CN1431894A - 含有得自转基因非人动物的人血清蛋白的化妆品组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备含有HSA的化妆品组合物的方法,其中(a)HSA得自转基因非人动物;和(b)HSA与适当载体和/或辅剂混和。按照本发明的一个优选实施方式本发明涉及已知油授乳牛的乳汁获得HSA的方法。最后,本发明涉及按照这些方法获得的化妆品组合物以及它们在皱纹、斑痕和烧伤的美容处理中的应用。
Description
本发明涉及制备含有人血清白蛋白(HSA)的化妆品组合物的方法,其中所述的HSA得自转基因动物。本发明进一步涉及通过这种方法获得的化妆品组合物。
白蛋白是脊椎动物中最丰富的可溶性蛋白,同时在血浆中代表着最高浓度的蛋白。
在人体中,HSA是在肝脏中产生的分子量为65kDa的球形、非糖基化蛋白。该蛋白参与大量基本功能,其中包括在循环系统中调节血压和渗透压以及转运脂肪酸、氨基酸、胆色素和多种血清分子。
为了在患有液体损失例如外科手术、休克、烧伤或水肿的患者中获得正常渗透压,HSA作为血浆扩张剂施用。鉴于这个目的,HSA目前是通过将血液捐献者收集的血液的分级分离来制备的。然而,这种制备方法本质上存在被传染性试剂例如肝炎病毒、人免疫缺陷病毒等污染的危险。因此从人体需要纯化HSA包括产品的巴氏消毒并且非常昂贵。
已知HSA是人体皮肤的主要组分。分离自人血的HSA的化妆品用途业已被提出但从未实现过,因为这种应用将违背伦理道德。由于从血液分离HSA的方法十分昂贵,由此得到的HSA的化妆品应用进一步受到这种蛋白的价格的阻碍。
由于通过编码所述因子的基因的重组表达来制备的血液制品例如凝血因子的数量日益增多,所以市场的动力进一步提高了从血液提纯HSA的相对价格。为了确保在HSA的药物应用中的充足供应,本领域已经开发出了多种制备HSA的变通方法,其中大多数采用了编码这种蛋白的基因的重组表达。
编码HSA的cDNA向表达载体中的克隆、用这种载体转化细菌或酵母宿主细胞、被转化宿主的培养和由此制备的HSA的分离均公开在例如EP074 646、EP091 527、EP366 400和EP612 761中。一个与从重组宿主细胞分离HSA有关的问题事实上在于,残留微生物组分,例如细菌或酵母蛋白或脂质,对于人体来说是强抗原,因此必须深度纯化HSA。
HSA作为载体蛋白对于许多微生物制品和组织培养组分具有固有的结合活性,这个事实进一步使纯化方案和努力复杂化。
作为制备重组HSA的另一种方法,现已提出了生产转基因动物表达的HSA,优选使用能够在转基因动物的乳汁中提供表达的表达载体。例如WO91/08216公开了一种在控制衍生自牛αS1-酪蛋白基因的5’-3’-调节序列下制备含有完全人基因组HSA基因的表达载体的制备方法。通过微量注射这种载体可以体外转化成熟和受精卵母细胞。该卵母细胞随后被体外培养、转移到牛体内且使其发育为转基因动物。HSA被分泌到这些转基因动物的乳汁中。
另外,HSA cDNA在转基因动物的β-乳球蛋白启动子控制下被表达,这也可以导致HSA分泌到该动物的乳汁中(WO93/93164)。
从转基因动物的乳汁中分离重组HSA的方法也在本领域中公开。例如W96/02573公开,可以通过一种方法从转基因动物的乳汁中分离出HSA,其中将乳汁脱脂,随后酸沉淀除去酪蛋白并且用汽巴弄蓝(cibacron blue)-琼脂糖柱进行色谱,其适当地特异性结合HSA并且由此能够区分开HSA和相应的牛蛋白、牛血清白蛋白(此后称作BSA)。
BSA在化妆品制剂中业已被广泛地用作活性化合物,例如霜剂和洗剂中,从而获得皮肤调理作用(参见CTFA,International CosmeticIngredient Dictionary)。Kligman和Christopher(J.Soc.Cosmetics Chemists,16(1965),557-562页)在这篇文章中公开了BSA的纯化溶液可以迅速消除老化面部皮肤的鱼尾纹。在临床研究中已经证明,这种作用主要是力学上的并且通过当蛋白膜干化时拉紧皮肤来获得(Kligman,A.M.和Papa,C.M.,Journ.Soc.Cosm.Chem.,vol.16(1965),557页)。Benhaim和Brun(Parfümerie und Kosmetik,vol.770(1996),176-180页)甚至推断当其收紧皮肤时,至今还没有活性成分能够获得如同BSA的等效作用,其在化妆品中也称作“基准产品”。
