CN1194758C - 阴道乳杆菌药物 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种适用于阴道药物中的乳杆菌属细菌的离体菌株，并且还公开了含有所述乳杆菌的药物，一种新的微生物保藏基质，一种保藏药物中的微生物细胞的方法，以及预防和治疗阴道及胃肠道感染的方法。

Description

阴道乳杆菌药物
有关政府资助的参考内容
本发明得到政府AI 31448和R43 AI 36021-01的部分资助，两者均获得国家健康协会的奖励，并且得到CDC 200-94-0819的部分资助，其获得疾病控制中心的奖励。政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及具有适用于阴道药物的有益特性的乳杆菌属细菌。本发明更具体涉及了具有保藏微生物细胞的基本纯净的培养物的阴道药物，本发明还涉及保藏基质、在所述保藏基质内保藏微生物细胞的方法，以及用于预防和治疗阴道感染的方法。
发明背景
在育龄妇女中，下部生殖道感染包括性传播疾病(STD)是一些最常见的临床问题。在美国，每年约有1千万职员患有阴道疾病。阴道排出物可由阴道感染(酵母菌、细菌性阴道病和滴虫病)或子宫颈感染(淋病或衣原体病)所产生。此外，与阴道感染相关的机体现象有早产、出生体重低和新生儿死亡，这些是产科学所面临的一些最严重的问题。细菌性阴道病是一种妊娠期间最常见的生殖器感染。在妊娠的第4-6月被诊断患有细菌性阴道病的妇女比未患细菌性阴道病的妇女多40％的可能性产生早产、低体重儿。如果可预防这种分娩，那怕是预防少部分，也可节省下大量金钱，并且能够防止新生儿期的发病和死亡。
乳杆菌(lactobacillus)是革兰氏阳性杆菌，它是一种存在于人体肠、口腔和阴道中的微生物菌丛。人们认为阴道内乳杆菌在通过产生乳酸和阴道的酸化或产生另外的抗微生物产物如过氧化氢(H2O2)的抗感染中发挥着重要的作用。迄今已证明，阴道乳杆菌丛占优势的妇女患淋病、衣原体病、滴虫病和细菌性阴道病的几率要低于50％。阴道内存在的产过氧化氢乳杆菌可以减少细菌性阴道病、症状性酵母性阴道炎和性病，其中包括奈瑟氏菌淋病、衣原体沙眼和滴虫阴道炎。体外研究已证实，产过氧化氢乳杆菌对阴道病原体，甚至对人免疫缺损病毒(HIV)具有有效的杀菌和杀病毒作用。
不幸的是，许多育龄妇女缺乏阴道乳杆菌。阴道的生态系统受到药物治疗、全身健康状况、性生活和节育的动态影响。许多阴道和全身药物疗法杀死了阴道乳杆菌。所以，用抗生素治疗性病会将妇女置于反复获得该疾病的高度危险中。上述发现以及对乳杆菌可增强阴道健康的广泛认识提示临床医师，使乳杆菌重新定居在妇女阴道内可以预防或治疗生殖道感染。
用于阴道内或口腔的乳杆菌产品业已在100年内以“嗜酸菌”制剂的形式在健康食品店中出售，并且在食品杂货店中销售嗜酸菌乳或酸奶(例如，这些产品通常被宣传为含有嗜酸乳杆菌菌株)。这些产品包括了含有来源于人体的冻干嗜酸乳杆菌的阴道栓剂和多种营养添加物。多数这样的产品是无效的，因为这些产品无法使外源性乳杆菌定居在阴道内。失败的原因似乎是由于市售产品的质量低劣。据报导，作为部分食品或乳杆菌补充品出售的乳杆菌产品经常受到其他潜在病原体污染。此外，酸奶提供的乳杆菌无法与阴道上皮细胞结合。乳杆菌与上皮细胞的结合是菌落定居在宿主机体内的必要步骤。由于产品可能含有不适用的微生物菌株(例如，许多含有难于在阴道内回复的菌株)、可能被其他潜在病原微生物感染、微生物成活力低和/或微生物缺乏与阴道上皮结合并定居的能力，由此即使使用市售乳杆菌产品也对预防或治疗阴道感染收效甚微。
因此，需要能够治疗阴道感染的产品，其应可以在精确的条件下制造且其声音合适的人体乳杆菌菌株，这种乳杆菌菌株具有体内杀菌性质、有效的粘附性以及活微生物效能。
发明概述
本发明涉及具有适合用作阴道药物的有益特性的乳杆菌属细菌。具体而言，本发明涉及含有保藏微生物细胞的基本纯净的培养物的阴道、直肠或口腔药物，还涉及保藏基质和用于预防和治疗阴道感染的方法。
当体内给药时，在此公开的独特乳杆菌菌株可以形成菌落并且长久固定在阴道上皮细胞上。随后这些独特的菌株可在一定时间内、于阴道环境内恢复。所述乳杆菌菌株这种持续定居和成活的能力主要归功于本发明所公开的新保藏基质。本发明的保藏基质提供的保护作用致使所述乳杆菌菌株能够以代谢失活态粘附于阴道上皮细胞，并且当恢复到能生产具有抑制功能的副产物的活化态时继续定位在阴道上皮细胞上。迄今人们还未注意到基质对微生物细胞的这种性能。本发明的保藏基质还灵活地适应了生产市售栓剂产品期间采用的多种干燥方法。
