CN1318453C - 荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物,其中R1为荧光基团,R2为烷基链,n为聚合度,分子量小于200kDa,壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代,取代度为1~50%,带有正电荷,zeta电位在5~80mV,粒径在5~1000nm。本发明取低分子量壳寡糖水溶液与脂肪酸、交联偶合剂反应,再与异硫氰基基团荧光标记在冰浴、避光和磁力搅拌条件下,反应5~48小时得荧光标记疏水改性壳寡糖,将其超声分散于水中,制备得到聚合物胶团微粒。本发明是一种具有生物降解、荷正电、低毒等特性的疏水改性壳寡糖,可作为细胞器靶向微粒载体在制备靶向药物中应用,也可作为荧光信号放大载体,在替代传统基因芯片的荧光标记中应用。本发明结构通式:
Description
技术领域
本发明属化合物制备方法,涉及荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法及作为纳米级胶团微粒载体在生命科学领域中的应用。
背景技术
近年来,微粒载体在药物靶向领域得到了越来越多的关注和应用。如研究较多的脂质体、纳米粒、微球和聚合物胶团等。这些微粒载体由于其粒径小、可在体内长循环、生物相容性好以及透过生物膜等特性,被认为是一种优良的靶向给药系统。特别在大分子药物以及基因给药方面具有独特的优点,是当前研究领域的热点。
药物靶向治疗学将药物靶向治疗分为三个发展阶段。早期为组织器官靶向,如利用微粒的小粒径被动靶向到肝等组织,通过“增强的透过及滞留效应”(enhanced permeability and retention effect)聚集到肿瘤组织等。随后,药物靶向治疗发展到细胞靶向。最近,有学者开始提出细胞器靶向概念,主要用于细胞器病变引起的疾病,如线粒体病等。
目前,已经有研究者进行了微粒载体的细胞摄取研究。Lee等人研究了聚组氨酸-聚乙二醇(polyHis-b-PEG)微粒的细胞摄取过程。但对于微粒的细胞摄取机制、在细胞内转运途径、以及如何实现所携带药物的细胞内释放等内容,还有待进一步研究。
壳聚糖是一种具有生物相容性、生物可降解、低毒的天然聚阳离子多糖。几十年来,壳聚糖被广泛应用于药物辅料、止血材料、组织工程支架等。市售壳聚糖存在分子量大(数十万),粘度高,无法在生理pH(7.4)条件下溶解等缺点。近年来,人们开始研究可溶性壳寡糖(即低分子壳聚糖)的理化性质及其应用。
已经进行的壳聚糖结构改性研究,主要涉及对高分子水难溶性壳聚糖结构的亲水性修饰,如N-羧甲基化,嫁接PEG分子等;在壳聚糖分子上同时嫁接亲水和疏水基团,制备具有两亲性质的材料;以及嫁接功能性基团如乳糖分子等达到靶向作用。随着壳寡糖研究的开展,两亲性壳寡糖的合成与理化性质研究,及其在工业、生物医学、农业等方面的应用,开始引起人们的广泛重视。
发明内容
本发明的一个目的是提供荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物,具有如下结构通式:
其中R1为荧光基团,R2为烷基链,n为壳寡糖的聚合度,壳寡糖的分子量小于200kDa,壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代,氨基取代度为1~50%,带有正电荷,zeta电位在5~80mV,粒径在5~1000nm,共价结合荧光分子。
本发明的第二个目的是提供荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法,通过以下方案实现:
