 8.5、100mM Tris HCl的缓冲液，于37℃静置1小时。然后，加入终浓度为60mM的碘乙酰胺，室温下避光反应1小时。待烷化反应结束后，用三氟乙酸(TFA)将pH值调为2；多肽溶液脱盐时，使用pepclean C18柱(Thermo)，依据柱生产厂家提供的操作步骤进行。

2.LC-MS/MS分析。

在真空离心蒸发浓缩器中，将洗脱下来的多肽进行脱水，随后用0.1％TFA复溶。多肽样品等分后试样加载到LC-MS/MS系统，测定多肽序列。其中HPLC使用内径75μm C18反相色谱柱，配对使用在线离子阱质谱仪。HPLC设计运行200分钟，柱流速是1μl/min。第一阶段：130min时从2％调整至33％(B％)；第二阶段：20min时调整到90％。质谱仪开启数据依赖模式和动态排除功能。

3.数据分析。

首先使用厂家提供的pt_denovo软件进行数据分析(1.1版)，并参考人类蛋白质序列数据库。再将鉴定到的肽段进行人工分析和验证。

附图说明

图1.根据本发明的方法获得的生物制品中人胎盘免疫活性多肽(抗乙肝胎盘转移因子)的指纹图谱(LC MS/MS)，其中显示本发明选中的23个主峰；

图2.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-1(P1)的氨基酸序列：HAGEYGAEALE；

图3.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-2(P2)的氨基酸序列：EYGAEALE；

图4.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-3(P3)的氨基酸序列：AGEYGAEALE；

图5.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-4(P4)的氨基酸序列：HVDDMPNAL；

图6.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-5(P5)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNAL；

图7.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-6(P6)的氨基酸序列：EYGAEALERM；

图8.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-7(P7)的氨基酸序列：ADALTNAVAHV；

图9.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-8(P8)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNAL；

图10.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-9(P9)的氨基酸序列：HVDDMPNALSAL；

图11.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-10(P10)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNAL；

图12.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-11(P11)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNALSAL；

图13.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-12(P12)的氨基酸序列：DDMPNASAL；

图14.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-13(P13)的氨基酸序列：VDDMPNASAL；

图15.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-14(P14)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNALSAL；

图16.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-15(P15)的氨基酸序列：DDMPNALSALSDLHAH；

图17.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-16(P16)的氨基酸序列：LTNAVAHVDDMPNALSAL；

图18.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-17(P17)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSA；

图19.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-18(P18)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNAL；

图20.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-19(P19)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNALSAL；

图21.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-20(P20)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNAL；

图22.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-21(P21)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSAL；

图23.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-22(P22)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNALSAL；

图24.人胎盘免疫活性多肽的指纹图谱峰-23(P23)的氨基酸序列：GEYGAEALERMFL；

图25.根据本发明的方法获得的生物制品中人胎盘免疫活性多肽的HPLC指纹图谱(A)与CN1554363A的提取物的HPLC指纹图谱(B)的比较；

图26.根据本发明的方法获得的生物制品中人胎盘免疫活性多肽的HPLC指纹图谱；和

图27.根据本发明的方法获得的生物制品中人胎盘免疫活性多肽的分子量质谱图。

序列说明

SEQ ID No.1-制剂指纹图谱峰-1(P1)的氨基酸序列：HAGEYGAEALE；

SEQ ID No.2-制剂指纹图谱峰-2(P2)的氨基酸序列：EYGAEALE；

SEQ ID No.3-制剂指纹图谱峰-3(P3)的氨基酸序列：AGEYGAEALE；

SEQ ID No.4-制剂指纹图谱峰-4(P4)的氨基酸序列：HVDDMPNAL；

SEQ ID No.5-制剂指纹图谱峰-5(P5)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNAL；

SEQ ID No.6-制剂指纹图谱峰-6(P6)的氨基酸序列：EYGAEALERM；

SEQ ID No.7-制剂指纹图谱峰-7(P7)的氨基酸序列：ADALTNAVAHV；

SEQ ID No.8-制剂指纹图谱峰-8(P8)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNAL；