本发明的一个实施方案涉及了一种阴道药物。这种药物含有基本纯净的、由乳杆菌属菌株分离出的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值(cohesion value)百分数(如下定义)至少约为50％，和(ii)在有效培养条件下，产生约0.5ppm以上的过氧化氢的能力。本发明的阴道药物还含有保藏基质，该保藏基质含有并且保藏所述的细菌培养物。所述基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。在一个实施方案中，所述基质的pH为约5.0-约7.0。在另一个实施方案中，所述基质的pH约为7.0。本发明的保藏基质能够在体外至少约12个月的时间里保存至少约105个基因稳定的活细胞。另一个实施方案中，所述基质可在体外至少约12个月的时间里保存至少约107个活细胞，更优选地，适合在体外至少约12个月的时间里保存至少约108个活细胞。
在另一个实施方案中，离体乳杆菌的VEC粘合值百分数至少约为65％，并且优选至少约为80％，并且更优选至少约95％。在另一个实施方案中，离体菌株有能力生产至少约10ppm的过氧化氢(H2O2)，并且更优选生产至少约20ppm的过氧化氢。
如上所述，本发明的一个实施方案涉及了上述乳杆菌菌株，当该菌株处于代谢失活态时可粘附在阴道上皮细胞上。在另一个实施方案中，所述离体菌株可在体内阴道上皮细胞上持续定居至少约1个月。在一个实施方案中，离体菌株的基因稳定性在体内至少可保持约24个月。该离体菌株的单细胞宽约1微米-约2微米，长约2微米-约4微米，并且在有效的培养条件下产生至少约0.75mg/100ml的乳酸。
在一个实施方案中，本发明的乳杆菌菌株是卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)；另一个实施方案中，本发明的乳杆菌菌株是詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)。在另一实施方案中，本发明的乳杆菌菌株具有卷曲CTV-05乳杆菌的所有识别特性，该菌种是本发明的优选乳杆菌菌株。
本发明的保藏基质在体外约4℃-约6℃的温度下，优选在室温下，至少约12个月期间保存至少约106个活细胞。在另一实施方案中，所述基质可在体外至少约18个月的时间里，优选在至少约24个月的时间内，保存至少约106个活细胞。
本发明的阴道药物可以含有惰性载体，所述惰性载体包括但不限于是麦芽糖糊精珠粒或明胶胶囊。在一个实施方案中，胃肠道药物含有(a)离体乳杆菌属的基本纯净的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值(如下定义)百分数至少约为50％，和(ii)在有效培养条件下生产大于约0.5ppm过氧化氢的能力；和(b)保藏基质，其中含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。这种基质可在体外至少约12个月的时间内保存至少约106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
本发明的另一实施方案涉及了用于保藏微生物细胞的保藏基质。所述基质含有(a)生物活性粘合剂，该粘合剂包括水溶性树胶、羧甲基纤维素和明胶；(b)抗氧剂(优选抗坏血酸钠)；(c)多元醇，其包括木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇和阿糖醇；(d)碳水化合物，其包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，以及其他单糖、二糖和低聚糖；和(e)蛋白质材料，其中包括脱脂乳(skim milk)和白蛋白。所述基质可在体外至少约12个月的时间内保持至少约106个基本纯净并且基因稳定的活细胞。
在另一实施方案中，所述的生物活性粘合剂至少是基质总重量的约10％，所述抗氧剂至少是基质总重量的约0.1％，所述多元醇至少是基质总重量的约1％，所述碳水化合物至少是基质总重量的约0.5％，并且所述蛋白质材料至少是基质总重量的约0.5％。
