CN1266421B - 抗癌化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从孛艾大戟、飞扬草和Euphorbia drummondii种植物得到的活性成分中所存在的化合物或一组化合物以及含有这些化合物的药物组合物。已经发现，这些植物的提取物对多种不同的癌细胞系具有选择性的细胞毒性。这些化合物可用于有效地治疗癌症，特别是恶性黑瘤和鳞状上皮细胞癌(SCC)。在本发明的优选实施方案中，所述化合物选自jatrophanes、pepluanes、paralianes和ingenanes及其可药用盐或酯，特别是构象II的jatrophanes。

Description

抗癌化合物
本发明涉及从大戟属植物，特别是孛艾大戟、飞扬草和Euphorbiadrummondii种植物得到的活性成分中所存在的化合物或一组化合物。已证实这些植物的提取物对多种不同的癌细胞系具有选择性的细胞毒性。存在于大戟属亚种树汁中的化合物可用于有效地治疗癌症，特别是恶性黑瘤和鳞状上皮细胞癌(SCC)。 
发明背景
皮肤接触阳光中的紫外光与皮肤癌、特别是恶性黑瘤和非黑瘤皮肤癌、主要是基底细胞癌(BCC)和鳞状上皮细胞癌(SCC)的发生之间存在密切联系。这些癌症的发生率正在世界范围内迅速增加。在英国，在1994年有4000名新被诊断为恶性黑瘤的患者，在过去10年中增加了80％(Wessex Cancer Trust，1996)。在美国，预期约有34100新的患者，每年增加4％。澳大利亚的昆士兰是世界上黑瘤发生率最高的地区，但早期检出和普及的公共卫生运动以及推广使用防晒霜和减少紫外线照射已减少了死亡人数。在英国人口中，BCC目前的发生率为千分之一，发生率在过去20年中增加了一倍以上(Imperial Cancer Research Fund，U.K.，1997)。在美国，预期在1997年将会诊断出100万新的BCC和SCC患者，而1990年为60万，1980年为40万(National Oceanic andAtmospheric Adminstration U.S.A.，1997)。在澳大利亚，尽管有大量关于日光和UV辐射的危险性的宣传，但没有理由怀疑类似增加的发生率不会发生，其中昆士兰人群的危险性最大。 
90％以上的所有皮肤癌发生在经常接受阳光或其它紫外线辐射的皮肤区域，U.V.B.可引起皮肤烧伤并且与恶性黑瘤有关，U.V.A.与皮肤过早老化和BCC以及SCC的发生有关(Wessex Cancer Trust，1996)。儿童期的阳光照射与在青年中发生恶性黑瘤有关。其它危险因素包括遗传因 素(错配，多处皮肤痣)、化学污染、过度接触X-射线、接触某些药物和杀虫剂。平流层臭氧层的消耗被认为与皮肤癌的长期增加有关。 
手术切除是目前对恶性黑瘤、BCC和SCC最常用的治疗方法。它可以是电干燥法和刮除术、冷冻手术、简单的大范围切除、显微镜手术或激光疗法的形式。当检测到癌症处于发展的晚期时，所用的治疗是外部辐射疗法、化疗或程度较轻的生物免疫疗法或光动力学疗法。对治疗的选择取决于疾病的类型和阶段以及患者的年龄和健康状况(NationalCancer Institute，U.S.A.，1997)。 
目前的所有疗法均受到很大程度的限制。主要原因是对切除位点的癌细胞的识别较差并且复发的可能性很高，需要后续的手术和治疗，有进一步损形和形成伤疤的危险性。有文献报道不完全切除的BCC的比例为30-67％(Sussman and Liggins，1996)。伴随手术的免疫抑制可能会造成剩余的细胞增殖，并增加转移的危险性。黑瘤患者中，在开始手术时癌症已经发生转移的危险性很高，随后导致死亡的复发很常见。目前用于替代手术的疗法如放射疗法和化疗，也存在免疫抑制并且特异性很差的危险性。免疫疗法和基因疗法是最具前景的，但对这些疗法的合理应用可能还需要数十年的时间。 
当肿瘤已经过了可以进行手术的阶段后，对黑瘤或各种类型的转移皮肤癌的最常用疗法是化疗，但该疗法很不成功(Beljanski and Crochet，1996)。 
理论上，理想的药物应是当对暴露的黑瘤、BCC或SCC局部给药时，可以选择性地使肿瘤细胞坏死或诱导它们发生细胞程序性死亡而不会损伤到周围的健康皮肤细胞。这在实践中尚未达到。目前可得到的药物既无选择性也无渗透性。 
一般公众还迷恋于局部化疗的概念。有许多记载的皮肤癌的“家庭疗法”，例如使用鞋油(boot polish)，这些疗法产生了非常严重的后果(Adele Green，Queensland Institute of Medical Research，Pers.Comm.)。主要的危险是产生疤痕组织，在疤痕组织下肿瘤细胞继续生长。在澳大利亚，有一种用作治疗雀斑和日光性角化病的非处方制剂的从茄属植物(袋鼠果或魔鬼果)植物得到的主要含有茄解定糖苷的提取物，其商标名为 “Curaderm”。但在对BCC的小型临床试验中，该制剂是无效的，在对治疗部位的组织进行的组织学检查中，20名患者中有14名显示出持续的肿瘤。在某些情况下，对治疗部位的组织学检查显示出在疤痕组织中埋有恶性组织。作者警告不要进行自我诊断和治疗，特别是使用刺激性物质(Francis等，1989)。 
但是，传闻报道建议植物树汁提取物仍被一般公众用来治疗雀斑和日光性角化病，并声称取得了一定的成功。 
在许多国家，大戟科、特别是大戟属植物的树汁被用于民间药物。该属根据其主要的药物特性用一位早期的希腊医生的名字命名(Pearn，1987)。直到最近才对这些主张进行了科学的研究。该属的差异很大，从小的、长得很低的草本植物到灌木和树木。几乎所有关于这些植物及其提取物活性的报道均是传闻或是来自于传统药物，对所用制剂的性质通常不清楚或者描述的很少。据称对多种病症有活性，从疣、“赘疣”、老茧、“瘢痕瘤”、鸡眼、瘭疽、“赘肉”等到各种癌症(参见，例如Hartwell：Lloydia 1969 32 153)。 
作为由美国国家癌症研究所进行的对从35000种陆生植物提取的114000种提取物的抗癌活性筛选程序的一部分，测试了大戟属植物。筛选了含水悬浮液、橄榄油悬浮液、醇提取液和酸提取液对可移植肿瘤细胞系肉瘤37的活性。对4种物质进行了研究。其中，孛艾大戟在所有提取物中均无活性；Euphorbia drummondii、飞扬草和树脂大戟的酸性提取物、醇提取物和橄榄油悬浮液分别有弱的活性(Belkin and Fitzgerald，1953)。对过去5年的科学和药学文献的综述揭示了该属的多种有效活性成分，例如二和四萜、类黄酮、甾醇和蛋白质，并报道了多种生物活性作用，包括阳性作用和不利的作用。表1概述了这些报道。特别是已知大戟属植物可以产生肿瘤促进剂如大戟二萜醇酯(Hecker，E.：“大戟科植物和瑞香科植物的协致癌物”，生药学和植物化学会议(Wagner等编，Springer Verlag 1970，147-165))。 
表1 
  
物种 活性成分 作用 参考文献
  
Euphorbia aleppica 全草：aleppicatines、二萜聚酯、cycloartene三萜、东莨菪亭、山柰酚、4-羟基苯甲酸 前列腺和肺瘤 Oksuz，S.等(1996)
Euphorbia Biglandulosa Desf. 脑苷脂 ？ Falsone G 等 (1994)
Euphorbia bougheii 胶乳 皮肤刺激和肿瘤促进作用 Gundidza，M.等(1993)
Euphorbia characias 胶乳：脂肪酶 与篦麻毒蛋白的B链同源(43.5％) Moulin，A.等(1994)
Euphorbia coopereiNE Br 全草：大戟二萜醇酯 皮肤刺激 Gundidza，M.等(1992)
狼毒大戟 碱性提取物 治疗癫痫症 Liu Y.等(1994)
飞扬草 全草 抑制志贺氏菌属亚种的细菌 Vijaya，K.等，(1995)
飞扬草 全草：类黄酮 抗腹泻活性 Galvez，J.等(1993)
