CN113698555A - pH/组织蛋白酶B逐级响应聚合物-药物结合物、胶束、及其制备方法和用途 - Google Patents

pH/组织蛋白酶B逐级响应聚合物-药物结合物、胶束、及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一系列具有pH/组织蛋白酶B逐级响应特性的聚合物‑药物结合物、胶束、及其制备方法和用途。所述聚合物‑药物结合物由亲水链段和疏水链段两部分组成，亲水链段主要由聚乙二醇等强亲水性聚合物构成，疏水链段则由如结构式1所示的具有叔氨基结构的聚烷基氨基丙烯酸酯单元和具有Gly‑Phe‑Leu‑Gly多肽连接臂的药物前体单元组成，其中，各个符号如说明书中所定义。此外，本发明还提供所述聚合物‑药物结合物、胶束在肿瘤和炎性疾病的化学治疗以及与免疫治疗和光动力治疗联合应用中的用途。
Figure DDA0002503155910000011

Description

pH/组织蛋白酶B逐级响应聚合物-药物结合物、胶束、及其制 备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及具有pH/组织蛋白酶B逐级响应药物释放特性的聚合物-药物结合物、胶束和胶束组合物，其制备方法及其医药用途。
背景技术
纳米药物是基于纳米技术、材料化学、药剂学以及临床医学等学科发展起来的新型药物递送技术，现已广泛应用于各种疾病的预防、诊断和治疗中。通过药物的纳米化设计，可显著改善药物的体内药动学特征和组织分布，提高药物的递送效率和治疗效能，在临床研究中显示出较大潜力。聚合物-药物结合物是将药物分子通过化学共价键与聚合物大分子相连接而形成的一种药物递送体系，既属于纳米药物递送领域，又可归属于聚合物疗法范畴。和传统纳米药物的物理性包覆相比，聚合物-药物结合物在递送过程中具有更优良的稳定性，并且可有效避免药物早期突释，提高递送可控性。如将疏水性药物分子连结到亲水性聚合物大分子上会极大的提高其水溶性，使其免受机体调理蛋白清除，提高其血液循环时间。此外，两亲性聚合物的自组装胶束化过程会使疏水性药物被包裹于胶束内核，有效避免了外界环境的刺激和降解。
纳米尺度的聚合物-药物结合物可通过肿瘤组织的EPR效应被动靶向于肿瘤部位，从而提高药物在肿瘤组织的浓度。但是，诸多研究也表明这种局部药物浓度的增加并没有带来疗效的显著提升。纳米药物因其在复杂的肿瘤微环境深部递送的巨大阻力使其对实体肿瘤组织的渗透和分布能力均较差，极大地限制了其临床转化。另有研究表明，具有超小粒径(<6nm)的纳米粒子因其较小的扩散阻力而显示出对实体瘤组织较强的渗透和分布能力，但是，这种超小纳米尺寸的聚合物-药物结合物体内清除率快，靶组织蓄积能力较差，无法充分发挥纳米药物的治疗优势。因此，如何利用病灶部位的独特微环境，结合不同粒径范围的纳米药物的递送优势，开发新型的聚合物-药物结合物系统对于提高药物递送效率和治疗效能，降低药物毒副作用具有重要的科学意义。
近年来，越来越多的研究者开始将智能响应型递药技术应用于聚合物-药物结合物的设计和开发中，构建具有内源性或外源性智能“开关”效应的聚合物-药物结合物体系，既能够使结合物体系在血液循环中维持足够的稳定性，提高血液循环时间和肿瘤蓄积，又能使蓄积在肿瘤组织的结合物体系在内源性或外源性刺激因子的作用下发生理化性质改变，提高其对肿瘤深部的渗透和分布，达到提高药效的目的。然而，目前报道的智能响应型聚合物-药物结合物体系对体内的疾病信号响应性差、促渗透能力较弱，需要开发具有更快信号响应速度和更强促渗透能力的新型智能响应型聚合物-药物结合物体系。
为了改善现有技术存在的不足，克服药物递送胞外和胞内双重障碍，本发明人经过深入探索，从而实现了本发明。
发明内容
本发明提供一系列具有快速酸响应解散促渗透效应和高效胞内释药能力的pH/组织蛋白酶B逐级响应聚合物-药物结合物、包含该结合物制备的胶束、胶束组合物，及其制备方法和医药用途。
本发明所述聚合物-药物结合物中，药物分子(比如化疗药物)通过Gly-Phe-Leu-Gly多肽连接臂共价连结在结合物骨架的疏水链段。在正常生理条件下，药物分子可通过聚合物-药物的自组装而隐藏于胶束的内核，避免被机体降解和对正常组织的毒副作用，而在疾病组织中特异性实现药物在胞外和胞内的pH/组织蛋白酶B逐级响应释放，克服小分子药物递送屏障，提高递送效率和治疗效能。本发明的聚合物-药物结合物为肿瘤和炎性疾病的化学治疗提供了更加安全、可靠的用药选择。此外，该结合物也可与免疫治疗和光动力治疗联合应用从而增强其疗效。
本发明的目的在于提供一种具有pH/组织蛋白酶B逐级响应药物释放特性的聚合物-药物结合物。
本发明所述的聚合物-药物结合物，由亲水链段和疏水链段两部分组成。
其中，亲水链段选自聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸甲酯磷脂酰胆碱中的一种或多种。
其中，疏水链段具有如结构式1所示结构：
Figure BDA0002503155890000021
其中，R’、R”、R”’、X1，X2分别选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基；
R””是聚合反应产生的端基，选自硫醇、硫酯、烷基、环烷基、芳香基，或者端基取代基团，选自荧光分子、光热探针或金属螯合基团。
R1、R2、R3、R4四个基团可相同也可不同，分别选自C1-C16烷基，C1-C16环烷基、C1-C16芳香基、C1-C16杂芳香基以及上述取代基团；
a和b分别为1～10的整数；
x和y均为整数，其和为20～200的整数；
z为1～10的整数，且x，y，z三个单元可按任意顺序组合排列；
F为活性药物分子，各个F可不同。
其中，R’、R”、R”’可以相同或不同，分别为C1-C6烷基；X1，X2分别为氢；R””为三硫代酯。
R1、R2、R3、R4可以相同或不同，分别为C1-C6烷基；a和b分别为1～5的整数；x和y均为整数，其和为60～100的整数；其他符号如上所述。
其中，活性药物分子选自化疗药物、光敏剂、荧光淬灭剂、免疫治疗药物和光热探针。
其中，活性药物分子是化疗药物。
本发明所述的聚合物-药物结合物，其具有如结构式2所示结构：
Figure BDA0002503155890000031
其中，Y1可选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基，羧基及其活泼酯基团、金属螯合基团和马来酰亚胺酯基团；
n为5～500的整数；
其他符号同上所示。
优选的，其中，Y1为C1-C6烷基；n为50-150的整数；其他符号同上所示。
