CN1324981C - 微生物花生四烯酸在海洋饲料中的应用 - Google Patents

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Abstract

描述了一种海洋饲料组合物，它包含微生物来源的花生四烯酸(ARA)或者甘油三酯形式的ARA。虽然饲料组合物本身不含有微生物细胞，但ARA适当地由例如被孢霉属真菌产生。与相应的来自鱼油的磷脂形式ARA相比，发现这种形式的ARA能够较好促进海洋生物(小虾和鱼)的生长和色素形成。ARA能够以油的形式，例如水包油的乳液，或者可首先饲喂幼体、轮形动物或无节幼体，它们本身以“活”饲料包括在用于大生物体的饲料组合物中。

Description

微生物花生四烯酸在海洋饲料中的应用
发明领域
本发明涉及微生物来源的花生四烯酸(ARA)在海洋饲料组合物中的应用，在饲养水产动物(例如，海洋的)和在水产养殖中的应用。ARA可以来源于单细胞生物体，这样可以为甘油三酯的形式。
发明背景
花生四烯酸(ARA)是一些长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)中的一种。从化学上说，它是顺式-5，8，11，14二十碳四烯酸(20：4)，属于LC-PUFA的(n-6)家族。
花生四烯酸是许多生物活性化合物的一种主要的前体(在鱼和高等陆地脊椎动物中)，所述生物活性化合物以类二十烷酸而知名，包含前列腺素、血栓烷、白细胞三烯。海洋鱼、小虾(shrimp)和各种陆地动物(如猫)，缺少Δ-5脱氢酶活性，因此不能把脂肪酸18：2(n-6)(亚油酸)转换为ARA。由于花生四烯酸是产生类二十烷酸所必需的，它是这类动物必需的脂肪酸，必须在其食物中供给。
这些动物的饮食中二十碳五烯酸(EPA){20：5(n-3)}、二十二碳六烯酸(DHA){22：6(n-3)}与花生四烯酸{20：4(n-6)}的比例很重要，因为相对过剩的EPA能阻止从花生四烯酸产生类二十烷酸。
海洋鱼和小虾正常食物中包含了不等数量的鱼油来源的花生四烯酸，已知鱼油中的花生四烯酸的含量是可变的，但通常相对较低，约占总脂肪酸的1％(Sargent，J.R.，McEvoy，L.A.和Bell，J.G.：水产养殖(Aquaculture)，155(1997)p.117-127)。
培育海洋鱼幼体(larvae)的能力经常在很大程度上取决于食物的营养组成。利用可得未加工原料，例如鱼油、动物下货等很难获得所希望的二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸和花生四烯酸的比例，这是因为即使原料相似，LC-PUFA水平常常有很大的变化，而且这些未加工的原料在灭菌过程相当大的一部分花生四烯酸会遭到破坏。
本发明的一个目的是提供一种具有可复现质量的花生四烯酸的来源，使水产养殖饲料工业能够在鱼幼体和小虾食物中(如活饲料)找到满意水平的花生四烯酸，以及适合这些动物的正确的二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸比例。几乎所有的海洋养殖(海洋生物养殖)生产系统依赖于活饲料，主要的是轮虫褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)和卤虫属(Artemia)的盐小虾无节幼体(nauplii)，虽然可替代的活饲料也存在。
用来自鱼油乳液的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸加富活饲料已经有描述(Sargent等人，出处同上)。他们也描述了利用冻干或者喷雾干燥的藻类和真菌细胞的可能性，其中藻类和真菌细胞中含有大量二十二碳六烯酸用于活饲料的加富。