化妆品制剂所用的BSA得自屠宰时的牛血。
除了该有益活性以外,出于多个原因应该在化妆品制剂中使用BSA。首先,人体已经很好地习惯于接触得自牛的产品,例如蛋白、碳水化合物、脂质、脂肪酸等;因此这些产品一般对于人体来说具有低抗原性。此外,蛋白的局部使用与其他使用方式如注射相比具有更小的变应性问题。因此BSA的化妆品应用不必需要高纯化的蛋白。因此BSA在价格上适宜,这允许将其掺混在化妆品中。
然而,有关传播性海绵状脑病(TSE/BSE,牛海绵状脑病)和这些疾病经过化妆品传染给人的事实无法完全排除,这导致不得不除去化妆品制剂中的牛制品。
白蛋白的替代来源的应用业已在现有技术中公开。例如US4,863,733涉及一种人体化妆处理的方法,其中血液得自人体,分离白蛋白且重新注射到患者体内,从而在斑痕的近处或植入区域中获得皮肤调理作用。而这种方法可以适用于自体HSA给体作用,异源给体作用也违背伦理道德,包括交叉感染的危险和过于昂贵。
卵和猪卵巢或胎盘也被推荐作为白蛋白的替代来源(U.S.2,043,657和U.S.3,041,245)。
EP180968和EP244849两者皆公开了含有HSA的化妆品制剂。据称HSA可以通过在细菌或酵母细胞中重组表达来制备。然而,如上所述,在微生物中的表达必定导致被微生物和细胞培养物抗原污染。因此由这些来源获得的HSA不得不提纯至非常高的水平,从而获得可以用在人体上的组合物。
这种纯化作用如此昂贵使该方法无法生产有销路的产品。
本发明面临的问题是制备具有可销售价格的化妆品制剂,其包含具有优于BSA的性能的活性化合物。
通过一种制备含HSA的化妆品组合物的方法可以解决这个问题,其中
(a)HSA得自转基因非人动物;和
(b)HSA与适当载体和/或辅剂混和。
本发明还涉及按照上述方法获得的化妆品组合物。
本发明令人惊奇地揭示出得自转基因非人动物的HSA可以用来制备化妆品组合物。转基因动物通常保存在封闭群体管理下处于相当良好制造业的条件下。因此,已知从特别选择的转基因动物收集血清白蛋白,可以避免病原体并使其与其他动物隔离开,不会涉及交叉传染疾病如BSE/TSE的危险。
按照本发明,HSA可以得自任何表达HSA基因的转基因非人动物。然而,HSA优选得自牛、绵羊、猪、马、啮齿动物或山羊。
鉴于本发明的目的术语“HSA”用于表示白蛋白总科的人体蛋白,如源于人体血液的及其天然或合成上修饰的变体。本领域技术人员了解多种人体白蛋白的多态和突变体(T.Peters,All about Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical Applications,AcademicPress Inc.,1996),这些包括在术语“HSA”中,以及人体白蛋白的含有至少1/3和优选2/3该蛋白序列的片段。
通过取代、插入或添加核苷酸在编码HSA的基因可以获得其他变体并且属于本申请中所用术语“HSA”范畴,只要由此制备的HSA核苷酸序列仍然具有与天然序列至少75%的同源性,其中优选至少85%的同源性并且首选至少90%的同源性。
本领域技术人员熟知用具有编码感兴趣的外来蛋白的异源DNA和用于在转基因动物中表达该蛋白的调节序列转化非人动物的单细胞的方法,以及再生转基因动物的方法(WO91/08216;Bondioli等,Biotechnology,
vol.16(1991),265;Ebert等,Bio/Technology,vol.9(1991),835;Hammer等,Nature,
