CN1429121A - 聚谷氨酸－喜树碱结合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供聚谷氨酸－治疗剂结合物及其制备方法和应用。

Description

聚谷氨酸-喜树碱结合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及包含分别与喜树碱和生物活性喜树碱类似物共价结合的聚谷氨酸聚合物的组合物。本发明还涉及此种组合物的制备方法和药物用途。
背景技术
喜树碱是一种不溶于水的旋光性生物碱，从喜树(Camptothecaacuminata)获得。20(S)-喜树碱和20(S)-喜树碱类似物是细胞毒性剂，据认为其作用原理是：稳定DNA的磷酸二酯主链中的一种拓扑异构酶I-诱导的单链断裂，从而阻止重新连接。这导致复制期间双链DNA断裂的产生，若不修复，就会导致细胞程序死亡。20(S)-喜树碱和许多20(S)-喜树碱类似物不溶于水。这些药物当中有许多表现出对人体癌细胞系和动物(活)体内异种移植物(xenografts)的优异抗肿瘤活性。然而，它们不溶于水的特性使这些药物难以给药。另外，20(S)-喜树碱及其类似物的药理学上重要的内酯环在人体血浆清蛋白存在下不稳定，从而导致该活性药物转化为与该清蛋白结合的钝化羧酸酯形式。克服20(S)-喜树碱及其类似物的此种药物和药代动力学缺陷的一种途经是使它们共价键合到诸如聚乙二醇之类的中性聚合物上(例如参见下面的参考文献1和2)。利用这种方法，大多数活性喜树碱的水中溶解度可得到改善，以致该结合的聚合物可溶解在含水介质中以非经肠方式给药。
目前，仍然需要一种新聚合物结合物，其每个聚合物链能增溶较大量20(S)-喜树碱或20(S)-喜树碱类似物，从而减少给定剂量活性药物给药时所需要的聚合物总质量。另外，仍然存在着对这样一种新聚合物结合物的需要，即，它具有20(S)-喜树碱的未结合水溶性药物前体及其类似物所不具备的作为抗肿瘤剂的独特性质。
背景出版物
1.U.S.Patent No.5,646,159
2.Greenwald et al.，Bioorg.Med.Chem.6：551-562(1998)
3.U.S.Patent No.5,545,880
4.Conover et al.Cancer Chemother.Pharmacol.42：407-414(1998)
5.PCT Application WO 99/17804
6.Hesswijk et al.J.Cont.Re.1：312(1985)
7.U.S.Patent No.5,880,131
8.U.S.Patent No.5,892,043
9.U.S.Patent No.5,837,673
10.U.S.Patent No.5,854,006
11.U.S.Patent No.5,340,817
12.U.S.Patent No.4,943,579
13.Singer et al.，Ann.NY Acad.Sci.922：136-150(2000)
发明详述
定义
本文所使用的术语“聚谷氨酸”或“聚谷氨酸聚合物”包括聚(1-谷氨酸)、聚(d-谷氨酸)、聚(d1-谷氨酸)、聚(1-γ谷氨酸)、聚(d-γ谷氨酸)和聚(d1-γ谷氨酸)。优选的是，该聚谷氨酸聚合物包含的氨基酸残基中至少50％是谷氨酸，更优选100％是谷氨酸。聚谷氨酸聚合物可被天然存在或化学改性的氨基酸，优选亲水氨基酸，取代最高达50％，只要当结合到治疗剂上时该取代的聚谷氨酸聚合物具有比未结合的治疗剂改进的水中溶解度和/或改进的效果，且优选是非致免疫的。
按本文所描述的方法制备结合物中所使用的聚谷氨酸聚合物的分子量通常大于5000D(道尔顿)，优选20kD～80kD，更优选25kD～60kD(按粘度测定)。本领域技术人员将懂得，当用其他方法测定时，分子量数值可能不同。这些其他方法包括，例如凝胶渗透、小角光散射、多角度激光散射、折光指数和它们的组合。
本文所使用的术语“PG”是指聚谷氨酸聚合物。
本文使用的术语“喜树碱”是指20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物。“CPT”是指具有如下结构的20(S)-喜树碱：
Figure A0180944100131
其中R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H。
“20(S)-喜树碱类似物”是指这样的生物活性20(S)-喜树碱类似物，其中上式所示喜树碱结构上的一个或多个R基团不是氢。例如参见，Wang等人，《Med.Res.Rev.(医学研究评论)》17：367～425(1997)；Labergne和Bigg，《Bull.Cancer(癌症通报)》(巴黎)1：51～8(1998)；以及本文的表2。
本文使用的术语“聚谷氨酸-喜树碱结合物”或“PG-喜树碱”是指共价键合到20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物上的聚谷氨酸聚合物，其中的键合可以通过聚谷氨酸的羧酸基团与治疗剂的官能团之间的直接键，或者通过双官能间隔基实现间接连接。优选的间隔基是在循环中对水解相对稳定的、可生物降解的并且当从结合物上裂解下来时是无毒的。要知道，合适的间隔基应不干扰结合物的抗肿瘤效果。间隔基的例子包括氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、-[NH-(CHR’)p-CO]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的侧链，n是1～10的整数，最优选1～3；p是1～10的整数，最优选1～3；通式为-[O-(CHR’)p-CO]n-的羟基酸，其中R’是天然存在的氨基酸的侧链，n是1～10的整数，最优选1～3；p是1～10的整数，最优选1～3(例如，2-羟基乙酸、4-羟基丁酸)；二醇、氨基硫醇、羟基硫醇、氨基醇以及这些的组合。目前优选的间隔基是氨基酸，更优选天然存在的氨基酸，更优选甘氨酸。治疗剂可通过任何连接方法连接到该聚合物或间隔基上，只要能生成可生物裂解键(即，在对应于活动物生物体内的条件下可借助酶催或非酶催机理裂解的键)。优选的键的例子包括酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰氧基烷基醚、酰氧基烷基硫醚、酰氧基烷基酯、酰氧基烷基酰胺、酰氧基烷氧羰基、酰氧基烷基胺、酰氧基烷基酰胺、酰氧基烷基氨基甲酸酯、酰氧基烷基氨磺酰、缩酮、缩醛、二硫键、硫酯、N-酰胺、烷氧羰氧基烷基、脲和N-磺酰基亚氨酸酯(N-sulfonylimidate)。目前最优选的是酰胺和酯键。
生成这些键的方法是有机合成化学领域技术人员熟知的且可见诸于，例如标准教科书如March，《高等有机化学》，WileyInterscience(1992)。
喜树碱在PG上的加载程度可表示为每个聚谷氨酸聚合物链的(喜树碱)分子数目，或优选地，作为结合物总重量的百分数(“％加载”)。对于给定结合物和给定用途，最佳加载度可根据所要求的结合物性质(例如，水中溶解度、疗效、药代动力学性质、毒性和剂量要求)凭经验确定。
PG-喜树碱结合物的加载百分数可按照下文“制备方法”一节所描述的方法测定。
喜树碱或喜树碱类似物必须能够通过在该天然分子上已经存在的官能团连接到聚合物上，或者可通过合成有机化学中熟知的程序引入，但不得改变药剂的活性。在下面给出的例子中以及如表3所示，喜树碱当处于未结合形式时为相对不溶于水的，而经过结合之后，则表现出在溶解度上的大大改善。然而，即便水溶性类似物和药物前体(例如，氨基酸酯)，在它们结合到聚谷氨酸上之后预期也将表现出许多优点(例如，药代动力学和在作用部位的保持性均比未结合的药剂改善，效果提高)。
在“标准偶联条件”下进行的反应是在偶合剂和催化剂存在下、在-20℃～150℃，优选0℃～70℃，更优选0℃～30℃的温度、在惰性溶剂(例如，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮)中进行的。当然，所用温度将取决于诸如治疗剂的稳定性和连接基团的反应性之类的因素。合适的偶合剂乃是合成有机化学中熟知的，包括但不限于，碳化二亚胺、氯甲酸烷基酯和三乙胺、吡啶鎓盐-三丁胺、二氯磷酸苯酯、2-氯-1，3，5-三硝基苯和吡啶，二-2-吡啶基碳酸酯、聚苯乙烯基二苯膦、(三甲基甲硅烷基)乙氧基乙炔、三氟甲磺酸1，1’-羰基双(3-甲基咪唑鎓)盐、偶氮二羧酸二乙酯和三苯膦、N，N’-羰基二咪唑、甲磺酰氯、新戊酰氯等。适合醇偶联的催化剂包括，例如4-N，N-二甲氨基吡啶和4-吡咯烷并吡啶。本文使用的术语“惰性溶剂”是指在与反应联系起来描述的反应条件下呈惰性的溶剂，例如包括苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃(“THF”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)、氯仿(“CHCl3”)、二氯甲烷(或“CH2Cl2”)、二乙醚、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、二噁烷、吡啶、二甲氧基乙烷、叔丁基甲基醚等。除非另行指出，本发明反应中使用的溶剂是惰性溶剂。
若多个官能团存在于喜树碱上，则选择性地将特定官能团连接在聚谷氨酸聚合物上，通常将要求使用适当保护基团。术语“保护基团”或“封闭基团”是指任何当键合到化合物的一个或多个羟基、巯基、氨基或羧基基团上时能防止在这些在基团上发生反应的基团，且保护基团可通过传统化学或酶催步骤脱除而重建原来的羟基、巯基、氨基或羧基基团。一般内容可参见Greene和Wuts的《有机合成中的保护基团》1999(John Wiley and Sons，纽约)。
具体使用何种可脱除保护基团并不重要，而优选的可脱除的羟基保护基团包括传统取代基，如烯丙基、苄基、乙酰基、氯乙酰基、硫代苄基、亚苄基(benzylidine)、苯甲酰甲基、叔丁基-二苯基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、MOM(甲氧基甲基)、MEM(2-甲氧基乙氧基甲基)以及任何其他能用化学方法引入到羟基官能团上且随后在与产物本性相容的温和条件下通过化学或酶催方法选择性脱除的基团。
优选的可脱除的氨基保护基团包括传统取代基，如叔丁氧羰基(t-BOC)、苄氧羰基(CBz)、芴基甲氧羰基(FMOC)、烯丙基氧羰基(ALOC)、三氯乙氧羰基(TROC)等，它们均可通过与产物本性相容的传统条件脱除。优选的羧基保护基团包括酯，如甲基、乙基、丙基、叔丁基等的酯，它们均可通过与产物本性相容的温和水解条件脱除。
专用语
表1中作为范例结合物给出本发明的某些PG-喜树碱结合物的专用名。表1所用专用名也可结合图1加以理解。
                表1
化合物                        PG结合物
1                              PG-CPT
                             (20-连接的)
2                          PG-(10-OAc-CPT)
                             (20-连接的)
3                          PG-(10-OH-CPT)
                             (20-连接的)
4                           PG-甘氨酰-CPT
                      (20-连接的)(甘氨酰＝gly)
5                       PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT
                              (20-连接的)
6                   PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT
                              (20-连接的)
7                            PG-丙氨酰-CPT
                              (20-连接的)
8                           PG-β-丙氨酰-CPT
                              (20-连接的)
9                          PG-(4-NH-丁酰)-CPT
                              (20-连接的)
10                          PG-(2-O-乙酰)-CPT
                              (20-连接的)
11                          PG-(4-O-丁酰)-CPT
                          (20-连接的)
12                         PG-(β-谷氨酰)-CPT
                              (20-连接的)
13                          PG-(10-O-CPT)
                              (10-连接的)
14                       PG-甘氨酰-(10-O-CPT)
                              (10-连接的)
15                          PG-(9-NH-CPT)
                             (9-连接的)
16                      PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)
                             (9-连接的)
17                      PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)
                             (20-连接的)
18                   PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)
                             (20-连接的)
19              PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)
                             (20-连接的)
优选实施方案描述
附图简述
图1显示表1中列举的PG-喜树碱(PG-CPT)结合物的结构。
优选实施方案详述
A.结合物
本发明涵盖的药物活性聚谷氨酸-喜树碱结合物，可用通式I表征：
Figure A0180944100171
其中：
PG是聚谷氨酸聚合物；
X是单键、氨基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羟基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的侧链；
喜树碱是20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物；
m是5～65的正整数；
喜树碱-X通过酯或酰胺键共价连接到所述聚合物的羧基基团上；
n是1～10，最优选1～3的整数；以及
p是1～10，最优选1～3的整数；
并用具体结构式II～VII表示：
其中R1、R2、R3和R4各自是氢；或
R1是-NH2，且R2、R3和R4各自是氢；或
R1是-NO2，且R2、R3和R4各自是氢；或
R1、R3和R4各自是氢且R2是-OH；或
R1、R3和R4各自是氢且R2是-O-C(O)-CH3；或
R1和R3各自是氢且R4是-Si二甲基叔丁基和R2是-OH。
Figure A0180944100182
Figure A0180944100191
其中Y是N或O；以及
其中：
Y是N或O；
R’是天然存在的氨基酸的侧链；
R1是-NH2或H；
R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；
R3是-H或烷基；以及
R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基。