SEQ ID No.9-制剂指纹图谱峰-9(P9)的氨基酸序列：HVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.10-制剂指纹图谱峰-10(P10)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNAL；

SEQ ID No.11-制剂指纹图谱峰-11(P11)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.12-制剂指纹图谱峰-12(P12)的氨基酸序列：DDMPNASAL；

SEQ ID No.13-制剂指纹图谱峰-13(P13)的氨基酸序列：VDDMPNASAL；

SEQ ID No.14-制剂指纹图谱峰-14(P14)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.15-制剂指纹图谱峰-15(P15)的氨基酸序列：DDMPNALSALSDLHAH；

SEQ ID No.16-制剂指纹图谱峰-16(P16)的氨基酸序列：LTNAVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.17-制剂指纹图谱峰-17(P17)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSA；

SEQ ID No.18-制剂指纹图谱峰-18(P18)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNAL；

SEQ ID No.19-制剂指纹图谱峰-19(P19)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.20-制剂指纹图谱峰-20(P20)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNAL；

SEQ ID No.21-制剂指纹图谱峰-21(P21)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.22-制剂指纹图谱峰-22(P22)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNALSAL；

SEQ ID No.23-制剂指纹图谱峰-23(P23)的氨基酸序列：GEYGAEALERMFL

实施例

以下的具体实例被解释为仅仅是说明性的，并且无论如何不以任何形式限制公开的其余部分。在没有进一步详细细节的情况下，据信本领域技术人员能够基于本文的描述以本发明的最完整的范围利用本发明。本文引述的全部公开物通过引用将它们的全部结合在此。

实施例1

人胎盘乙型肝炎特异免疫活性多肽制备方法，包括以下步骤：

1.与产妇签署合作协议，获取产妇体检结果；对胎盘进行采样检测，并于-20℃储存。

2.在GMP车间或GLP实验室，解冻胎盘，去除羊膜和脐带后用纯化水清洗并沥干。

3.在4～10℃条件下，将胎盘用手术剪切成1cm²小块，装入无菌容器内速冻。

4.取解冻胎盘块，加入3倍胎盘重量的含0.1mol/L氯化钠的注射用水，在均质机中均质10min。高倍显微镜下检查无完整细胞。

5.匀浆在10℃恒温浸提有效成分1h。

6.在60℃条件下恒温10h，灭活病毒。随后降温到10℃。

7.在4℃条件下，在离心机中以10000转/分离心30分钟，收集上清液，检测pH值应为6.6～7.4。

8.用100kD中空纤维超滤柱对上清液超滤，超滤液用10kD中空纤维超滤柱超滤，收集液即为原液。

9.用2×生理盐水或注射用水对原液进行调配，使溶液中pH为6.5～7.5、多肽的含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白细胞粘附抑制指数≥50％。。

10.将调配好的原液用0.22μm的微孔滤膜除菌，得到半成品。

11.半成品分装即得注射剂，或做成冻干粉针制剂成品。成品于2～8℃保存备用。

实施例2

将实施例1中得到的抗乙肝胎盘转移因子生物制品，对其中的有效成分进行检测分析。

1.常规制剂质控检测(标准和方法引自《中国生物制品规程》2002年增补本--抗乙肝胎盘转移因子注射液相同项下)

外观：应为微黄色澄明液体，无异物、浑浊或沉淀；合格。

化学检定：pH为6.8；蛋白质反应为阴性；多肽含量0.67mg/ml；核糖含量89μg/ml；合格。

无菌试验：无菌生长；合格

热原检查：家兔每1kg体重注射剂量为3.0ml；合格。

异常毒性(小鼠法)：无异常反应，动物健存，体重增加；合格。

异常毒性(豚鼠法)：无异常反应，动物健存，体重增加；合格。

HBsAg检测：阴性；合格。

2.HPLC指纹图谱见图26(标准和方法引自《中国生物制品规程》2002年增补本--抗乙肝胎盘转移因子注射液相同项下)