vol.315(1985),680;Houdebine L.M.(ed),Transgenic Animals-Generation and Use,Harwood Academic Publishers GmbH(1996),Amsterdam;Pinkert C.A.(ed),Transgenic Animal Technoligy:A Laboratory Handbook.Academic Press,San Diego(1994),CA))。
通过任何现有技术中已知的许多方法可以用核酸转化细胞。例如,用一种包括下列步骤的方法可以获得转基因非人动物:(a)将核酸编码HSA引入到适当的非人受体细胞;和(b)从该受体细胞再生转基因非人动物。
受体细胞优选是胚胎细胞,但也可使用其它类型的细胞。转基因非人动物由胚胎受体细胞开始的再生包括将细胞转移到雌性非人动物中,并让胚胎在其体内生长。
生产转基因非人动物的方法还可以包括动物的克隆。本领域技术人员熟知克隆动物的方法(Baguisi等,Nature Biotech.,
vol.17(1999),456-461;Campbell等,Nature,
vol.380(1996),64-66;Cibelli等,Science,
vol.280(1998),1256;Kato等,Science,
vol.282(1998),2095-2098;Schnieke等,Science,
vol.278(1997),2130-2133;Vignon等,C.R.Acad.Scin.Pzaris,Sciences de la Vie/Life Sciences
vol.321(1998),735-745;Wakayama等,Nature,
vol.394(1998),369-374;Wells等,Biol.Reprod.
vol.57(1997),385-393;Wilmut等,Nature,vol.385(1997),813)并且很容易按照本发明用于制备大量转基因动物。
在一个实施方式中HSA得自转基因非人动物的乳汁或血液,优选得自授乳牛的乳汁。
在另一实施方式中HSA得自转基因鸟的卵。该转基因鸟优选是小鸡。在转基因母鸡中表达蛋白使该蛋白转运到那些母鸡卵内的方法是本领域熟知的(参见例如Morrison等,Immuotechnology,vol.4(1998),p115-125)。
含有HSA的转基因动物的组成部分或产品(例如乳汁或卵)可以直接配制成化妆品制剂。或者,可以从其中分离出部分或全部的HSA。因此本发明业提供一种制备化妆品组合物的方法,其包括从转基因动物分离HSA的步骤。
本领域技术人员懂得多种纯化蛋白的方法并且可以根据本发明使用以获得纯化的HSA。例如,如果从转基因非人动物的乳汁中分离HSA,优选通过过滤进行。
澄清化或除澄清化以外,分离HSA的方法可以进一步包括一个或多个步骤,其中从含HSA的溶液中沉淀出HSA。例如可以从转基因非人哺乳动物的乳汁或血液通过一个沉淀步骤获得高纯度的HSA。本领域熟知能够沉淀HSA的适当试剂,并且本领域技术人员可以通过简单试验进行鉴定。此后,利用熟知方法将HSA重新悬浮在预期溶液中。更加可取地,溶剂具有简化HSA的化妆学用途的特性(pH、离子的选择)。
分离HSA的方法可以进一步包括色谱纯化步骤,其可以按照本领域已知的多种任何色谱方法进行。优选采用亲合或离子交换色谱。
按照本发明从转基因非人动物获得的HSA不一定需要纯化达到高水平。因此,用于化妆品组合物的制剂的HSA制品可以仍然含有例如残留量的BSA,含量范围占被分离HSA重量的0.05-2.5%(重量),最优选0.5-1.0%(重量)。
所述的化妆品化合物可以进一步包含转基因动物的其他物质,例如其他蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物等。由于大多数人已经很好地习惯于接触来自这些动物的产品,所以使用本发明的制剂时变应性反应的危险性很低。