优选的，本发明所述的聚合物-药物结合物，其具有如结构式3所示结构：
Figure BDA0002503155890000032
Figure BDA0002503155890000041
其中，R1’、R2’选自如下结构：
Figure BDA0002503155890000042
R””为三硫代酯。
x和y之和为70～90；
F同上所定义。
其中，活性药物分子选自紫杉烷类以及非紫杉烷类化疗药物。
本发明的另一个目的在于提供聚合物-药物结合物的合成方法。
本发明所述的聚合物-药物结合物的合成方法，包括：RAFT聚合技术合成聚合物-药物结合物大分子及RAFT聚合物端基修饰技术。
本发明的另一个目的在于提供聚合物-药物结合物胶束。
本发明所述聚合物-药物结合物胶束由一种或多种聚合物-药物结合物在水介质中通过自组装过程而形成。
本发明所述的聚合物-药物结合物胶束，其包括活性药物为化疗药物的聚合物-药物结合物。
本发明所述的聚合物-药物结合物胶束，其中，化疗药物为多西他赛DTX。
本发明胶束组合物，其包含聚合物-药物结合物胶束。
本发明的另一个目的在于提供聚合物-药物结合物在制备治疗恶性肿瘤和炎性疾病的药物中的应用。
本发明所述的聚合物-药物结合物胶束在制备治疗恶性肿瘤和炎性疾病的药物中的应用。
本发明所述的聚合物-药物结合物胶束与其他药物组合应用时在制备治疗恶性肿瘤和炎性疾病的药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优势：
1.本发明提供的具有肿瘤微环境快速酸响应解散促渗透效应和高效胞内释药能力的pH/组织蛋白酶B逐级响应聚合物-药物结合物胶束，能够有效克服药物递送胞外和胞内双重障碍，实现活性药物的精准胞内递送，并实现有效胞内释放。
2.本发明提供的聚合物-药物结合物胶束能够在血液循环和正常组织中保持足够的稳定性，并避免药物释放，有效降低药物对正常组织的毒副作用；而在疾病组织中实现对微酸环境的快速响应，胶束解散促渗透，提高药物递送效率和治疗效能。
3.本发明合成方法简单、可靠，并可与多种治疗策略结合，实现协同抗肿瘤效应。例如，化疗与免疫治疗联合，化疗和光热治疗联合等。
附图说明
图1为实施例2中合成的聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX的高效液相色谱(A)和核磁共振氢谱(B)。
图2为实施例2中合成的聚合物-药物结合物PEG-PEPA-DTX的高效液相色谱(A)和核磁共振氢谱(B)。
图3为实施例2中合成的聚合物-药物结合物PEG-PDBA-DTX的高效液相色谱(A)和核磁共振氢谱(B)。
图4为实施例2中合成的聚合物-药物结合物PEG-PCHA-DTX(A,B)，PEG-PDPA-DTX(C,D)，PEG-iPDPA-DTX(E,F)及PEG-PEHA-DTX(G,H)的高效液相色谱和核磁共振氢谱。
图5为实施例2中合成的聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX在木瓜蛋白酶裂解前后的高效液相色谱。
图6为实施例3中合成的聚合物-药物结合物Cy5-PEG-PC7A-DTX和Cy5-PEG-PCHA-DTX的紫外吸收光谱(A)，实施例4中制备的Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束和Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束随pH值变化的荧光吸收比率变化图(B)，以及Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束(C)和Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束(D)在pH 7.4和pH 6.6条件下的荧光发射光谱。
图7为实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束在pH 7.4和pH6.6条件下的粒径分布变化图(A)和电位变化图(B)。
图8为实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束在pH 7.4和pH6.6条件下的电镜图。
图9为实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束(A)和PEG-PCHA-DTX胶束(B)在不同介质中DTX累计释放量(％)-时间(h)曲线。
图10为采用CCK-8法检测实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束在pH 7.4(A)和pH 6.6(B)孵育条件下对4T1细胞的细胞毒作用。
图11为采用流式细胞术检测实施例4中制备的Cy5标记的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束在pH 7.4和pH 6.6孵育条件下在4T1细胞中的摄取。
图12为采用激光共聚焦显微镜研究实施例4中制备的Cy5标记的PEG-PC7A-DTX胶束在pH 7.4和pH 6.6孵育条件下在4T1细胞中的溶酶体共定位现象，比例尺：25μm。
图13为采用激光共聚焦显微镜层切技术考察实施例4中制备的Cy5标记的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束在pH 7.4和pH 6.6孵育条件下对体外4T1细胞肿瘤球的渗透能力，比例尺：100μm。。
图14为实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束、市售处方Tasotere及空白胶束PEG-PC7A和PEG-PCHA在动物水平对荷4T1肿瘤的BALB/c小鼠模型的体内抗肿瘤效果。
图15为实施例4中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和免疫检查点抑制剂α-PD-1在动物水平对荷B16OVA肿瘤的C57BL/6小鼠模型的联合抗肿瘤效果。
具体实施方式
本发明提供具有pH/组织蛋白酶B逐级响应药物释放特性的聚合物-药物结合物，由亲水链段和疏水链段两部分组成。
其中，聚合物-药物结合物的亲水链段选自聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸甲酯磷脂酰胆碱中的一种或多种，优选聚环氧乙烷或聚乙二醇。
聚合物-药物结合物的疏水链段如结构式1所示结构：