地锦 全草： 可水解的单宁、多元酚糖苷 ？ Yoshida，T.等 (1994)
九牛造 根：3，3′-4-三-O-间甲基鞣花酸、β-谷甾醇 中国草药，作用未知 Guo，Z.等(1995)
甘遂 全草：ingenols 刺激巨噬细胞Fc受体的表达 Matsumoto，T.等(1992)
续随子 颗粒化的植物材料 灭鼠剂 Gassling和Landis(1990)，美国专利4906472
银边翠 胶乳 促细胞分裂的凝 Stirpe，F.等
  
    集素 (1993)
孛艾大戟 ？槲皮苷、hyperoside、山柰酚、谷甾醇、生物碱、糖甙 疣、鸡眼、哮喘、侵蚀性溃疡、BCC的民间疗法 Weedon和Chick(1976)和其中所引用的参考文献
Euphorbia Poisonii 二萜 对人肾癌细胞系A-498有选择性细胞毒性 Fatope，M.O.等(1996)
铁海棠 胶乳 抑制软体动物Biomphalariaglabrata(血吸虫病的载体) Jurberg，P.等(1995)
绿玉树 全草 在Burkitt’s淋巴瘤中降低EBV特异性细胞免疫 Imai，S.(1994)
其中，研究的最多的是洋大戟草(同意词E.hirta L；E.capitataLam.)，其常见的名称包括pill-bearing大戟、蛇杂草、猫发、昆士兰哮喘杂草和花头大戟。该植物广泛分布于热带国家，包括印度，以及北澳大利亚，包括昆士兰。根据“食品、药品和化妆品中常用天然成分大全”(Leung和Foster，1996)，整个开花或结果的植物被用于草药疗法，主要用于咳嗽制剂，以及用于治疗呼吸疾病如哮喘、支气管炎、咳嗽和枯草热的传统药物。该文献报道了洋大戟草的活性组分为胆碱和莽草酸，所存在的其它化合物包括三萜、甾醇、类黄酮、正烷烃、酚酸、L-肌醇、糖和树脂。这些成分中，莽草酸是合成芳族氨基酸的主要中间体，并报道了其在小鼠中具有致癌活性(Evans和Osman，1974；Stavric和Stoltz，1976)。Jakupovic等在孛艾大戟的树汁中发现了jatrophane、ingenane和被称为pepluane的四环二萜(1998a)。据称该jatrophane的构象与已知的jatrophane不同。并且还指出jatrophane属于一组无刺激性的二萜，这可能是在以前的研究中它们被忽视的原因。没有任何关于jatrophane 或新的pepluane化合物的生物学活性的公开内容或建议；也没有建议这些化合物可用于任何药用目的。 
最近的报道描述了大量从Euphorbia poisonii(一种生长于北尼日利亚的剧毒植物，用作花园杀虫剂并据称可用于杀人)的胶乳中得到的tigliane二萜酯的选择性细胞毒性。这些化合物之一对人肾癌细胞系A-498的选择性细胞毒性比阿霉素高10000倍(Fatope等，1996)。 
在一系列专利申请中，Tamas要求了飞扬草植物及其提取物用于各种目的的用途，包括肿瘤的治疗(EP 330094)、AIDS相关性并发症和AIDS(HU-208790)和增加免疫性以及用作抗真菌剂来治疗开放的伤口(DE-4102054)。 
因此，虽然有独立的关于各种大戟属植物制剂抗癌活性的报道(参见Fatope等，1996；Oksuz等，1996)，但是，不仅至少一种大戟属植物中存在的化合物被报道为致癌性的(Evans和Osman，1974；Stavric和Stolz，1976；Hecker，1970；1977)，而且至少有一种物质具有皮肤刺激性和肿瘤促进作用(Gundidza等，1993)，其它物质则可以降低Burkitt’s淋巴瘤中的EBV特异性细胞免疫(Imai，1994)。 
就我们所知，没有可信的或可再现的使用大戟属植物提取物治疗恶性黑瘤或SCC的报道。Weedon，D.和Chic k，J.的题目为“基底细胞癌的家庭治疗”(1976)中报道了用孛艾大戟(微小大戟或milk weed)的胶乳进行的BCC的家庭治疗。作者指出，从Galen时代起就断言了该植物乳液的药物特性，它广泛用于鸡眼、疣和哮喘的家庭治疗。在世纪之交，悉尼的一些医生将其用于治疗侵蚀性溃疡。作者的患者声称已自我治疗多重BCC多年。 
“患者，54岁，男性，从1971年起偶尔在Royal Brisbane医院就诊。在一次就诊时，发现在其胸部的前部有临床基底细胞癌，并通过从一边取的微小样品的活组织检查证实。数天后，当活组织检查部位愈合后，患者连续5天每天涂抹孛艾大戟树汁。该部位形成红斑然后变为脓疱，然后损伤处蜕皮。在治疗6周后返回时，患者同意我们手术切除小部分残余的疤痕。多个切片表明皮肤疤痕组织含有少量慢性炎症细胞，但没有残余肿瘤的证据”。
作者指出，“该信息决不应作为推荐的治疗形式”。有少数报道警告树汁的腐蚀性，并且用孛艾大戟对疣进行家庭治疗时导致了少量眼损伤(Eke，T.，1994)。似乎Weedon和Chick所报道的效果是由于孛艾大戟树汁的刺激性引起的，对于Francis等(1989)所报道的茄属提取物“Curaderm”来说，在该治疗所产生的疤痕组织内或疤痕组织下有高度的残存肿瘤细胞的危险性。 
本发明人惊奇地发现，从三种不同的大戟属植物，孛艾大戟、飞扬草和Euphorbia drummondii得到的植物树汁可以特异性地抑制三种不同人肿瘤细胞系的生长，包括恶性黑瘤。此外，在极低的浓度下，孛艾大戟和飞扬草的树汁可以诱导恶性黑瘤细胞的分化，从而使其具有正常黑素细胞的形态学外观。在相同或更低的浓度下，提取物可以刺激金属硫蛋白基因启动子的激活以及MM96L恶性黑瘤细胞内报告基因的表达。该结果是非常惊人的，因为所用的黑瘤细胞系用所有被检测用来抑制该细胞的常规化疗剂很难抑制(Maynard和Parsons，1986)。 
发明概述
首先，本发明提供大戟属植物，特别是孛艾大戟、飞扬草和/或Euphorbia drummondii的树汁中所存在的化合物或一组化合物，所述化合物： 
(a)可以杀死或抑制癌细胞的生长，但不明显影响正常新生的成纤维细胞，或自发地转变的角质形成细胞； 
(b)于95℃加热15分钟后活性不被破坏； 
(c)用丙酮处理后活性不会被破坏； 
(d)活性可用95％乙醇提取； 
(e)刺激金属硫蛋白基因激活。 
优选的是，所述化合物可以抑制至少一种选自MM96L、MM229、MM220、MM537、MM2058、B16、LIM1215、HeLa、A549、MCF7、MCC16和Colo16的细胞系的生长。更优选的是，所述化合物可以抑制MM96L细胞的生长或诱导其分化。 
更优选的是，所述化合物还可以诱导正常黑素细胞增殖。 
优选的是，化合物存在于孛艾大戟和飞扬草的树汁中。 
本发明的化学馏分含有选自jatrophanes、pepluanes、paralianes和当归酰取代的ingenanes或其乙酰化的衍生物及其可药用盐或酯。 
可以理解，虽然参照在树汁或树汁提取物中检测出的化合物对本发明进行了详细的描述，但这些化合物，无论存在于全植物或其部分中还是从其中被提取了出来，仍在本发明的范围内。 
第二方面，本发明提供含有上述活性化合物和可药用载体或稀释剂的组合物。 
本发明还提供一种含有上述化学馏分以及可药用或化妆品可接受的载体的组合物。 
更优选的是，所述化合物是选自jatrophanes、pepluanes、paralianes和ingenanes。 
当化合物是jatrophane时，其优选具有Jakupovic等所定义的构象II(1 998a)。可以理解，在天然存在的jatrophane、pepluane和paraliane骨架中观察到的取代基也包括在本发明范围内。这包括如下取代基和类似物。 
该类型的化合物存在于多种大戟属的植物中(Jakupovic等，1998a，b，c；Marco等，1998)。 
Figure S98807751519950316D000091
更优选该化合物选自： 
5，8，9，10，14-五乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-15-羟基pepluane(pepluane)； 