(1)疏水改性壳寡糖制备:取市售分子量为450kDa的高分子量的壳聚糖(90~95%脱乙酰度),在55~60℃和pH5.0条件下搅拌溶解,按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶降解,过滤除去杂质,按照使用要求,分别从分子量0.10kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa的超滤膜中,选择合适的超滤膜超滤分级,超滤液冷冻干燥,得分子量小于200kDa(优选壳寡糖为0.1~50kDa)、脱乙酰度大于80%的低分子量壳寡糖,凝胶渗透色谱法测定分子量。取上述壳寡糖水溶液,按照壳寡糖、脂肪酸、交联偶合剂碳二亚胺摩尔比1∶1~50∶1~50,控制50℃~90℃,反应5~48小时。终反应液透析纯化,冷冻干燥得到疏水改性壳寡糖;脂肪酸选自豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山萮酸等中任一种。
(2)荧光标记疏水改性壳寡糖制备:取疏水改性壳寡糖水溶液,按照疏水改性壳寡糖∶异硫氰基基团荧光标记物摩尔比1∶1~50,在冰浴、避光和磁力搅拌条件下,反应5~48小时。终反应液透析纯化,冷冻干燥得到荧光标记疏水改性壳寡糖。异硫氰基基团荧光素选自异硫氰基荧光素或四甲基异硫氰酸罗丹明。
(3)荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物胶团的制备:按1~10000∶1000(mg/ml,w/v)的比例,将荧光标记疏水改性壳寡糖超声分散于水中,制备得到聚合物胶团微粒。
由于壳聚糖本身的分子量较大,为改善其水溶性,以往的研究主要通过嫁接亲水基团(如磺酸基)来实现。这种嫁接方式,除了能够在一定程度上增加材料的溶解性能以外,并不能带来材料使用功能上的显著改进。降低壳聚糖的分子量,显然有利于改进壳聚糖本身在水性介质,特别是在较高pH环境下的溶解性能。在本发明中,首先选用低分子量壳寡糖。研究中发现,分子量小于200kDa的壳寡糖,具备了良好的在较高pH环境下的水溶性,且细胞毒性随分子量的下降而显著降低。从而扩大了壳聚糖的应用领域,能作为优良的药物载体材料。
本发明所述的壳寡糖为分子量分布比较窄、理化性质相对稳定的低分子量壳寡糖。由于高分子量壳寡糖在经过酶降解后,分子量分布比较宽,本发明通过不同截留分子量的超滤膜分级,得到不同分子量段的壳寡糖,其中优选的壳寡糖分子量为0.1~50kDa
本发明中,所选取的主要原材料壳寡糖,源于自然界甲壳类动物,具有低毒、可生物降解的特性。嫁接用脂肪酸,为人类日常食物的重要组成成分。嫁接反应采用碳二亚胺交联法,该法大量应用于生化领域,反应条件温和,易于控制,其反应副产物可通过透析法方便除去,可保证生成产物的生物相容性。
本发明中,制备胶团载体的方法简单。由于嫁接物本身具有独特的双亲结构,具有适当亲水亲油基比例的两亲聚合物,在水中自发聚集形成聚合物胶团。优化条件下制备得到的改性壳寡糖,在去离子水中形成胶团的粒径小于100nm,表面zeta电位为正值。
本发明的第三个目的是提供荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物胶团作为细胞器靶向微粒载体在制备靶向药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物胶团作为荧光信号放大的载体,在替代传统基因芯片的荧光标记中应用。
本发明的有益之处是:提供的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物胶团,是一种具有优良细胞器靶向的微粒载体,可应用于生命科学领域与制药领域。利用这种载体,可用于载体本身在细胞内各个细胞器的靶向分布研究;探索大分子物质进入细胞的途径和机制;为开拓细胞器靶向药物治疗,提供理论与技术基础。