Sargent等人也建议使用花生四烯酸，但是是以磷脂的形式。花生四烯酸的磷脂是比目鱼和小虾活饲料的一个天然来源，这也是存在于鱼油中的形式。磷脂形式的花生四烯酸不容易氧化(与游离的花生四烯酸相比)，因此是水产养殖工业优选的。
WO-A-90/07283(Suntory)涉及鱼和有壳水生动物的含有真菌细胞的饲料，其中含有n-3脂肪酸(例如EPA，DHA)或者其酯。但是，这些原料通常ARA含量低，并且ARA通常以磷脂形式存在。
但是，利用微生物来源的ARA可以在海洋动物中得到高含量的ARA。发现在用含有来自单细胞生物体的ARA的饲料饲养的海洋动物体内ARA富集有明显增加。
发明描述
根据本发明的第一个方面，提供了一种海洋饲料组合物，其包含一种或多种(海洋)饲料的成分和/或组分以及微生物来源的花生四烯酸(ARA)。这样ARA可以来源于单细胞生物体，例如微生物，应理解这不包括鱼油(或者海洋的)来源。微生物来源的ARA通常以甘油三酯的形式存在，因此本发明也涉及包含甘油三酯形式的ARA的海洋饲料组合物。
优选地饲料将(基本上)以不含磷脂形式存在的ARA。这样本发明可避免使用磷脂ARA，这种形式的ARA存在于海洋来源(例如鱼油)中。这样用一种不同于天然来源形式的ARA来喂养海洋动物，换言之，也就是生物体不会正常消化的形式，这看起来是违反直观感觉的。但是，应用者已经发现这可以导致意想不到的好处。
ARA通常将以油或者在油中形式提供。这样，油可能得自或者由单细胞生物体产生，例如来自微生物来源。这样油可至少含有10％，例如至少20％，优选的至少30％，有利的至少35％，最适的至少40％的ARA(以总脂肪酸重量为基础)。油中ARA的含量至少是250，优选的至少300，最适的至少350g/kg油。油中适宜的最低甘油三酯含量为90％，例如至少95％，最适的至少97％。存在的ARA中优选的至少85％，例如至少90％，最适的至少95％以甘油三酯形式存在。
优选的ARA不滞留在细胞内，例如产生ARA的微生物细胞内。这样，本发明的海洋饲料可(基本上)不含单细胞生物体或微生物，例如ARA来源的或者产生ARA的生物体或细胞。这样不仅能使饲料组合物容易配制，而且更令人吃惊的是，一旦ARA从产生它的细胞内提取出来就更稳定。
虽然ARA被建议应用到海洋饲料中，但是现有的趋势是利用磷脂形式的ARA，它通常来源于海洋来源。这不仅因为磷脂形式是海洋动物中自然存在的形式，而且因为它不容易被氧化。摒弃这些偏见，申请人发现微生物来源的ARA(或者甘油三酯形式的ARA)比磷脂形式的ARA能提供更多的优点。更特别的是，当用本发明的饲料组合物饲养时，海洋生物体能够更高地吸收和利用ARA。而且，高质量的微生物来源ARA可以克服或者至少减轻氧化问题。
微生物来源的ARA进一步的优点是，油可以有比，例如鱼油更高的ARA含量，这意味着较少量的微生物油可以递送相同量的ARA(导致了低廉的运输、贮藏和饲料费用)。
ARA所来源的或者产生ARA的微生物(或者单细胞)来源是适宜的微生物，例如以丝状的形式，例如真菌或者藻类。优选的真菌是毛霉(Mucorales)目。例如，真菌可能是被孢霉属(Mortierella)，须霉属(Phycomyces)、布拉霉属(Blakeslea)或者曲霉属(Aspergilus)。优选的真菌是高山被孢霉(Mortierella alpina)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)和土曲霉(Aspergilus terrus)的种。
优选的藻类是沟鞭藻类和/或者属于Crypthecodinium的属。
优选的藻类是Crypthecodinium cohnii的种。
不同于海洋来源的PUFA含量可以因种类和所用加工技术的变化而变化，这些ARA来源产生可预测量的ARA。
ARA优选通过发酵法得自微生物(或单细胞)来源或由其产生。微生物可以生长在(大规模)发酵罐中。当微生物存在于由可同化的碳源(例如，葡萄糖或者麦芽糖糊精)和适合的氮源(例如，铵离子，如来自硫酸铵或者酵母提取物)组成的水性组合物中时，就可以进行发酵。