2，3，5，7，15-五乙酰氧基-9-烟酰氧基-14-氧代jatropha-6(1)，11E-二烯(jatrophane 1)； 
2，5，7，9，14-六乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-15-羟基-jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane 2)； 
2，5，14-三乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-7-异丁酰氧基-9-烟酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane 3)； 
2，5，9，14-四乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-7-异丁酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane 4)； 
2，5，7，14-四乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-9-烟酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane 5)； 
2，5，7，9，14-五乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane 6)； 
20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯； 
以及其可药用盐或酯。 
在本发明的一个优选实施方案中，组合物还含有β-丙氨酸甜菜碱(betaine)盐酸盐或t-4-羟基-N，N-二甲基脯氨酸。 
第三方面，本发明提供治疗癌症的方法，该方法包括向需要所述治疗的哺乳动物施用抗癌有效量的本发明化合物的步骤。 
癌症优选为实体瘤。更优选所述癌症选自恶性黑瘤、其它皮肤癌，包括Merkel细胞癌、鳞状上皮细胞癌和基底细胞癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌和乳腺癌。 
第四方面，本发明提供抑制肿瘤形成细胞的增殖活性的方法，该方法包括使细胞接触抗增殖活性量的本发明化合物的步骤。可以对细胞进行来自体内的处理或体内处理。 
第五方面，本发明提供预防或缓解由紫外线辐射、离子辐射、微波辐射、接触臭氧等所引起的皮肤损伤的方法，该方法包括向需要所述治疗的患者局部施用有效量的本发明化合物的步骤。本发明的该方面可用于治疗日光性角化病、放疗过程中的皮肤损伤等。 
第六方面，本发明提供刺激非肿瘤形成细胞增殖的方法，该方法包括使细胞接触诱导增殖量的本发明的化合物或组合物。这可用于诱导组织的再生，并且，由于本发明的组合物可引起T-淋巴细胞增殖，还可用于促进对疾病状态的免疫应答。 
哺乳动物可以是人，也可以是家畜或宠物。虽然本发明的化合物特别适于用作治疗人的药物，但也可将其用作兽药，包括对宠物如狗、猫、家畜如马、牛和羊或动物园的动物如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物的治疗。 
本发明的化合物和组合物可以通过任何适宜的途径给药，本领域技术人员很容易确定对于所治疗病症的最佳途径和剂量。剂量应由护理医生或兽医确定，并取决于所治疗疾病的性质和状态、治疗对象的年龄和一般健康状况、给药途径和已经进行过的先前的治疗。 
载体或稀释剂以及其它赋形剂取决于给药途径，本领域技术人员也可以很容易地确定用于每个具体病例的最佳配方。可以考虑本发明的化合物可以口服、局部和/或通过胃肠外注射给药，包括静脉内注射。 
用于制备药物组合物的方法和药物载体是本领域公知的，可以参照教科书如Remington’s Pharmaceutical Sciences，17版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，USA所述。 
对于本发明书的目的，应当清楚的理解措辞“含有”是指“包括但不仅限于”。 
附图概述
图1给出了孛艾大戟树汁对金属硫蛋白基因激活的影响，它是通过用显色底物检测β-半乳糖苷酶的活性测得的。 
图2给出了MCF7乳腺癌细胞在孛艾大戟树汁的存在下在微滴定板的孔中生长7天的增殖情况(用对照值的百分数表示)。 
图3给出了可溶于乙醇的孛艾大戟树汁提取物的RP-HPLC亚分级在195nm的吸收曲线。 
图4给出了对图3的馏份14的重复的RP-HPLC色谱的结果。 
图5给出了图4中峰的恒定二极管排列光谱。
图6给出了用实施例7的馏份15处理MM96L黑瘤细胞的结果。细胞用抗体TRP-1染色，针对细胞骨架A，B：4天，C，D：21天。 
图7给出了实施例6的醚溶性馏份的薄层色谱结果，用氯仿∶乙酸乙酯(82∶18)作为展开溶剂。 
图8给出了通过2维硅胶TLC进一步纯化的结果，第一维用己烷∶乙酸乙酯(1∶1)，第二维用甲苯∶丙酮(9∶1)。 
A：点34-45可在紫外线箱内观察。在1/500稀释度下对MM96L的活性进行记分(+++＝无影响，-＝完全细胞死亡，d＝细胞100％反转成树状外观)。 
B：点14-20可在紫外线箱内观察。在1/500稀释度下对MM96L的活性进行记分(+++＝无影响，-＝完全细胞死亡，d＝细胞100％反转成树状外观)。 
C：点21-27可在紫外线箱内观察。在1/500稀释度下对MM96L的活性进行记分(+++＝无影响，-＝完全细胞死亡，d＝细胞100％反转成树状外观)。 
图9给出了粗品树汁在HPTLC上的上行色谱中的结果，用甲苯∶丙酮(9∶1)溶剂系统展开。在紫外线箱内可观察到不透明带1-7。 
图10给出了图9的馏份1在HPTLC上的上行色谱中的结果，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)溶剂系统展开。在紫外线箱内可观察到带A-G。(旁边的条纹用0.1％碘的氯仿溶液染色显示出馏份G-对MM96L无活性)。 
图11给出了图9的馏份1在HPTLC上的上行色谱中的结果，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)溶剂系统展开。在紫外线箱内可观察到带H。 
图12给出了从粗品树汁制备的可溶于乙醚的馏份在制备薄层色谱(PLC，Merck)上的上行色谱结果，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)溶剂系统展开。在紫外线箱内可观察到H和A-F区域，将这些区域提取并用于体内研究。 
图13给出了用实施例11所述的部分纯化的馏份在裸鼠中治疗皮下人黑瘤MM96L异种移植物的结果。箭头表示对肿瘤(右手侧)和正常皮肤(后背顶部)局部处理的位置。治疗方案开始32天后，以及第一次局部给药20天后，没有残余肿瘤生长或对正常皮肤持续损伤的迹象。
发明详述
参照以下非限定性实施例和附图对本发明进行详细描述。 
实施例1　大戟属植物树汁对肿瘤细胞系的抑制活性
测试了三种大戟属植物孛艾大戟、飞扬草和Euphorbia drummondii的树汁抑制三种不同的人肿瘤细胞系生长的能力。测试对正常皮肤成纤维细胞的活性作为对照。 
将细胞系保存在含有5％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基中，并在相同的培养基中进行试验。 
从自由生长在昆士兰东南部的Sunshine海岸腹地的Palmwood农场的栽植土壤的植物收集树汁。将植物树干表面用70％乙醇简单冲洗，使用乙醇洗涤的剪刀切割树干以释放乳状胶乳树汁。将树汁收集在10ml的无菌塑料离心管内，于4℃运送到Brisbane并于-20℃下冷冻保存。临用前，将树汁用无菌MilliQ水连续稀释5倍至1/3125，并装入1.5mlEppendorf管中。将各稀释液的10μL等份液加入到两个含有100μL细胞系的微滴定板的孔中。一式两份进行试验。 