Figure BDA0002503155890000061
其中，R’、R”、R”’、X1，X2分别选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基；R’、R”、R”’优选C1-C6烷基，更优选-CH3，X1，X2优选-H。
R””是聚合反应产生的端基，选自硫醇、硫酯、烷基、环烷基、芳香基，或者端基取代基团，优选硫酯。在一些实施方式中，R””为荧光基团，例如，Cy5,Cy7.5或TAMRA。
R1、R2、R3、R4四个基团分别选自C1-C16烷基，C1-C16环烷基、C1-C16芳香基、C1-C16杂芳香基以及上述取代基团，优选C1-C6烷基，更优选C2-C4烷基，四者可以相同，也可以不同，可以是直链烷基如乙基、丙基、丁基，也可以是支链烷基如异丙基。
a和b分别为1～10的整数，优选1～5，更优选为2；
x和y均为整数，其和为20～200的整数，其和优选60～150，更优选为70～90；
z为1～10的整数，优选为1～5，更优选为2～3；
x，y，z三个单元可按任意顺序组合排列；
F为活性药物分子，可选自化疗药物、光敏剂、荧光淬灭剂、免疫治疗药物和光热探针。各个F可不同。
其中，所述的化疗药物选自多西他赛、紫杉醇、多柔比兴、表阿霉素、喜树碱、羟基喜树碱中的一种或多种，优选紫杉烷类药物多西他赛和紫杉醇。
所述的光敏剂选自二氢卟吩、焦脱镁叶绿酸a、维替泊芬、光克洛、单天冬胺酰基卟吩等卟啉类光敏剂，以及阳离子型光敏剂、醌类光敏剂、姜黄素类光敏剂等非卟啉类光敏剂。
所述的荧光淬灭剂选自QSY、QXL、DABCYL、DABSYL。
所述免疫治疗药物选自toll样受体激动剂，如CpG、R848，或小分子IDO抑制剂等。
所述光热探针选自ICG、IR780、IR783、Cy7.5、IR808等小分子探针。
在一些实施方式中，本发明所提供的聚合物-药物结合物，具有如结构式2所示结构：
Figure BDA0002503155890000071
其中，Y1可选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基，羧基及其活泼酯基团、金属螯合基团和马来酰亚胺酯基团，优选C1-C6支链烷基。
n为5～500的整数，优选112；
其他符号如结构式1中所示。
在一些实施方式中，本发明所提供的聚合物-药物结合物，具有如结构式3所示结构：
Figure BDA0002503155890000081
其中，R1’、R2’选自如下结构：
Figure BDA0002503155890000082
其他符号如结构式1中所示。
本发明还提供了上述聚合物-药物结合物的合成方法，包括RAFT聚合技术合成聚合物-药物结合物大分子及RAFT聚合物端基修饰技术。
例如，本发明的聚合物-药物结合物可通过如下步骤进行合成：
步骤一：大分子链转移剂的合成
Figure BDA0002503155890000083
将端基为-COOH的RAFT小分子链转移剂和端基为Y1的聚乙二醇(另一端为未经修饰的羟基)溶于二氯甲烷中，随后向反应液中加入催化量的4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺。室温避光反应36-72小时后，过滤除去沉淀，有机滤液旋蒸浓缩，用冰乙醚沉淀纯化数次，干燥即得聚乙二醇大分子链转移剂。
步骤二：聚合物-药物结合物的RAFT聚合
Figure BDA0002503155890000091
将“步骤一”所得到的具有RAFT试剂端基的聚乙二醇大分子链转移剂与各丙烯酸酯单体及前药单体以特定摩尔比混合，用适量的N,N-二甲基甲酰胺或1,4二氧六环溶解，然后加入相当于聚乙二醇大分子链转移剂1/2-1/10摩尔当量的引发剂偶氮二异丁腈，混合均匀后，冷冻-充氮气-融化循环3次除氧，反应置于60-90℃反应6-48小时，在反应终点，反应产物首先于N,N-二甲基甲酰胺透析48-72小时除去未反应的小分子，然后对蒸馏水透析，冷冻干燥即得聚合物-药物结合物。
其中，X1，X2、Y1，X2、R1、R2、R3、R4、R’、R”、R”’、R””、n、x、y、z、a、b等符号如上所述。
本发明还提供聚合物-药物结合物前体大分子的端基荧光修饰策略。荧光分子选自：Cy5,Cy7.5,TAMRA等，优选Cy5。
例如，本发明的Cy5端基荧光修饰的聚合物-药物结合物可通过如下步骤进行合成：
步骤一：聚合物-药物结合物的端基氨解
Figure BDA0002503155890000101
称取一定量RAFT聚合技术得到的聚合物-药物结合物前体大分子溶于甲醇中，超声溶解，氮气氛围下，加入10-50倍摩尔当量的正丁胺和1-5倍摩尔当量的三丁基膦，反应于氮气条件下室温搅拌4-8小时。反应结束后，乙醚沉淀，洗涤，真空干燥即得端巯基化聚合物-药物结合物。
步骤二：端巯基化聚合物-药物结合物的Cy5偶联
Figure BDA0002503155890000102
将上述“步骤一”所得到的端巯基化聚合物-药物结合物于氮气氛围下溶于甲醇中，然后加入2-4倍摩尔当量的马来酰亚胺化Cy5和3-6倍摩尔当量的三乙胺，超声溶解，使混合均匀，反应体系于室温继续搅拌24-48小时。反应液过Sephadex LH20凝胶柱(甲醇为洗脱剂)纯化，产物冻干即得Cy5端基修饰的聚合物-药物结合物。
其中，X1，X2、Y1，X2、R1、R2、R3、R4、R’、R”、R”’、R””、n、x、y、z、a、b等符号如上所述。
本发明的另一方面提供包含一种或多种本发明的聚合物-药物结合物通过自组装过程而形成的胶束。
本发明的胶束包括活性药物为化疗药物的聚合物-药物结合物，以及选自光敏剂、荧光淬灭剂、免疫治疗药物和光热探针中的一种或多种。含有不同活性分子的聚合物-药物结合物的摩尔比可以为100:1～1:100，其比例可按需调整。
在本发明的胶束中，化疗药物可通过前药单体的方式通过RAFT聚合连结到聚合物骨架上，在某些实施方式中，包含多西他赛的聚合物-药物结合物胶束的粒径约30～50nm。
本发明的聚合物-药物结合物胶束的制备方法，可采用去溶剂法、薄膜超声法、乙醇注入法等，优选去溶剂法。
例如，本发明的聚合物-药物结合物胶束可通过如下步骤进行制备：
步骤一：分别按一定比例称取一种或多种聚合物-药物结合物，加入适量有机溶剂超声溶解，备用；
步骤二：取体积比为10-100的超纯水，在探头超声条件下，将“步骤一”所得溶液快速加入至超纯水中，持续超声1-3分钟；
步骤三：将超声结束后含有机溶剂的胶束溶液转移至超滤管中，用超纯水超滤3～5次，用以除去有机溶剂。离心除去不溶部分，即获得胶束溶液。
