CN1438217A

CN1438217A - 一种抗生育化合物及其制备方法

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Publication number: CN1438217A
Application number: CN 03115892
Authority: CN
Inventors: 吕加国; 赵亚南; 周有骏; 朱驹; 纪亚忠; 张万年; 崔英; 惠宁; 季海涛; 余建鑫; 刘玉环; 宋云龙; 盛春泉; 章玲; 张俊洁; 徐明娟; 许翠琴; 王贺玲
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2003-03-20
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2003-08-27
Anticipated expiration: 2023-03-20
Also published as: CN1273446C

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是抗生育化合物4－胍基苯甲酸(4－甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐及其制备方法，以及用其制备的一种抗生育制剂。化合物4－胍基苯甲酸(4－甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐具有抑制顶体酶的活性，但其溶解度小，制备方法繁琐，得率低。本发明化合物不仅溶解度大，抑制顶体酶活性高，而且制备方法简单，得率高，成本低，体外及动物试验表明具有良好的抗生育效果，可用于制备抗生育制剂。

Description

一种抗生育化合物及其制备方法

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，是抗生育化合物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐及其制备方法以及用其制备的一种抗生育制剂。

背景技术：

人精子顶体蛋白酶是受精过程中必不可少的蛋白水解酶，顶体蛋白水解酶抑制剂能抑制精子顶体蛋白酶活性，影响精子的顶体反应和穿卵能力，从而达到避孕效果。据报道4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐具有抑制顶体酶活性(详见J.Med.Chem.1986，29，514～519)，化学结构式为：其经典制备路线如下：

反应步骤为：

(1)对氨基苯甲酸于水溶液中，在盐酸存在下与硫氰酸铵作用，生成4-硫脲基苯甲酸盐酸盐；

(2)4-硫脲基苯甲酸盐酸盐在乙醇溶液中与碘甲烷反应，生成4-(S-甲基异硫脲基)苯甲酸氢碘酸盐；

(3)4-(S-甲基异硫脲基)苯甲酸氢碘酸盐与过量氨水反应生成4-胍基苯甲酸；

(4)4-胍基苯甲酸与稀盐酸生成4-胍基苯甲酸盐酸盐；

(5)4-胍基苯甲酸盐酸盐与4-羟基苯甲酸甲酯于吡啶与N，N-二甲基甲酰胺溶剂中在4-甲苯磺酸催化下以DCC脱水成酯，反应毕以醋酸破坏过量的DCC，粗品以索氏提取器用氯仿做溶剂提取得产品4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯；

(6)4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯与稀盐酸生成4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐。

上述制备工艺存在如下不足：

1、步骤(1)至(3)，反应时间长，操作繁琐，总产率较低；

2、步骤(2)中使用碘甲烷，价格较贵；

3、步骤(5)无水要求高，后处理繁琐，收率极低，特别是4-胍基苯甲酸盐酸盐与对羟基苯甲酸甲酯成酯反应，采用DCC脱水成酯的方法，反应不完全，后处理困难，产率很低。

由于上述不足，以及4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐溶解度差，所以虽然其有抑制顶体酶活性的报道，但至今未见用该化合物制备抗生育制剂的报道。

发明内容：

本发明提供一种溶解度大、抗生育效果好、制备工艺简单、得率高的抗生育化合物，以及用该化合物制备的抗生育制剂。

本发明抗生育化合物，是4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐，该化合物不仅溶解度比4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐大，而且制备工艺大大简化，产物得率又高。

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐合成路线如下：

反应步骤为：

(1)1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸盐(I)和对氨基苯甲酸(II)于乙醇中反应，反应毕碱化，稀盐酸酸化，得4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)；

(2)4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)与氯化亚砜作用生成4-胍基苯甲酰氯盐酸盐，再加入四氢呋喃、三乙胺和4-羟基苯甲酸甲酯(IV)生成4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐(V)；

(3)(V)于二甲亚砜溶剂中，冰浴下与稀氢氧化钠作用，得游离4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯，再与甲烷磺酸反应得产物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐(VI)。