本文使用的术语“烷基”是指脂族烃基团。该烷基基团具有1～20个碳原子(不论在本文中何处出现，诸如“1～20”烷基基团是指在给定范围内的每个整数；例如，“1～20个碳原子”是指，烷基基团可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至并包括20个碳原子组成，尽管这一定义也覆盖那些本文中没有明确指定数值范围的术语“烷基”的情况)。更优选的是，它具有1～10个碳原子的“中级”烷基。最优选的是，它是具有1～4个碳原子的“低级”烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基。烷基基团可以是取代或未取代的。当被取代时，取代基基团优选是一个或多个单独并独立地选自羟基、烷氧基、巯基、烷硫基、氰基、卤素、羰基、硝基和氨基的基团。
本文使用的术语“三烷基甲硅烷基”是指基团-Si(烷基)3，其中使用的“烷基”按上面的规定。
本发明优选实施方案包含一种PG-喜树碱结合物，与未结合喜树碱或喜树碱类似物相比，这种结合物表现出显著的抗肿瘤活性、提高的水中溶解度、较低毒性和较高最大耐受剂量(MTD)。与未结合药剂相比，此种结合物预期还将表现出独特的药代动力学特性(例如，提高的渗透性和在肿瘤组织中的保持性、活性剂的持续释放、长生物学半衰期)并使药物的内酯环形式稳定化，已知这对于其活性具有至关重要的作用。另外，还预期，通过结合到PG的多个可用结合部位上使高度不可溶喜树碱类似物增溶的能力将扩大本来可能具有高活性但由于其溶解度问题目前尚无法使用的临床上有用的喜树碱类似物的范围。参考上面的结构式，由通式II和通式VI代表的PG-喜树碱结合物是目前最优选的，其中：
R1、R2、R3和R4各自是氢；
R1、R3和R4各自是氢，R2是-OH或-O-C(O)-CH3；
R1是-NH2，R2、R3和R4各自是氢；
以及由通式IV代表的结合物。
该结合物中使用的聚谷氨酸聚合物应可溶于水、可生物降解和基本不导致免疫。本发明范围所涵盖的聚谷氨酸聚合物已在上面做了描述(参见“定义”)。聚谷氨酸聚合物的分子量一般大于5000D，优选20kD～80kD，更优选25kD～60kD(按粘度测定)。目前最优选的是分子量介于30kD～50kD的聚(L-谷氨酸)聚合物。本领域技术人员将懂得，当采用其他方法测定时，该分子量数值可能不同。这些其他方法包括，例如凝胶渗透、小角光散射、多角度激光散射、折光指数和它们的组合。
对于本发明的直接结合物而言，加载百分数优选介于约7％～约20％，更优选约10％～约17％，进一步优选约12％～约15％。就通过氨基酸连接基间接地连接到PG上的结合物来说，加载百分数优选介于约7％～约50％，优选约15％～约38％，最优选约20％～约38％。
B.制备方法
本发明聚谷氨酸-喜树碱结合物可通过将生物活性喜树碱化合物直接或间接连接到聚谷氨酸聚合物上来制备。任何喜树碱化合物均可使用，只要它包含或者通过官能化，优选通过酯或酰胺键，而带上可连接到PG的γ-羧酸酯基上的基团。例如参见，Wang等人，《Med.Res.Rev.(医学研究评论)》17：367～425(1997)；Labergne和Bigg，《Bull.Cancer(癌症通报)》(巴黎)1：51～8(1998)；以及下表2。于是，20(S)-喜树碱和生物活性20(S)-喜树碱类似物可通过喜树碱核的20(S)-羟基基团，或者通过类似物的另一种可用官能团，连接到PG上。
一般来说，直接连接的聚谷氨酸-喜树碱结合物的制备程序是，将喜树碱和聚谷氨酸溶解在二甲基甲酰胺或其他惰性溶剂中，使该溶液冷却并在冷却的混合物中加入偶合剂和过量胺碱，例如，二甲氨基吡啶。令人惊奇的是，现已发现，用双(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯(BOP-Cl)或碘化2-氯甲基吡啶鎓作为偶合剂能制备20(S)-喜树碱或20(S)-喜树碱类似物含量比本领域此前已知的数值显著提高(即，约10％～20％范围的加载百分数)的结合物。这一发现之所以特别重要是因为，它提供一种活性药物与PG聚合物的摩尔比大大提高的组合物，因而可减少对患者施用给定剂量药物时所需要的聚合物总质量。此种结合物的其他有利和新颖特征将在本申请的其他地方讨论。
让反应混合物温热并搅拌一段足以使反应进行到完成约70％的时间。形成的结合物可这样离析出来：通过加入过量体积的盐水溶液(例如，NaCl、KCl、NH4Cl)，优选10～15％盐溶液，同时在0℃～10℃之间将反应混合物冷却从而将其从溶液中沉淀出来，然后收集质子化形式的固体结合物。
现已发现，必须从结合物中去除未反应喜树碱，以确保本发明组合物的高效果、最低毒性。未反应喜树碱或其他杂质可通过用可溶解未反应喜树碱或其他杂质(但不溶解结合物)的有机溶剂，例如，1～3％甲醇-二氯甲烷、1～3％甲醇-氯仿、氯仿、二氯乙烷等洗涤该固体结合物，从而将其萃取出来。一般而言，未反应喜树碱在结合物产物中的存在可按如下程序检测：在2％甲醇-二氯甲烷中用超声波处理结合物3小时，然后通过薄层色谱法(TLC)分析有机萃取物中的喜树碱。结合物的1H NMR谱提供有关喜树碱是否共价键合到PG上的证据(见表3某些选择的范例结合物的NMR分析数据)。
为测定加载到聚合物上的药物量，一部分直接结合的PG-喜树碱在碱存在下进行水解，结果释放出被结合的喜树碱，这同时也将内酯环打开而成为游离羧酸盐。酸化以使羧酸盐重新闭环成为内酯后，萃取出释放出的喜树碱。采用薄层色谱法(TLC)和1H NMR技术对如此获得的喜树碱与喜树碱的纯真样品进行比较。根据从萃取物中回收到的喜树碱数量和产物结合物的重量计算出加载百分数。该加载百分数也可通过测定PG-喜树碱的紫外吸收度，并从喜树碱标准曲线计算出喜树碱含量来确定。就典型而言，该测定是在364nm进行的。然而，本领域技术人员却能够仅凭常规实验就确定出该测定的最佳波长。当存在多个可用于连接的官能团时，某一药物的特定基团在聚谷氨酸聚合物上的选择性连接要求根据这些基团的不同反应性采取适当保护基团。适当保护基团的非限定性例子是乙酰基。本领域已知的其他适宜保护基团例如描述在Greene和Wuts，(《有机合成中的保护基团》1999(JohnWiley and Sons，纽约))中。
20(S)-10-羟基喜树碱用诸如醋酐之类的活性酰基给体在吡啶碱存在下进行处理能给出唯一在10-羟基基团的反应。该10-乙酰氧基衍生物随后通过20(S)-羟基连接到PG上。之所以选择乙酸酯作为保护基团是因为，预期它将在体内水解并且是可药用的。替代地，10-羟基基团在结合到PG上之前可用可脱除的保护基团(例如BOC)保护，随后再用三氟乙酸处理实现脱保护(参见下文实例3)。在没有保护基团的情况下，20(S)-10-羟基喜树碱与PG采用碘化氯甲基吡啶鎓/4-二甲氨基吡啶/PG-H在二甲基甲酰胺中的反应能得到作为唯一产物的PG-(10-O-CPT)。
20(S)-9-氨基喜树碱在直接结合条件下(碘化氯甲基吡啶鎓和4-二甲氨基吡啶)在PG上的偶联，发生在芳族A-环杂原子取代基上，在此种情况下生成PG-9-NH-CPT作为唯一产物。该结果是根据20(S)-9-氨基喜树碱与Boc-L-谷氨酸α-叔丁酯的类似偶联结果推断的，后面的偶联所获产物的1H NMR谱显示对应于20(S)-9-氨基喜树碱芳族质子的信号的特征位移，而对应于内酯乙基质子的信号则未发生位移。
本发明涵盖的PG-喜树碱结合物也可通过在20(S)-喜树碱或20(S)-喜树碱类似物与PG聚合物的α-或γ-羧基基团之间插入一个双官能连接基来制备。优选的连接基是天然存在的氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸或羟基酸，更优选甘氨酸连接基。采用此种连接基能提供一种其20(S)-喜树碱及其类似物的加载百分数比直接结合物更高的高效结合物。间接结合物的一般制备方法是：按照已知程序(例如参见，美国专利5,646,159和Greenwald等人，《Bioorg.Med.Chem.》6：551～562(1998)制备20(S)-喜树碱或所要求的20(S)-喜树碱类似物的氨基酸酯或羟基酯，并在标准偶联条件下分别通过氨基酸的氨基基团或羟基酸的羟基基团偶联到PG的α-或γ-羧基基团上，从而分别生成酰胺或酯键。
20(S)-10-羟基喜树碱通过连接到20(S)-羟基基团上的甘氨酸连接基结合到PG上是这样实现的：20(S)-羟基喜树碱用二碳酸二叔丁基酯和吡啶处理唯一地获得相应的10-O-Boc衍生物。后者用Boc-甘氨酸采用碳化二亚胺偶合剂(例如，二异丙基碳化二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺)和4-二甲氨基吡啶，进行20-O-酰基化。用三氟乙酸脱除这两个Boc保护基团，随后与PG结合，结果获得PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)。采用此种方法合成了PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)和PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)。
20(S)-10-羟基喜树碱通过连接在10-羟基基团上的甘氨酸连接基结合到PG上是这样实施的。20(S)-10-羟基喜树碱用Boc-甘氨酸和吡啶的对称酐进行处理，结果仅生成相应的10-(N-Boc)-甘氨酸酯。后者用三氟乙酸处理而脱除N-Boc保护基团。获得的20(S)-10-羟基喜树碱的10-甘氨酸酯采用1，3-二异丙基碳化二亚胺和4-二甲氨基吡啶结合到PG上，结果生成PG-甘氨酰-(10-O-CPT)。
在甘氨酸的α-氨基酸基团上偶联的唯一性是根据20(S)-10-羟基喜树碱的10-甘氨酸酯与N-Boc-L-谷氨酸α-叔丁酯在相同反应条件下的类似偶联推断的。后一反应产物的1H NMR谱显示对应于20(S)-10-羟基喜树碱芳族质子的特征信号的位移，然而对应于内酯乙基基团质子的信号则不发生位移。
20(S)-9-氨基喜树碱通过连接在9-氨基基团上的甘氨酸连接基结合到PG上的头两个步骤可按照Wall等人，《J.Med.Chem.》36：2689-2700(1993)所描述的方法完成。20(S)-9-(甘氨酰氨基)喜树碱的三氟乙酸盐在PG上的结合是在二异丙基碳化二亚胺和二甲氨基吡啶存在下进行的，结果生成PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)。
利用甘氨酰-甘氨酸(甘氨酰-甘氨酰；二甘氨酰)连接基使PG与20(S)-喜树碱结合是这样实现的：首先，20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐与N-(叔丁氧羰基)甘氨酸在碳化二亚胺偶合剂存在下起反应生成20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)-喜树碱。后者随后用三氟乙酸处理生成20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐。20-O-(甘氨酰-甘氨酰)-喜树碱三氟乙酸盐随后与聚-L-谷氨酸在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二异丙基碳化二亚胺存在下起反应生成PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT。
利用甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰；三甘氨酰)连接基使PG与20(S)-喜树碱结合是这样实现的：首先，((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)-甘氨酸与20-(S)喜树碱在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二异丙基碳化二亚胺存在下起反应生成20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)-甘氨酰)喜树碱。20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)甘氨酰)喜树碱随后用三氟乙酸起处理生成20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐。后者与聚(L-谷氨酸)(956mg)在N，N-二甲氨基吡啶和1，3-二异丙基碳化二亚胺存在下起反应生成PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT。
本发明PG-喜树碱结合物表现出抗各种肿瘤的抗肿瘤活性，包括人类肺癌、人类非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和黑瘤(参见实例20)。据信，这些结合物将具有广谱抗哺乳动物(包括人)癌症的活性，包括固体肿瘤(例如，肺、卵巢癌、乳腺、胃肠、结肠、胰腺、膀胱、肾、前列腺、脑)以及各种造血系统癌(例如，Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血症)。据信，这些结合物在治疗抗药性癌症方面也十分有用。
包含本发明PG-喜树碱结合物的药物组合物也包括在本发明范围内。这些药物组合物还包括任何有效地显示(活)体内抗肿瘤活性数量的结合物。医学专业的临床医生将懂得，对病人给药的剂量将随着患者的年龄、体重和身体条件、给药途经、具体治疗的癌症、肿瘤发展阶段等因素而不同。就任何特定对象而言，具体剂量服法(包括剂量和给药次数)应当由有经验的医生针对该病人酌定。设想该结合物的体内给药有效剂量(优选非经肠或静脉给药)每千克体重每日为约0.1～100毫克当量(mg eq.)喜树碱或喜树碱类似物，优选每千克体重每日为1～60毫克当量喜树碱或喜树碱类似物。该药物组合物包含药用有效量的PG-喜树碱结合物，和可药用载体或稀释剂。有效量药物组合物的确定则完全属于本领域技术人员所能掌握的。治疗用的可接受载体或稀释剂乃是药学领域众所周知的，例如描述在《Remington’sPharmaceutical Sciences》Mack出版公司(A.R.Gennaro主编，1985)。防腐剂、稳定剂、染料或其他添加剂可加入到该药物组合物中。本发明范围还包括PG-喜树碱结合物与其他药物一起给药的组合疗法，其它药物包括但不限于其他抗肿瘤药物，以及与放疗相结合组合疗法。
该药物组合物可根据治疗对象的具体条件配制，并可通过全身/局部给药。配制技术和给药可见诸于上面的《Remington’sPharmaceutical Sciences》。合适的途经可包括口服、直肠、经皮、阴道、经粘膜或经肠给药；非经肠给药，包括肌肉、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接静脉内、静脉内、腹腔、鼻内或眼内注射。
用于注射，本发明药物组合物可配制成水溶液，优选配制成在生理学相容的缓冲液如生理盐水缓冲液中的溶液。为了实施本发明，使用可药用载体将本文公开的药物组合物配制成适合全身给药的单位剂量形式，乃属本发明范围之内。
本发明将通过下面的实施例加以说明，然而它们从任何意义上不应视为对本发明范围的限制。
实施例
在下面的实施例中，用于制备结合物的聚谷氨酸的分子量系由供应商(Sigma)，根据粘度测定结果提供的。此外，实例序号与图1中的化合物号相对应。
实例1
PG-CPT[方法1]
向预先在真空下干燥4h的20(S)-喜树碱(132mg，0.38mmol)和聚(L-谷氨酸)(33kD，530mg)的混合物中，加入无水二甲基甲酰胺(20mL)。溶液在冰浴中冷却，然后加入双(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯(174mg，0.68mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(167mg，1.37mmol)和二异丙基乙胺(74mg，0.57mmol)。让反应混合物温热至室温。搅拌2日后，混合物在冰浴中进行冷却，然后在25min内加入10％氯化钠水溶液(45mL)。该混合物通过加入0.5M盐酸(3.5mL)被酸化到pH2.5，并在室温搅拌1h。滤出沉淀，用水(4×50mL)洗涤，然后在真空下干燥12h。固体研磨成粉末之后，悬浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。搅拌3h后，固体通过离心进行分离并滗析掉上清液。重复该洗涤过程4遍以便完全除掉未反应喜树碱。固体在真空下干燥2日，获得PG-CPT(521mg，87％质量平衡，按回收的20(S)-喜树碱重量(64.5mg)计)。1H NMR(300MHz在DMSO-d6)：δ12.10(s，-COOH)，6.90-8.80(m)，5.15-5.8(m)，3.10-4.35(m)，1.42-2.62(m，)，0.90(br s，19-CH3).按如下所述确定在本实例中PG-CPT的20(S)-喜树碱重量加载百分数。向PG-CPT(100mg)在甲醇-水(1∶1，4mL)中的悬浮液中，加入1M氢氧化钠水溶液(2mL)。该黄色溶液搅拌16h，通过加入1M盐酸酸化到pH5，然后用二氯甲烷(4×20mL)萃取。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩，从而产出20(S)-喜树碱(13mg)。该样品的质子NMR和TLC与20(S)-喜树碱纯真样品的相同。根据上述结果，在本实例中20(S)-喜树碱在PG-CPT中的重量加载百分数是13％。