按照本发明的方法制备的化妆品组合物可以含有任何量的适合化妆品制剂的HSA。通常,HSA的含量是该化妆品组合物重量的0.1-30%(重量)的范围内并优选1-15%(重量)。最优选HSA的浓度是该化妆品组合物重量的3-8%(重量)。
本领域技术人员了解用于制备化妆品制剂的多种载体和辅剂(例如可以参考Jellinek,Kosmetologie,Dr.Alfred Hüthig Verlag;Janistyn,Taschenbuch der Modernen Parümerie und Kosmetik,Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart;和Bauer等,Pharmazeutische Technologie,Thieme Verlag)。因此,用于制备本发明的化妆品组合物的载体和/或辅剂的种类,应取决于所制备化妆品的类型。本领域已知的任何适合给予HSA的载体和辅剂可以用在制备本发明的化妆品组合物的方法中。
(水包油和/或油包水)霜剂、洗剂、油、水凝胶剂和防晒剂、晒后和须后制剂的许多实例公开在W.Umbach,Kosmetik:Entwicklung,Herstellung u.Anwendung Kosmet.Mittel,Thieme,1995中。HSA可以通过所属领域技术人员熟知的方法掺混在任何这些制剂中。
由于其光滑和湿润活性,HSA适宜掺混在“免洗”产品中,例如水凝胶剂、霜剂、防晒凝胶、晒后和须后制剂以及唇膏。按照本发明,尤其优选将HSA掺混在基因水包油或油包水乳液的制剂中和成膜制剂中。
除了HSA以外,所述的化妆品制剂可以含有一种或多种其他活性化合物,例如抗细菌或抗真菌化合物。
在另一实施方式中,本发明涉及已知按照上述方法获得的化妆品组合物。该化妆品组合物可以具有任何已知化妆品组合物的形式,但优选配制为洗剂、霜剂、凝胶剂或油。
最后,本发明还涉及这些组合物在一般性皮肤调理中和特别是在皱纹、斑痕和烧伤的美容处理中的应用。
Claims (19)
1.制备含有HSA的化妆品组合物的方法,其中:
(a)HSA得自转基因非人动物;和
(b)HSA与适当载体和/或辅剂混和。
2.按照权利要求1的方法,其中HSA得自牛、绵羊、猪、马、啮齿动物或山羊。
3.按照权利要求1或2的方法,其中HSA得自转基因非人动物的乳汁或血液。
4.按照权利要求1-3任一的方法,其中HSA得自授乳牛的乳汁。
5.按照权利要求1或2的方法,其中HSA得自转基因鸟的卵。
6.按照上述权利要求任一的方法,其中获得HSA的步骤包括澄清化步骤。
7.按照权利要求6的方法,其中所述的澄清化是通过过滤进行。
8.按照权利要求1-7任一的方法,其中获得HSA的步骤包括从含HSA的溶液沉淀出HSA的步骤。
9.按照权利要求1-8任一的方法,其中获得HSA的步骤进一步包括色谱纯化步骤。
10.按照权利要求9的方法,其中色谱步骤是通过亲合色谱或离子交换色谱进行。
11.按照权利要求1-10任一的方法,其中从转基因非人动物分离出的HSA含有残留量的占被分离HSA重量0-10%重量的BSA。
12.按照权利要求11的方法,其中残留量的BSA是被分离HSA重量的0.05-2.5%重量。
13.按照权利要求12的方法,其中残留量的BSA是被分离HSA重量的0.5-1.0%重量。
14.按照权利要求1-13任一的方法,其中HSA以占化妆品组合物重量0.1-30%重量的浓度掺在化妆品组合物中。
15.按照权利要求14的方法,其中HSA以占化妆品组合物重量1-15%重量的浓度掺在化妆品组合物中。
16.按照权利要求15的方法,其中HSA以占化妆品组合物重量3-8%重量的浓度掺在化妆品组合物中。
17.按照权利要求1-16任一项所述的方法获得的化妆品组合物。
18.按照权利要求17的化妆品组合物,其是洗剂、霜剂、凝胶剂或油。
19.按照权利要求17或18之一所述的组合物在皱纹、斑痕和烧伤的美容处理中的应用。
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