5天后，单盲检测细胞，与对照未处理的细胞样品比较生长的抑制作用。表3-6中概述了结果，其中，试验的细胞系为： 
NFF　　　正常皮肤成纤维细胞 
MM96L　　恶性黑瘤细胞，脑转移 
HeLa　　 宫颈癌 
HACat    自发转变的人角质形成细胞 
评分标准为0＝无影响至5＝完全细胞死亡 
表头中的稀释度是指加入培养物中之前样品的稀释度。因此，最终培养物的稀释度大约增加10倍。 
表3　　NFF正常成纤维细胞 
表4恶性黑瘤 
表5Hela细胞 
Figure S98807751519950316D000153
表6HACat角质形成细胞 
Figure S98807751519950316D000154
从这些结果可以看出： 
a)孛艾大戟对HeLa细胞有效，对MM96L细胞的活性较低。 
b)飞扬草对MM96L细胞有效，对HeLa细胞的活性很强。 
c)Euphorbia drummondii对MM96L的效果低于其它两种样品，仅在测试的最高浓度下抑制HeLa细胞。 
d)在1/5稀释度下NFF正常成纤维细胞受到严重影响，但在其它稀 释度下仅受较弱影响。例如，在1/25的稀释度下，对NFF细胞的抑制较弱(2级)，但严重抑制MM96L细胞(4级)。对于1/125的稀释度，未观察到对NFF细胞的影响(0级)，但在一个样品中观察到了对MM96L细胞的严重抑制(4级)，在重复样品中观察到了较弱的抑制(1级)。HACat(可以认为是代表性的正常角质形成细胞)仅在最高浓度下被抑制。 
在孛艾大戟树汁的高浓度下，似乎可以直接杀死MM96细胞。在低浓度下(稀释度为1/625)，虽然未观察到生长抑制，但存活的细胞是树状的，并且具有正常黑素细胞的外观。不想受任何机制的限制，似乎孛艾大戟树汁含有至少一种可以促进分化而不是直接损伤DNA的细胞毒性试剂。 
实施例2  加热或丙酮处理对大戟属植物树汁活性的影响
由不同的人用不同的细胞系制剂、不同的植物样品和不同的评分标准按照实施例1的描述用孛艾大戟和飞扬草重复进行实验。 
样品按照实施例1的描述制备，或进行加热或用丙酮处理。将未稀释的植物树汁提取物于95℃加热15分钟。对于丙酮处理，将40μL提取液悬浮在400μL丙酮中，然后将试管在旋涡混合器上振荡。将内容物以10000g离心3分钟，将上清液(可溶于丙酮的馏份)转移至另一个试管中。沉淀物和上清液均在敞口试管中于室温下放置在通风橱中过夜，打开排风机以蒸发残余的丙酮。 
结果如表7-9所示，其中+++表示无影响，-表示100％细胞死亡，“C”表示培养物受污染。使用该评分标准，结果比实施例1更令人吃惊，在高达1∶3125的稀释度下仍观察到了强的抑制活性。但是，在该实验中观察到了对NFF细胞的某些生长抑制。 
加热或丙酮处理均不会显著影响抗肿瘤活性。用丙酮处理时，大部分活性存在于沉淀物中，特别是对于飞扬草的情况，虽然在可溶性馏份中也存在一些活性。这表明有活性的化合物不是蛋白质，并且至少有一种成分可能是脂类。
Figure S98807751519950316D000171
表9 
HeLa细胞 
  
样品 1/5 1/25 1/125 1/625 1/3125
孛艾大戟 ± + +++ +++ +++
飞扬草 - +++ +++ +++ +++
飞扬草加热 + ++ +++ +++ +++
可溶于丙酮的孛艾大戟 +++ +++ +++ +++ +++
可溶于丙酮的飞扬草 +++ +++ +++ +++ +++
丙酮沉淀的孛艾大戟 ++ ++ +++ +++ +++
丙酮沉淀的 飞扬草 ± +++ +++ +++ +++
孛艾大戟加热 - +++ +++ +++ +++
实施例3  用孛艾大戟进一步试验
由于孛艾大戟是该研究中所测试的三种植物中最丰富的一种，因此用该物质的提取物进行进一步实验。这并非暗示在其它两种物质中没有活性。 
用MM229和MM220人恶性黑瘤细胞和B16小鼠恶性黑瘤细胞系以及NFF和MM96L细胞重复实施例2。一式两份地进行试验，加入等量的水作为对照，丙酮处理后的沉积物和上清液馏份的稀释度为1/20至1/12500。结果如表10所示。
Figure S98807751519950316D000201
结果证实了实施例2的结果。在1/100至1/50的稀释度下，对NFF细胞无影响，但观察到了MM96L细胞的明显抑制。在这些浓度下存活的黑瘤细胞具有正常黑素细胞的外观。还观察到了对其它两种人黑瘤细胞系和小鼠黑瘤细胞系的抑制。 
用Merkel细胞癌(MCC16)或鳞状上皮细胞癌(Colo6)得到了相似的结果。结果如表11所示。 
即使在1/500000的稀释度下，鳞状上皮细胞癌仍显示出树状细胞形态。粗提取物的这种极端效力对于Merkel细胞抑制也很明显，在1/500000稀释度下仍很明显。 
表11
孛艾大戟粗树汁对Merkel细胞癌(MCC16)和鳞状上皮细胞癌(Colo16)细胞数量的影响 
Figure S98807751519950316D000211
评分：+++＝无影响 
　    -＝完全细胞死亡 
      *d＝表示向细胞的树状形态转变； 
      对MCC16的评分未记录树状比例 
实施例4  孛艾大戟的乙醇提取物
将新制备的孛艾大戟的树汁用95％含水乙醇提取。提取后，通过真空离心除去可溶性馏份中的乙醇，然后将该馏份在含有5％胎牛血清和抗生素的组织培养液(RPMI1640)中重新构建至其最初的体积。将乙醇提取后的沉积物通过真空离心干燥，然后在上述组织培养液中重新构建至 其最初的体积。将粗树汁(C)、可溶性馏份(S)和沉积物(P)按照以上描述对NFF细胞、黑瘤细胞系MM96L、MM537、MM229和MM2058进行试验，并同时对结肠癌细胞系LIM1215和肺癌细胞系A549进行试验。一式三份地进行分析，分析在加入样品之后培养4天后进行。结果如表12所示，其中+表示细胞的正常外观，++表示细胞数量可能增加，-表示细胞死亡。
Figure S98807751519950316D000231
结果与以上实验所得到的结果抑一致。同样，在低剂量下，MM96L细胞具有树状外观。在稀释度为1/20时，粗树汁以及由乙醇提取得到的可溶性馏份可以杀死所有肿瘤细胞系以及正常的成纤维细胞系NFF。似乎大部分活性均在可溶于乙醇的馏份中。肺癌细胞系A459似乎特别敏感，在高达1/2500的稀释度下仍受到粗树汁以及可溶性馏份的影响。 
实施例5  转染的MM96L恶性黑瘤细胞系中基因表达的报道分析
将孛艾大戟树汁在磷酸盐缓冲盐水稀释剂中的溶液加入到含有用构建体转染的MM96L细胞或乳腺癌细胞系MCF7的孔中，所述构建体由绵羊金属硫蛋白启动子、已被金属硫蛋白基因取代了的β-半乳糖苷酶报道基因的上游组成。因此，该试验是对基因表达的测定，具体地讲，是对金属硫蛋白基因潜在转录、翻译和表达的测定。将细胞用微滴定板中的提取物处理20小时，加入100μM硫酸锌并将平板继续保温5小时，然后除去培养液。将细胞与显色底物一起在37℃保温1-2小时测定β-半乳糖苷酶的活性。该试验是基因转录激活的灵敏试验。 
结果如图1所示。 
这表明对金属硫蛋白基因的激活有明显的刺激作用，这是通过β-半乳糖苷酶报道基因表达的增加而测得的，令人惊奇的是，当样品进一步稀释时，该作用更加明显。孛艾大戟树汁介导该作用的机制并不清楚。可以特异性抑制组蛋白脱乙酰酶活性的已知药物在药物浓度增加时会显示出报道基因表达的增加，而孛艾大戟则显示出相反的剂量反应。但是，这些结果表明该试验可用于检测孛艾大戟树汁或植物本身中活性成分的纯化。 
金属硫蛋白具有抗氧化活性，对重金属诱导的癌症具有保护作用。金属硫蛋白启动子的激活作用发生在无法直接杀死细胞的孛艾大戟树汁的低浓度下，除极为敏感的乳腺癌细胞系MCF7外(图2)。在这些稀释度下，MM96L黑瘤细胞的外观向正常黑素细胞的树状形态的改变可能与金属硫蛋白基因的这些作用有关。 