在一个实施方案中，所述的生物活性粘合剂至少占基质总重量的约14％，所述抗氧剂至少是基质总重量的约0.5％，所述多元醇至少是基质总重量的约6％，所述碳水化合物至少是基质总重量的约2.5％，并且所述蛋白质材料至少是基质总重量的约1.5％。
本发明的一个实施方案是一种用于保藏微生物细胞的保藏基质，以所述保藏基质重量计，其含有约14％明胶、约0.5％抗坏血酸钠，约2.5％葡萄糖，约1.5％脱脂乳和约6％木糖醇。
本发明的另一实施方案涉及一种制备用于保藏微生物细胞的保藏基质的制备方法。该方法包括步骤(a)提供组份，其包括(i)灭菌生物活性粘合剂，其包括水溶性树胶、羧甲基纤维素和明胶；(ii)灭菌蛋白质材料，其包括脱脂乳和白蛋白；(iii)灭菌多元醇，其包括木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇和阿糖醇；(iv)灭菌抗氧剂；(v)灭菌碳水化合物，其可以包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，以及其他单糖、二糖和低聚糖；和(vi)水；和(b)将上述组分混合在一起形成溶液。所述生物活性粘合剂可以以液体的形式提供。
本发明的一个实施方案涉及一种在保藏基质内保藏微生物细胞的方法。该方法包括步骤(a)将至少约106个微生物细胞的培养物悬浮在保藏基质中形成细胞基质悬浮液；(b)将该细胞基质悬浮液加至惰性载体，形成给药组合物；并且除去给药组合物中的水分。所述保藏基质含有上述组分。在一个实施方案中，该方法还包括将所述给药组合物放置在包装内的步骤，以保护该给药组合物在运输和储存过程中不受水分和氧的影响。
在一个实施方案中，所述惰性载体可以包括麦芽糖糊精珠粒，并且所述方法包括将所述细胞基质悬浮液涂层在麦芽糖糊精珠粒上并且经流化床干燥除去水分而干燥该珠粒的步骤。
在另一实施方案中，所述惰性载体包括明胶胶囊，所述方法包括将明胶胶囊冷却直至细胞悬浮液基质形成非流体基质的步骤，以及随后在干燥室中将该明胶胶囊干燥的步骤。干燥步骤包括在将温度约为24℃-32℃的干燥空气吹入到干燥室中，所用干燥空气中的水分含量少于约25％，并且优选少于约15％，更优选少于约5％，且从干燥室内除去湿空气。干燥室内装有压缩机、至少一个烃类洗涤过滤器(hydrocarbon scrubbing filter)和冷气压缩机。该干燥室还可以装有干燥剂柱。
本发明的另一实施方案涉及一种保护妇女免受阴道感染的方法。该方法包括将上述本发明的阴道药物施用给妇女。另一实施方案涉及一种阴道感染的治疗方法，其包括将上述阴道药物施用给妇女的步骤。适合用所述药物治疗的阴道感染包括细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。
本发明的一个实施方案涉及一种减少人体感染人免疫缺损病毒(HIV)的危险性的方法，其包括将本发明的上述药物给药给人体。给药上述药物可以将人体感染HIV的风险性降低至少约2倍。
本发明的另一实施方案涉及一种预防人体感染症状性酵母菌阴道炎的方法，其包括给人体施用本发明的上述阴道药物。在优选实施方案中，所述药物中所含的乳杆菌菌株是卷曲乳杆菌CTV-05(Lactobacillus crispatusCTV-05)。
本发明的一个实施方案涉及一种预防人体感染胃肠道感染的方法，其包括给人体施用本发明的上述阴道药物。
本发明的一个实施方案涉及一种预防早产(preterm birth)的方法，其包括给妊娠妇女施用本发明的上述阴道药物。
本发明的一个实施方案涉及一种增强雌激素在阴道和肠内的代谢作用的方法，其包括给妇女施用本发明的上述阴道药物。
本发明的另一实施方案涉及一种阴道药物，其含有(a)至少两种离体乳杆菌属菌株的基本纯净的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值(如下定义)百分数至少约为50％，和(ii)在有效培养条件下，生产大于约0.5ppm的过氧化氢的能力；和(b)一种保藏基质，其含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白材料。这种基质可在体外至少约12个月的时间内保存至少约106个基本纯净并且基因稳定的活细胞。可用该药物有效地治疗至少两种阴道感染，其中包括细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。在一个实施方案中，所述细菌培养物中含有可有效治疗第一种阴道感染的第一菌株，并且含有可有效治疗第二种阴道感染的第二菌株。在一个优选实施方案中，所述第一菌株是卷曲乳杆菌CTV-05，并且第二菌株为詹氏乳杆菌。