本发明制备方法在4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐制备方法基础上作了改进：1.在4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)的制备中，由原三步反应缩短为一步反应，反应条件温和，缩短了反应时间，提高了收率；2.在4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)与4-羟基苯甲酸甲酯(IV)成酯反应中改用酰氯法，反应更简便，后处理简易，收率提高，成本降低；3.在4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)制备中革除了原制备方法中碘甲烷等价格昂贵的试剂，从而降低了成本。重要的是4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐比4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐溶解度大为提高，因而提高了化合物的抗生育效果。

用本发明化合物和辅料制备抗生育制剂，辅料为柠檬酸、柠檬酸钠、过氧化氢、卡伯浦974p和甘油，重量配比如下：

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐 1份

柠檬酸 5-7份

柠檬酸钠 22-26份

过氧化氢 4-6份

卡伯浦974p 0.8-1.2份

甘油 12-14份

制备方法为(按各组份的上述重量配比)

将2.75％(g/v)柠檬酸溶液加到3.69％(g/v)柠檬酸钠溶液中，搅拌至柠檬酸盐缓冲液pH4.8～5.3，加3％过氧化氢至柠檬酸盐缓冲液中，得过氧化氢柠檬酸盐缓冲液，备用。

取4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐，溶于甘油中，搅拌溶解，将卡泊浦-974p加入至甘油中，当卡泊浦-974p被甘油完全浸润后，把过氧化氢柠檬酸缓冲液加入至甘油液中，持续搅拌均匀即得本发明抗生育制剂。

该制剂呈冻胶状，用于阴道给药，经体外及动物试验，具有良好的抗生育效果；且一次给药抗生育作用时间可持续24小时。

具体实施方式

实施例1：4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)的制备

4-氨基苯甲酸13.7g(0.10mol)、1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸盐20.12g(0.10mol)在200ml乙醇中，磁力搅拌，氮气保护下回流8小时，回收乙醇，残留物加10％氢氧化钠溶液至pH9，加活性炭2g脱色，滤液加10％盐酸中和至pH3，析出固体。固体加蒸馏水煮沸溶解，放冷，慢慢析出针状无色固体，抽滤，得4-胍基苯甲酸盐酸盐白色固体15.7g，产率72.7％。mp：276～277℃。

核磁共振仪测得其核磁共振氢谱如下：

¹HNMRδ(DMSO，300MHz)：7.19(2H，d，J＝4.86)；7.94(2H，d，J＝4.84)；8.33(4H，s)；12.18(1H，s)

实施例2：4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐(V)的制备

4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)23.3g(0.10mol)，氯化亚砜119g(1.00mol)，磁力搅拌，回流1.5小时，放冷，加石油醚100ml，过滤得4-胍基苯甲酰氯盐酸盐。

于另一反应瓶中加4-羟基苯甲酸甲酯(IV)15.2g(0.10mol)，无水四氢呋喃150ml，三乙胺10.1g(0.10mol)，搅拌反应，温度维持在3～2℃迅速加入上述4-胍基苯甲酰氯盐酸盐，冰浴反应2小时，室温搅拌3小时，过滤，滤饼以乙醚160ml分四次充分洗涤，抽干，干燥，得4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐(V)白色固体32g℃产率91.5％，熔点255～257℃。

实施例3：4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐(VI)的制备

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐(V)32g，二甲亚砜150ml，搅溶；冰浴下将0.10mol氢氧化钠40ml滴入二甲亚砜液中，冰浴搅拌1小时，将反应液倾入冰蒸馏水中；以乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯液，加甲烷磺酸9.6g(0.10mol)，浓缩去适量乙酸乙酯液，固体过滤。无水乙醇重结晶得4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐(VI)纯品18g，产率48.1％。熔点215～217℃。

核磁共振仪测得其核磁共振氢谱如下：

¹HNMR(DMSO，300MHz)：3.88(3H，s)；4.27(3H，s)；7.44(2H，d，J＝5.22)；7.81～7.85(4H，m)；8.08(2H，d，J＝5.22)；8.18(2H，d，J＝5.16)；10.15(1H，s)。

实验例4：制备抗生育制剂

将2.75％(g/v)柠檬酸溶液12ml加到3.69％(g/v)柠檬酸钠溶液48ml中，搅拌，得柠檬酸盐缓冲液60ml，pH5，再加3％过氧化氢溶液10ml，得过氧化氢柠檬酸盐缓冲液70ml，备用。