实施例6  可溶于乙醇的提取物的亚分级
将按照实施例4用95％乙醇提取制得的可溶性馏份进行恒溶剂反相高效液相色谱(RP-HPLC)。 
将100μL粗提取物溶于1ml95％乙醇并在4℃下定期振荡过夜。将提取物以10000g离心4分钟，然后除去上清液，并通过真空离心干燥。将固体重新构建于100μL简单离心的流动缓冲液中，然后将可溶性物质上到Brownlee Aquapore RP-300柱(C8)，220×4mm上，带有一30×4mmRP-300保护柱。 
流动缓冲液为乙腈∶水50∶50(v/v)，流速为0.75ml/分钟。以0.5分钟的间隔收集馏份，检测在195nm的吸收曲线。吸收曲线如图3所示。 
将馏份通过真空离心进行干燥，重新构建于500μL PBS中，然后按照以上描述对MM96L细胞进行分析并进行金属硫蛋白报道分析。馏份13和28均可引起MM96L细胞向树状外观的完全反转，但未观察到细胞死亡。该作用在报道分析中更为明显，其中在1/10000(即培养物中的最终浓度为1/100000)的稀释度下仍能观察到活性。 
除上述结果外，本发明人还发现在超离心后，在上清液和沉积物中均发现了对MM96L细胞的活性，将样品通过分子量截止膜后仍无法除去活性。除以上试验的细胞系外，孛艾大戟树汁在高达1/100000的最终浓度下可以抑制MCF7乳腺癌细胞系的细胞增殖。用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)试剂(Pierce)分析细胞数量。结果如图2所示。 
实施例7  溶剂分级
通过极性逐渐增加的一系列溶剂进行孛艾大戟粗品溶胶的进一步溶剂分级。在离心管中，向1ml粗品胶乳中加入20ml乙醚。将试管振荡并以5000g离心5分钟以分层。分出乙醚上层并将该过程重复两次。合并乙醚馏份，在旋转蒸发仪上浓缩至干并在1ml DME中重新构建以进行生物学分析。按照相似的方式，将残余物用乙酸乙酯萃取，然后用二氯甲烷萃取。通过减少MCF7乳腺癌细胞的数量和向树状外观的反转测定活性，最初的乙醚提取液具有大部分活性。但是，在乙酸乙酯和二氯甲烷层的馏份中也显示出了活性。在最后的水溶性馏份中未观察到活性。结果如表13所示。
Figure S98807751519950316D000261
在用复制缺陷型腺病毒构建体感染的HeLa细胞中分析CMV启动子活性，其中的Ela基因已被CMV启动子驱动的β-半乳糖苷酶代替。表14所示的结果用感染的未处理的细胞的对照值的百分比表示。 
表14 
Figure S98807751519950316D000271
*乙二醇二甲醚 
得到的结果与使用其它分化诱导剂如组蛋白脱乙酰酶抑制剂或丁酸酯观察到的结果定性相似，尽管其活性比用这些试剂观察到的更强。在较高浓度的粗品和乙醚提取物中观察到的较低的促进剂活性可能反应了在那些浓度下观察到的对HeLa细胞的杀死细胞作用。 
在其它溶剂分级实验中，将粗品树汁在甲醇∶水(17∶3)和正己烷之间进行分配，预期的溶剂分配是基于以前从三萜(庚烷相)中分离二萜(极性相)的报道(Evans和Kinghorn1977)。但是，出人意料的是，在两相中均检测到了活性，这表明活性成分在该系统中的行为反常。 
另一种溶剂分级方法受需要在HPLC分析之前阐明样品所启发。将粗品胶乳与乙醇混合至70-95％并于4℃振荡过夜。将混合物以1000g离心10分钟，分出上清液并浓缩至粗品树汁原体积的约三分之一。向浓缩物中加入100％乙腈至30-60％。以12000g离心10分钟分离形成的白色沉淀。经TLC和质谱确定，上清液富含大环二萜类化合物(jatrophanes和pepluane)。该结果给出了大规模富集活性成分的适当方法。
实施例8　可溶于乙醇的提取物的进一步活性指导的亚分级
将实施例7和图3所述的HPLC亚分级的馏份14和15通过重复的色谱法进一步纯化，用恒定二极管排列光谱选择主要的对称峰(例如馏份14和15；馏份14的结果如图4和5所示)。通过细胞试验证实纯化馏份造成MM96L反转成树状外观的活性。 
图6给出了加入馏份15后转变成MM96L细胞的特点。利用抗体偶联的方法，作为光学显微照片显示出细胞。用溴-氯-吲哚磷酸和氮蓝四唑(BCIP/NBT)作为展开底物，用第二抗体(绵羊抗-小鼠-碱性磷酸酯酶结合物)检测第一抗体(抗酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)的小鼠单克隆抗体)。保温4天后(图6A和6B)，黑瘤细胞的数量明显减少并且其形态明显改变。细胞回复至长的、树状的外观，这是正常成熟黑素细胞的特征。该区域内的所有细胞均变成了该改变的形态，出现这种MM96L细胞群异质性是令人惊奇的。保温21天后，处理的细胞以群的形式表现出彼此接近平行的排列，如图6C和6D所示，这是正常成熟黑素细胞的特征。用孛艾大戟的所有树状细胞诱导馏份，包括粗品树汁均观察到了相似的特点。 
对馏份14和15的电喷雾质谱分析表明存在2，5，7，14-四乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-9-烟酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane5，Jakupovic等，1998a)，其m/z为780(计算值779.315)。用1D NMR对馏份14进行核磁共振(NMR)分析给出7-9.4ppm的低场信号，这与存在于环位置9的烟酸酯中的吡啶部分相一致。此外，5-6ppm处的大偶合常数证实了反式双键，这与jatrophane环结构中的11，12环内双键相符。负离子模式的电喷雾质谱还证实馏份14中存在2，5，7，9，14-五乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基jatropha-6(17)，11E-二烯(jatrophane6，Jakupovic等，1998a)，其m/z为716(计算值716.304)、673(M-乙烯酮)、656(M-AcOH)。 
馏份15含有2，3，5，7，15-五乙酰氧基-9-烟酰氧基-14-氧代jatropha-6(1)，11E-二烯(jatrophane1，Jakupovic等，1998a)，其m/z为597(M-乙烯酮-AcOH)。因此，通过质谱分析，在HPLC中于7-7.5分钟先洗脱的、具有细胞杀伤和树状活性的馏份含有jatrophane5、6和1的混合物。 该结果与HPLC(在HPTLC上进行层析，展开剂为甲苯∶丙酮9∶1)馏份14和15的行为一致。UV-阳性斑点未从原点移动，Rf0.0(约数)，与后洗脱的馏份(例如馏份20-22，Rf0.3-0.5)相对比。这表明jatrophane5、6和1的极性比jatrophane3、2和4相对较强，这由HPTLC上的色谱(展开剂为甲苯∶丙酮9∶1或己烷∶乙酸乙酯4∶1)证实。这些结果与Jakupovic等(1998a)用汽油∶甲基叔丁基醚(1∶1)作为展开剂得到的结果相似，例如jatrophane5：Rf0.04，jatrophane6：Rf0.10(3倍)，jatrophane1：Rf0.11。在先洗脱的HPLC馏份的质谱数据中没有存在ingenane衍生物(见后面)或表1中所列的文献中报道的孛艾大戟粗提取物中的其它成分的迹象。 
实施例9　在薄层色谱(TLC)和高效薄层色谱(HPTLC)上的生物学活性指导的粗提取物和醚溶性提取物的纯化
(a)将实施例7制备的醚溶性馏份重新构建于乙二醇二甲醚(DME)中并在20×20cm硅胶板上进行色谱分离，用氯仿∶乙酸乙酯(82∶18)作为展开剂(图7)。将平板在紫外线箱中观察并标出UV阳性的带，从硅胶上切除，用DME洗脱，然后测试对MM96L黑瘤细胞系的抑制活性和形态反转。通过将整个硅胶分成吸收UV和不吸收UV的馏份，在预备实验中证实活性存在于UV吸收带中。将硅胶的旁边条纹用0.1％碘的氯仿溶液染色表明了其它碘强阳性的带。但是，发现其活性可忽略。在Rf0.0(A)、Rf0.16-0.18(B1)、Rf0.22-0.24(B2)、Rf0.73-0.80(C)、Rf0.80-0.96(D)的UV吸收带是生物学活性的，1/5000稀释度下可观察到细胞数量的减少和完全反转成树状细胞外观。 