本发明的一个实施方案涉及一种阴道药物，其中含有(a)离体卷曲乳杆菌属CTV-05的基本纯净的细菌培养物；和(b)一种保藏基质，其中含有约14％明胶、约0.5％抗坏血酸钠，约2.5％葡萄糖，约1.5％脱脂乳和约6％木糖醇。这种基质可在体外至少约12个月的时间内保藏至少约106个基因稳定的活细胞，并且维持卷曲乳杆菌CTV-05的有益特性。这些特性包括，在代谢失活态下粘附在阴道上皮细胞上的能力，在有效培养条件下产生大于约0.5ppm过氧化氢的能力，以及至少约为50％的阴道上皮细胞(VEC)粘合值百分数。
附图简述
图1表示高温储存对乳杆菌菌株CTV-05成活稳定性的影响。
图2表示室温和冷冻温度下的长期储存对乳杆菌菌株CTV-05成活稳定性的影响。
图3是一个加速储存期研究的线性图，其表示在本发明风干的保藏基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
图4是一个加速储存期研究的线性图，其表示在风干的标准脱脂乳基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
图5是一个加速储存期研究的线性图，其表示在本发明冷冻干燥的保藏基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
图6是一个加速储存期研究的线性图，其表示在冷冻干燥的标准脱脂乳基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
图7是一个加速储存期研究的线性图，其表示在麦芽糖糊精上经流化床干燥的本发明保藏基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
图8是一个加速储存期研究的线性图，其表示在本发明悬浮基质中保藏的卷曲乳杆菌CTV-05的长期成活力。
发明详述
本发明广义地涉及了具有适于口腔使用或阴道内使用作为预防阴道感染药物的有益特性的人体乳杆菌属细菌菌株。具体而言，所述有益特性包括：粘附并定居(colonize)在阴道上皮细胞上的能力、产生过氧化氢的能力、特异功效、储存稳定性、对阴道感染物的抑制作用、生产乳酸的能力，以及适当大小的微生物细胞个体。此外，本发明涉及一种含有被保藏微生物细胞基本纯净的培养物的阴道药物，并且涉及一种药物内微生物细胞的保藏方法，该方法可以在至少约12个月的储存期内维持细胞的纯度、遗传稳定性和所述的有益特性。
目前的市售乳杆菌产品常常受到污染，并且不含有足量产过氧化氢乳杆菌的合适阴道菌株。此外，市售的乳杆菌菌株常常无法定居在阴道上皮细胞中。除了适当功效和菌株选择以外，由于其工业生产期间所用的保藏方法目前的产品还缺乏功效。在许多产品中，乳杆菌菌株常常丧失了粘附于体外剥落阴道上皮细胞的能力，以及定居在体内阴道上皮细胞上的能力。此外，被保藏菌株的储存期通常较短，在2-3个月内活细胞的数量迅速减少。目前采用的一些保藏方法是为了用于保藏食物而开发的，但对保藏微生物来说，这些方法可能不是最佳的。对保藏方法的要求是严格的，它们必须能够保护并且暂停细胞的生长，同时允许细胞以代谢失活态(即保藏态)粘附于阴道壁上。
本发明提供了优于市售食品和阴道填充物的几个好处。应用现代基于DNA技术可发现，阴道内最常见的乳杆菌不是嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)，但许多目前的食品添加剂和阴道治疗药却基于嗜酸乳杆菌。本发明人识别并且分离出新的卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌菌株，它们优于任一种阴道药物内所用的市售菌株。而且，本发明人试验出了小规模及大规模生产菌株的最佳条件，在这些条件下，不会在增殖、收获、保藏、放置在阴道给药体系内以及储存期间失去所需特性。本发明人还提供了用于在制剂(format)中保藏微生物的一种新保藏基质和保藏方法，该方法能够保存微生物的所需特性。具体而言，本发明的保藏基质允许乳杆菌菌株以代谢失活态粘附在体内阴道上皮细胞上并且保持住位置，并且可以回复到能够生产功能抑制副产物的活化状态。在本发明之前还未描述过微生物/保藏基质组合物的这种性能。本发明的保藏基质还能够在室温或冷冻温度储存下长时间地保藏微生物，并且具有适应生产市售药物期间的多种干燥法的灵活性。这是具有如此性能的保藏基质的第一个实证。本发明人还未发现任何已知乳杆菌阴道药物表现出等同于或优于本发明所述药物在体外和体内试验中所表现的效能。