条件：Pack Doil-200(8.0×300mm)色谱柱，以0.1M PB-0.1M Na₂SO₄-0.05％NaN₃pH 7.0的缓冲液为流动相，检测波长260nm，流速0.6mL/min，灵敏度0.08AUFS，对样品稀释20倍。

HPLC指纹图谱显示：①在19.0～23.0min保留时间内定有三个连续组份；②2、3组份总含量≥90％(以峰面积计算)；③第三组份含量为55±5％(以峰面积计算)；

3.抗乙肝胎盘转移因子的最大分子量测定。

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，N₂激光源，波长337nm，激光发射脉宽4ns，线性飞行距离65cm，加速电压22kV，检测电压1850V。采用正离子线性采集模式，基质为CCA。

根据质谱图(参见附图27)判定：抗乙肝胎盘转移因子的最大分子量为8197Da<10kD，符合规定。

4.根据本发明的方法获得的生物制品中人胎盘免疫活性多肽的HPLC指纹图谱(25(A))与CN1554363A的HPLC指纹图谱(25(B))的比较。

1)因依CN1554363A制得的提取物，依题述检测未能得到文中所提到的指纹图谱，故未能进行成分比对；

2)将本发明的提取物依照CN1554363A的检测条件进行检测：Pack Doil-200(8.0×300mm)色谱柱，以0.1M PB-0.1M Na₂S0₄-0.05％NaN₃pH7.0的缓冲液为流动相，检测波长260nm，流速0.6mL/min，灵敏度0.08AUFS，对样品稀释20倍。

结果显示：

a.图25(A)中峰1＇、峰2＇和峰3＇的峰高比1：30：42，而图25(B)中峰1、峰2和峰3的峰高比1：1.3：3.4；

b.图25(A)中峰2＇和峰3＇组分峰面积之和>90％,与图25(B)中峰2和峰3组分峰面积之和<90％不相同；

c.图25(A)中峰4＇紧邻峰3＇，而图2中峰3后无紧邻峰。

由以上可知，图25(A)和图25(B)指示的是两种不同的物质组合，因此本发明的提取物与CN1554363A的提取物在组分和含量方面都是不同的。

5.样品经过分离和分析获得指纹图谱(LC MS/MS)(图1，其中显示本发明选中的23个主峰)。将含量最高的主要峰段进行氨基酸序列分析，本发明中获得23个主峰的氨基酸序列，质谱图见附图2至24。

实施例3

1.抗乙肝胎盘转移因子生物制品的特异免疫活性测定--白细胞粘附抑制试验(标准和方法引自《中国生物制品规程》2002年增补本--抗乙肝胎盘转移因子注射液相同项下)

1.1小鼠白细胞悬液的制备：取体重22～25g健康小鼠5只，由眼静脉放血，无菌取出脾脏，以Hank's液洗3次，用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液，用1640培养液洗3次(1500r/min离心15分钟)，然后每只鼠脾脏加3m1无菌蒸馏水破坏红细胞，再加3.6％氯化钠溶液1m1调整渗透压，混匀后用200目尼龙网过滤，滤液经1500r/min离心5分钟，再分别用0.9％氯化钠溶液和1640培养液各洗1次，收集细胞，用1640培养液调整细胞浓度为1.0×10⁶～3.0×10⁶个/ml，备用。

供试品溶液的制备：取待检品2ml备用。

1.2试验步骤：取洁净的离心管2支，各加细胞悬液lml，一管加待检样品1ml为试验管，另一管加无菌0.9％氯化钠溶液l ml为对照管。置37℃致敏30分钟，1500r/min离心10分钟，弃上清液，每管沉淀分别准确加入1640培养液1m1。取无菌培养瓶6个，前3瓶各加试验管细胞悬液0.2m1，后3瓶各加对照管细胞悬液0.2ml，然后每瓶内加纯化HBsAg 0.2ml(HBsAg100μg/ml)，1640培养液0.6m1，置CO₂培养箱内37℃培养1～2小时后，取出轻轻摇匀，静置1～3分钟，显微镜下计数未粘附的白细胞数。

2.3检测结果：未粘附白细胞抑制指数(NAI)＝(试验组平均未粘附细胞数一对照组平均未粘附细胞数)/对照组平均未粘附细胞数×100％。(NAI％应不小于50％)