将B1、C和D区用二维溶剂系统通过硅胶60板进一步色谱纯化，第一维溶剂为己烷∶乙酸乙酯(1∶1)，第二维溶剂为甲苯∶丙酮(9∶1)(分别列于图8A至8C)。如图所示，在1/500稀释度下，UV吸收斑点对大于30％细胞数量的MM96L具有抑制活性并且完全反转成树状细胞外观。 
将D区得到的强UV吸收斑点22和23(参见图8C)从硅胶上切除，用DME洗脱并通过真空离心干燥。对馏份22和23的质谱分析表明存 在5，8，9，10，14-五乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-15-羟基pepluane，m/z639.5[M-AcOH]+，即pepluane。 
(b)将整个粗品树汁在带有浓缩区的10×10cm HPTLC硅胶60板(Merck目录号013748.1000)上进行色谱纯化，用甲苯∶丙酮(9∶1)作为展开剂，如图9所示。从硅胶上切除UV阳性区(1，Rf0.14；2，Rf0.23；3，Rf0.49；4，Rf0.54；5，Rf0.57；6，Rf0.63；7，Rf0.73)并用DME/乙醚洗脱。将馏份按照以上描述对MM96L进行测试，证实馏份1、3、4、5和6具有细胞抑制活性和细胞反转活性。将这些馏份独立地在HPTLC板上色谱分离，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂，得到UV阳性带A，Rf0.17；B，Rf0.24；C，Rf0.42；D，Rf0.48；E，Rf0.52；F，Rf0.58；G，Rf0.62(图10)和H，Rf0.02(图11)。除G(碘阳性，参见图10)外的所有馏份均对MM96L细胞有活性，表现为在1/5000的稀释度下的细胞生长抑制和反转成完全的树状形态。 
表15给出了馏份A-F(B缺失)和H的质谱分析，从发表的孛艾大戟组分的已知分子量的离子对化合物暂时归属。
Figure S98807751519950316D000311
pepluane＝5，8，9，10，14-五乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-15-羟基pepluane 
jatrophane2＝2，5，7，9，14-六乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-15-羟基-jatropha-6(17)，11E-二烯 
jatrophane3＝2，5，14-三乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-7-异丁酰氧基-9-烟酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯； 
jatrophane4＝2，5，9，14-四乙酰氧基-3-苯甲酰氧基-8，15-二羟基-7-异丁酰氧基jatropha-6(17)，11E-二烯 
因此，质谱表明了20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯(馏份A)、pepluane(馏份A、C和D)和jatrophane2(馏份D)、3(馏份C和H)和4(馏份E和F)。馏份H的1H化学位移数据如表16所示。 
表16 
馏份H的1H化学位移*数据 
Figure S98807751519950316D000331
*化学位移在295K测定，相对于7.24ppm的氯仿。 
这些归属表明存在jatrophane环结构，这通过DQF-COSY、NOESY和TOCSY二维光谱证实。馏份H的光谱符合jatrophane3存在两种非对映异构的构象(可能性最大)，存在两种或多种相似取代的jatrophanes的混合物或带有两个烟酸酯、一个苯甲酸酯和一个异丁酸酯部分的新的jatrophane。可能的环构象为II，参见Jakupovic等(1998a)，J4，5大约为6Hz并且在5和8以及4和7之间存在强的NOE；J7，8和J8，9实际为零，这可以通过DQF COSY光谱的交叉峰的全部消失证实。没有与存在任何ingenol结构相一致的信号。将样品从磁铁中取出，等份液表现出对MM96L可能有活性，表现为在20μg/ml时的完全细胞死亡和低于20pg/ml时完全反转为树状外观。 
实施例10  NMR分析
将馏份A通过HPTLC色谱进一步纯化，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)作为展开剂。作为UV紫外线箱吸收性的辅助手段，还通过用70％磷酸的甲醇溶液喷雾凝胶对旁边的条纹进行染色，并通过将凝胶用吹风机加热进行显色，显示出在UV光下的强蓝色带，该蓝色带与主要的UV吸收带分离。切除与该条带对应的未染色的区域，用醚洗脱并通过真空离心干燥。从4ml胶乳中共得到约1mg该物质。将该物质进行NMR分析，随后进行生物分析，表明该物质可以在1/5000,000(相当于1ng/ml的终浓度)稀释度下可以反转成完全的树状形态。通过NMR鉴定，该物质为C27H36O7，20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯，如表17所示。该发现与表15中的质谱证据相一致。
表17 
在生物活性馏份A2上得到的支持20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯化学结构的NMR数据 
Figure S98807751519950316D000351
但是，在活性指导的HPLC纯化的质谱中以及在除馏份A的其它TLC馏份中没有20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯表明该物质不是唯一的活性成分。相反，通过从NMR和质谱推论，也暗示含有jatrophane1-6和pepluane。这对于通过TLC制备的馏份H(jatrophane 3 Na+m/z830；参见表16的1D NMR结果)和通过HPLC制备的馏份13和14(jatrophane5，m/z779和1D NMR；jatrophane 6 m/z 716；jatrophane1或6衍生物，m/z 597)来说尤其是这样。 
Jakupovic等(1998a)推测化合物的paraliane类是jatrophane至pepluane通路之间的中间体。由于本发明中证实了jatrophane和pepluane均有抗癌细胞活性和树状细胞反转，似乎有理由推断paraliane化合物也具有这些性质。 
实施例11  通过制备性薄层色谱制备用于小鼠试验的材料
将15ml70％乙醇中的粗树汁按实施例6所述用乙醚提取。将提取物通过真空离心浓缩，然后再悬浮在约5毫升DME中。将DME提取物在制备性TLC板(Merck PLC，硅胶60，目录号005745.1000)上进行色谱，用己烷∶乙酸乙酯(4∶1)为展开剂。切下对应于图12中“H”区和“A-F”区的区域并合并，用醚/DME洗脱，然后真空离心干燥。提取物富含jatrophanes2，3和4，pepluane和ingenane乙酸酯。将沉淀悬浮在95％乙醇中，然后以10,000g离心10分钟。将上清液(6.0ml，10mg/ml)分成0.2ml的等份，于-20℃贮存。将该提取物用于MM96L黑瘤细胞系研究，并且表明有高效力，在1/(5×106)稀释度下树状细胞形态仍明显；这再次说明了这种粗树汁的效力。这样制备的提取物富含jatrophanes2，3和4，pepluane和ingenane乙酸酯。要注射前，将20μl用含5％胎牛血清的RPMI1640组织培养基稀释至1毫升，注射0.1-0.2毫升。将乙醇溶液(10mg/ml)用棉花蕾吸收(0.2-0.4ml)，然后局部施用于小鼠。 