PG-CPT[方法2]
向在真空下干燥6h的20(S)-喜树碱(64mg，0.18mmol)和聚(L-谷氨酸)(50kD，256mg)的混合物中，加入无水二甲基甲酰胺(15mL)。溶液在冰/盐浴中冷却至-5℃之后，在氩气氛下加入碘化2-氯甲基吡啶鎓(85mg，0.33mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(81mg，0.66mmol)。让反应混合物温热至室温。搅拌4日后，将混合物冷却至0℃，然后在25min内加入10％氯化钠水溶液(35mL)。该混合物通过加入0.5M盐酸(3.5mL)被酸化到pH2.5，并在室温搅拌1h。滤出沉淀，用水(4×30mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体研磨成粉末之后，悬浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。搅拌3h后，固体通过离心进行分离并滗析掉上清液。重复该洗涤过程4遍以便完全除掉未反应的喜树碱。固体在真空下干燥，结果获得PG-CPT(295mg，97％质量平衡，按回收的20(S)-喜树碱重量(13mg)计)。
                    1H NMR(300MHz在DMSO-d6)：δ12.10(s，-COOH)，6.90-8.80(m)，5.15-5.8(m)，3.10-44.35(m)，1.42-2.62(m)，0.90(br s，19-CH3).采用按方法1在PG-CPT合成中所述方法，在本实例中PG-CPT的20(S)-喜树碱重量加载百分数的测定值是16％。
实例2
PG-(10-OAc-CPT)
20(S)-10-乙酰氧基喜树碱按照美国专利4,545,880(Miyasaka等人)中描述的方法制备，在此将文献全文收作参考。
聚(L-谷氨酸)(50kD，235mg)和10-乙酰氧基喜树碱(53mg，0.13mmol)在二甲基甲酰胺(8mL)中的悬浮液，在温和加热下进行溶解。当获得的溶液冷却至室温时，顺序加入碘化氯甲基吡啶鎓(75mg，0.29mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液和4-二甲氨基吡啶(73mg，0.60mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液。搅拌18h后，混合物在冰浴中冷却，然后在剧烈搅拌下、在30min内加入10％氯化钠水溶液(30mL)。通过缓慢加入0.5M盐酸酸化至pH1～2之后，让混合物温热至室温，再搅拌30min。通过离心收集固体，滗析掉上清液。固体悬浮在水(200mL)中，离心后再次离析出来。该洗涤过程重复两遍，然后固体在真空下干燥。该固体在2％甲醇-氯仿(25mL)中的悬浮液用超声波处理90min，然后过滤。重复该洗涤过程，固体在真空下干燥，从而获得黄色粉末状PG-(10-OAc-CPT)(174mg，61％质量平衡)。
                                    1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.5(多重宽信号，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.85(三重宽峰，C-18CH3).
实例3
PG-(10-OH-CPT)
向20(S)-10-羟基喜树碱(317mg，0.87mmol)在二甲基甲酰胺(8mL)和吡啶(1.5mL)中的溶液中，加入二叔丁基二碳酸酯(328mg，1.5mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液。在室温搅拌3h后，让混合物在氯仿(100mL)与水(100mL)之间进行分配。氯仿相用1M盐酸(2×100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，然后在真空下干燥。固体进行重结晶(氯仿-己烷)从而获得20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜树碱(358mg，91％收率)，呈黄色粉末状。
      1H NMR(300MHz.CDCl3)8.34(s，1H)，8.23(d，J＝8Hz，1H)，7.75(d，J＝2Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.66(dd，J＝8,2Hz，1H)，5.75(d，J＝17Hz，1H)，5.31(d，J＝17Hz，1H)，5.27(s，2H)，1.91(sep.，J＝6Hz，2H)，1.62(s，9H)，1.06(t，J＝6Hz，3H).
聚(L-谷氨酸)(507mg，3.9mmol游离羧酸酯)与20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜树碱(103mg，0.23mmol)在二甲基甲酰胺(20mL)中的悬浮液，在温和加热下进行溶解。当获得的溶液冷却至室温时，顺序加入碘化氯甲基吡啶鎓(129mg，0.5mmol)在二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液和4-二甲氨基吡啶(131mg，1.1mmol)在二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液。搅拌80h后，混合物在冰浴中冷却，然后在剧烈搅拌下、在30min内加入10％氯化钠水溶液(65mL)。通过缓慢加入0.5M盐酸酸化至pH1～2之后，让混合物温热至室温，再搅拌30min。通过离心收集固体，滗析掉上清液。固体悬浮在水(200mL)中，离心后再次离析出来。该洗涤过程重复两遍，然后固体在真空下干燥。该固体在2％甲醇-氯仿(25mL)中的悬浮液用超声波处理90min，然后过滤。重复该洗涤过程，固体在真空下干燥，从而获得黄色粉末状PG-(10-叔丁氧基羰氧基喜树碱)(20-结合的)(471mg，78％质量平衡)。加载百分数经测定结果是10％，按从甲醇-氯仿洗涤溶液中回收的20(S)-10-叔丁氧基羰氧基喜树碱(53mg)计。
               1H NMR(300MHz.d6-DMSO)δ7.2-8.5(多重宽信号，Ar-H)，5.45，5.20(br.s，C-17，C-5 CH2)，1.55(s，10-O-Boc)，0.85(brs，C-18 CH3).
该PG-(10-叔丁氧基羰氧基喜树碱)(20-结合的)(288mg)分成4份在30min时间内加入到三氟乙酸(50mL)中。搅拌24h后，混合物在真空下浓缩，获得PG-(10-OH-CPT)(251mg，87％质量平衡)。1H NMR谱的积分指出5％的重量加载百分数。1H NMR(300MHz，TFA-d)δ9.15(br.s.，Ar-H)；7.2-8.5(多重宽信号，Ar-H)；5.6-6.0(多重信号，C-17，C-5 CH2)；1.05(三重宽峰，C-18 CH3).
实例4
PG-甘氨酰-CPT
向在冰浴(4～6℃)中冷却的20(S)-喜树碱(17.0g，48.8mmol)、N-(叔丁氧羰基)-甘氨酸(12.82g，73.2mmol)在无水二甲基甲酰胺(170mL)中的混合物中，在15min内分数份加入4-二甲氨基吡啶(7.75g，63.5mmol)，随后在20min内分数份加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(14.03g，73.2mmol)。在5～10℃(冰/水浴)下搅拌3.5h后，混合物在冰浴(4℃)中进行冷却，并在剧烈搅拌下在30min内加入水(275mL)。再搅拌15min后，固体滤出，用水(2×150mL)，冰冷却的0.1M盐酸(300mL)和水(3×100mL)洗涤。冷冻干燥20h后，固体从乙酸乙酯-甲醇(1∶4，500mL)中重结晶。过滤后，固体用冰冷的甲醇(2×100mL)洗涤，干燥后获得20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)喜树碱(22.5g，91％收率)。质子NMR与纯真样品相同。
向在冰浴中冷却的20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)喜树碱(48.6g，93.6mmol)在无水乙酸乙酯(125mL)中的悬浮液中，在30min内加入三氟乙酸(250mL)。3.5h后，溶剂在减压下蒸发。从己烷-甲醇-乙酸乙酯(1∶1∶20，575mL)重结晶，获得的固体经过滤，用乙酸乙酯(150mL)洗涤，然后在真空下干燥，结果产出黄色粉末状20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(46.4g，93％收率)。
                                                      1HNMR(TFA-d)：δ9.35(s，1H)，8.25-8.45(m，3H)，8.05(t，J＝7.3Hz，1H)，7.82(s，1H)，5.80(d，J＝18.1Hz，1H)，5.70(s，2H)，5.55(d，J＝18.1Hz，1H)，4.42(d，J＝17.6Hz，1H)4.30(d，J＝17.6Hz，1H)，2.10-2.30(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向聚-(L-甘氨酸)(1.24g)在无水二甲基甲酰胺(31mL)中的溶液中，加入20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(1.0g，1.9mmol)。冷却至0℃后，分数份加入二甲氨基吡啶(707mg，5.79mmol)，随后在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(292mg，2.32mmol)在二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液。让混合物温热至室温。搅拌2日后，混合物在冰浴中进行冷却并在30min内加入10％氯化钠水溶液(75mL)。混合物通过加入1M盐酸而酸化至pH2.5。在室温搅拌1h后，固体过滤，用水(4×100mL)洗涤，然后在真空下干燥。该固体悬浮在2％甲醇-二氯甲烷(75mL)中，搅拌1h，然后过滤。重复该洗涤过程，用2％甲醇-二氯甲烷3遍，用乙腈(100mL)一遍并用水(100mL)一遍。固体在真空下干燥2日，结果获得黄色粉末状PG-甘氨酰-CPT(1.88g，93％质量平衡)。
   1H NMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，
芳烃质子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烃质子)，7.95(s，
芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.72(s，5-H2)5.60(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.80(br s)，4.30-4.70(m，甘氨酸亚甲基质子)，2.00-2.70(m)，1.10(br s).
实例5
PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT
20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(2.60g，5.0mmol)和N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(2.63g，15.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(50mL)中的混合物搅拌30min后，在冰浴中冷却，然后加入4-二甲氨基吡啶(1.83g，15.0mmol)。在30min内加入二异丙基碳化二亚胺(1.89g，15.0mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物用水(100mL)处理并用二氯甲烷(3×100mL)萃取。合并的有机萃取物依次用水(100mL)、0.1M盐酸(100mL)和水(100mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。在减压下浓缩后，残余物通过在在硅胶上的闪色谱术提纯，其中用4％甲醇-二氯甲烷作洗脱液，结果产出20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)喜树碱(1.30g，45％收率)呈黄色粉末。
           1H NMR(CDCl3)：δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.10(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.10(brs，1H)，3.70-4.45(m，4H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.38(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)喜树碱(1.20g，2.10mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，4mL)中的溶液，在室温搅拌1h。在减压下蒸发溶剂之后，残余物与乙酸乙酯(50mL)一起研制。固体滤出，用二氯甲烷(40mL)洗涤并在真空下干燥，结果产出黄色粉末状20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(1.0g，82％收率)。
           1H NMR(TFA-d)：δ9.45(s，1H)，8.10-8.50(m，3H)，7.95(s，1H)，5.90(d，J＝18.3Hz，1H)，5.80(s)，5.65(d，J＝18.3Hz，1H)，4.10-4.60(m，4H)，2.20-2.50(m，2H)，1.10(t，J＝7.4Hz，3H).
向在冰浴中冷却的20-O-(甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(220mg，0.38mmol)和聚-L-谷氨酸(532mg)在无水二甲基甲酰胺(14.5mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(140mL，1.15mmol)。在20min内，加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(58mg，0.46mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。然后，让混合物温热至室温，在氩气氛下搅拌35h后，混合物在冰浴中进行冷却，然后在30min内加入10％氯化钠水溶液(35mL)。搅拌1h后，混合物用1M盐酸酸化至pH2.5。滤出固体物，用水(3×75mL)洗涤，在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗涤，在真空下干燥，用乙腈(100mL)洗涤，用水(100mL)洗涤，然后在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT(625mg，88％质量平衡)。
                                               1HNMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.20-5.10(m)，32.10-2.90(m)，1.00(s).