发酵过程中或者发酵结束后，就得到含有微生物和培养基的发酵液，如水性溶液。分离发酵液(例如，通过过滤、离心或其它液固分离技术)以得到水性溶液(例如，以过滤液的形式)和微生物(指的是生物质)。从生物质中提取和/或分离ARA(和其它PUFA，如果有必要的话)。这可以通过使用一种溶剂，例如一种非极性溶剂或任何其它适合的能够溶解ARA的溶剂来实现。特别的是，这可以是C3-8烷，例如己烷。
在ARA提取以前，生物质可以经过机械的、化学的和/或者物理的加工。例如生物质可以被加热和/或者巴氏灭菌。生物质可以例如通过挤出，被加工成粒状。
象前面解释的一样，ARA在海洋饲料中优选以油的形式存在。油也可以乳液形式存在。这样，也可以水包油乳液中的油形式提供ARA。乳液优选地含有乳化剂，并且可额外含有的抗氧化剂。卵磷脂能实现此两种功能。
本发明的组合物可以用作水产动物的饲料和，一般说来，可用于水产养殖。该组合物可饲养的适合的海洋动物是盐或者海水生物。较适合的生物是冷水生物。
这种组合物饲养的海洋生物体可以是幼体(例如甲壳纲(Crustacea)亚门)，轮虫(例如轮虫(Rotifera)动物门)，或者无节幼体(例如卤虫属的幼体)。优选的轮虫是褶皱臂尾轮虫的种。所有的这些生物体相对较小，且其自身可存在于海洋饲料中用于被大的生物体消化。这种情况下，这些生物体是饲料的组分或者成分之一，并且组成一种活饲料。这种情况下，ARA可能已经在这些生物体内或者存在于组合物的其它地方。
其它适合饲养本发明组合物的生物体包括桡足类的动物(例如，挠足亚纲(Copepoda))，例如，Tisbe纲、Acartia、卤虫属和/或者真宽水蚤属(Eurytemora)中的种类。
特别构思的海洋生物体属于软体动物门(Mollusca)，例如，Bivalvia纲，Protobranchia亚纲和瓣鳃亚纲(Lamellibranchia)(包括贻贝属(Mytilus)和牡蛎属(Ostrea)，贻贝和牡蛎)。也包括头足纲(Cephalopoda)，例如Coleoida亚纲，例如十足目(Decapoda)，乌贼属(Sepia)，Loligo(包括鱿鱼和墨鱼)和八腕目(Octopoda)(章鱼)。
其它的生物体属于甲壳纲亚门，例如Actcus部，包括蝲蛄(crayfish)，和端足目(Amphipoda)，例如钩虾属(Gammarus)部，它包括对虾和小虾。
海洋生物体因此包括非脊椎动物，如章鱼和鱿鱼，对虾(瘦虾属(Leander))，小虾(褐虾属(Crangon))。鱼或者其它的脊椎动物，如鲱鱼，大菱鲆(例如，大菱鲆(Scopbtbalmus maximus))，大比目鱼，大马哈鱼(Atlantica，Chinook，Coho，Pacific)，鳟鱼(例如虹鳟鱼，Oncorhynchusmykiss)，鲷(例如，海洋鲷，金头鲷(Sparus aurata))，鳎(例如，普通鳎鱼，鳎(Solea solea)，Senegal sole，Solea senegalensis Kaus)，鲈鱼(例如海洋鲈鱼，Dicentrarchus labra)，比目鱼(Parlichtys，例如，日本比目鱼，Parlichtys divaceus)，黄尾(Yellow tail)，遮目鱼(Milkfish)，北极嘉鱼(Arctic Charr)。
也包括有壳水生动物，如龙虾类，贻贝类，牡蛎类，蛤类，对虾类(沼虾属(Macrobrachium)，例如，马来沼虾(rosenbergii))，小虾类(对虾属(Penaeus)，例如，日本对虾(japonicus)，Kurum虾和vannamei，白足虾，monodon和setiferus)。
优选的虾是卤虫纲的属。而且，卤虫属的无节幼体能够被饲养或者作为活的饲料包含在本发明的饲料组合物中。