经测定抗乙肝胎盘转移因子生物制品的特异免疫活性(NAI％)为62。

2.小白鼠足掌注射试验

2.1材料：

取昆系小白鼠24只，雌雄各半，体重在18～22g之间，随机分6组，每组12只。HBsAg为2.0μg/ml。

样品。实施例1中制得的抗乙肝胎盘转移因子生物制品。

2.2试验方法。

实验组。取小白鼠12只，每天腹腔内注射抗乙肝胎盘转移因子生物制品0.2ml，连续5天，停止注射2天；第8天于后肢足掌皮下注射1μg HBsAg，第10天剪下注射部足掌，随即以10％甲醛固定，送作病理切片、HE染色检查。

对照组。生理盐水组取小白鼠12只，试验方法同实验组。

3.肉眼观察。

各组小白鼠经腹腔注射不同制剂后，均未见异常表现。但足掌皮下注射HBVM阳性血清后，6h后注射侧后肢膝以下即显轻重不一的水肿、充血，次日晨更明显，第三天基本消退；其中以抗乙肝胎盘转移因子生物制品组很明显，甚至影响肢体运动，生理盐水组不明显，见表1。

表1 足掌皮下注射后膝关节以下水肿、充血比较

4.病理切片检查。

足掌注射处局部组织HE染色，镜下见除生理盐水组外，实验组有局部程度不一的间质水肿、充血，退变和炎性细胞浸润，一般以淋巴细胞为主，有的见较多的多核细胞。较生理盐水组，实验组局部病变明显，见表2。

表2 足掌皮下注射后局部病理检查结果比较

结论：经抗乙肝胎盘转移因子生物制品腹腔注射的小白鼠，获得对HBV特异免疫活性后，再次在足掌皮下遇到HBVM阳性血清攻击后，不仅肉眼观察可见注射侧后肢膝下明显水肿、充血，同时足掌注射部病理切片HE染色亦可见明显水肿、充血、退变和细胞浸润，其中以淋巴细胞为主。

3.抗乙肝胎盘转移因子生物制品对小鼠淋巴细胞的影响

3.1材料。选昆系健康小鼠30只，体重18-22g，随机分为3组：生理盐水对照组、抗乙肝胎盘转移因子生物制品组和乙肝疫苗+抗乙肝胎盘转移因子生物制品组。

3.2实验方法。对照组每天腹腔注射生理盐水0.2ml/只，实验组每天腹腔注射抗乙肝胎盘转移因子生物制品0.3ml./只，连续7天；乙肝疫苗在第一次腹腔注射时同时进行，剂量1μg/只。在试验前1天和实验后第2天、第8天分别断尾取血，取血20μl加入0.38ml白细胞稀释液混匀，2小时内进行白细胞计数；同时推血涂片2张，其一姬萨姆染色分类计数用于计算淋巴细胞绝对值；另一张进行ANAE染色，油镜下观察计数200个淋巴细胞，胞浆中有紫色颗粒者为ANAE阳性细胞。可将ANAE阳性细胞分为2个亚类，包浆中出现1-3个明显紫红色颗粒者为颗粒型(T-样)，稀散或弥散细点者为弥散型(Thy-型)。根据淋巴细胞绝对值和各类细胞的百分率，分别计算出其绝对值。

3.3结果：

实验第2天小鼠淋巴细胞的变化。实验组各类T细胞均较对照组有不同程度的增长，尤以T-样细胞表现突出(P<0.01)，两实验组间无显著差别，见表3。

实验第8天小鼠淋巴细胞的变化。实验组第8天ANAE阳性细胞较对照组增加(P<0.01)，其中T-样细胞增加最明显，而Thy-样细胞组间无明显差别。乙肝疫苗+抗乙肝胎盘转移因子生物制品组T-样细胞显著高于单纯抗乙肝胎盘转移因子生物制品组(P<0.01)，见表4。

表3 第2天小鼠白细胞的变化(个/mm³、)

表4 第8天小鼠白细胞的变化(个/mm³、)