实例6
PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT
向冷却至0℃的((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)甘氨酰)甘氨酸(1.99g，6.88mmol)和20(S)-喜树碱(1.20g，3.44mmol)在无水二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中，加入N，N-二甲氨基吡啶(630mg，5.16mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(0.96g，7.6mmol)，并让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物在冰浴中进行冷却，用水(55mL)处理，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)和水(2×50mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物用硅胶闪色谱提纯，其中以4％甲醇-二氯甲烷作洗脱液，结果获得黄色粉末状20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)甘氨酰)喜树碱(1.52g，71％收率)。
                    1H NMR(CDCl3)：δ8.40(s，1H)，8.25(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.05(br s，1H)，5.65(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.15(br s，1H)，3.70-4.45(m，6H)，2.15-2.35(m，2H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(((N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-甘氨酰)甘氨酰)喜树碱(1.50g，2.42mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，5mL)中的溶液在室温搅拌1h。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物与乙酸乙酯(30mL)一起研制。滤出固体物，用二氯甲烷(50mL)洗涤，并在真空下干燥，结果获得黄色粉末状20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(1.3g，85％收率)。
                                                    1HNMR(DMSO-d6)：δ8.78(s，1H)，7.70-8.65(m，4H)，7.10(s，1H)，5.55(s，2H)，3.95-4.30(m，2H)，3.85(s，2H)，3.51(s，2H)，2.10-2.25(m，2H)，0.95(t，J＝7.4Hz，3H).
向在冰浴中冷却的20-O-(甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(940mg，1.49mmol)和聚(L-谷氨酸)(956mg)在无水二甲基甲酰胺(29.5mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(545mg，4.47mmol)。在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(275mg，1.78mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氩气氛下搅拌3日后，混合物在冰浴中进行冷却，然后在30min内加入10％氯化钠水溶液(69mL)。搅拌1h后，混合物通过加入1M盐酸酸化至pH2.5。滤出固体物，用水(3×75mL)洗涤，在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(3×50mL)洗涤，在真空下干燥，用乙腈(100mL)洗涤，用水(100mL)洗涤，最后在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT(1.50g，87％质量平衡)。
      1H NMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.50(芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.10-5.00(m)，2.05-2.75(m)，1.05(s).
实例7
PG-丙氨酰-CPT
向冷却至0℃的N-(叔丁氧羰氧基)丙氨酸(568mg，3.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜树碱(348mg，1.0mmol)和二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(379mg，3.0mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物用水(50mL)处理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氢钠水溶液(2×25mL)，最后用水(2×50mL)洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下蒸发掉溶剂。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-二氯甲烷为洗脱液，结果产出黄色粉末状20-O-(N-(叔丁氧羰基氧基)-丙氨酰)喜树碱(420mg，81％收率)。
              1H NMR(CDCl3)：δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.95(br s，1H)，4.45(br t，1H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.55(d，3H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基氧基)丙氨酰)喜树碱(300mg，0.57mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室温搅拌1h。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物与10％甲醇-氯仿(12mL)一起研制。过滤后，获得黄色粉末状20-O-(丙氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(318mg，87％收率)，然后立即用于下一步反应中。在搅拌下向20-O-(丙氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(114mg，0.21mmol)、聚(L-谷氨酸)(280mg)和N，N-二甲氨基吡啶(77mg，0.63mmol)在无水二甲基甲酰胺(8.5mL)中的悬浮液中，在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(34.5mg，0.273mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。混合物在氩气氛下搅拌2日。在冰浴中冷却后，在30min内加入10％氯化钠水溶液(21mL)。搅拌1h后，混合物通过加入1N盐酸调节到pH2.5。滤出固体物，用水(5×25mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗涤，在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-丙氨酰-CPT(330mg，81％质量平衡)。
1H NMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.80-6.05(m)，3.80-4.50(m)，1.20-2.80(m)，1.70(br s)，1.00(s).
实例8
PG-(β-丙氨酰)-CPT
向冷却至0℃的N-叔丁氧羰基-β-丙氨酸(568mg，3.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜树碱(348mg，1.0mmol)和二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(379mg，3.0mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物用水(50mL)稀释并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氢钠水溶液(2×25mL)，最后用水(2×50mL)洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下蒸发掉溶剂。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脱，结果产出浅黄色粉末状20-O-(N-叔丁氧羰基-β-丙氨酰)喜树碱(431mg，83％收率)。
              1H NMR(CDCl3)：δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40 (d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.15(br s，1H)，3.30-3.50(m，2H)，2.55-2.80m(m，2H)，2.15-2.25(m，2H)，1.45(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基-β-丙氨酰)喜树碱(250mg，0.48mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室温搅拌1h。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物与甲醇-己烷-二氯甲烷(1∶2∶7)一起研制。过滤后，获得黄色粉末状20-O-(β-丙氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(241mg，94％收率)。
              1H NMR(DMSO-d6)：δ8.78(s，1H)，8.05-8.50 m，2H)，7.60-7.94(m，2H)，7.15(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，2.80-3.60(m，4H)，2.15-2.25(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
在搅拌下向20-O-(β-丙氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(241mg，0.45mmol)、聚(L-谷氨酸)(326mg)和N，N-二甲氨基吡啶(165mg，1.35mmol)在无水二甲基甲酰胺(12.5mL)中的混合物中，在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(74mg，0.59mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。混合物在氩气氛下搅拌2日。在冰浴中冷却后，在30min内加入10％氯化钠水溶液(30mL)。搅拌1h后，混合物通过加入1M盐酸酸化至pH2.5。滤出固体物，用水(5×25mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗涤，然后在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-(β-丙氨酰)-CPT(485mg，94％质量平衡)。
   1H NMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.85-8.6(芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.70-5.10(m)，3.65-3.90(m)，2.00-3.10(m)，1.00(s).
实例9
PG-(4-NH-丁酰)-CPT
向冷却至0℃的4-(叔丁氧羰基氨基)丁酸(203mg，3.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜树碱(348mg，1.0mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。随后，慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(379mg，3.0mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物用水(50mL)处理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)、水(2×50mL)、0.1M碳酸氢钠水溶液(2×25mL)，和水(2×50mL)洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下蒸发掉溶剂。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脱，结果产出黄色粉末状20-O-(4-(叔丁氧羰基氨基)丁酰)喜树碱(432mg，81％收率)。
                                                 1H NMR(CDCl3)：δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.85(brs，1H)，3.05-3.30(m，2H)，2.40-2.60(m，2H)，2.05-2.30m(m，2H)，1.75-1.90(m，2H)，1.40(s，9H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(4-(叔丁氧羰基氨基)丁酰)喜树碱(400mg，0.751mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，2mL)中的溶液在室温搅拌1h。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物与10％甲醇-二氯甲烷(12mL)一起研制。过滤后，获得黄色固体20-O-(4-氨基丁酰)喜树碱三氟乙酸盐(331mg，83％收率)。
                  1H NMR(DMSO-d6)：δ8.78(s，1H)，8.05-8.45(m，2H)，7.65-7.94(m，2H)，7.05(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，2.60-2.85(m，4H)，2.00-2.25(m，2H)，1.70-1.90(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向20-O-(4-氨基丁酰)喜树碱三氟乙酸盐(250mg，0.46mmol)、聚(L-谷氨酸)(414mg)和N，N-二甲氨基吡啶(168mg，1.38mmol)在无水二甲基甲酰胺(13.5mL)中的悬浮液中，在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(75mg，0.6mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。混合物在氩气氛下搅拌2日，在冰浴中冷却后，在30min内加入10％氯化钠水溶液(35mL)。搅拌1h后，混合物通过加入1M盐酸酸化至pH2.5。滤出固体物，用水(5×25mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗涤，然后在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-(4-NH-丁酰)-CPT(574mg，94％质量平衡)。
                                                1HNMR(300MHz在TFA-d)δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，芳烃质子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烃质子)，7.95(s，芳烃质子)，7.20(s，芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.70-5.05(m)，3.45-3.70(m)，2.02-3.00(m)，1.05(br s).
实例10
PG-(2-O-乙酰)-CPT
按照Greenwald等人，《Bioorg.Med.Chem.》6：551～562(1998)所述程序制备20-O-(2-羟基乙酰)喜树碱。
碘化氯甲基吡啶鎓(163mg，0.64mmol)和4-二甲氨基吡啶(89mg，0.73mmol)顺序地加入到20-O-(2-羟基乙酰)喜树碱(80mg，0.20mmol)和聚(L-谷氨酸)(411mg)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中。搅拌18h后，混合物在冰浴中进行冷却，并在1h时间内加入10％氯化钠水溶液(50mL)。所获混合物的pH值通过加入0.1M盐酸而降低到2。离心后收集沉淀，并将其悬浮在水(25mL)中，再次离心后收集。该程序再重复两遍，固体在真空下干燥。固体悬浮在氯仿-甲醇(95∶5，10mL)中并用超声波处理90min。混合物进行过滤，固体在真空下干燥，结果获得浅黄色固体PG-(2-O-乙酰)-CPT(404mg，86％质量平衡)。根据回收到的20-O-(2-羟基乙酰)喜树碱的重量计算的重量加载百分数是15％。
                                    1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ7.6-8.7(多重宽信号CPT Ar-H)，7.15(s，CPT Ar-H)，4.8-5.6(宽信号，CPT 内酯，C5-CH2-)，3.7-4.3(宽信号，PG α-CH)，3.1-3.4(宽单峰，PG)，1.7-2.4(宽信号，PG)，1.0(宽信号，CPT-CH2CH3).
实例11
PG-(4-O-丁酰)-CPT
向冷却至0℃的20(S)-喜树碱(300mg，0.86mmol)和4-苄氧基丁酸(501mg，2.58mmol)在无水二甲基甲酰胺(12mL)中的混合物中，加入N，N-二甲氨基吡啶(210mg，1.72mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(326mg，2.58mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌15h后，混合物用水(50mL)处理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)、水(2×50mL)洗涤并用硫酸钠干燥。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脱，结果产出黄色粉末状20-O-(4-苄氧基丁酰)喜树碱(432mg，81％收率)。
     1H NMR(CDCl3)：δ8.35(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz 1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.20-7.40(m，6H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.52(brs，2H)，3.45-3.60(m，2H)，2.60-2.75(m，2H)，1.90-2.35(m，4H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
向20-O-(4-苄氧基丁酰)喜树碱(1.0g，1.90mmol)和10％披钯炭(50％水，200mg)悬浮在乙醇-1，4-二噁烷(4∶1，20mL)中的混合物中，加入环己烯(0.78g，9.5mmol)。在缓缓回流下加热15h后，混合物进行冷却并过滤除掉催化剂。在减压下浓缩后，固体残余物用甲醇(8.0mL)进行结晶，结果获得浅黄色粉末20-O-(4-羟基丁酰)喜树碱(679mg，82％收率)。
                                         1H NMR(CD3OD)：δ8.40(s，1H)，8.05(d，J＝8.38Hz 1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.76-7.85(m，1H)，7.65(t，J＝7.4Hz，1H)，7.30(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，3.50(t，3H)，2.50(t，2H)，1.70-2.30(m，4H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
向20-O-(4-羟基丁酰)喜树碱(114mg，0.26mmol)和聚(L-谷氨酸)(265mg，1.8mmol)在无水二甲基甲酰胺(7.5mL)中的混合物中，加入二甲氨基吡啶(6mg，0.052mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(43mg，0.34mmol)，反应混合物在氩气氛下搅拌5h。在冰浴中冷却后，滴加10％氯化钠水溶液(18mL)。pH值通过加入1N盐酸调节到2.5。在室温搅拌1h后，混合物进行过滤。固体用水(3×30mL)洗涤，然后在真空下干燥。粉末用2％甲醇-二氯甲烷(4×30mL)洗涤，然后在真空下干燥，结果产出黄色粉末PG-(4-O-丁酰)-CPT(360mg，95％质量平衡)。
                                                   1HNMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，8.30-8.52(m，芳烃质子)，8.27(t，J＝6.6Hz，芳烃质子)，7.95(s，芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s，)5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.90(br s)，4.40(s)，2.00-2.90(m)，1.10(brs).
实例12
PG-(γ-谷氨酰)-CPT
向冷却至0℃的N-(叔丁氧羰基)谷氨酰-γ-叔丁酯(910mg，3.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(8mL)中的溶液中，加入20(S)-喜树碱(348mg，1.0mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(244mg，2.0mmol)。慢慢加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(379mg，3.0mmol)，然后让反应混合物温热至室温。搅拌16h后，混合物用水(50mL)处理并用二氯甲烷(4×40mL)萃取。合并的有机萃取物依次用0.1M盐酸(2×50mL)、水(2×50mL)，0.1M碳酸氢钠水溶液(2×25mL)和水(2×50mL)洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下蒸发掉溶剂。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-二氯甲烷洗脱，结果产出黄色粉末状20-O-(N-(叔丁氧羰基)-γ-谷氨酰)喜树碱α-叔丁酯(432mg，81％收率)。
             1H NMR(CDCl3)：δ8.40(s，1H)，8.22(d，J＝8.38Hz，1H)，7.91(d，J＝8.07，1H)，7.65-7.85(m，2H)，7.26(s，1H)，5.70(d，J＝17.25Hz，1H)，5.40(d，J＝17.25Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.05(br d，1H)，4.10(brs，1H)，1.85-2.70(m，6H)，1.45(s，18H)，0.95(t，J＝7.47Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基)谷氨酰)喜树碱α-叔丁酯(300mg，0.47mmol)在二氯甲烷-三氟乙酸(1∶1，1mL)中的溶液在室温搅拌20min。在减压下蒸发掉溶剂后，残余物与甲醇-二氯甲烷-己烷(1∶2∶2，10mL)一起研制。过滤后获得黄色固体20-O-(γ-谷氨酰)喜树碱α-叔丁酯三氟乙酸盐(239mg，79％收率)。
                                                       1H NMR(DMSO-d6)：δ8.78(s，1H)，7.70-8.20(m，3H)，7.05(s，1H)，5.55(s，2H)，5.30(s，2H)，(brs，1H)，1.90-2.85(m，6H)1.50(s，9H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H).