活饲料，其中可消化的海洋生物体在食物中提供用来被大的生物体消化，特别适合小的生物体或者那些在发育早期的生物，例如，幼体例如3日龄，5日龄或甚至10日龄幼体。这是因为这样的生物体不能够有效地同化制备的饲料。通常在各种或标准饲料组分和/或者成分中额外包含活生物体。活的无节幼体，例如卤水小虾或者卤虫属特别适合于幼体。
其它的组分或者成分可包括，例如，鱼粉，大豆粗粉，小麦粗粉粘合剂和/或者稳定剂，如果有必要，还有矿物质和/或者维生素。饲料可以小球和/或者颗粒的形式。幼体(例如鱼和甲壳纲动物)初始可能饲喂活饲料，然后发育中食用非活饲料。
下面是对可包括于其中的各种矿物质元素的一些参考，分别如下：
鱼粉                  30-60％，例如40-50％
酶法消化的鱼粉(浓缩)  1-15％，例如5-10％
大豆和/或者小麦粗粉   5-25％，例如10-18％(各自)
矿物质和/或者维生素   0.5-4％，例如1-2％(各自)
对于许多的海洋生物体，特别是鱼，食物中可含有10-40％的脂类。它也可能含有35％-50％的蛋白质。生物体可得的适合磷的含量小于0.8％。这种食物可包含天然的或者人工的类胡萝卜素、维生素和/或者矿物质。
饲料中(例如，非活饲料)存在的ARA优选含量是0.1-5％，例如，从0.1％到2％。适合的总n-6PUFA含量可从食物的1％到15％(重量)。
对于活饲料来说，ARA的含量可5-30％，例如从10％到25％，最适的是15％到20％。总n-6PUFA的含量可从5％到50％，例如从5％到30％。这里ARA可位于活的可食用的海洋生物体中(已经被摄食)。
如果必要，海洋饲料可以包含其它多不饱和脂肪酸(PUFA)，例如C18，C20，和/或C22ω-3或者ω-6PUFA。构思的其它PUFA包括例如二十二碳六烯酸(DHA)(来自藻类或者真菌，例如藻类Crypthecodinium或者真菌破囊壶菌属(Thraustochytrium))，γ-亚麻酸(GLA)和/或者EPA。任何一个这些PUFA均可以单独提供或者加入到含有ARA的油中。
如果除了ARA之外还提供EPA，那么EPA∶ARA的比例可以从1∶0.5到1∶2，例如从1∶1到1∶1.6。如果有DHA，那么DHA∶ARA的比例可以从1∶0.2到1∶1，例如从1∶0.25到1∶0.7。当EPA和DHA都有时，那么DHA∶EPA∶ARA的比例可以从3-5∶0.5-2.0∶1.0-2.0(例如，如果饲料不是活的)或者，对于活的饲料为从1.0-2.0∶0.7-1.3∶0.7-1.3。
本发明的第二个方面涉及制备海洋饲料组合物的方法，这个方法包括将微生物来源的ARA或者甘油三酯形式的ARA与一种或多种海洋饲料组分和/或者成分混合。这可包括鱼粉和植物来源的材料，前面有详细的描述。
此饲料组合物也可，例如是“活”组合物，其包含活的多细胞海洋生物体，例如，前面描述的幼体，无节幼体或者轮虫
因此，本发明的这个方面也包括向一种现有的海洋饲料组合物增补ARA。
本发明的第三个方面涉及使用微生物来源的ARA，或者甘油三酯形式的ARA(或者含有任一ARA形式的海洋饲料组合物)，来促进海洋生物体的生长和/或色素形成。这也可以扩展到海洋食物的补加，例如作为营养添加剂。这个用途还构思了帮助海洋生物体产生类二十烷酸。
本发明的第四个方面涉及用第一个方面的海洋饲料组合物饲喂海洋生物体的方法。
本发明的第五个方面涉及用于提高海洋生物体生长和/或色素形成的方法，这个方法包括用第一个方面的海洋饲料组合物饲喂生物体。
优选的本发明一个方面的特点和特征在细节上已作必要修正从而适合另一个方面。
本发明将被通过举例方式，参照下面的实施例进行描述，这些实施例用于阐明，并不意在限制。
比较实施例1，2和实施例3
用微生物来源的花生四烯酸(ARA)加富卤虫饲料
粗花生四烯酸(ARA)油由真菌高山被孢霉产生，利用了国际申请PCT/EP97/01446(WO-A-97/36996)的实施例1的方案。这油可以从Gist-brocades B.V.获得，商标是VEVODARTM。这油然后就可以用卵磷脂(卵磷脂的最终浓度为10％)配制富含花生四烯酸的乳液。