优选，在上述本发明的胶束中，活性小分子为化疗药物多西他赛。
上述本发明胶束制备中的“步骤一”所述的有机溶剂优选：四氢呋喃、甲醇、乙腈及其混合液，更优选甲醇；“步骤二”中超纯水和有机溶剂的比例优选10-30，更优选20；步骤二”中持续超声时间优选1-2分钟，更优选1分钟；“步骤三”中持续超滤次数优选4-5分钟，更优选4次；
优选，本发明的上述含多西他赛的聚合物-药物结合物胶束可通过如下步骤进行制备：
步骤一：称取含多西他赛的聚合物-药物结合物5mg于200μL的甲醇中，超声溶解，备用；
步骤二：取4mL超纯水于EP管中，在探头超声条件下，将“步骤一”所得的200μL聚合物-药物结合物甲醇溶液快速加入至超纯水中，持续超声1分钟；
步骤三：将超声结束后的胶束溶液转移至100kD超滤管中，用超纯水超滤4次(4000rpm,15min)，用以除去甲醇。以10000rpm转速离心10min除去不溶部分，上清转移至新的EP管中即得含多西他赛的聚合物-药物结合物胶束溶液。
本发明还提供了上述聚合物-药物结合物胶束在肿瘤治疗领域的医药用途。
本发明通过以下具体的实施例对本发明所涉及的内容进行说明和阐释，但本发明不受这些具体实施例的内容限定。
在以下实施例中，除非另有说明，各个符号或简称代表的含义如下所示：
PEG-OH：单甲基封端聚乙二醇
Figure BDA0002503155890000111
PEG-CTA：大分子链转移剂
Figure BDA0002503155890000112
CTA：三硫代酯链转移剂
Figure BDA0002503155890000121
C7A：单体结构为
Figure BDA0002503155890000122
CHA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000123
EPA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000124
DPA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000125
iDPA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000126
DBA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000127
EHA：单体结构为
Figure BDA0002503155890000128
MA-GFLG-DTX：单体结构为
Figure BDA0002503155890000129
DTX：多西他赛
Figure BDA0002503155890000131
Cy5-mal：马来酰化Cy5
Figure BDA0002503155890000132
实施例1：大分子链转移剂PEG-CTA的合成
精密称取PEG-OH(5g，1mmol)和等摩尔当量的CTA于圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷，超声溶解，随后向反应液中加入0.1倍摩尔当量的4-二甲氨基吡啶和1.5倍摩尔当量的二环己基碳二亚胺。室温避光反应36小时后，超滤除去沉淀，有机滤液用旋转蒸发仪将反应液浓缩至10mL。产物于冰乙醚中纯化3次，即得到4.2g大分子链转移剂PEG-CTA，产率为84％。
实施例2：聚合物-药物结合物的RAFT聚合和结构表征
1.聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX的合成
称取“实施例1”中的PEG-CTA(50mg，0.01mmol)于反应瓶中，加入100倍摩尔当量的C7A单体和5倍摩尔当量的MA-GFLG-DTX前药单体，用1mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，接着加入0.333倍摩尔当量的引发剂偶氮二异丁腈，超声使其充分溶解混匀。冷冻-充氮气-融化循环3次除氧，反应置于60℃反应36小时。反应终止后，将反应液转移至10kD的透析袋中用N,N-二甲基甲酰胺透析48小时除去未反应的单体及其他小分子，然后对蒸馏水透析12小时除去有机溶剂，透析产物经冷冻干燥即得聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX。纯化后的PEG-PC7A-DTX高效液相色谱及核磁共振氢谱如图1所示，从图1A中可以看出聚合物液相图呈单峰，表明结合物纯度良好，无游离药物，从图1B可计算出PEG-PC7A-DTX上C7A单体的数量为70，DTX载药量为～6.5％。
2.聚合物-药物结合物PEG-PEPA-DTX的合成
称取“实施例1”中的PEG-CTA(50mg，0.01mmol)于反应瓶中，加入100倍摩尔当量的EPA单体和5倍摩尔当量的MA-GFLG-DTX前药单体，用1mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，接着加入0.333倍摩尔当量的引发剂偶氮二异丁腈，超声使其充分溶解混匀。冷冻-充氮气-融化循环3次除氧，反应置于60℃反应36小时。反应终止后，将反应液转移至10kD的透析袋中用N,N-二甲基甲酰胺透析48小时除去未反应的单体及其他小分子，然后对蒸馏水透析12小时除去有机溶剂，透析产物经冷冻干燥即得聚合物-药物结合物PEG-PEPA-DTX。纯化后的PEG-PEPA-DTX高效液相色谱及核磁共振氢谱如图2所示，从图2A中可以看出聚合物液相图呈单峰，表明结合物纯度良好，无游离药物，从图2B可计算出PEG-PEPA-DTX上EPA单体的数量为90，DTX载药量为～8.0％。
3.聚合物-药物结合物PEG-PDBA-DTX的合成
称取“实施例1”中的PEG-CTA(50mg，0.01mmol)于反应瓶中，加入100倍摩尔当量的DBA单体和5倍摩尔当量的MA-GFLG-DTX前药单体，用1mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，接着加入0.333倍摩尔当量的引发剂偶氮二异丁腈，超声使其充分溶解混匀。冷冻-充氮气-融化循环3次除氧，反应置于60℃反应36小时。反应终止后，将反应液转移至10kD的透析袋中用N,N-二甲基甲酰胺透析48小时除去未反应的单体及其他小分子，然后对蒸馏水透析12小时除去有机溶剂，透析产物经冷冻干燥即得聚合物-药物结合物PEG-PDBA-DTX。纯化后的PEG-PDBA-DTX高效液相色谱及核磁共振氢谱如图3所示，从图3A中可以看出聚合物液相图呈单峰，表明结合物纯度良好，无游离药物，从图3B可计算出PEG-PDBA-DTX上DBA单体的数量为90，DTX载药量为～5.0％。