向20-O-(γ-谷氨酰)喜树碱α-叔丁酯三氟乙酸盐(239mg，0.37mmol)、聚(L-谷氨酸)(395mg，2.69mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(135.6mg，1.11mmol)在无水二甲基甲酰胺(12.5mL)中的混合物中，在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(61mg，0.48mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氩气氛下搅拌2日后，混合物在冰浴中进行冷却，在30min内加入10％氯化钠水溶液(30mL)。搅拌1h后，混合物通过加入1M盐酸酸化至pH2.5。滤出固体物，用水(4×30mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体用2％甲醇-二氯甲烷(4×50mL)洗涤并在真空下干燥，结果产出黄色粉末状PG-(γ-谷氨酰)-CPTα-叔丁酯(556mg，94％质量平衡)。
             1H NMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.90-8.60(m，芳烃质子)，7.25(s，芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.60-5.0(m)，2.05-3.00(m)，1.55(s)，1.10(br s).
PG-(γ-谷氨酰)-CPTα-叔丁酯(550mg)在三氟乙酸(5mL)中的溶液，在室温搅拌16h。在减压下浓缩后，残余物用水(100mL)洗涤，然后在真空下干燥，从而获得黄色粉末状PG-(γ-谷氨酰)-CPT(460mg)。
                      1H NMR(300MHz在TFA-d)：δ9.45(s，C-7H)，7.90-8.60(m，芳烃质子)，5.92(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，5.70(s)，5.62(d，J＝18.3Hz，内酯质子)，4.60-5.0(m)，2.05-3.00(m)，1.05(br s).
实例13
PG-(10-O-CPT)
聚(L-谷氨酸)钠盐(50kD，740mg)在二甲基甲酰胺(30mL)中的悬浮液在冰浴中冷却。加入甲磺酸(0.3mL，4.6mmol)，混合物搅拌30min。顺序加入10-羟基喜树碱(166mg，0.45mmol)、碘化氯甲基吡啶鎓(190mg，0.74mmol)和4-二甲氨基吡啶(168mg，1.4mmol)。让混合物温热至室温，并剧烈搅拌20h。混合物在冰浴中进行冷却，并在45min内在剧烈搅拌下加入10％氯化钠水溶液(100mL)。通过缓慢加入0.5M盐酸酸化至pH1～2之后，让混合物温热至室温，再搅拌30min。离心收集固体并滗析除掉上清液。固体悬浮在水(200mL)中，再次离心后离析。再重复上述洗涤过程两遍，固体在真空下干燥。固体在2％甲醇-氯仿(25mL)中的悬浮液用超声波处理90min，然后过滤。重复该洗涤过程，固体在真空下干燥后获得黄色粉末状PG-(10-O-CPT)(674mg，93％质量平衡)。
                  1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.6(多重宽信号，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.85(三重宽峰，C-18 CH3).
根据从甲醇-氯仿洗涤液中回收到的20(S)-10-羟基喜树碱重量，测得加载百分数是13％。
替代地，PG-(10-O-CPT)按上述方法合成，但采用聚(L-谷氨酸)代替聚(L-谷氨酸)钠盐和甲磺酸。
实例14
PG-甘氨酰-(10-O-CPT)
N-叔丁氧羰基甘氨酸(603mg，3.4mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液用二异丙基碳化二亚胺(0.27mL，1.7mmol)处理。搅拌15min后，该溶液被加入到20(S)-10-羟基喜树碱(406mg，1.11mmol)和吡啶(0.9mL)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中。搅拌4h后，混合物倒入水(300mL)中，并用氯仿(4×75mL)萃取。合并的氯仿萃取物用0.1M盐酸(2×100mL)洗涤，随后用饱和碳酸氢钠水溶液(2×100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用2％甲醇-氯仿作洗脱，结果获得浅黄色粉末状20(S)-10-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氧基)喜树碱(247mg，43％)。
          1H NMR(300MHz，CDCl3)8.32(s，1H)，8.21(d，J＝8Hz，1H)，7.70(d，J＝3Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.56(dd，J＝8,3Hz，1H)，5.73(d，J＝15Hz，1H)，5.28(d，J＝15Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.17(m，1H)，4.26(d，J＝7Hz，2H)，1.88(sep.，J＝6Hz，2H)，1.49(s，9H)，1.04(t，J＝6Hz，3H).
20(S)-10-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氧基)喜树碱(206mg，0.39mmol)在二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(5mL)中的溶液搅拌90min。在真空下浓缩后，残余物溶解在氯仿(50mL)中，然后在真空下浓缩。残余物溶解在甲苯(50mL)中，并在真空下浓缩，从而获得20(S)-10-(甘氨酰氧基)喜树碱。
20(S)-10-(甘氨酰氧基)喜树碱在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液加入到聚(L-谷氨酸)(50kD，641mg)在二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液中，随后加入4-二甲氨基吡啶(151mg，1.2mmol)和二异丙基碳化二亚胺(0.08mL，0.5mmol)。剧烈搅拌60h后，混合物在冰浴中冷却，并在剧烈搅拌下、1h内加入10％氯化钠水溶液(75mL)。通过缓慢加入0.5M盐酸酸化至pH1～2以后，让混合物温热至室温，并搅拌30min。离心收集固体并滗析除掉上清液。固体悬浮在水(200mL)中，再次离心后离析。再重复上述洗涤程序两遍，固体在真空下干燥。固体在2％甲醇-氯仿(25mL)中的悬浮液用超声波处理90min，然后过滤。重复该用2％甲醇-氯仿洗涤的程序。固体在真空下干燥后获得黄色粉末状PG-甘氨酰-(10-O-CPT)(560mg，70％)。
                                   1H NMR(300MHz.d6-DMSO)7.2-8.8(多重宽信号，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.9(br s，C-18 CH3).
实例15
PG-(9-NH-CPT)
向在真空下干燥4h后的20(S)-9-氨基喜树碱(157mg，0.43mmol)和聚(L-谷氨酸)(38kD，628mg)的混合物中，加入无水二甲基甲酰胺(35mL)。在冰浴中冷却后，加入碘化2-氯甲基吡啶鎓(199mg，0.78mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(200mg，1.64mmol)，让混合物温热至室温。搅拌2日后，混合物冷却至0℃，然后在25min内加入10％氯化钠水溶液(82mL)。混合物通过加入1M盐酸(3.5mL)酸化至pH2.5，然后在室温搅拌1h。过滤出沉淀，用水(4×50mL)洗涤，然后在真空下干燥。固体研磨成粉末并悬浮在2％甲醇-二氯甲烷(10mL)中。搅拌3h后，离心分离出固体，滗析除掉上清液。重复该洗涤过程4遍，以便完全除掉未反应的20(S)-9-氨基喜树碱。固体在真空下干燥，结果产出PG-(9-NH-CPT)(592mg，80％质量平衡，按回收的20(S)-9-氨基喜树碱(45mg)计)。
                                       1H NMR(300MHz在DMSO-d6)：12.10(s，-COOH)，8.80(s)，6.50-8.5(m)，5.15-5.8(m)，3.10-4.35(m)，1.42-2.62(m，)，0.90(br s，19-CH3).
在本例中，PG-(9-NH-CPT)的20(S)-9-氨基喜树碱重量加载百分数是14％，按偶联反应期间消耗的20(S)-9-氨基喜树碱的重量(115mg)计。
实例16
PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)
按照Wall等人，《J.Med.Chem.》1993，36，2689～2700中描述的方法的修改方案制备20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)喜树碱。向N-叔丁氧羰基甘氨酸(526mg，3.0mmol)在无水二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中，加入20(S)-9-氨基喜树碱(363mg，1.0mmol)，随后在30min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(379mg，3.0mmol)。在氮气氛下搅拌12h后，混合物用水(2×50mL)处理，然后用二氯甲烷(3×100mL)萃取。合并的有机萃取物用水(50mL)、0.1M盐酸(2×50mL)、0.1M饱和碳酸氢钠水溶液和水(50mL)洗涤。溶液用硫酸钠干燥并在减压下浓缩。残余物经过结晶(甲醇-氯仿(1∶9))后，获得黄色粉末状20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)-喜树碱(354mg，68％收率)。
       1H NMR(DMSO-d6)：δ10.10(s，1H)，8.79(s，1H)，8.03(d，J＝7Hz，1H)，7.85(t，J＝7Hz，1H)，7.79(d，J＝7Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.19(t，J＝6Hz，1H)，6.53(s，1H)，5.44(s，2H)，5.29(s，2H)，3.92(m，2H)，1.88(m，2H)，1.44(s，9H)，0.89(t，J＝7Hz，3H).
20(S)-9-(N-叔丁氧羰基甘氨酰氨基)喜树碱(80mg，0.15mmol)在三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，4mL)中的溶液在室温搅拌1h。在减压下蒸发掉溶剂，然后固体进行重结晶(二氯甲烷-二乙醚(3∶7，50mL)，结果获得褐黄色粉末状20(S)-9-甘氨酰氨基)喜树碱三氟乙酸盐(78mg，82％收率)。
在搅拌下向20(S)-9-(甘氨酰氨基)喜树碱三氟乙酸盐(78mg，0.15mmol)、聚(L-谷氨酸)(38kD，222mg)和N，N-二甲氨基吡啶(46mg，0.37mmol)在无水二甲基甲酰胺(5.5mL)中的悬浮液中，在20min内加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(17mg，0.14mmol)在二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液。在氩气氛下搅拌2日后，混合物在冰浴中冷却，然后在30min内加入10％氯化钠水溶液(15mL)。再搅拌1h后，混合物通过加入1M盐酸(1.5mL)酸化至pH2.5，然后过滤。固体用水(5×25mL)洗涤，并在真空下干燥，用2％甲醇-二氯甲烷(3×50mL)洗涤，在真空下干燥，从而获得褐黄色粉末状PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)(255mg，92％质量平衡)。在本例中，PG-甘氨酰-(9-NH-CPT)的20(S)-9-氨基喜树碱重量加载百分数是20％，按偶联反应中消耗的20(S)-9-氨基喜树碱的重量计。
实例17
PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)
二异丙基碳化二亚胺(0.36mg，2.3mmol)加入到20(S)-10-叔丁氧羰基氧基喜树碱(350mg，0.77mmol)、N-叔丁氧羰基甘氨酸(403mg，2.3mmol)和4-二甲氨基吡啶(283mg，2.3mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中。搅拌20h后，混合物用氯仿(150mL)稀释，并用1M盐酸(2×100mL)洗涤，随后用饱和碳酸氢钠水溶液-水(1∶1，2×50mL)洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用1％甲醇-氯仿洗脱，结果获得黄色粉末状20-O-(N-叔丁氧羰基甘氨酰)-10-(叔丁氧羰基氧基)喜树碱(250mg，52％收率)。
1H NMR(300MHz.CDCl3)8.34(s，1H)，8.23(d，J＝8Hz，1H)，7.74(d，J＝2Hz，1H)，7.67(dd，J＝8,2Hz，1H)，5.70(d，J＝17Hz，1H)，5.41(d，J＝17Hz，1H)，5.27(s，2H)，4.96(m，1H)，4.29-4.03(m，2H)，2.23(d.sex.，J＝31，6Hz，2H)，1.63(s，9H)，1.43(s，9H)，1.00(t，J＝6Hz，3H).
20-O-(N-叔丁氧羰基甘氨酰)-10-(叔丁氧羰基氧基)喜树碱(250mg，0.4mmol)在二氯甲烷(40mL)中的溶液与三氟乙酸(10mL)一起搅拌60min。在真空下浓缩后，残余物溶解在甲醇(10mL)中。加入甲苯(50mL)，然后溶液在真空下浓缩。重复该程序两遍，结果获得20-O-甘氨酰-10-羟基-喜树碱。前一步骤中合成的20-O-甘氨酰-10-羟基喜树碱溶解在二甲基甲酰胺(5mL)中，并用N，N-二异丙基乙胺(0.2mL，1.1mmol)处理。该溶液被加入到聚(L-谷氨酸)(37.7kD，640mg)与二异丙基碳化二亚胺(0.1mL，0.64mmol)在二甲基甲酰胺(25mL)中的溶液中。搅拌18h后，混合物在冰浴中冷却，并在剧烈搅拌下加入10％氯化钠水溶液(75mL)。通过加入0.5M盐酸酸化至pH1～2以后，让混合物温热至室温，并搅拌1h。离心收集固体，并滗析除掉上清液。固体悬浮在水(200mL)中，再次重复离心后离析的程序。该洗涤过程再重复两遍，固体在真空下干燥。固体在2％甲醇-氯仿(25mL)中的悬浮液用超声波处理90min。重复该洗涤过程。然后，固体在真空下干燥，结果获得黄色粉末状PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)(663mg，83％质量平衡)：1H NMR(300MHz，d6-DMSO)7.1-8.5(多重宽信号，Ar-H)，5.45，5.20(br s，C-17，C-5 CH2)，0.9(br s，C-18 CH3).