3.4讨论

本研究结果表明，抗乙肝胎盘转移因子生物制品可使小鼠外周血T4细胞增加，而且这种作用在用药后48h就已经开始。同时证明，抗乙肝胎盘转移因子生物制品可使小鼠增加胸腺指数，而对脾指数无影响，B细胞并非来源于胸腺。

第8天实验组小鼠外周血T4细胞均显著高于对照组，表现出抗乙肝胎盘转移因子生物制品的非特异免疫活性；然而乙肝疫苗+抗乙肝胎盘转移因子生物制品组T4细胞比单纯抗乙肝胎盘转移因子生物制品组增加更明显，两者差别显著(P<0.01)，表明了抗乙肝胎盘转移因子生物制品对HBV的特异免疫活性。小鼠免疫细胞被乙肝疫苗致敏后，使抗乙肝胎盘转移因子生物制品的特异性免疫活性得以显示，使得小鼠外周血T4细胞增加。

4.抗乙肝胎盘转移因子生物制品对乙型肝炎病例E花结和淋转影响

4.1总玫瑰花结(ERT)和活性玫瑰花结(ART)检查。

取肝素抗凝血2.5ml，以无钙镁离子Hank液稀释2倍，加淋巴细胞分离液，以2000r/min离心20min，分离单核细胞；吸取单核细胞层，Hank液洗3次，混悬，计数调整细胞浓度为4×10⁵个/ml；分2管，各0.3ml，一查ERT、一检ART。取羊红细胞(SRBC)以Hank液洗3次，混悬，计数调整细胞浓度为8×10⁷个/ml。

ERT管内加等量SRBC，ART管内加1/2量SRBC，500r/min离心5min，ERT管置于4℃冰箱过夜，ART管弃去适量上清液加0.25％戊二醛1滴，静置1min，颗粒混匀，置4℃冰箱内15～20min，颗粒混匀，涂片，干后姬萨姆染色，高倍镜下计数200个淋巴细胞，凡结合3个以上SRBC者为ART细胞，计算百分数。ERT管过夜后亦按同法检查计数。

4.2淋巴细胞转化试验(LTT)

按常规制备RPMI1640用于LTT培养基，按无菌要求采静脉血0.4ml，立即注入培养基内，摇匀，置于37℃孵箱内72h，孵育中每天摇动培养瓶2次。弃去培养瓶内上清液，使剩下约0.5ml培养基，混匀，吸入毛细塑料吸管内，封住一端，2500r/min离心20min，取白细胞层涂片，甲醇固定，姬萨姆染色，油镜下计数200个淋巴细胞，按下式计算淋巴细胞转化率：

4.3病例选择。全部256例受检者均为住院接受抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗的乙型肝炎患者，其中急性乙肝96例，慢性乙肝(活动型)160例。患者住院后治疗前即验血一次，以后在治疗中一月左右和出院前再各查一次。另，任选健康献血员30例验血一次作对照。

4.4检查结果

4.4.1正常人和乙肝病例的ERT、ART和LTT。

急性乙肝和慢性乙肝病例的外周血平均ERT、ART和LTT均低于正常人，除慢性乙肝平均ERT降低不太明显外，其余均具有统计学意义，见表5。

表5 正常人和乙肝病例的ERT、ERT和LTT

4.4.2乙肝病例经抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗前后ERT、ART和LTT变化。

急慢性乙肝病例在接受特异胎盘肽治疗后，平均ERT、ART和LTT均较治疗前增多，其中除急性乙肝治疗后ART升高不明显外，其余均有统计学意义；出院前检查，急性乙肝的平均ERT、ART和LTT增加明显，但无统计学意义。而慢性乙肝均明显增多，且均具有统计学意义，见表6-7。说明抗乙肝胎盘转移因子生物制品可使乙肝病例体内T淋巴细胞增多、活化，增强病体免疫功能。