ARA油的乳液被配制成二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA)的比例为4/1/1.5(实施例3)的比例，而另一个乳液(用做比较实施例2)则用鱼油代替微生物的ARA油，被配制成DHA∶EPA∶ARA比例为2.5/1/0.2。这两种乳液通过3000转/分钟离心15分钟来测定稳定性。这两种乳液在该离心测试中均稳定，意味着没有观察到分离成不同的层。
卤虫属的包囊在28℃于海水中孵化。孵化后24小时，收集无节幼体并转移到一个富集容器中，密度为250无节幼体/ml。
然后这两种乳液然后被用来(每种有重复样本)补充成为一个标准的无节幼体的食物：
a)用300ppm的微生物ARA乳液加富(实施例3)；和
b)用300ppm的鱼油乳液加富(比较实施例2)。
随后的加富后，无节幼体样品被用来利用FAME(脂肪酯甲基酯)方法来进行脂肪酸分析，以确定它们的PUFA含量，Lepage和Roy，脂类研究杂志(J.Lip Res.)25：1391-6(1984)中描述了此方法。作为对照，一些无节幼体利用不含有任何乳液(无ARA，比较实施例1)的标准食物生长。
加富的和对照的无节幼体之二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸水平示于表1中。
表1：卤虫属无节幼体中(加富后)二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸水平及所有的(n-3)和(n-6)脂肪酸总和
 加富方案(实施例)  二十二碳六烯酸(DHA，n-3)含量(mg/g干重)  二十碳五烯酸(EPA，n-3)含量(mg/g干重)  花生四烯酸(ARA，n-6)含量(mg/g干重)  总(n-3)+(n-6)脂肪酸(mg/g干重)
 1.对照(无)  0.1  7.9  1.6  20.7
 2.鱼油乳液  28.3  23.5  4.6  84.6
 3.微生物来源的ARA乳液  24  15.6  16.1  83.3
结果表明，从高山被孢霉中获得的花生四烯酸可以用来加富卤虫属饲料。这导致了饲喂无节幼体中二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸比例的改变。微生物油提供的脂肪酸的比例更适合通过明显提高生物体中ARA含量，以提高水产生物种类的生长和色素形成。这些富含ARA的无节幼体本身可以用作活的饲料成分，作为较大海洋动物的饲料组合物。
用褶皱臂尾轮虫来代替卤虫属无节幼体重复同一过程。
比较实施例4，5和实施例6
ARA加富食物对于虎虾(tiger shrimp)生长参数的影响
四日龄的斑节对虾(Penaeus monodon)(大虎虾)可通过商业来源获得，在含有消毒海水的槽中于28℃生长，密度为20后期幼体/升。ARA加富的卤虫属无节幼体和对照的无节幼体(来自实施例2和实施例3)每天四次加到容器中，任意取食总共10天(如Rees，J.F.，Cure，K，Piyatiratitivorakul，Sorgeloos，P和Menasveta，在农业养殖(Agriculture)122(1994)193-207中所描述)。
幼体总质量的增加被用做生长的指示。在实验的开始和结束测定干重(总生物质)，重量的增加示于表2。
表2：用微生物来源的ARA加富的卤虫属无节幼体饲喂的斑节对虾后期幼体的生长，与用未加富的无节幼体以及用鱼油加富的无节幼体饲喂斑节对虾后期幼体生长的比较(无节幼体依实施例2和3制备)。
 实施例  加富方案  虾干重的增加(mg)
 4  对照(无)  30
 5  鱼油乳液(实施例2)  92
 6  微生物ARA乳液(实施例3)  135
结果清楚的表明微生物来源的ARA加富的卤虫属无节幼体对幼体生长的有利影响。