实例18
PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)
20(S)-7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)(333mg，0.85mmol)溶解在二甲基甲酰胺(6mL)与吡啶(2mL)的混合物中。加入二叔丁基二碳酸酯(294mg，1.35mmol)在二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液，然后混合物在室温搅拌19h。混合物在真空下浓缩，残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脱，结果获得黄色粉末状20(S)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜树碱(337mg，80％收率)。
     1H NMR(300MHz.CDCl3)δ8.24(d，J＝12Hz，1H)，7.88(d，J＝4Hz，1H)，7.63-7.70(m，2H)，5.75(d，J＝16Hz，1H)，5.31(d，J＝16Hz，1H)，5.27(s，2H)，3.28(q，J＝7Hz，2H)，1.90(sep.，J＝8Hz，2H)，1.61(s，9H)，1.43(t，J＝7Hz，3H)，1.08(t，J＝8Hz，3H).
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(192mg，1.0mmol)加入到10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜树碱(150mg，0.30mmol)、N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(178mg，1.0mmol)和4-二甲氨基吡啶(137mg，1.1mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中。搅拌24h后，混合物用氯仿(75mL)稀释并用1M盐酸(2×50mL)，以及碳酸氢钠饱和水溶液与水(1∶1，2×50mL)进行洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。残余物利用色谱术在硅胶上提纯，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脱，结果获得黄色粉末状20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜树碱(41mg，20％收率)。
                                                1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.27(d，J＝9Hz，1H)，7.90(d，J＝3Hz，1H)，7.68(dd，J＝9，3Hz，1H)，5.72(d，J＝17Hz，1H)，5.42(d，J＝17Hz，1H)，5.25(s，2H)，4.96(m，1H)，4.29-4.03(m，2H)，3.17(q，J＝7Hz，2H)，2.23(d.sex.，J＝31,6Hz，2H)，1.63(s，9H)，1.48-1.38(m，12H)，1.00(t，J＝6Hz，3H).
20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-10-叔丁氧羰基氧基-7-乙基喜树碱(40mg，0.06mmol)溶解在二氯甲烷(25mL)中，然后加入三氟乙酸(15mL)。搅拌1h后，混合物在真空下浓缩。残余物溶解在甲醇(20mL)中，然后加入甲苯(20mL)。溶液在真空下浓缩。再重复该程序两遍。获得的固体溶解在二甲基甲酰胺(3mL)中并用N，N-二异丙基乙胺(0.03mL，0.17mmol)处理。该溶液加入到聚(L-谷氨酸)(168mL)和二异丙基碳化二亚胺(0.02mL，0.13mmol)在二甲基甲酰胺(6mL)中的溶液中。搅拌21h后，混合物在冰浴中冷却，在剧烈搅拌下、在60min内加入10％氯化钠水溶液(30mL)。混合物pH值通过加入0.5M盐酸降低到1～2。让混合物温热至室温，并再搅拌60min。混合物离心分离，并滗析除掉上清液。固体悬浮在水(75mL)中，并再次离心分离。再重复该程序两遍，固体在真空下干燥24h。固体悬浮在氯仿-甲醇(92∶2，25mL)中，获得的淤浆用超声波处理90min。混合物过滤，并重复该程序。固体在真空下干燥，结果获得黄色粉末状PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)(112mg，54％质量平衡)。1H NMR谱表明重量加载百分数是12％。
           1H NMR(300MHz.d-TFA)δ8.5-7.7(多重宽信号，Ar-H)，6.0-5.6(宽信号，C-17，C-5 CH2)，4.6(m，gly CH2)，3.5(m，7-乙基CH2)，1.6(br.t，7-乙基CH3)，0.9(br t，C-18 CH3).
实例19
PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基Si-10-OAc-CPT)
向20(S)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-10-羟基喜树碱(DB67；Bom等人，《J.Med.Chem.》43：3970～80(2000))(38mg，0.08mmol)在二氯甲烷(0.5mL)与吡啶(0.1mL，1.2mmol)的混合物中的溶液中，加入乙酐(0.04mL，0.42mmol)。搅拌20h后，反应混合物在真空下浓缩。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用氯仿-甲醇(99∶1)洗脱，结果获得黄色粉末状10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜树碱(29mg，70％)。
                   1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，1H，J＝10hz)，8.08(d，1H，J＝2Hz)，7.67(s，1H)，7.53(dd，1H，J＝10,2Hz)，5.75(d，1H，J＝15Hz)，5.34(s，2H)，5.30(d，1H，J＝15Hz)，2.39(s，3H)，1.88(hep，2H，J＝9Hz)，1.06(t，3H，J＝9H)，0.98(s，9H)，0.69(s，6H).
1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(35mg，0.18mmol)加入到10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜树碱(30mg，0.058mmol)、N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(33mg，0.19mmol)和4-二甲氨基吡啶(16mg，0.13mmol)在二氯甲烷中的溶液中。搅拌20h后，混合物用二氯甲烷(25mL)稀释，获得的溶液用1M盐酸(2×20mL)洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤后在真空下浓缩。残余物用硅胶闪色谱提纯，其中用1％甲醇-氯仿洗脱，结果获得黄色粉末状10-乙酰氧基-20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜树碱(24mg，61％收率)。
     1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.23(d，1H，J＝10hz)，8.11(d，1H，J＝2Hz)，7.56(dd，1H，J＝10,2Hz)，7.22(s，1H)，5.68(d，1H，J＝15Hz)，5.40(d，1H，J＝15Hz)，5.29(s，2H)，4.95(brs，1H)，4.27-4.00(m，2H)，2.40(s，3H)，2.36-2.13(m，2H)，1.43(s，9H)，1.01-0.95(m，12H)，0.70(s，6H).
向10-乙酰氧基-20-O-(N-(叔丁氧羰基)甘氨酰)-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜树碱(21mg，0.031mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入三氟乙酸(2.5mL)。搅拌90min后，混合物在真空下浓缩。残余物溶解在甲醇-甲苯(1∶1，4mL)中。溶液在真空下浓缩。再重复该程序两遍，结果获得10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐，后者不经进一步提纯直接用于下一步骤中。
                                                  1H NMR(300MHz，CD3OD)δ8.21-8.11(m，2H)，7.68-7.63(m，1H)，7.42(s，1H)，5.69-5.38(m，4H)，4.22(q，2H，J＝18Hz)，2.39(s，3H)，2.33-2.20(m，2H)，1.07(t，3H，J＝8Hz)，1.00(s，9H)，0.75(s，6H).
4-二甲氨基吡啶(12mg，0.098mmol)和二异丙基碳化二亚胺(0.37mL 0.1M在二甲基甲酰胺中的溶液)顺序地加入到10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-20-O-(甘氨酰)喜树碱三氟乙酸盐(0.03mmol)和聚(L-谷氨酸)(64mg)在二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液中。搅拌20h后，混合物在冰浴中冷却，然后在30min时间内加入10％氯化钠水溶液(20mL)。混合物的pH值通过缓慢加入0.1M盐酸降低到2。离心收集沉淀。固体悬浮在水(10mL)中，并再次离心后离析。再重复两遍该程序，然后固体在真空下干燥。随后，固体悬浮在5％甲醇-氯仿(10mL)中并用超声波处理90min。将混合物过滤，收集到的固体在真空下干燥，结果获得浅黄色固体PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)(69mg，84％质量平衡)。1H的积分表明，重量加载百分数是15％。
                                                     1HNMR(300MHz，CF3CO2D)δ8.71(br s CPT Ar-H)，8.17(s，CPT Ar-H)，7.99-7.91(m，CPT Ar-H)，6.00-5.58(m，CPT内酯，C5-CH2-)，5.00-4.77(m，PGα-CH)，3.84(s，Gly CH2)，2.78-2.59(m，PG-CH2-)，2.38-2.05(m，PG-CH2-)，1.30(br s，CPT-CH2CH3)，1.12(br s，CPT(CH3)3CSi(CH3)2)，0.88(br s，CPT(CH3)3CSi(CH3)2).
实例20
活体内生物活性
A.喜树碱结合物
首先，采用单一IP注射在携带皮下B16黑瘤的C57BL/6小鼠中试验PG-CPT结合物的最大耐受剂量(MTD)和相对疗效。尽管B16黑瘤对20(S)-喜树碱仅有微弱响应，但是之所以采用此种模型来考察各种不同化合物以做出初步疗效评估，是因为其重现性好及其在短时间内便可评估化合物的能力。肿瘤是通过皮下注射在补充了2％FBS的0.2mL体积PBS(磷酸缓冲盐水)中的1.0×105鼠科黑瘤细胞(B16-FO；ATTCCRL-6322)而生长在右肩胛间隙区域的肌肉中的。试验化合物和载体对照样在肿瘤细胞移植后7或8日，当肿瘤已长到5±1mm3时给药的(每20g体重0.5mL)。喜树碱结合物通过在45℃、超声波处理45～60min溶解在0.1M磷酸氢钠溶液中。天然喜树碱溶解在8.3％CremophorEL/8.3％乙醇在0.75％盐水中的混合物中。所有注射都通过腹腔内(IP)进行。每一个治疗组由10只随机分派到每个组的小鼠组成。肿瘤体积按照公式(长×宽×高)/2计算。肿瘤等于或大于2000mm3的小鼠则通过颈椎脱位使之安乐死。试验化合物的肿瘤疗效，通过计算肿瘤生长延缓(TGD)来确定：治疗组中肿瘤达到某一固定体积以天数表示的平均时间减去对照组中肿瘤达到同样体积的平均时间。为确定统计学差异，做了未配对Student的t-试验。以各种不同浓度对化合物进行了试验，以确定它们的MTD。MTD是最大耐受当量喜树碱剂量。PG-20(S)-喜树碱结合物的MTD，据发现，比游离20(S)-喜树碱大约高出两倍，因此允许较高剂量的喜树碱给药，从而产生提高的抗肿瘤疗效。对于直接偶联的20(S)-喜树碱，即PG-CPT来说，最大加载为约14％(20(S)-喜树碱重量/结合物总重量)。甘氨酸连接基(PG-甘氨酰-CPT)允许加载高达39％，和提高的水中溶解度。
B.采用动物模型的各种PG-喜树碱结合物对肿瘤生长的影响
总的来说，据发现，20(S)-喜树碱的PG-甘氨酸结合物优于采用其他连接基制备的PG-CPT结合物(生理学上，即，疗效和毒性和/或就水介质中溶解度而言，以及容易合成和在PG主链上能够加载的喜树碱数量)，而与由下列组成的PG-甘氨酰-结合物大致相同：20(S)-9-氨基喜树碱、20(S)-10-羟基喜树碱、20(S)-7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)和20(S)-10-乙酰氧基-7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)喜树碱(10-O乙酰DB 67)。支持这一论断的数据总括在下文中。
在某些实验中，PG结合物与未结合的20(S)-喜树碱或市售供应的托泊替堪做了比较。在所有情况下，PG-结合物都显示出比游离药物好的抗肿瘤效果。
另外，在其他两种肿瘤模型(MCA-4乳腺癌和OCA-1卵巢癌)中的单剂量效果研究表明，PG-CPT，无论是直接偶联还是利用甘氨酸连接基，都具有在其MTD剂量水平比天然20(S)-喜树碱提高的疗效，而且，PG-结合物的MTD为天然CPT的MTD的TMD约2倍。除了上面提到的模型之外，还使用了一种其他同基因模型，即，LL/2路易斯肺(ATTCCRL-1642)和使用2种异种模型，即，人体NC1-H460肺癌(ATTCHTB-177)模型和HT-29人体直肠癌(ATTC HTB-38)。在这些异种模型中，替代有免疫能力的C57BL/6小鼠，采用一种免疫受损的ncr nu/nu小鼠。除了为产生肿瘤而植入的肿瘤细胞数目之外，试验规定和程序与B-16/FO模型的一样。
除了甘氨酸之外，总共使用了6种连接基来制造20(S)-喜树碱的PG-结合物。在所有的结合物中，PG取自同一批并具有50kD的平均MW(分子量)。在许多实验中采用B-16模型试验了不同的结合物，并与PG-甘氨酰-CPT做了比较。首先，已证明甘氨酸结合物在所有3种试验的20(S)-喜树碱浓度下都比2-羟基乙酸(乙醇酸)结合物疗效明显。其次证明，甘氨酸结合物在B-16模型中比采用谷氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸制备的结合物都明显。
这些结合物的加载量从β-丙氨酸连接的20(S)-喜树碱的22％到甘氨酸连接的20(S)-喜树碱的37％不等。另一种做了评估并与甘氨酸比较的连接基是4-羟基丁酸。这两种结合物具有同样的20(S)-喜树碱加载量(35％)并在一系列试验中采用B-16/FO、LL/2和HT-29模型做了比较。结果表明，甘氨酸结合物的疗效等于或高于4-羟基丁酸结合物。另外，4-羟基丁酸结合物较难合成，水中溶解度比甘氨酸结合物低且可能具有不可心的效应。
在一系列实验中利用HT-29和NC1-H460模型做了研究了连接基长度的影响。比较了由甘氨酸(例如，PG-甘氨酰-CPT)、甘氨酰-甘氨酰(二聚体)(例如，PG-甘氨酰-甘氨酰-CPT)或甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰(三聚体)(例如，PG-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-CPT)作为连接基连接相等数量20(S)喜树碱(加载量)组成的结合物的疗效。有关这方面的基本原理是，(理论上)连接基越长，所形成的PG-CPT结合物就越稳定。似乎，在相同％20(S)-喜树碱加载量和等当量的20(S)-喜树碱浓度条件下，含三聚体的结合物效果比单体和含二聚体的结合物(显示相同效果)更有效。然而，在相同20(S)-喜树碱当量浓度下，含三聚体的结合物毒性比单-甘氨酸结合物大。另外，含二聚体-和三聚体结合物的合成比甘氨酸结合物更费时，且含三聚体结合物的水中溶解度显著低于单-甘氨酸结合物的溶解度。能够决定结合物疗效和毒性的重要参数尤其是，PG的平均分子量和％20(S)-喜树碱加载量。采用B-16和HT-29模型已证明，PG-甘氨酰-CPT结合物，当采用50kD的PG时要比采用74kD或33kD的PG制备的更有效。因此决定，仅着重研究50kD PG-甘氨酰-结合物，并研究改变20(S)-喜树碱加载量对抗肿瘤效果的影响。在采用HT-29结肠癌的初步试验中发现，采用35％加载量明显比25％、20％或15％加载量的结合物更有效，其间小鼠接受相同数量20(S)-喜树碱当量。将加载量从35％增加到37％和39％，进一步增加在HT-29，同样也在NC1-H460模型中的疗效。加载量增加到47％，并未产生更好的疗效；事实上，其疗效比35％加载量的材料低。结合物的水中溶解度在35％～39％之间呈下降趋势，该较高的加载量材料最难溶解。
一种采用HT-29模型的实验显示，一种50kD PG-甘氨酰-CPT的腹腔内(ip)单剂量的疗效按如下投药可进一步提高：给小鼠4次服用，每次间隔一周，总共累积喜树碱剂量为单剂量的3倍。这样的服药方法小鼠耐受情况非常好。理想的PG-甘氨酰-CPT结合物由平均分子量50kD(按粘度测定)的PG、(单)甘氨酸作为连接基以及35～37％20(S)-喜树碱组成。在雄性ncr nu/nu小鼠中的MTD是40mg/kg20(S)-喜树碱当量并且是游离20(S)-喜树碱的MTD的约2倍。
C.其他人类肿瘤模型