表6 急性乙肝治疗前后ERT、ERT和LTT变化

表7 慢性乙肝治疗前后ERT、ERT和LTT变化

4.5讨论

经检测观察，乙肝病例在接受治疗前，平均ERT、ART和LTT均低于正常人，但在接受抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗后，特别是慢性乙肝病例，平均ERT、ART和LTT均明显增多。说明乙肝病例在接受抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗后，不仅T淋巴细胞有所增加，而且活性亦有增强。这一点与小白鼠动物实验的结果是一致的。

T淋巴细胞在人体免疫功能中具有重要的意义，特别在乙肝慢性化、病情迁延不愈和不能清除体内HBV中，公认具有密切关系，主要是因T淋巴细胞免疫功能低所致。动物实验和临床观察已初步证明抗乙肝胎盘转移因子生物制品具有增进T淋巴细胞免疫功能作用。

实施例4

将本专利所得抗乙肝胎盘转移因子生物制品分装成注射剂，进行临床试验研究。结果显示含有23种多肽的抗乙肝胎盘转移因子生物制品对乙型肝炎有治疗效果。

1、临床II期试验

临床研究单位：第三军医大学西南医院全军传染病专科中心；试验研究设计：收入97例病人。①分组PSTF组(A组)，正常胎盘转移因子组(B组)，猪苓多糖加乙肝疫苗组(C组)，空白对照组(D组)。方法：A组:PSTF4ml(每ml含多肽0.8mg)，肌注，每日一次，3个月为一疗程。B组：正常胎盘转移因子4m1(每ml含多肽0.8mg)，肌注，每日一次，3个月为一疗程。C组：猪苓多糖40mg，肌注，每日一次，用药20天，休息10天为一疗程，连续治疗三个疗程；同时皮下注射乙肝疫苗30μg，半月一次，共6次。D组：只进行基础治疗。结果：结果发现抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗组的HBeAg、HBV-DNA阴转率及抗HBe阳转率在治疗结束时分别为53.6％、50.0％和42.9％，均显著高于正常胎盘转移因子治疗组(9.1％，P<0.05)和空白对照组(6.3％，P<0.01)；随访3个月均为46.2％，均显著高于空白对照组(8.7％，P<0.01)。正常胎盘转移因子治疗组和猪苓多糖加乙肝疫苗治疗组与空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。结论：抗乙肝胎盘转移因子生物制品是一种有效、价廉、使用方便的抗乙型肝炎病毒药物。

2、临床III期试验

临床单位：解放军第三军医大学、河南省医学科学研究所、重庆医科大学、北京地坛医院、山东泰安解放军第88医院。试验研究：入选370例慢性乙肝病人；①分组：A组PSTF治疗组；B、C组为对照组，B组是HBV标志均为阴性胎盘提取的转移因子(PTF)，C组为猪苓多糖+乙肝疫苗。②方法：A组与B组分别注射PSTF和PTF 4ml，1/d,20d为一疗程，连续3疗程；乙肝疫苗30μg每15d皮下注射一次，共6次。结果：治疗结束后，A组ALT复常率明显高于C组(p<0.01)，但血清胆红素(SB)复常率组间无显著差异；A组HBV复制指标阴转率均显著高于对照组(p<0.01)；A组HBV-DNA及其与HBeAg双阳性的阴转率均显著高于对照组。结论：抗乙肝胎盘转移因子生物制品对于改善临床症状和体征，恢复肝功能及HBeAg、HBVDNA等病毒复制指标的转换均显著优于普通胎盘转移因子、猪苓多糖+乙肝疫苗。

3.治疗乙型肝炎肝硬变临床研究：

临床单位：解放军第88医院肝病研究所。试验研究：全部病例(258例)抗乙肝胎盘转移因子生物制品，2-4ml肌注，每天1次，平均治疗5月；并存少量腹水者口服适量利尿剂；同时均口服一般量维生素B1和C，不给其它治疗肝病药物。在自觉征象消失、肝功能正常或接近正常，达临床治愈后再出院巩固治疗6-12月。结果：达到自觉征象消失、肝功能正常或接近正常划属临床治愈,共180例(69.8％)；肝功能除絮状试验和蛋白尚未正常外，其它均正常，划属临床基本治愈，共31例(12.0％)；自觉征象消失,肝功能有进步列为进步共42例(16.3％)；活检后未见明确效果5例(1.9％)；黄疸升高者平均治后40.0天下降正常，谷丙转氨酶平均治后2月95.7％正常；絮状试验、白球蛋白比和蛋白电泳r-球蛋白恢复较缓慢,平均治后4～5月70.1％正常或接近正常；HBsAg治后平均104.7天15例(5.9％)阴转，活检后平均54.0天15例出现HBsAb，但二者并非见于同一病人；HBeAg平均治后82.2天81例(55.5％)阴转。结论：抗乙肝胎盘转移因子生物制品对乙型肝炎肝硬化患者的症状和生化指标有较好的改善作用。