4.根据上述RAFT聚合方法，该实施例同时合成了以下聚合物-药物结合物：PEG-PCHA-DTX，PEG-PDPA-DTX，PEG-iPDPA-DTX，PEG-PEHA-DTX。各个聚合物-药物结合物的高效液相色谱及核磁共振氢谱如图4所示。从图4中可以看出聚合物液相图均呈单峰，无游离药物，表明结合物纯度良好。根据各聚合物-药物结合物的核磁共振氢谱确定PEG-PCHA-DTX，PEG-PDPA-DTX，PEG-iPDPA-DTX，PEG-PEHA-DTX的CHA、DPA、iDPA、EHA等单体的连结个数分别为70、90、90、90，其对应的聚合物-药物结合物的DTX载药量分别约为～7.0％、～6.0％、～9.0％、～9.0％。
5.采用木瓜蛋白酶降解法测定聚合物-药物结合物释放游离药物的能力，以上述实施例制备的PEG-PC7A-DTX为例，木瓜蛋白酶裂解前后用高效液相色谱对聚合物释放出来的游离DTX进行跟踪。结果表明，通过木瓜蛋白酶裂解，PEG-PC7A-DTX可有效释放出游离DTX，根据木瓜蛋白酶裂解数据，计算出的有效DTX载药量为5.73％，与核磁共振氢谱定量结果基本一致，说明方法可靠。聚合物-药物结合物经木瓜蛋白酶裂解前后的高效液相图谱如图5所示，从图中可以看出，裂解前聚合物的纯度良好，为单峰，而酶裂解之后，出现游离DTX峰。以上结果均证实MA-GFLG-DTX前药单体可与C7A单体共聚连结到大分子链转移剂上形成聚合物-药物结合物，并能够实现酶敏感响应，释放出游离DTX，聚合物合成方法可靠。
实施例3：Cy5端基荧光修饰聚合物-药物结合物的合成
本实施例中将荧光分子Cy5通过聚合物-药物结合物的端基连结到聚合物上，合成Cy5端基荧光修饰的聚合物-药物结合物。
所述的聚合物-药物结合物具有如下结构：
Figure BDA0002503155890000151
亲水嵌段为甲基封端PEG(Mw＝5000Da)，疏水链段侧链的R1’和R2”基团结构如下所示：
Figure BDA0002503155890000152
与荧光分子Cy5连结后，所述的Cy5端基荧光修饰的聚合物-药物结合物具有如下结构：
Figure BDA0002503155890000153
以聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX和PEG-PCHA-DTX为例，Cy5荧光分子的端基修饰方法按如下方法进行：
1.Cy5-PEG-PC7A-DTX的合成
步骤一：PEG-PC7A-DTX的端基氨解
称聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX 100mg溶于甲醇中，超声溶解，氮气氛围下，加入10倍摩尔当量的正丁胺和1倍摩尔当量的三丁基膦，反应于氮气条件下室温搅拌4小时。反应液颜色由黄色变澄清，终止反应，乙醚沉淀，洗涤，真空干燥即得端巯基化聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX-SH。
步骤二：端巯基化聚合物-药物结合物的Cy5偶联
称取上述“步骤一”所得到的端巯基化聚合物-药物结合物50mg于氮气氛围下溶于1mL甲醇中，然后加入2倍摩尔当量的Cy5-mal和3倍摩尔当量的三乙胺，超声溶解，使混合均匀，反应体系于室温氮气氛围中继续搅拌48小时。反应产物用凝胶柱Sephadex LH20纯化，甲醇为洗脱剂，收集聚合物部分，产物冻干即得Cy5端基荧光修饰的聚合物-药物结合物Cy5-PEG-PC7A-DTX，产率81％，Cy5荧光分子在聚合物中的质量分数为0.5％。产物的薄层色谱检测结果显示，产物纯度良好，其紫外图谱如图6所示。
2.Cy5-PEG-PCHA-DTX的合成
步骤一：PEG-PCHA-DTX的端基氨解
称聚合物-药物结合物PEG-PCHA-DTX 100mg溶于四氢呋喃中，超声溶解，氮气氛围下，加入10倍摩尔当量的正丁胺和1倍摩尔当量的三丁基膦，反应于氮气条件下室温搅拌4小时。反应液颜色由黄色变澄清，终止反应，乙醚沉淀，洗涤，真空干燥即得端巯基化聚合物-药物结合物PEG-PCHA-DTX-SH。
步骤二：端巯基化聚合物-药物结合物的Cy5偶联
称取上述“步骤一”所得到的端巯基化聚合物-药物结合物50mg于氮气氛围下溶于1mL四氢呋喃中，然后加入2倍摩尔当量的Cy5-mal和3倍摩尔当量的三乙胺，超声溶解，使混合均匀，反应体系于室温氮气氛围中继续搅拌48小时。反应产物用凝胶柱Sephadex LH20纯化，四氢呋喃为洗脱剂，收集聚合物部分，产物冻干即得Cy5端基荧光修饰的聚合物-药物结合物Cy5-PEG-PCHA-DTX，产率81％，Cy5荧光分子在聚合物中的质量分数为0.5％。产物的薄层色谱检测结果显示，产物纯度良好，其紫外图谱如图6所示。
实施例4：聚合物-药物结合物胶束的制备
本实施例采用去溶剂法制备了各种聚合物-药物结合物胶束。
1.PEG-PC7A-DTX胶束的制备
精密称取5mg“实施例2”中制备的聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX于200μL的甲醇中，超声溶解，备用；另取4mL超纯水于EP管中，在探头超声条件下，将上述聚合物-药物结合物甲醇溶液快速加入至超纯水中，持续超声1分钟；将超声结束后的胶束溶液转移至100kD超滤管中，用超纯水超滤4次(4000rpm,15min)，用以除去甲醇。10000rpm转速离心10min除去不溶部分，上清转移至新的EP管中即得PEG-PC7A-DTX胶束溶液。
2.Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束的制备
精密称取5mg“实施例3”中制备的聚合物-药物结合物Cy5-PEG-PC7A-DTX于200μL的甲醇中，超声溶解，备用；另取4mL超纯水于EP管中，在探头超声条件下，将上述聚合物-药物结合物甲醇溶液快速加入至超纯水中，持续超声1分钟；将超声结束后的胶束溶液转移至100kD超滤管中，用超纯水超滤4次(4000rpm,15min)，用以除去甲醇。10000rpm转速离心10min除去不溶部分，上清转移至新的EP管中即得Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束溶液，其在不同pH值环境中的荧光吸收值及荧光发射光谱如图6所示。
3.Cy5-PEG-PC7A-DTX常亮式胶束的制备