研究了GP-甘氨酰-CPT(33kD，37％加载量)对在雌性裸鼠(无胸腺)皮下接种的NC1-H322(ATTC CRL-5806)人类肺癌的抗肿瘤活性。该药物是，当肿瘤尺寸长到7～8mm直径时，在第9、13、17和21日以40mg/kg的20(S)-喜树碱当量剂量静脉注射的。TGD是40日。具有7～8mm皮下NC1-H460人类非小细胞肺癌异种移植物的雌性裸鼠在第1、5、9和13日以每次注射40mg/kg20(S)-喜树碱的剂量用PG-甘氨酰-CPT进行治疗。该40毫克当量20(S)-喜树碱/kg每第4日×4的试验剂量超过MTD一些。尽管没有死的，但比开始体重减轻了约20％。该PG-甘氨酰-CPT进行治疗的小鼠，其绝对肿瘤生长延缓(规定为，肿瘤从8mm长到12mm在进行治疗与对照组之间相差的天数)是43天。在第二个实验中，按相同方案(腹腔内)试验了直接结合的PG-CPT，也产生了实质性的生长延缓，且没有显著毒性。
PG-甘氨酰-CPT也在皮下接种了1.5×106个细胞/个老鼠的NC1-H1299(ATTC CRL-5803)人类肺癌细胞的雌性裸鼠中进行了试验。鉴于在此前的裸鼠实验中以40毫克当量20(S)-喜树碱/kg的剂量给药导致体重过分减轻，故剂量减少到30毫克当量20(S)-喜树碱/kg，按每4日一次共4次。该剂量的耐受情况很好，观察到TGD为32日。
D.10-羟基喜树碱结合物
20(S)-10-羟基喜树碱的PG-结合物在B16模型中进行了初步研究。该研究中，活性最大的结合物是直接结合的或通过20-羟基基团连接的甘氨酸结合的材料。在初步试验中，直接偶联的材料PG-(10-OAc-CPT)似乎在50毫克当量20(S)-10-羟基喜树碱/kg的剂量时的活性比GP-甘氨酰-(10-O-CPT)更大。然而，该剂量低于这两种化合物的MTD，而且PG-(10-OAc-CPT)溶液非常粘稠，该化合物在约30min后便从溶液中沉淀出来，这就使其实际上无法使用。
在50毫克当量20(S)-10-羟基喜树碱/kg的剂量时，PG-(10-OAc-CPT)产生5.3天的TGD(p＜0.01，与对照例相比)。有趣的是，PG-(10-OH-CPT)的MTD介于10～50毫克当量20(S)-10-羟基喜树碱/kg。然而，即便在50mg/kg这样的毒性剂量，其疗效也不如PG-(10-OAc-CPT)或PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)那样高。
有趣地注意到，在采用B-16/FO模型的直接比较中，50kD PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)结合物的效果，在相同加载百分数和SN38浓度条件下，是PG-甘氨酰-(7-乙基-10-OH-CPT)的大约两倍。当我们采用H-29模型比较PG-甘氨酰-CPT与PG-甘氨酰-(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)时也观察到同样的情况。总之，据发现，PG-20(S)-10-羟基喜树碱结合物和10-羟基喜树碱衍生物或(7-叔丁基二甲基甲硅烷基-10-OAc-CPT)的PG结合物，不如PG-甘氨酰-20(S)喜树碱结合物那样有效、耐受性好或容易溶解在水溶液中，不论它们直接连接或甘氨酸连接，或者连接在不同部位。
E.9-氨基喜树碱结合物
研究表明，PG-9-NH-CPT具有活性并且MTD超过25毫克当量20(S)-9-氨基喜树碱/kg。然而却发现，20(S)-9-氨基喜树碱结合物不如PG-甘氨酰-20(S)喜树碱结合物那样有效、耐受性好或容易溶解在水溶液中，不论它们直接连接或甘氨酸连接，或通过酯键或酰胺键连接，或者连接在不同部位。
F.总结和数据比较
在与PG-甘氨酰-20(S)-CPT结合物的直接比较中，不论由20(S)-9-氨基喜树碱制备的PG-结合物抑或由20(S)-10-羟基喜树碱制备的那些，都不如PG-甘氨酰-CPT结合物那样有效、耐受性好和容易溶解在水溶液中，不论它们直接连接或甘氨酸连接或者通过酯键或酰胺键连接，或者连接在不同部位。
虽然已结合本发明具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应懂得，在不偏离本发明真谛和范围的前提下尚可做出各种各样改变，和等价替代。另外，为使具体情况、材料、物料组成、方法、一个或多个工艺步骤适应本发明目标实质和范围，可做出多种修改。所有这些修改都应包括在所附权利要求的范围内。本文援引的所有专利、专利申请和出版物一律全文收作参考。
表2
Figure A0180944100551
其中R4＝H
化合物 R5  R1 R2 R3
 20(S)-喜树碱 H  H  H  H
托泊替堪 H  CH2N(CH3)2  OH  H
20(S)-9-氨基喜树碱 H  NH2  H  H
20(S)-9-硝基喜树碱 H  NO2  H  H
10-羟基喜树碱 H  H  OH  H
 SN-38 CH2CH3  H  OH  H
 20(S)-10，11-亚甲二氧基喜树碱 H  H -CH2-O-CH2-
Lurtotecan(GI 147211) -CH2-(N-甲基哌嗪)  H -O-CH2-CH2-O-
伊立替康(CPT-11) CH2CH3  H OCO-[1，4′-二哌啶基] H
 DX-8951F -CH2-CH2-CH(NH2)- CH3  F
 DB 67 -SiMe2t-Bu  H -OH  H
                                           表3
结合物 ％CPT占结合物(w/w) 水中溶解度 诊断信号在300MHz1H NMR谱(DMSO-d6) 鼠科单剂量MTD(IP(mg eq.CPT/kg)
PG-CPT(20-结合) 14 11mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.4-8.5(多重宽信号，Ar-H)，5.6(宽单峰，内酯-CH2-)，0.9(宽信号，CPT CH2CH3) 60-80mg eq.CPT/kg
PG-gly-CPT20-结合) 37 25mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.4-8.5(多重宽信号，Ar-H)，5.6(宽单峰，内酯-CH2-)，0.9(宽信号，CPT CH2CH3) 60-80mg eq.CPT/kg
PG-(10-OAc-CPT)(20-结合) 13 10mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.2-8.6(多重宽信号，Ar-H)；5.4(单峰，内酯-CH2-)；5.2(单峰，C5-H2)；0.9(三重宽峰，CPTCH2CH3) 10-20mg eq.CPT/kg
PG-(10-O-CPT)(10-结合) 13 10mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.2-8.6(多重宽信号，Ar-H)；5.4(单峰，内酯-CH2-)；5.2(单峰，C5-H2)；0.9(三重宽峰，CPTCH2CH3) 50mg eq.CPT/kg
PG-gly-(10-O-CPT)(10-连接) 20 ＞10mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.2-8.8(多重宽信号，Ar-H)；5.4(单峰，内酯-CH2-)；5.2(单峰，C5-H2)；0.9(宽信号，CPTCH2CH3) ＞10＜50mgeq.CPT/kg
PG-(10-OH-CPT)(20-连接) 19 ＞10mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，7.0-8.5(多重宽信号signals，Ar-H)；5.4(单峰，内酯-CH2-)；5.2(单峰，C5-H2)；0.9(宽信号，CPTCH2CH3) ＞50mg eq.CPT/kg
PG-(9-NH-CPT)(9-结合) 14 7mg/ml δ12.1(宽单峰，PGγ-COOH)，8.8(宽单峰，C7-H)，7.2-8.0(多重宽信号，Ar-H)，5.4(宽单峰，内酯-CH2-)，0.9(宽信号，CPT CH2CH3). ＞25mg eq.CPT/kg
译注：gly＝甘氨酰

Claims (34)

1.一种组合物，它包含一种聚谷氨酸-喜树碱结合物，其通式为：
其中：
PG是聚谷氨酸聚合物；
X是单键、氨基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羟基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的侧链；
喜树碱是20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物；
m是5～65的正整数；
喜树碱-X通过酯或酰胺键共价连接到所述聚合物的羧基基团上；
n是1～10的整数；以及
p是1～10的整数。
2.权利要求1的组合物，其中X是单键。
3.权利要求1的组合物，其中：
X是氨基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羟基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，
其中R’是天然存在的氨基酸的侧链；
n是1～10的整数；以及
p是1～10的整数。
4.权利要求1的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约5000～约100,000。
5.权利要求4的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约20,000～约80,000。
6.权利要求5的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约25,000～约60,000。
7.权利要求1的组合物，其中所述喜树碱类似物选自20(S)-喜树碱、20(S)-托泊替堪、20(S)-9-氨基喜树碱、20(S)-9-硝基喜树碱、20(S)-10-羟基喜树碱、SN-38、20(S)-10，11-亚甲二氧基喜树碱、lurtotecan、伊立替康、DX-8951F或DB 67。
8.权利要求7的组合物，其中所述喜树碱类似物选自20(S)-喜树碱、20(S)-9-氨基喜树碱、20(S)-9-硝基喜树碱、20(S)-7-乙基-10-羟基喜树碱、20(S)-10-羟基喜树碱或20(S)-10-乙酰氧基喜树碱。
9.权利要求2的组合物，其中所述聚谷氨酸喜树碱结合物具有如下通式
Figure A0180944100031
且所述喜树碱选自
(a)20(S)-喜树碱，其中R1、R2、R3和R4各自是氢；
(b)20(S)-9-氨基喜树碱，其中R1是-NH2，且R2、R3和R4各自是氢；
(c)20(S)-9-硝基喜树碱，其中R1是-NO2，且R2、R3和R4各自是氢；
(d)20(S)-10-羟基喜树碱，其中R1、R3和R4各自是氢，且R2是-OH；或者
(e)20(S)-10-乙酰氧基喜树碱，其中R1、R3和R4各自是氢，且R2是-O-C(O)-CH3。
10.权利要求9的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约25,000～约60,000。
11.权利要求10的组合物，其中所述喜树碱是20(S)-喜树碱，且所述20(S)-喜树碱占结合物重量的约10％～约16wt％。
12.权利要求3的组合物，其中所述聚谷氨酸喜树碱结合物选自通式III、通式IV或通式V：
其中Y是N或O。
13.权利要求12的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约30,000～约60,000。
14.权利要求13的组合物，其中所述喜树碱占结合物重量的约10％～约16wt％。
15.权利要求3的组合物，其中所述聚谷氨酸喜树碱结合物结构选自通式VI或通式VII：
Figure A0180944100051
其中：
Y是N或O；
R’是天然存在的氨基酸的侧链；
R1是-NH2或H；
R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；
R3是-H或烷基；以及
R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基。
16.权利要求15的组合物，其中R’是H。
17.权利要求16的组合物，其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约30,000～约60,000。
18.权利要求17的组合物，其中所述20(S)-喜树碱占结合物重量的约10％～约50wt％。
19.权利要求18的组合物，其中所述20(S)-喜树碱占结合物重量的约15％～约38wt％。
20.一种包含PG-甘氨酰-CPT、PG-甘氨酰-(10-OH-CPT)或GP-甘氨酰-(9-NH-CPT)的组合物，其中所述PG的分子量介于约25,000～约60,000，且所述20(S)-喜树碱占结合物重量的约10％～约50wt％。
21.一种制备包含具有下列通式的聚谷氨酸-喜树碱结合物的组合物的方法，
其中：
PG是聚谷氨酸聚合物；
X是单键、氨基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-NH]n-，或羟基酰基连接基-[OC-(CHR’)p-O-]n-，其中R’是天然存在的氨基酸的侧链；
喜树碱是20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物；
m是5～65的正整数；
喜树碱-X通过酯或酰胺键共价连接到所述聚合物的羧基基团上；
n是1～10的整数；以及
p是1～10的整数，
其中所述方法包括：
(a)提供MW(分子量)介于约25,000～约60,000道尔顿，按粘度测定，的聚谷氨酸聚合物，以及20(S)-喜树碱以便结合在其上；以及
(b)在足以使每摩尔聚合物连接至少5摩尔20(S)-喜树碱的条件下使所述20(S)-喜树碱共价地连接到所述聚谷氨酸聚合物上，从而生成所述聚谷氨酸-喜树碱结合物。
22.权利要求21的方法，其中所述20(S)-喜树碱选自20(S)-9-氨基喜树碱、20(S)-10-羟基喜树碱或20(S)-喜树碱。
23.权利要求22的方法，其中20(S)-喜树碱占结合物重量的约10％～约16wt％。
24.一种制备包含聚谷氨酸-喜树碱结合物的组合物的方法，包括：
(a)提供质子化形式的聚谷氨酸聚合物和20(S)-喜树碱或生物活性20(S)-喜树碱类似物以便结合在其上；
(b)使所述聚谷氨酸聚合物与所述20(S)-喜树碱在惰性有机溶剂中、在双(20-氧代-3-噁唑烷基)次磷酸存在下，在足以生成聚谷氨酸-喜树碱结合物的条件下起反应；以及
(c)通过加入过量体积的盐水溶液使所述聚谷氨酸-喜树碱结合物从溶液中沉淀出来。
25.权利要求24的方法，进一步包括：
(d)洗涤所述沉淀以除掉未反应的20(S)-喜树碱。
26.权利要求24的方法，其中用碘化氯甲基吡啶鎓代替步骤(b)中的双(20-氧代-3-噁唑烷基)次磷酸。
27.权利要求24的方法，其中所述聚谷氨酸聚合物的MW介于约25,000～约60,000道尔顿，按粘度测定。
28.权利要求27的方法，其中所述20(S)-喜树碱占结合物重量的约10％～约16wt％。
29.一种药物组合物，它包含抗肿瘤和/或抗白血病有效量的权利要求1、11或14中任何一项的聚谷氨酸-喜树碱结合物或其可药用盐以及可药用载体和/或稀释剂。
30.一种药物组合物，它包含抗肿瘤和/或抗白血病有效量的权利要求20的聚谷氨酸-喜树碱结合物或其可药用盐以及可药用载体和/或稀释剂。
31.一种治疗白血病或固体肿瘤的方法，包括对需要此种治疗的患者施用权利要求30的药物组合物，从而实现所述白血病或所述固体肿瘤的治疗。
32.一种包含按权利要求21～28之一的方法制备的聚谷氨酸-喜树碱结合物的组合物。
33.一种包含具有通式III、通式IV或通式V的聚谷氨酸-喜树碱结合物的组合物：
Figure A0180944100081
Figure A0180944100091
其中：
PG是聚谷氨酸聚合物；
Y是N或O；
R’是天然存在的氨基酸的侧链；
n是1～10的整数；以及
p是1～10的整数，
其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约30,000～约60,000。
34.一种包含具有通式VI或通式VII的聚谷氨酸-喜树碱结合物的组合物：
Figure A0180944100101
其中：
Y是N或O；
R’是天然存在的氨基酸的侧链；
R1是-NH2或H；
R2是-H、-OH或-O-C(O)-CH3；
R3是-H或烷基；以及
R4是-H、烷基或三烷基甲硅烷基，
其中所述聚谷氨酸聚合物的分子量介于约30,000～约60,000。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102649810A (zh) * 2011-05-19 2012-08-29 东北林业大学 喜树碱衍生物、其制备方法和用途
CN106267227A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 北京蓝贝望生物医药科技股份有限公司 抗肿瘤药物
CN106831853A (zh) * 2017-02-15 2017-06-13 浙江海正药业股份有限公司 7‑乙基‑10‑o‑叔丁基二苯基硅基喜树碱‑20‑o‑甘氨酸盐酸盐的制备工艺
CN108727581A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 华东师范大学 以苯硼酸酯为连接单元的两亲性喜树碱高分子前药及其制备方法和应用

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6441025B2 (en) * 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
US20030054977A1 (en) * 1999-10-12 2003-03-20 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
WO2001026693A2 (en) 1999-10-12 2001-04-19 Cell Therapeutics, Inc. Manufacture of polyglutamate-therapeutic agent conjugates