4、联合拉米夫定用药对比研究

联合用药治疗乙型肝炎临床研究-1：临床单位：广西中医学院附属瑞康医院。试验 研究：①慢性乙型肝炎患者随机分为2组，对照组：给予拉米夫定100mg，每日早晨空腹服用；治疗组：给予拉米夫定100mg(服用同对照组)，同时给予抗乙肝胎盘转移因子生物制品4mL(肌肉注射，每日1次)。2组疗程均为3个月。方法：治疗3个月，治疗组的HBV-DNA阴转率和ALT复常率均显著高于对照组(P<0.05)，外周血CD4亚群水平上，CD4/CD8比值趋于正常，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结果：治疗3个月后，治疗组的HBV-DNA阴转率和ALT复常率均显著高于对照组(P<0.05)，外周血CD4亚群水平上调，CD4/CD8比值趋于正常，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论：抗乙肝特异胎盘转移因子是一种有效、价廉、使用方便的抗乙型肝炎病毒药物。

联合用药治疗乙型肝炎临床研究-2：临床单位：杭州市第六人民医院。试验研究：①分组：治疗组--拉米夫定联合抗乙肝胎盘转移因子生物制品，对照组--单用拉米夫定。②方法：在一般对症支持保肝治疗基础上，联合治疗给予拉米夫定口服，每天1次，疗程24月，同时予抗乙肝胎盘转移因子生物制品4ml/次肌注，前6个月每天一次，后隔日一次，疗程12个月；对照组仅给予拉米夫定100mg口服，每天1次，疗程24月。结果：治疗结束后，联合治疗组HBeAg血清转换优于对照组(P<0.05)；联合治疗组YMDD变异低于对照组(P<0.01)。结论：拉米夫定联合抗乙肝胎盘转移因子生物制品治疗病毒复制活跃的活动性肝硬化在HBeAg血清转换、YMDD变异上比单用拉米夫定有更好的临床作用。

其他实施方案

在本说明书中公开的全部特征可以以任意组合方式进行组合。在本说明书中所公开每个特征可以被服务于相同、等价或类似目的的备选特征替换。因此，除非另外清楚地说明，所公开的每个特征仅仅是一般系列的等价或相似特征的实例。

由以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以做出本发明的各种变化和改变以使其适应用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求之内。

Claims (10)

1.一种含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将新鲜胎盘直接放入无菌0～4℃的保温容器中，之后将胎盘装入真空包装内并在低温(-20℃)的条件下保存；

2)将以上保存的胎盘20～30℃解冻，加入0.1mol/L氯化钠水溶液并均质以获得匀浆；

3)将以上获得的匀浆于0～10℃恒温条件下进行有效成分浸提0.5-5小时，再将匀浆升温至55℃～65℃，连续均匀水浴5～15小时，完成病毒灭活，然后将匀浆冷却至10℃以下；

4)将以上获得的匀浆在温度为4℃～10℃、转速为3000～12000r/min的条件下离心30～100分钟，获得上清液；和

5)将以上获得的上清液进行超滤处理，获得所述含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述方法在步骤5)之后还包括以下步骤：

6)将获得的提取物用生理盐水或注射用水调配，然后经过0.22μm孔径的滤芯/滤膜除菌，获得注射液半成品，和任选地：

7)将以上获得的注射液半成品配制成注射液或制成冻干粉针剂。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中：