本发明中,采用胶团的荧光标记技术,为研究胶团在细胞内的分布与靶向,提供了必要的技术手段。胶团本身具备独特的核-膜结构,并且带有正电荷,将为药物载体技术的发展,特别是携带一些生物大分子进入细胞及特定的细胞器,奠定比较坚实的工作基础。研究中发现,与细胞共孵育后,该微粒快速被细胞摄取,具有细胞器靶向功能,本发明制备得到的胶团,可靶向性地聚集到某些细胞器。荧光标记胶团可通过自身的正电荷,可携带蛋白质或活性生物分子,进入药物作用靶点;通过荧光示踪技术,可应用于这种胶团作为大分子药物载体的功能与机理重要探索手段。为研究大分子物质的细胞转运及其代谢途径提供良好的技术手段,同时也为开拓细胞器靶向药物治疗提供技术基础。
本发明合成的荧光标记的胶团,也可作为荧光信号放大的载体,在生命科学的前沿领域用途十分广泛。可作为基因芯片的荧光信号载体,成为基因组学研究的有力工具。由于原有的基因芯片技术中采用的荧光标记手段存在很多缺点,如荧光信号弱、检测技术高、设备价格昂贵且效率低等。本发明采用荧光标记的胶团与生物分子尺度相当,可结合于DNA上,替代传统基因芯片的荧光标记手段,为其临床应用铺平道路。
本发明提供的这种微粒载体的制备方法,方法简单。所选取的主要原材料壳寡糖,源于自然界甲壳类动物,具有低毒、可生物降解的特性。
附图说明
图1为与荧光标记胶团孵育30min后的A549细胞摄取照片。
图2为A549细胞摄取荧光标记胶团后细胞内荧光强度的变化。
具体实施方式
实例一:
1、壳寡糖的制备
壳聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25%(v/v)的盐酸水溶液中,55~60℃条件下搅拌溶解,用稀氨水或稀盐酸调pH至5.0,按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶,控制反应时间8小时后,将反应产物4000r×min-1离心10分钟,上清液用0.45μm微孔滤膜预处理,以不同分子量的超滤膜超滤分级,超滤液冷冻干燥,得到一定分子量的壳寡糖。并由凝胶渗透色谱法测定平均分子量为50.6kDa。
2、荧光标记疏水改性壳寡糖的制备
取上述壳寡糖5.0g,精密称定。加40ml双蒸水搅拌溶解后,加入碳二亚胺30mg,搅拌溶解。将0.35g的豆蔻酸,加至10ml甲醇溶液中,超声溶解后,加至上述壳寡糖溶液中,在400r·min-1磁力搅拌条件下,控制温度60℃,反应时间24h以上。终反应液置透析袋,双蒸水透析24h,除去反应副产物。透析液冷冻干燥制备得到疏水改性壳寡糖。
疏水改性后壳寡糖的氨基取代度,采用三硝基苯磺酸法测定。取不同量的壳寡糖(0.5~9mg),精密称定,分别溶于2ml的重蒸水中,加入4%(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1%(w/v)的三硝基苯磺酸2ml,37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml,摇匀,在344nm波长处测定吸收值,制备标准曲线。取上述的壳寡糖4mg溶于2ml重蒸水,同法操作,测定344nm波长处的吸收值,按标准曲线计算其取代度为4.8%。
取0.1g四甲基异硫氰酸罗丹明和0.5g疏水改性壳寡糖,精密称定后分别溶解于60%乙醇溶液中。在冰浴、避光与磁力搅拌(400r·min-1)条件下,将疏水改性壳寡糖乙醇溶液,滴加到罗丹明溶液中,相同条件下继续反应10h。终反应液置透析袋,重蒸水透析24h,除去未反应罗丹明。透析液冷冻干燥,得荧光标记疏水改性壳寡糖。
3、荧光标记疏水改性壳寡糖胶团制备
取荧光标记疏水改性壳寡糖10mg,精密称定。加适量双蒸水水浴超声10min分散,定容至1000ml,得荧光标记疏水改性壳寡糖胶团溶液。
Zetasizer 3000HS分析仪测定粒径及表面电位。荧光标记疏水改性壳寡糖胶团的平均粒径为322.2nm;表面电位为40.9±0.1mV。
实例二:
1、壳寡糖的制备