US20020077290A1 (en) * 2000-03-17 2002-06-20 Rama Bhatt Polyglutamic acid-camptothecin conjugates and methods of preparation
US6629995B1 (en) * 2000-03-31 2003-10-07 Super Gen, Inc. Camptothecin conjugates
US7968569B2 (en) 2002-05-17 2011-06-28 Celgene Corporation Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
US7393862B2 (en) 2002-05-17 2008-07-01 Celgene Corporation Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias
CN103393695A (zh) * 2002-05-17 2013-11-20 细胞基因公司 用于治疗和控制多发性骨髓瘤的方法及组合物
US7323479B2 (en) 2002-05-17 2008-01-29 Celgene Corporation Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline
USRE48890E1 (en) 2002-05-17 2022-01-11 Celgene Corporation Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation
US11116782B2 (en) 2002-10-15 2021-09-14 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
ES2488841T3 (es) 2002-10-31 2014-08-29 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Derivados de alto peso molecular de camptotecinas
US8796436B2 (en) 2003-04-17 2014-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US8017762B2 (en) * 2003-04-17 2011-09-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US7851615B2 (en) * 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
US7723509B2 (en) * 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
ES2702942T3 (es) * 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
UA83504C2 (en) 2003-09-04 2008-07-25 Селджин Корпорейшн Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
CN1946421B (zh) 2004-04-27 2013-07-17 威尔斯达特生物制剂公司 使用病毒和喜树碱进行的癌症治疗
US8614228B2 (en) 2004-08-11 2013-12-24 Arqule, Inc. Quinone prodrug compositions and methods of use
EP1877097B1 (en) 2004-08-11 2012-06-20 Arqule, Inc. Aminoacid conjugates of beta-lapachone for tumor targeting
EP1792927B1 (en) 2004-09-22 2013-03-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Novel block copolymer, micelle preparation, and anticancer agent containing the same as active ingredient
RU2435586C2 (ru) 2005-07-14 2011-12-10 Веллстат Байолоджикс Корпорейшн Лечение рака с применением вирусов, фторпиримидинов и камптотецинов
ITPD20050242A1 (it) * 2005-08-03 2007-02-04 Fidia Farmaceutici Bioconiugati antitumorali dell'acido ialuronico o dei suoi derivati, ottenibili per coniugazione chimica diretta o indiretta, e loro impiego in campo farmaceutico
KR20080074207A (ko) * 2005-12-05 2008-08-12 닛토덴코 가부시키가이샤 폴리글루타메이트-아미노산 콘쥬게이트 및 이의 제조 방법
US7462627B2 (en) * 2006-02-09 2008-12-09 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin for treatment of breast, colorectal, pancreatic, ovarian and lung cancers
US7671067B2 (en) * 2006-02-09 2010-03-02 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of non-hodgkin's lymphomas with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamtothecin
WO2007111211A1 (ja) 2006-03-28 2007-10-04 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha タキサン類の高分子結合体
AU2007232206B2 (en) 2006-03-30 2013-04-04 Drais Pharmaceuticals, Inc. Camptothecin-cell penetrating peptide conjugates and pharmaceutical compositions containing the same
JP5181347B2 (ja) 2006-05-18 2013-04-10 日本化薬株式会社 ポドフィロトキシン類の高分子結合体
CL2007002218A1 (es) 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
JP5548364B2 (ja) * 2006-10-03 2014-07-16 日本化薬株式会社 レゾルシノール誘導体の高分子結合体
US8334364B2 (en) * 2006-11-06 2012-12-18 Nipon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight derivative of nucleic acid antimetabolite
WO2008056654A1 (en) * 2006-11-08 2008-05-15 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist
US20080181852A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Nitto Denko Corporation Multi-functional Drug Carriers
BRPI0807232A2 (pt) * 2007-02-09 2014-04-29 Enzon Pharmaceuticals Inc Tratamento de cânceres resistentes ou refratários com conjugados poliméricos multi-braços de 7-etil-10-hidroxicamptotecina
CN101674852A (zh) * 2007-04-10 2010-03-17 日东电工株式会社 多功能聚谷氨酸盐药物载体
ES2532656T3 (es) 2007-04-30 2015-03-30 Arqule, Inc. Compuestos de hidroxi sulfonato de quinona y sus usos
US8197828B2 (en) * 2007-05-09 2012-06-12 Nitto Denko Corporation Compositions that include a hydrophobic compound and a polyamino acid conjugate
CN101730549B (zh) * 2007-05-09 2015-12-09 日东电工株式会社 与铂类药物结合的聚合物
EP2155253A2 (en) * 2007-05-09 2010-02-24 Nitto Denko Corporation Polyglutamate conjugates and polyglutamate-amino acid conjugates having a plurality of drugs
USRE46190E1 (en) 2007-09-28 2016-11-01 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight conjugate of steroids
AU2009222230A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-11 Nitto Denko Corporation Polymer paclitaxel conjugates and methods for treating cancer
KR101589582B1 (ko) 2008-03-18 2016-01-28 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 생리활성물질의 고분자량 결합체
US9149540B2 (en) 2008-05-08 2015-10-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymer conjugate of folic acid or folic acid derivative
JP2011162569A (ja) * 2008-05-23 2011-08-25 Nano Career Kk カンプトテシン高分子誘導体及びその用途
TW201010732A (en) * 2008-08-29 2010-03-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Method of treating RAS associated cancer
US20100093935A1 (en) * 2008-10-15 2010-04-15 Nitto Denko Corporation Method of preparing polyglutamate conjugates
AU2009307922A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Treatment of neuroblastoma with multi-arm polymeric conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin
JP5544357B2 (ja) 2009-05-15 2014-07-09 日本化薬株式会社 水酸基を有する生理活性物質の高分子結合体
JP2013514443A (ja) * 2009-12-16 2013-04-25 日東電工株式会社 ポリグルタミン酸の制御された合成
BR112012022337A2 (pt) * 2010-03-11 2016-07-05 Nitto Denko Corp composição e respectivos método de preparação e uso de quantidade eficaz
WO2012067138A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 日本化薬株式会社 新規なシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
US9346923B2 (en) 2011-09-11 2016-05-24 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Method for manufacturing block copolymer
US9180203B2 (en) * 2012-10-23 2015-11-10 The Johns Hopkins University Self-assembling drug amphiphiles and methods for synthesis and use
HUE061382T2 (hu) 2014-08-22 2023-06-28 Celgene Corp Eljárás myeloma multiplex kezelésére immunomoduláló vegyületekkel, antestekkel kombinálva
EP3313818B1 (en) 2015-06-26 2023-11-08 Celgene Corporation Methods for the treatment of kaposi's sarcoma or kshv-induced lymphoma using immunomodulatory compounds, and uses of biomarkers
CA3038912A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 If7Cure, Inc Process for the manufacture of a tumor-vasculature targeting antitumor agent
JP2021095424A (ja) * 2018-03-28 2021-06-24 持田製薬株式会社 抗癌剤結合アルギン酸誘導体
KR20220134528A (ko) * 2019-12-04 2022-10-05 단타리, 인크. 치료 나노입자의 합성을 위한 방법 및 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356166A (en) * 1978-12-08 1982-10-26 University Of Utah Time-release chemical delivery system
KR100561788B1 (ko) * 1996-03-12 2006-09-20 피지-티엑스엘 컴파니,엘.피. 수용성파클리탁셀전구약물을포함하는조성물및이러한조성물을포함하는이식가능한의료장치
US6441025B2 (en) * 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102649810A (zh) * 2011-05-19 2012-08-29 东北林业大学 喜树碱衍生物、其制备方法和用途
CN106267227A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 北京蓝贝望生物医药科技股份有限公司 抗肿瘤药物
WO2018028589A1 (zh) * 2016-08-12 2018-02-15 北京蓝贝望生物医药科技股份有限公司 一种多聚结合物及其制备方法，以及包含该多聚结合物的药物组合物及其用途
CN106831853A (zh) * 2017-02-15 2017-06-13 浙江海正药业股份有限公司 7‑乙基‑10‑o‑叔丁基二苯基硅基喜树碱‑20‑o‑甘氨酸盐酸盐的制备工艺
CN108727581A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 华东师范大学 以苯硼酸酯为连接单元的两亲性喜树碱高分子前药及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001070275A3 (en) 2002-01-03
AU2001247513A1 (en) 2001-10-03
HUP0204562A2 (hu) 2003-04-28
CZ20023330A3 (cs) 2003-02-12
ZA200207423B (en) 2003-12-17
MXPA02009082A (es) 2003-12-11
SK14822002A3 (sk) 2003-05-02
JP2003527443A (ja) 2003-09-16
NO20024421L (no) 2002-11-15
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SI21172A (sl) 2003-10-31
KR20020082888A (ko) 2002-10-31
NO20024421D0 (no) 2002-09-16
US20020016285A1 (en) 2002-02-07
BR0109272A (pt) 2004-06-29
EP1267939A2 (en) 2003-01-02
TR200202194T2 (tr) 2003-01-21
WO2001070275A2 (en) 2001-09-27
CA2402643A1 (en) 2001-09-27
PL358335A1 (en) 2004-08-09
RU2002128610A (ru) 2004-03-27

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