1)所述胎盘是人胎盘，优选乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳性，乙型肝炎病毒(HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、性病病原体(梅毒、淋病等)均为阴性的人胎盘；和/或

2)步骤1)还包括去除胎盘附属结构(脐带和羊膜)，将所得胎盘组织用注射用水冲洗、沥干，切成小块；和/或

3)在步骤2)中在解冻后加入含有0.1mol/L的氯化钠的注射用水，胎盘：盐水(重量比)＝1：2～4；和/或

4)在步骤4)中获得的上清液的pH为6.6～7.4，并且不用NaOH调节pH；和/或

5)在步骤5)中的超滤处理是如下进行：将上清液经截留分子量为80～200kD的中空超滤纤维柱超滤，所得滤液再用截留分子量为5～20kD(优选10kD)的中空超滤纤维柱超滤，收集滤液。

4.一种含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂，其可通过根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法制备。

5.根据权利要求4中任一项的生物制剂，其中所述抗乙肝胎盘转移因子的分子量小于10kD。

6.根据权利要求4-5中任一项的生物制剂，其为溶液形式，并且溶液中pH为6.5～7.5，多肽含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白细胞粘附抑制指数≥50％。

7.一种生物制剂，其含有一种或多种(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23种)选自以下的多肽：

1)、制剂指纹图谱峰-1(P1)的氨基酸序列：HAGEYGAEALE；

2)、制剂指纹图谱峰-2(P2)的氨基酸序列：EYGAEALE；

3)、制剂指纹图谱峰-3(P3)的氨基酸序列：AGEYGAEALE；

4)、制剂指纹图谱峰-4(P4)的氨基酸序列：HVDDMPNAL；

5)、制剂指纹图谱峰-5(P5)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNAL；

6)、制剂指纹图谱峰-6(P6)的氨基酸序列：EYGAEALERM；

7)、制剂指纹图谱峰-7(P7)的氨基酸序列：ADALTNAVAHV；

8)、制剂指纹图谱峰-8(P8)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNAL；

9)、制剂指纹图谱峰-9(P9)的氨基酸序列：HVDDMPNALSAL；

10)、制剂指纹图谱峰-10(P10)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNAL；

11)、制剂指纹图谱峰-11(P11)的氨基酸序列：AVAHVDDMPNALSAL；

12)、制剂指纹图谱峰-12(P12)的氨基酸序列：DDMPNASAL；

13)、制剂指纹图谱峰-13(P13)的氨基酸序列：VDDMPNASAL；

14)、制剂指纹图谱峰-14(P14)的氨基酸序列：TNAVAHVDDMPNALSAL；

15)、制剂指纹图谱峰-15(P15)的氨基酸序列：DDMPNALSALSDLHAH；

16)、制剂指纹图谱峰-16(P16)的氨基酸序列：LTNAVAHVDDMPNALSAL；

17)、制剂指纹图谱峰-17(P17)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSA；

18)、制剂指纹图谱峰-18(P18)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNAL；

19)、制剂指纹图谱峰-19(P19)的氨基酸序列：ALTNAVAHVDDMPNALSAL；

20)、制剂指纹图谱峰-20(P20)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNAL；

21)、制剂指纹图谱峰-21(P21)的氨基酸序列：ADALTNAVAHVDDMPNALSAL；

22)、制剂指纹图谱峰-22(P22)的氨基酸序列：DALTNAVAHVDDMPNALSAL；

23)、制剂指纹图谱峰-23(P23)的氨基酸序列：GEYGAEALERMFL。

8.根据权利要求4-7的生物制剂，其为注射液或冻干粉针剂形式。

9.根据权利要求4-8中任一项的生物制剂在制备药物或试剂盒中的应用，所述药物或试剂盒用于改善人体免疫力、治疗肝炎、肝硬化和/或肝癌，优选用于治疗乙型肝炎，优选其中所述药物或试剂盒还含有另外的用于治疗乙型肝炎的药物，如拉米夫定。

10.用于治疗肝炎(优选乙型肝炎)、肝硬化和/或肝癌的药物组合物，其含有根据权利要求4-7中任一项的生物制剂和药学上可接受的载体。