实施例12　抑制肿瘤细胞皮下移植物的生长
(a)在4个不同的部位，给5个4周龄裸小鼠皮下注射含2×106MM96L人黑素瘤细胞的0.1ml组织培养基。在第1，2，3，5，6，7和8天， 给3只处理的小鼠注射含5％胎牛血清和20μg乙醇提取物的0.1ml RPMI培养基。另外，给处理的小鼠局部施用多达4次约5-10μl10mg/ml乙醇提取物或粗的未稀释的树汁。每个被处理的小鼠的两个独立的位置接受乙醇提取物或粗品树汁的治疗。1只小鼠在第12，13和14天接受局部治疗，另2只处理的小鼠在第15，19，20和22天接受局部治疗。在第32天测量肿瘤体积。 
在局部施用前，注射提取物对肿瘤体积没有显著影响。局部施用乙醇提取物后，肿瘤外观隔夜均有变化。肿瘤变成灰黑色，然后变成硬的，有多瘤的黑色外观，接着形成痂。用粗树汁治疗的肿瘤一天后有类似的变化。这时，乙醇提取物与粗树汁的总体影响相似，因此，已将局部治疗之损伤的测量值合并。在接受注射及局部治疗的小鼠上，肿瘤体积减小了76％(p<0.2)。如图13所示，一个已用乙醇提取物治疗的肿瘤已完全消失，另外8个缩小形成平的黑痂。另3个治疗的肿瘤开始呈现出类似的颜色变化和肿瘤退化，但在测量前，停止局部治疗后10天，肿瘤重新生长。 
(b)在下腹部的两个部分，给6只4周龄C57黑(C57B1)小鼠注射0.1ml含105B16黑素瘤癌细胞的组织培养基。使肿瘤发育4天，然后实施下列方案：3次注射(注射在含5％胎牛血清的0.1mlRPMI培养基中的20μg乙醇提取物(第1，2和4天)，以及1次局部治疗(在第4天，5-10μl的10mg/ml乙醇提取物)。第一次注射后8天，用尺测量肿瘤的面积。与3只对照小鼠的肿瘤大小相比，治疗使3只治疗小鼠的B16黑素瘤肿瘤的大小减小了64％(p<0.05)。 
结果总结于表18。 
表18 
孛艾大戟提取物对肿瘤生长的体内抑制 
Figure S98807751519950316D000371
Figure S98807751519950316D000381
*(a)体积，mm3
(b)面积，mm2
实施例13　用纯化的提取物在人黑素瘤细胞系(MM96L)中诱导基因表达的改变
将在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中的150cm2平板中培养的MM96L细胞系的人黑素瘤细胞与纯化的提取物在37℃，5％CO2/空气中保温4小时。将细胞用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤，在PBS中刮落，沉淀，再悬浮在1毫升PBS中，沉淀，然后在300μl NP-40裂解缓冲液中被吸收，在冰上放置15分钟，沉淀，然后将上清液用蛋白酶K和SDS在37℃处理15分钟，用酚氯仿提取，然后用乙酸铵/乙醇在-20℃沉淀总RNA过夜。用Promega mRNA分离试剂盒分离mRNA，然后在存在33P-标记的dCTP下反转录所述mRNA，得到cDNA。按照制造商的说明，将后者在GenomeSystems human Gene Discovery Array 1.2(GDA)上杂交。将排列用MolecularDynamics PhosphorImager定量分析，然后用ImageQant和Excel软件分析。 
计算治疗和未治疗的细胞的两个点之体积的比例，然后将所述比例用于定义基因激活(比例>1)或抑制(<1)的水平。背景通常为500-1000计数，但不用减去；因此，所述比例通常会低估实际变化。 
所述排列含有18000个独特序列以上的cDNA点，即所谓表达的序列标记(ESTs)，其中约3000个来自人细胞的可鉴定的表达基因。在被检测的人黑素瘤细胞中的许多EST序列受提取物治疗的上调或下调。认为只有以比例的标准偏差<30％的两个点为基础的改变在该阶段是生物学显著的。还应注意在该试验中使用相对短的4小时治疗时间以便鉴定试剂的最早和最重要的靶。可能依赖于初反应的基因表达中的进一步的主要改变在此以后发生。 
由一些相关已知基因之转录本水平变化得到的结果总结于表19中，所述变化被认为有利于直接或间接控制癌细胞。 
认为在实施例中观察到的细胞形态学方面的变化是因大量蛋白质的主要下调而导致的，所述蛋白质与肌动蛋白，一种主要的细胞骨骼蛋白相结合。在此也涉及维生素A醇结合蛋白的增加，以及通过增加树脂样物质的 细胞内水平在诱导分化的表型方面的增加。 
通过观察的XP修复蛋白的诱导作用，也可以提高因日光性UV辐射诱导的现有和未来DNA损伤的修复。另外，GADD45和离子化辐射抗性蛋白(DAP3)的减少可用于使肿瘤组织对放射性治疗敏感化。后者的变化也是相当显著的，因为后者是由UVB引起的在MM96L细胞中的明显上调，是皮肤癌和黑素瘤的起因。 
诱导了大量与提高免疫应答有关的分子，特别是G-CSF。认为其中一些，例如主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质可用于免疫治疗，提高杀伤T细胞活性。 
对于控制细胞生长最显著的变化与检测到的G-蛋白质和PKC途径的改变以及蛋白酶体活性的增强有关。细胞内信号对于许多细胞过程是很重要的，所述细胞过程包括增殖和正常平衡途径与途径相互作用方面的改变，例如如由Ras信号传导介导的那些对细胞可能有不利的结果。蛋白酶体组分LAMP7-E1的诱导水平在实验中对所有基因均是最高的，并预期会极大地改变通过遍在蛋白途径加工的许多蛋白质。 
在基因表达排列数据的基础上，认为本发明的化合物通过以下方式具有活性： 
1.在调节G-蛋白质的基因表达中，PKC和Ras信号传导途径以导致体内抗癌活性的方式。 
2.在改善日光性UV和类似试剂的损伤中，在靶或效应细胞中通过提高DNA修复和免疫应答。 
3.作为用放射性治疗或其他DNA-损伤剂的治疗的佐剂，在下调保护性蛋白(GADD45和DAP3)的基础上。
表19 
  
功能 基因 EGAD号 提取物的调节 参考文献
免疫应答 唾液酰基转移酶MHC 1类蛋白G-CSF受体 HT4978HT3059HT2680HT4313 2.162.641.3911.68 Li等，1998
细胞生长调节 80H-K成纤维细胞生长因子9 HT1772HT2447 2.110.59 Kanai等，1997
分化 细胞视黄醇结合蛋白1 HT2520 2.69 Perozzi等，1998
G蛋白途径 β多肽3G-结合蛋白小G蛋白TTF HT484HT3752HT5016 2.270.350.47  
表19(续) 
  
PKC途径 磷脂酶DPKC zeta HT2473HT21136 4.040.67 Bosch等，1998
肿瘤抑制基因 Wilm’s肿瘤相关蛋白 HT3751 1.99  
DNA损伤和修复蛋白 XP组C p58Hsp 27/28XP组C HHR2GADD45离子辐射抵抗蛋白(DAP3) HT4209HT2997HT4247HT3135HT5168 2.362.362.090.630.46  
蛋白水解 LAMP7-E1 HT3850 26.91 Mimnaugh等，1997
细胞形态 肌动蛋白抑制蛋白IICofilin亲环蛋白B微管蛋白αk1 HT928HT1657HT1953HT1813 0.620.560.360.61 Djafarzadeh，1997
癌基因 TAX HT3360 0.32 Pise-Masison等，1998
实施例14 治疗人自愿者中的日光性角化病
从Queensland Institute of Medical Research得到伦理委员会进行临床医生指导的试验的许可，该试验，用孛艾大戟的粗树汁治疗人的面部日光性角化病。 