在实验的最后，15日龄的后期幼体被随后冻干。利用先前实施例描述的标准技术来分析幼体的脂肪酸组分。结果用mg FAME(脂肪酸甲基酯)/g虾干重表示。
表3：用微生物来源ARA加富的卤虫属饲喂，与用富含鱼油乳液的无节幼体以及阴性对照(如，未加富PUFA的无节幼体)饲喂相比，虎虾后期幼体的脂肪酸成分
 脂肪酸  比较实施例4阴性对照  比较实施例5鱼油  实施例6微生物来源的ARA油
 ARA  2.8  3.4  9.7
 DHA  0.4  8.5  8.3
 EPA  3.1  9.7  9.5
结果证明，利用微生物来源的ARA之后期幼体中ARA含量显著增加。
比较实施例7和8与实施例9
ARA加富食物对白鲈鱼幼体生长的影响
除了使用的是白鲈鱼幼体以外，重复与实施例4-6描述相似的实验。J.A.Clawson和T.T.Lovell在水产养殖(Aquaculture)108(1992)：125-134中有详细的使用方法描述。获得的结果表明，用富含微生物来源的ARA卤虫属无节幼体饲喂与用富含鱼油的卤虫属无节幼体饲喂相比，前者提高了白鲈鱼幼体生长。

Claims (23)

1.一种海洋饲料组合物，其包含一种或多种饲料组分和/或者成分，以及微生物来源的花生四烯酸(ARA)，其不含产生或者能够产生ARA的微生物。
2.一种海洋饲料组合物，其包含一种或多种饲料组分和/或者成分以及ARA，其中ARA呈甘油三酯的形式。
3.权利要求2的海洋饲料组合物，其中组合物不含有磷脂形式的ARA。
4.根据权利要求1或2的组合物，其中的ARA由真菌或者藻类产生，或来自于真菌或藻类。
5.根据权利要求4的组合物，其中的真菌是毛霉目。
6.根据要求5的组合物，其中的真菌是被孢霉属、须霉属、布拉霉属或者曲霉属。
7.根据权利要求6的组合物，其中的真菌是高山被孢霉的种。
8.根据权利要求1或2的组合物，其中的ARA以油的形式存在。
9.根据权利要求8的组合物，其中油中ARA的含量至少为20％。
10.根据权利要求8的组合物，其中含有ARA的油以水包油乳液配制。
11.根据权利要求1或2的组合物，其是一种“活”饲料组合物，且包含了可食用的海洋生物体。
12.根据权利要求11的组合物，其中可食用的海洋生物体以活的饲料存在，或者要喂养的海洋生物体是幼体、轮虫或无节幼体。
13.根据权利要求12的组合物，其中的生物体是甲壳纲亚门或者轮虫门。
14.根据权利要求12的组合物，其中的ARA在活饲料中以可食用的海洋生物体存在。
15.根据权利要求1或2的组合物，其额外含有C18、C20或C22ω-3或者ω-6多不饱和脂肪酸(PUFA)。
16.根据权利要求15的组合物，其中的PUFA包含DHA、GLA和/或EPA。
17.一种制备海洋饲料组合物的方法，包括将微生物来源的花生四烯酸(ARA)或者呈甘油三酯形式的ARA与一种或多种饲料组分和/或者成分混合。
18.一种用于促进海洋生物体生长和/或者色素形成的方法，包括用权利要求1或2中定义的海洋饲料组合物喂养生物体。
19.根据权利要求18的方法，其中的海洋生物体是桡足亚纲或者头足纲、软体动物门、甲壳纲亚门、瘦虾属或者褐虾属。
20.根据权利要求18的方法，其中的生物体是贻贝、牡蛎、鱿鱼、墨鱼、章鱼、蝲蛄、对虾、小虾、鲱鱼、大菱鲆、大比目鱼、大马哈鱼、鳟鱼、鲷、鳎鱼、鲈鱼、比目鱼、嘉鱼、龙虾或蛤。
21.一种喂养海洋生物体的方法，包含给生物体供应权利要求1或2中任一项的饲料组合物。
22.根据权利要求21的方法，其中的海洋生物体是桡足亚纲或者头足纲、软体动物门、甲壳纲亚门、瘦虾属或者褐虾属。
23.根据权利要求21的方法，其中的生物体是贻贝、牡蛎、鱿鱼、墨鱼、章鱼、蝲蛄、对虾、小虾、鲱鱼、大菱鲆、大比目鱼、大马哈鱼、鳟鱼、鲷、鳎鱼、鲈鱼、比目鱼、嘉鱼、龙虾或蛤。
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