壳聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25%(v/v)的盐酸水溶液中,55~60℃条件下搅拌溶解,用稀氨水或稀盐酸调pH至5.0,按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶,控制反应时间24小时,待反应结束后,将反应产物4000r×min-1离心10分钟,上清液用0.45μm微孔滤膜预处理,以不同分子量的超滤膜超滤分级,超滤液冷冻干燥,得到一定分子量的壳寡糖。并由凝胶渗透色谱法测定平均分子量为10.1kDa。
2、荧光标记疏水改性壳寡糖的制备
取0.5g壳聚糖(平均分子量10.1kDa),精密称定。加40ml双蒸水搅拌溶解后,加入碳二亚胺55mg,搅拌溶解。将0.08g的硬脂酸,加至10ml乙醇溶液中,超声溶解后,加至上述壳寡糖溶液中,在400r·min-1磁力搅拌条件下,控制温度60℃,反应时间24h以上。终反应液置透析袋,双蒸水透析24h,除去反应副产物。透析液冷冻干燥制备得到疏水改性壳寡糖,按实例一中的三硝基苯磺酸法测定,取代度为9.1%。
取40.0mg异硫氰基荧光素和0.5g疏水改性壳寡糖,精密称定后分别溶解于80%乙醇溶液中。在冰浴、避光与磁力搅拌(400r·min-1)条件下,将疏水改性壳寡糖乙醇溶液,滴加到异硫氰基荧光素溶液中,相同条件下继续反应24h。终反应液置透析袋,重蒸水透析24h,除去未反应荧光素。透析液冷冻干燥,得荧光标记疏水改性壳寡糖。
3、荧光标记疏水改性壳寡糖胶团制备
取荧光标记疏水改性壳寡糖20mg,精密称定。加适量双蒸水水浴超声10min分散,定容至100ml,得荧光标记疏水改性壳寡糖胶团溶液。
Zetasizer 3000HS分析仪测定粒径及表面电位。荧光标记疏水改性壳寡糖胶团的平均粒径为32.2nm,呈单峰分布;表面电位为51.6±0.2mV。
实例三:
1、壳寡糖的制备
壳聚糖(平均分子量450kDa)6g加至200mL 1.25%(v/v)的盐酸水溶液中,55~60℃条件下搅拌溶解,用稀氨水或稀盐酸调pH至5.0,按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶,控制反应时间20小时,待反应结束后,将反应产物4000r×min-1离心10分钟,上清液用0.45μm微孔滤膜预处理,以不同分子量的超滤膜超滤分级,超滤液冷冻干燥,得到不同分子量的壳寡糖。并由凝胶渗透色谱法测定平均分子量为18.8kDa。
2、荧光标记疏水改性壳寡糖的制备
取0.5g壳寡糖(平均分子量18.8kDa),精密称定。加40ml双蒸水搅拌溶解后,加入碳二亚胺0.12mg,搅拌溶解。将0.16g的硬脂酸,加至10ml乙醇溶液中,超声溶解后,加至上述壳寡糖溶液中,在400r·min-1磁力搅拌条件下,控制温度80℃,反应时间24h以上。终反应液置透析袋,双蒸水透析24h,除去反应副产物。透析液冷冻干燥制备得到疏水改性壳寡糖,按实例一中的三硝基苯磺酸法测定,取代度为17.8%。
取16.0mg异硫氰基荧光素和0.5g疏水改性壳寡糖,精密称定后分别溶解于16ml和20ml 50%乙醇溶液中。在冰浴、避光与磁力搅拌(400r·min-1)条件下,将疏水改性壳寡糖乙醇溶液,滴加到异硫氰基荧光素溶液中,相同条件下继续反应24h。终反应液置透析袋,重蒸水透析24h,除去未反应异硫氰基荧光素。透析液冷冻干燥,得荧光标记疏水改性壳寡糖,待用。
3、荧光标记疏水改性壳寡糖胶团制备
取荧光标记疏水改性壳寡糖40mg,精密称定。加适量双蒸水水浴超声10min分散,定容至20ml,得荧光标记疏水改性壳寡糖胶团溶液。
Zetasizer 3000HS分析仪测定粒径及表面电位。荧光标记疏水改性壳寡糖胶团的平均粒径为28.9nm,呈单峰分布;表面电位为50.9±0.1mV。
以A549细胞为模型细胞,在37℃,5%CO2条件下培养细胞至呈对数生长期后,离心收集后,按每孔1×105个细胞的密度接种24孔培养板,孵箱内预培养24小时。在培养液中加入荧光标记疏水改性壳寡糖胶团溶液孵育。胶团浓度控制为50~300μg·ml-1。培养一定时间后,用荧光倒置显微镜观察,并定时收集细胞,细胞裂解后用荧光光度计测定细胞内液的荧光值。