取4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐2g，溶于25g甘油中，以50转/分钟不断搅拌，将3g卡泊浦-974p慢慢加入至甘油中，当卡泊浦-974p被甘油完全浸润后，把上述70ml过氧化氢柠檬酸缓冲液在5分钟之内持续加入甘油液中，加毕，以50转/分钟搅拌2小时，得本发明抗生育制剂。

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐急性毒性试验与致突变作用

一、急性毒性试验

本实验选用昆明种小鼠，雌雄各半，重18～22g。实验前停食4小时，按体重随机分组，灌胃给药。观察给药后七天内动物的毒性反应和死亡数。

小鼠服药后15分钟开始精神委靡、少动、反应退缓，呼吸加深，除个别动物死亡外，8小时后动物都恢复正常，饮食、活动正常，体重增加。经Bilss法计算，小鼠口服LD₅₀大于5000mg/kg。表明本发明化合物毒性极小。

二、致突变试验

一)试验方法

用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)TA97、TA98、TA100及TA102为指示微生物。采用标准平板掺入法，实验在加和不加代谢活性系统条件下进行，代谢活化系统用S9。样品的各种浓度均做3个平板，取其均值及标准差(X±S)，实验条件的设计见表1。

表1实验条件的设计

剂量 S9或Buf 菌量顶琼脂培养时间测试物

(μg/皿) (ml) (ml) (ml) (h)本发明化合物 5000 0.20 0.10 2.0 48

1000 0.20 0.10 2.0 48

500 0.20 0.10 2.0 48

100 0.20 0.10 2.0 48

50 0.20 0.10 2.0 48二甲亚砜 0.1ml 0.20 0.10 2.0 48

水 0.1ml 0.20 0.10 2.0 48阳性对照 0.1ml 0.20 0.10 2.0 48

二)结果，见表2

三)评价

Ames试验结果的评价，是以比较各剂量的回变菌落数与阴性对照的倍数为基础，如大于或相当于阴性对照的两倍，并在一定剂量范围内存在着剂量反应关系，则判为阳性。

本实验中各剂量组的本发明化合物对TA97、TA98、TA100及TA102的回变菌落数，在加和不加S9条件下均与自发回变数相近(未超过白发回变数的2倍)，故判本发明化合物致突变为阴性。表2 4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐对S.typhimurium TA97、TA98、TA100及TA102的致突变性结果

测试物回变菌落数(个/皿，X±S)

及剂量 TA97 TA98 TA100 TA102(μg/皿) -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9本发明化合物 5000 112±3.1 105±9.1 42±3.1 38±3.1 158±17.0 156±16.2 240±14.3 251±17.4

1000 112±3.6 133±4.91 42±7.0 31±3.5 139±14.7 177±10.2 231±11.5 270±5.0

500 110±10.1 117±15.1 29±8.5 33±7.2 163±21.9 166±7.0 275±52.3 252±20.2

100 103±13.9 109±2.1 35±6.5 31±8.5 168±11.4 170±13.6 243±24.2 238±3.1

50 124±7.0 118±11.3 34±7.5 33±6.8 149±9.6 169±12.1 246±30.7 257±6.1二甲亚砜 0.1ml 113±4.4 116±15.1 36±4.6 33±3.8 164±9.8 172±5.7 237±15.7 239±2.0

水 0.1ml 113±24.0 112±11.4 31±3.5 34±7.4 159±8.5 176±6.4 250±11.7 246±10.1敌克松 50μg 773±83.1 - 605±102 - 702±100 - 727±48.3 -2-AF 10μg - 751±539 - 549±50.4 - 806±95.6 - -1，8-二羟基蒽醌 30μg - - - - - - - 839±64.1

体外试验

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐(VI)对精子顶体酶抑制作用的检测

本实验采用常规的明胶薄膜法来测定4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐对人精子顶体酶的抑制活性。并用已知对人精子顶体酶有抑制活性的TLCK(对甲苯磺酰赖氨酰氯甲基酮)做对照。结果表明：4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐是一种较强且有效的精子顶体酶抑制剂，它比标准的顶体酶抑制剂TLCK的抑制活性强约120倍，最低有效抑制浓度为4×10^-2mg/ml。

动物试验

本试验的目的是观察本发明化合物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐在家兔体内的抗生育作用本发明化合物浓度为：3mg/ml，6mg/ml(用含有8％DMF的生理盐水配制)。动物：家兔，新西兰种