精密称取4mg“实施例2”中制备的PEG-PC7A-DTX和1mg实施例3”中制备的Cy5-PEG-PC7A-DTX溶于200μL的甲醇中，备用；另取4mL超纯水于EP管中，在探头超声条件下，将上述聚合物-药物结合物甲醇溶液快速加入至超纯水中，持续超声1分钟；将超声结束后的胶束溶液转移至100kD超滤管中，用超纯水超滤4次(4000rpm,15min)，用以除去甲醇。10000rpm转速离心10min除去不溶部分，上清转移至新的EP管中即得Cy5-PEG-PC7A-DTX常亮式胶束溶液。
4.pH非敏感PEG-PCHA-DTX和Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束的制备
分别精密称取5mg“实施例2”中制备的聚合物-药物结合物PEG-PC7A-DTX或“实施例3”中制备的聚合物-药物结合物Cy5-PEG-PC7A-DTX于200μL的四氢呋喃中，超声溶解，备用；另取4mL超纯水于EP管中，在探头超声条件下，将上述聚合物-药物结合物四氢呋喃溶液分别快速加入至超纯水中，持续超声1分钟；将超声结束后的胶束溶液转移至100kD超滤管中，用超纯水超滤4次(4000rpm,15min)，用以除去四氢呋喃。10000rpm转速离心10min除去不溶部分，上清转移至新的EP管中即得PEG-PCHA-DTX或Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束溶液。
5.聚合物-药物结合物胶束的粒径和电位
将上述实施例中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束分别用pH 7.4和pH 6.6的缓冲液稀释至100μg/mL，用动态光散射仪测定两种胶束制剂在不同pH值下的粒径和电位，透射电镜观察其胶束形态变化。结果如图7所示，PEG-PC7A-DTX胶束表现出明显的pH敏感特性，其粒径从pH 7.4时的～40nm降低至pH 6.6时的～5nm，说明胶束随pH值的降低而快速解散，表现为单一聚合物形态分布在水溶液中。其Zeta电位可迅速从pH 7.4时的-12.5±1.5mV转变成pH 6.6时的正电荷46.0±0.5mV。与此相反，pH非敏感PEG-PCHA-DTX胶束的粒径和电位在两种pH条件下差异不大，说明其不具有pH敏感特性。
用透射电镜进一步考察了两种前药胶束在不同pH值下的表观形态，结果如图8所示。PEG-PC7A-DTX胶束在pH 7.4下呈现出均一的球形，分散性良好，粒径30nm左右，而在pH6.6条件下胶束解散，圆整、均一的纳米形态完全消失。而pH非敏感PEG-PCHA-DTX胶束在两种pH介质中均表现出良好的胶束形态，其粒径也在30nm左右。
实施例5：聚合物-药物结合物胶束的体外释放
将“实施例4”中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束分别用不同的释放介质(PBS 7.4，PBS 6.6，完全培养基，木瓜蛋白酶溶液)稀释至1mg/mL，样品置于37℃，100r/min的恒温振荡器中孵育，在设定时间点(1h，2h，3h，6h，9h，12h，24h，48h)分别移取各样品50μL于1.5mL EP管中，快速于冰浴中冷却，用150μL乙腈稀释样品，过0.22μm的微孔滤膜，高效液相色谱法检测释放出来的游离药物。结果如图9所示，总体来说，两种聚合物前药胶束在PBS 7.4，PBS 6.6以及完全培养基中均表现出缓慢的药物释放行为；其中PEG-PC7A-DTX胶束的释放相对较快。PEG-PC7A-DTX胶束在PBS 6.6的48h释放量高于其在PBS 7.4介质中的48h释放量，而pH非敏感PEG-PCHA-DTX胶束在PBS 6.6的48h释放量却低于其在PBS 7.4介质中的48h释放量，这与PEG-PC7A-DTX胶束的pH敏感解散特性有关。从木瓜蛋白酶溶液组的药物释放行为可以看到，PEG-PC7A-DTX胶束可在8h内释放出几乎全部的游离药物，而PEG-PCHA-DTX胶束中的药物48h释放量低于5％，表明PEG-PC7A-DTX胶束对pH和组织蛋白酶B信号具有逐级响应释放特性。
实施例6：聚合物-药物结合物胶束的细胞毒作用
取对数生长期的4T1细胞以1000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL完全培养基，在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中进行常规培养24小时，待细胞完全贴壁后，弃去原有培养基，分别加入100μL含不同DTX浓度的泰素帝(Tasotere)、“实施例4”中制备的PEG-PC7A-DTX胶束和PEG-PCHA-DTX胶束的pH 7.4或pH 6.6的完全培养基，最终的DTX浓度分别为8.663，1.238，0.619，0.124，0.062，0.012，0.001μM，细胞继续于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中孵育24小时后，弃去含有胶束的培养液，PBS清洗一次后，加入空白的RPMI-1640完全培养基，继续培养24小时后，用CCK-8检测试剂盒在酶标仪(Multiskan FC，Thermo Fisher)上于450nm处读取吸光度OD值，计算聚合物-药物结合物胶束在不同pH值条件下对4T1细胞的细胞毒作用，结果如图10所示。
在4T1细胞中，Tasotere在不同pH值下均表现出比聚合物-药物结合物胶束更强的细胞毒作用，其IC50约为10nM，且pH值对其细胞毒性影响不大。PEG-PC7A-DTX胶束在相同孵育条件下均表现出比PEG-PCHA-DTX胶束更强的细胞毒作用，且其在pH 6.6条件下的细胞毒作用更为明显。PEG-PC7A-DTX胶束在pH 6.6孵育条件下对4T1细胞的IC50可达到31nM，其体外细胞增殖抑制活性已非常接近Tasotere。
实施例7：聚合物-药物结合物胶束的细胞摄取能力