研究结果表明,孵育30min后,胶团开始分布到细胞内,并靶向细胞核,参见图1、图2,图2显示,当载体浓度为50μg·ml-1时,孵育15min时的细胞内荧光强度值为8.33;2h后,荧光强度增加到11.83,相应的,当胶团浓度为300μg·ml-1时,细胞内的荧光强度从34.45增加到78.69,可见胶团的细胞摄取具有时间和浓度依赖性,随着孵育时间和胶团浓度的增加,细胞摄取呈现增加的趋势。
无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此,前而的实施方案应理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (7)
1、荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物,具有以下结构通式:
壳寡糖的分子量小于200kDa,壳寡糖链上的部分自由氨基被烷基取代,氨基取代度为1~50%,其中R1为荧光基团,R2为烷基链,n为壳寡糖的聚合度,带有正电荷,zeta电位在5~80mV,粒径在5~1000nm,共价结合荧光分子。
2、根据权利要求1所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法,其特征是通过以下步骤实现:
(1)疏水改性壳寡糖制备:取分子量450kDa,90~95%脱乙酰度的壳寡糖,在55~60℃和pH5.0条件下搅拌溶解,按纤维素酶与壳聚糖重量比为0.5∶100加入纤维素酶降解,过滤除去杂质,以超滤膜超滤分级,滤液冷冻干燥,得分子量小于200kDa、脱乙酰度大于80%的低分子量壳寡糖,凝胶渗透色谱法测定分子量,取上述壳寡糖水溶液,按照壳寡糖、脂肪酸、交联偶合剂碳二亚胺摩尔比1∶1~50∶1~50,控制50℃~90℃,反应5~48小时,终反应液透析纯化,冷冻干燥得到疏水改性壳寡糖;
(2)荧光标记疏水改性壳寡糖制备:取疏水改性壳寡糖水溶液,按照疏水改性壳寡糖、异硫氰基基团荧光标记物摩尔比1∶1~50,在冰浴、避光和磁力搅拌条件下,反应5~48小时,终反应液透析纯化,冷冻干燥得到荧光标记疏水改性壳寡糖,其中壳寡糖、脂肪酸及异硫氰基基团荧光标记物的摩尔比为1∶1~50∶1~50;
(3)荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物胶团制备:按1~10000∶1000mg/ml,w/v的比例,将荧光标记疏水改性壳寡糖超声分散于水中,制备得到聚合物胶团微粒。
3、根据权利要求2所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法,其特征是:步骤(1)壳寡糖为0.1~50kDa的低分子量壳寡糖。
4、根据权利要求2所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法,其特征是:步骤(1)脂肪酸选自豆蔻酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、山萮酸中任一种。
5、根据权利要求2所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物的制备方法,其特征是:步骤(2)中异硫氰基基团荧光标记物为异硫氰基基团荧光素或四甲基异硫氰酸罗丹明。
6、根据权利要求1所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物作为细胞器靶向微粒载体在制备靶向药物中的应用。
7、根据权利要求1所述的荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物作为荧光信号放大的载体在替代传统基因芯片的荧光标记中应用。
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