来源：中国科学院实验动物中心

体重：3～4kg

性别：雌性分组：对照组、家兔5只，每只给1ml含8％DMF的生理盐水；

低剂量组，家兔7只，给本发明化合物的剂量为3mg/只；

大剂量组，家兔5只，给本发明化合物的剂量为6mg/只。试验的主要步骤：

精液的采取：取新西兰种家兔，雄性，与雌兔同笼时，用人工阴道，采取新鲜精液，置37℃水浴中，检查精子活动度，并计数。

要求：精子活动度≥60％，前向运动精子≥75％，精子数＞10⁸/ml。选用雌性成熟的家兔，给药前一天注射苯甲酸求偶索(50mg/只)，24小时后阴道内注入本发明化合物(不同剂量)混悬液1ml，5分钟后，注入上述人工阴道法收集到的兔精液0.5ml[原精液]。5～10分钟耳静脉注射hCG(绒毛膜促性腺激素)100单位。

对照组家兔阴道内注入含有8％DMF的生理盐水1ml/只，3～5分钟后注入人工采集的精液0.5ml；5～10分钟后耳静脉注射hCG 100单位。

十天后，麻醉情况下剖腹检查子宫内胎儿数，卵巢黄体数；最终判断本发明化合物在家兔体内的抗生育效果。结果见表3。

表3：本发明化合物家兔体内抗生育试验

家兔体重黄体数胎儿数妊娠组别％

(No.) (kg) (左右) (左右) (否)对 1 3.6 8(4，4) 8(4，4) +

2 3.6 8(4，4) 8(4，4) +

3 3.7 5(2，3) 5(2，3) +照

4 3.2 6(2，4) 6(2，4) + 100.0

5 4.2 6(2，4) 6(2，4) +组-----------------------------------------------------X±SD (n＝5) 3.7±0.3 6.7±1.2 6.7±1.2 5/5

6 4.0 13(8，5) 0(0，0) -低 7 3.35 8(3，5) 1(1，0) +剂 8 4.0 8(4，4) 0(0，0) -量

9 4.2 12(4，8) 0(0，0) -组 28.9(3mg/只)10 3.5 6(2，4) 0(0，0) -

11 4.2 13(5，6) 0(0，0) -

12 3.9 12(4，8) 6(2，4) +----------------------------------------------------------X±SD (n＝7) 3.9±0.3 10.3±2.7 1.0±0.1 2/7大 13 3.4 13(8，5) 0(0，0) -剂 14 3.6 15(7，8) 0(0，0) -量

15 3.5 13(7，6) 0(0，0) -组 0

16 3.65 7(3，4) 0(0，0) -(6mg/只)

17 3.6 15(6，9) 0(0，0) ------------------------------------------------------------X±SD (n＝5) 3.6±0.1 12.6±2.9 0 0

由表3看出，一次给药后，对照组家兔5只全部妊娠，平均黄体数为6.7±1.2，平均胎儿数为6.7±1.2；本发明化合物大剂量组(6mg/只)，家兔5只无一只妊娠，平均黄体数12.6±2.9；本发明化合物低剂量组(3mg/只)，家兔7只有二只妊娠，妊娠率为28.9％，平均胎儿数1.0±0.1，黄体数为10.3±2.7。结果表明，本发明化合物具有显著体内抗生育效果。

Claims

1.一种抗生育化合物，其为4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐，化学结构式如下：

2.权利要求1所述的抗生育化合物的制备方法，合成路线如下：

反应步骤为：

(1)1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸盐(I)与对氨基苯甲酸(II)于乙醇中反应，反应毕碱化，稀盐酸酸化，得4-胍基苯甲酸盐酸盐(III)；

(3)4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯盐酸盐(V)于二甲亚砜溶剂中，冰浴下与稀氢氧化钠作用，得游离4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯，再与甲烷磺酸反应得产物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐(VI)。

3.权利要求1所述抗生育化合物与辅料组成的抗生育制剂，其特征在于辅料为柠檬酸、柠檬酸钠、过氧化氢、卡泊浦974p和甘油，配比如下：

4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸盐 1份

柠檬酸 5-7份

柠檬酸钠 22-26份

过氧化氢 4-6份

卡伯浦974 0.8-1.2份

甘油 12-14份。

4.权利要求1所述抗生育化合物用于制备抗生育制剂的用途。