将从澳大利亚生长的植物中得到并在-20℃在50％甘油中贮存了2周的粗提取物通过棉花蕾涂药器施用在临床诊断为日光性角化病的男性自愿者的面部左太阳穴部，直径为约5毫米。将约50μl涂到表面上。1天后，在相同的部位涂第二次。第一次给药后，4-5小时内，均无反应，此后，在该部位产生炎症反应并扩展至直径为80-100mm面积。1天后，在给药部位和给药区远端的局部斑上有局部肿胀和水疱形成，好象恶化前的部位也被攻击。第一次治疗后4天，肿胀消除并在受影响的部位明显有痂形成。14天后，痂蜕落，下面是新皮肤。6周后，治疗过的区域仍有粉色，但没有原来的日光性角化病的痕迹。作为对照，对相同自愿者前臂上1cm2区域的正常皮肤进行同样的治疗。局部有轻度的炎症，但在治疗后7-10天消失。 
正如由实施例13基因排列筛选得到的免疫应答结果和下文实施例15通过孛艾大戟粗树汁对T细胞进行体外增殖试验得到的观察结果所表明的，与日光性角化病治疗有关的严重炎症反应可能反应了杀伤T细胞的恢复和增殖。杀伤T细胞活性的提高被认为是通过免疫系统破坏癌细胞的关键步骤并可有助于解释对原治疗部位外的恶化前损伤的识别和治疗。 
实施例15　来自TLC的粗树汁和纯化馏分“A”和“H”对正常黑素细胞数量的影响
12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)是体外培养正常黑素细胞所必需的，因为缺少TPA，这些细胞生长很不良。在预备试验中，从试验开始，就将孛艾大戟馏分加至不含TPA的培养基中。将孛艾大戟馏分加至新鲜培养基中，然后将记录的细胞数与不加孛艾大戟馏分或TPA的新鲜培养基相比。在该方案中，比用TPA-缺乏培养基中生长的“对照”细胞得到的黑素细胞数量多。令人惊奇的是，含孛艾大戟馏分的培养基中的细胞看起来比所谓含TPA的“标准”培养基中生长的那些细胞更健康。因此，由孛艾大戟衍生的化合物提供了在细胞培养中使用TPA作为工具的更优越的替代方案。
在第二个试验中，将正常黑素细胞以每孔5000个细胞铺在板上，并在含10％胎牛血清、霍乱毒素、抗生素和TPA的RPMI 1640培养基中。24小时后，从细胞中吸出培养基，然后用不加TPA但加入所规定的添加物的新鲜培养基。再保温10天后，计数细胞。结果列于表20中。可以看出甚至在1/5000000稀释度下，用粗和纯馏分也可观察到细胞增殖作用，与在前文实施例中所述的在这些抗癌细胞系浓度下观察到的抑制作用相反。在另一试验中，用孛艾大戟树汁处理T细胞后也得到T细胞的体外增殖。 
表20 
  
样品 1/50 1/500 1/5,000 1/50,000 1/500,000 1/5,000,000
溶剂(对照) + + + + + +
粗品孛艾大戟树汁 - + + ++ ++ ++
馏份“A”(富含ingenol乙酸酯) + ++ ++ ++ ++ +
馏份“H”(富含jatrophane3) ± ++ ++ ++ ++ ++
评分：+＝正常生长 
     ++＝比正常生长高约50％ 
由于孛艾大戟树汁馏分可诱导正常黑素细胞和T细胞增殖，所以在体内或体外，在任何需要正常细胞再生的疾病中，这种试剂可广泛地用作细胞增殖剂，所述医疗情况包括但不限于： 
a)在创伤和外科手术后，以及在烧伤恢复中，扩增皮肤细胞(角质细胞)以使伤口快速愈合， 
b)为移植扩增胰腺小岛细胞 
c)扩增免疫系统的T细胞和其他细胞。令人感兴趣地注意到在日光性角化病治疗时，在人自愿者试验中通过给药点的作用扩展可以通过正常杀伤T细胞募集到给药区域来解释。 
d)肝、肾、结肠、肺和眼之老化和坏死组织的再生 
e)扩增宿主组织用于器官移植 
实施例16　甜菜碱对恶性黑素瘤MM96L细胞数量的影响
将不同类型的甜菜碱溶解于无菌MilliQTM水中，达到1mg/ml的最终浓度，然后按前述稀释到含5000个MM96L细胞的0.1ml组织培养基中。保温4天后，计数细胞。结果列于表21。 
大部分测试的甜菜碱对细胞数量没有影响，而β-丙氨甜菜碱盐酸盐(高甜菜碱)以20μg/ml的最终浓度抑制细胞数量，细胞具有树状外观。t-4-羟基-N，N-二甲基脯氨酸也在20μg/ml的最终浓度下抑制细胞数量；但是，细胞形态转变成多树状形，其意义尚不清楚。 
推测β-丙氨酸甜菜碱盐酸盐(高甜菜碱)可能是孛艾大戟树汁粗品或其纯化的活性成分，包括ingenol、pepluane和jatrophanes1-6(单独的或混合的)的适宜的配方试剂，它可用于对恶化前的皮肤损伤局部给药(使用低稀释度的孛艾大戟活性成分)，或用高浓度的孛艾大戟活性成分配制成抗癌剂。现已建议，将甜菜碱本身用作抗癌剂，参见，例如美国专利5545667(Wiersema等)。 
由于甜菜碱的表面活性剂特性，它们被广泛用作化妆品的配方成分。由于它们的两性特性，甜菜碱还有助于将其它成分转运到皮肤的深层。与非常稀的孛艾大戟树汁提取物或由其得到的纯化馏份例如jatrophanes、pepluane、paraliane或ingenane(单独的或混合的)一起用于皮肤化妆品制剂的甜菜碱应具有互补的特性。对于所有测试的甜菜碱，包括甘氨酸甜菜碱，仅有β-丙氨酸甜菜碱盐酸盐(高甜菜碱)具有表型反转作用，尽管与孛艾大戟树汁及其馏份相比较弱。 
表21 
  
样品 1/50 1/500 1/5000
甘氨酸甜菜碱 +++ +++ +++
N-甲基脯氨酸，游离碱 +++ +++ +++
t-4-羟基-N-甲基脯氨酸，游离碱 +++ +++ +++
水苏碱(脯氨酸甜菜碱)，游离碱 +++ +++ +++
t-3-羟基-N-甲基脯氨酸，游离碱 +++ +++ +++
β-丙氨酸甜菜碱盐酸盐(高甜菜碱) ++d +++ +++
  
t-4-羟基-N，N-二甲基脯氨酸，游离碱 +pd +++ +++
d＝树状形态 
pd＝多树状形态 
评分：+++＝无效 
        -＝完全细胞死亡 
本领域技术人员可以理解，虽然为了清楚和理解的目的对本发明进行了详细的描述，但可以对本文中所描述的实施方案和方法进行各种修饰和改变而不超出本说明书所公开的本发明的范围。 
以下列出本文所引用的参考文献，将这些文献引入本文作为参考。 
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Claims (8)

1.纯化的ingenane化合物在生产用于治疗癌症或其它涉及肿瘤形成细胞的疾病药物中的用途；其中所述化合物：
a)能从孛艾大戟、飞扬草和/或Euphorbia drummondii树汁中用95%乙醇提取；
b)能刺激金属硫蛋白基因激活和
c)能杀死或抑制癌细胞的生长，或诱导MM96L细胞分化，但不明显影响正常新生的成纤维细胞，或自发地转变的角质形成细胞；
其中所述活性在95℃加热15分钟，或用丙酮处理后不会被破坏。
2.权利要求1的用途，所述化合物能抑制至少一种选自MM96L、MM229、MM220、MM537、MM2058、HeLa、B16、LIM1215、A549、MCF7、MCC16和Colo16的细胞系的生长。
3.权利要求2的用途，其中所述化合物能抑制MM96L细胞的生长或可以诱导其分化。
4.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述化合物可以诱导正常黑素细胞和/或T细胞增殖。
5.权利要求1的用途，其中所述化合物是20-乙酰基-ingenol-3-当归酸酯。
6.权利要求1的用途，其中癌症是皮肤癌、恶性黑瘤、Merkel细胞癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌或日光性角化病。
7.权利要求1中的用途，其中该药物适于局部用药。
8.权利要求1中的用途，其中癌症是实体瘤、肺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌或乳腺癌。
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