选用“实施例4”中制备的Cy5标记的聚合物-药物结合物胶束考察其在不同pH条件下在4T1细胞中的摄取作用。取对数生长期的4T1细胞以40000个/孔的密度接种于12孔板中，每孔1mL完全培养基，在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中进行常规培养24小时，待细胞完全贴壁后，弃去原有培养基，分别加入500μL含相同浓度Cy5-PEG-PC7A-DTX(常亮式)和Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束的pH 7.4或pH 6.6的无血清培养基，于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中孵育20分钟后，吸去含有胶束的培养液，PBS洗涤细胞两次后，用胰酶消化细胞，1500r/min离心5分钟收集细胞，PBS洗涤两次后，重悬于200μL PBS中，流式细胞仪检测(FACSCalibur，BD)细胞摄取量，定量结果如图11所示。从细胞摄取结果中可以看出，PEG-PC7A-DTX胶束在两种pH值下的细胞摄取均显著高于pH非敏感PEG-PCHA-DTX胶束，且PEG-PC7A-DTX胶束在pH 6.6的条件下的细胞摄取量是其在pH 7.4条件下摄取量的5倍。这是由PEG-PC7A-DTX胶束在pH 6.6条件下解散、粒径变小，暴露正电荷促摄取导致，而PEG-PCHA-DTX胶束在两种pH值条件下的细胞摄取量无显著差异。
实施例8：聚合物-药物结合物胶束的胞内溶酶体共定位研究
取对数生长期的4T1细胞以40000个/孔的密度接种于共聚焦小皿中，在37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中进行常规培养24小时，待细胞完全贴壁后，弃去原有培养基，分别加入500μL不同pH值无血清培养基稀释的Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束(“实施例4”中制备)，使最终的胶束浓度为100μg/mL，细胞于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中孵育20分钟后，吸去含有胶束的培养液，加有血清培养基继续培养2小时后，弃去培养基，加入无血清培养基稀释的Hoechst 33342工作液，37℃孵育15分钟，弃去染液，用PBS洗涤三次后，加入Lyso-TrackerGreen工作液，用激光共聚焦显微镜观察溶酶体共定位情况，结果如图12所示，可见PEG-PC7A-DTX胶束在不同pH值下均最终于溶酶体聚集，这也为细胞内溶酶体中大量存在的组织蛋白酶B发挥GFLG多肽水解断裂作用提供了必要条件。
实施例9：聚合物-药物结合物胶束的体外肿瘤球渗透能力研究
建立4T1小鼠体外肿瘤球模型，待肿瘤球的直径生长至300～400μm，将肿瘤球转移至八孔腔室载玻片中，小心弃去原有培养基，分别加入300μL不同pH值无血清培养基稀释的Cy5-PEG-PC7A-DTX胶束(常亮式)和Cy5-PEG-PCHA-DTX胶束(“实施例4”)8小时后，吸去含有胶束的培养液，PBS洗涤三次，多聚甲醛固定30分钟，再用PBS洗三次。采用激光共聚焦层切技术，从肿瘤球顶部到中间以10μm的间隔进行横向光切，研究肿瘤球不同层面的荧光强度，考察制剂在肿瘤球内的穿透能力，结果如图13所示。在相同的荧光条件下，PEG-PC7A-DTX胶束在pH 6.6条件下的渗透深度和摄取强度显著高于其在pH 7.4条件下的渗透和摄取。并且pH非敏感PEG-PCHA-DTX胶束在两种pH值条件下，均显示出较弱的荧光信号和较差的渗透能力。以上体外三维肿瘤球中的现象证实，本发明所提供的PEG-PC7A-DTX胶束可以在肿瘤微酸环境中解散并促进对肿瘤深部的渗透和摄取。
实施例10：聚合物-药物结合物胶束的体内抗肿瘤效应研究
建立荷4T1肿瘤BALB/c小鼠模型(北京大学医学部实验动物科学部，雌性，18～20g)，待肿瘤体积生长至50～100mm3，随机分6个实验组，每组10只，分别给予不同的给药策略，第一次给药当天为第0天，具体组别及其给药方案如下：
1.生理盐水：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射200μL生理盐水；
2.Tasotere：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射3mg/kg Tasotere；
3.PEG-PCHA空白胶束：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射同PEG-PCHA-DTX载药胶束相应剂量的PEG-PCHA空白胶束；
4.PEG-PC7A空白胶束：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射同PEG-PC7A-DTX载药胶束相应剂量的PEG-PC7A空白胶束；
5.PEG-PCHA-DTX胶束：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射3mg/kg(以DTX计)PEG-PCHA-DTX胶束；
6.PEG-PC7A-DTX胶束：第0、2、4、6、8天分别尾静脉注射3mg/kg(以DTX计)PEG-PC7A-DTX胶束；
从给药当天(即第0天)起，每天用电子游标卡尺测量各实验组小鼠的肿瘤长径(a)和短径(b)，肿瘤体积V＝a×b2/2和相对肿瘤体积RTV＝V/V0，V0为第0天肿瘤体积。相对肿瘤体积-时间变化图如图14所示，从图中可以看到，PEG-PCHA空白胶束和PEG-PCHA-DTX载药胶束对肿瘤的生长无抑制作用，其生长曲线和生理盐水对照组基本吻合，PEG-PC7A空白胶束在给药期间(前12天)有一定的抑瘤效果，但在观察后期(12-17天)其肿瘤生长迅速，在第17天的时候其肿瘤大小与生理盐水对照组无显著差异。Tasotere游离药物组具有显著的肿瘤生长抑制作用，其17天抑瘤率为32％。而本发明所提供的PEG-PC7A-DTX胶束对4T1肿瘤的抑制作用最为显著，可达73％的肿瘤抑制能力。因此，PEG-PC7A-DTX胶束具有良好的体内肿瘤抑制效果。
实施例11：PEG-PC7A-DTX胶束联用免疫检查点抑制剂α-PD-1的协同抗肿瘤效应评价
建立荷B16OVA肿瘤C57BL/6小鼠模型(北京大学医学部实验动物科学部，雌性，18～20g)，待肿瘤体积生长至50～100mm3，随机分5个实验组，每组7只，分别给予不同的给药策略，第一次给药当天为第0天，具体组别及其给药方案如下：
1.生理盐水：第0、3、6、9天分别尾静脉注射200μL生理盐水；
2.α-PD-1：第1、4、7、10天分别腹腔注射75μg/200μLα-PD-1；
3.Tasotere+α-PD-1：第0、3、6、9天分别尾静脉注射3mg/kg Tasotere，第1、4、7、10天分别腹腔注射75μg/200μL α-PD-1；
4.PEG-PC7A-DTX胶束：第0、3、6、9天分别尾静脉注射3mg/kg(以DTX计)PEG-PC7A-DTX胶束；
5.PEG-PC7A-DTX胶束+α-PD-1：第0、3、6、9天分别尾静脉注射3mg/kg(以DTX计)PEG-PC7A-DTX胶束，第1、4、7、10天分别腹腔注射75μg/200μL α-PD-1。
按“实施例10”中的相对肿瘤体积计算方法每天监测各给药组小鼠肿瘤的生长情况，绘制相对肿瘤体积-时间变化图。如图15所示，单独腹腔注射α-PD-1四次对B16OVA肿瘤生长抑制效果并不明显，与Tasotere联合应用后有明显的抗肿瘤效果，其15天抑瘤率为60％。单独给药PEG-PC7A-DTX胶束既有非常显著的抗肿瘤作用，其抑瘤率可达71％。联用PEG-PC7A-DTX胶束和α-PD-1会进一步增强其抗肿瘤效果，其联用抑瘤率高达86％，与单用PEG-PC7A-DTX胶束组和联用Tasotere和α-PD-1组均具有显著性差异。因此，联用PEG-PC7A-DTX胶束和免疫检查点抑制剂α-PD-1会发挥协同抗肿瘤效应，进一步增强PEG-PC7A-DTX胶束的抗肿瘤效果。
以上实验中，本发明仅仅是示例性的选取部分实施例中制备的聚合物-药物结合物胶束用于说明本发明所具备的优势，但本发明并不限定于此。需要说明的是，本发明的其他聚合物-药物结合物胶束同样具有高效的药物递送能力，并展现出优越的治疗效果。
本发明如上所述进行了记载。本发明在其范围内包括各种细节方式的变更，但这些变更并不偏离本发明权利要求的范围。此外，所有的对本领域技术人员而言明显地认为是本发明的变更这样的情形，都包括在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.具有pH/组织蛋白酶B逐级响应药物释放特性的聚合物-药物结合物，由亲水链段和疏水链段两部分组成。
2.根据权利要求1所述的聚合物-药物结合物，其特征在于，其中，亲水链段选自聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酸甲酯磷脂酰胆碱中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物-药物结合物，其特征在于，其中，疏水链段具有如结构式1所示结构：
Figure FDA0002503155880000011
其中，R’、R”、R”’、X1，X2分别选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基；
R””是聚合反应产生的端基，选自硫醇、硫酯、烷基、环烷基、芳香基，或者端基取代基团，选自荧光分子、光热探针或金属螯合基团。
R1、R2、R3、R4四个基团可相同也可不同，分别选自C1-C16烷基，C1-C16环烷基、C1-C16芳香基、C1-C16杂芳香基以及上述取代基团；
a和b分别为1～10的整数；
x和y均为整数，其和为20～200的整数；
z为1～10的整数，且x，y，z三个单元可按任意顺序组合排列；
F为活性药物分子，各个F可不同。
4.根据权利要求3所述的聚合物-药物结合物，其特征在于，其中，活性药物分子选自化疗药物、光敏剂、荧光淬灭剂、免疫治疗药物和光热探针。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的聚合物-药物结合物，其特征在于，其具有如结构式2所示结构：
Figure FDA0002503155880000021
其中，Y1可选自-H，C1-C12烷基、C1-C12取代烷基，C1-C12环烷基、C1-C12取代环烷基，羧基及其活泼酯基团、金属螯合基团和马来酰亚胺酯基团；
n为5～500的整数；
其他符号根据权利要求3所定义。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的聚合物-药物结合物，其特征在于，其具有如结构式3所示结构：
Figure FDA0002503155880000022
其中，R1’、R2’选自如下结构：
Figure FDA0002503155880000031
x和y之和为70～90；
F如权利要求3所定义；
R””为三硫代酯。
7.权利要求1-5中任一项所述的聚合物-药物结合物的合成方法，其特征在于，包括：RAFT聚合技术合成聚合物-药物结合物大分子及RAFT聚合物端基修饰技术。
8.聚合物-药物结合物胶束，其特征在于，由一种或多种根据权利要求1-6中任一项所述的聚合物-药物结合物通过自组装过程而形成。
9.胶束组合物，其特征在于，其包含权利要求8所述的聚合物-药物结合物胶束。
10.权利要求8所述的聚合物-药物结合物胶束在制备治疗恶性肿瘤和炎性疾病的药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106995516A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 北京化工大学 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
CN108066771A (zh) * 2017-12-15 2018-05-25 北京思如诺科技有限公司 一种具有高载药量环境响应型抗肿瘤纳米药物、载体以及制备方法
CN110856750A (zh) * 2018-08-16 2020-03-03 北京大学 pH敏感缀合物、胶束及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106995516A (zh) * 2016-01-22 2017-08-01 北京化工大学 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
CN108066771A (zh) * 2017-12-15 2018-05-25 北京思如诺科技有限公司 一种具有高载药量环境响应型抗肿瘤纳米药物、载体以及制备方法
CN110856750A (zh) * 2018-08-16 2020-03-03 北京大学 pH敏感缀合物、胶束及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUTH DUNCAN: ""THE DAWNING ERA OF POLYMER THERAPEUTICS"", 《NAT. REV. DRUG DISCOV.》, vol. 2, pages 347 - 360, XP002467298, DOI: 10.1038/nrd1088 *

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