根据本发明，“阴道药物”是一种可用于预防或治疗与阴道直接或间接有关的感染、疾病或其他失调的药物(即药剂或药品)，其中包括经阴道进入体内的感染和疾病。所以，在此公开的内容基本上是本发明阴道药物在阴道感染中的应用，但应理解的是，这种阴道药物也可用于治疗那些与阴道感染没有必然联系的感染和症状，例如胃肠道感染，此时本发明的药物可以作为胃肠道用药物。
本发明的一个实施方案涉及了一种阴道药物，其含有离体乳杆菌属菌株的基本纯净的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值(如下述定义)百分数至少约为50％；和(ii)生产大于约0.5ppm的过氧化氢的能力。所述阴道药物还含有保藏基质，该保藏基质含有并保藏所述的细菌培养物。这种基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。该基质可在体外至少约12个月的时间内保藏至少约106个基因稳定的活细胞。在一个实施方案中，该阴道药物可含有惰性载体，包括麦芽糖糊精珠粒和明胶胶囊。
按照本发明，离体微生物菌株是从天然环境取得的菌株。此处的术语“离体”不是必须反应使微生物纯化的程度。相反，微生物菌株的“基本纯净的培养物”是指除含有一种或多种所需菌株或微生物以外基本上不含有其他微生物的培养物(即，“栓剂菌株”或“药物菌株”)。换言之，微生物菌株的基本纯净的培养物基本上不含有其他污染物，所述污染物包括微生物污染物和不需要的化学污染物。
可以通过任何方法来测定培养物中是否存在一种或多种栓剂菌株并且不存在污染性菌株，其中包括对培养物中的微生物进行分析(1)用标记的DNA探针测定DNA的同源性，(2)DNA指纹和/或(3)细胞壁脂肪酸的分布。例如，通过测定培养物中的DNA是否在严格杂交条件下杂交形成栓剂菌株的DNA，可以分析出培养物中的菌株是否是所需栓剂菌株的DNA同源物。在此所述的“严格杂交条件”是指在利用核酸分子(包括低聚核苷酸)来识别具有相同核酸序列的分子的标准杂交条件。在杂交反应中，严格杂交条件能够分离出那些有至少约70％核酸序列与探针核酸分子相同的核酸分子。这种标准杂交条件公开在例如Sambrook等人的“分子克隆：实验手册”(1989，Cold Spring Harbor Labs Press)”中。Sambrook等人的文献在此全文引入作为参考。该条件的例子包括但不限于下列条件：例如，将Tm’为约50℃-约65℃、长为18-25个核苷酸的低聚核苷酸探针(例如来自栓剂菌株的DNA)与一般被固定在滤器(例如硝基纤维素滤器)上的核酸分子(例如来自被测培养物的DNA)在含有5X SSPE、1％肌氨酰、5X Denhardts试剂和0.1mg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中进行杂交，杂交是在37℃下进行约2-12小时。随后用37℃的含有5X SSPE、1％肌氨酰的洗涤液将滤器洗涤3次，每次洗涤15分钟。再将滤器37℃的含有2X SSPE、1％肌氨酰的洗涤液中洗涤，每次洗涤15分钟。例如，在42℃下，随意地将引物DNA探针与一般固定在滤器(例如硝基纤维素滤器)上的核酸分子在含有5X SSPE、1％肌氨酰、0.5％Blotto(溶于水中的干乳)和0.1mg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中杂交约2-12小时。随后用42℃的含有5X SSPE、1％肌氨酰的洗涤液将滤器洗涤2次，每次洗涤15分钟；再将滤器在含有2X SSPE、1％肌氨酰的42℃洗涤液中洗涤，每次洗涤15分钟。
后面的实施例部分将详细描述利用DNA指纹通过重复序列聚合酶链式反应(Rep PCR)，或利用细胞壁脂肪酸分析来鉴别一种或多种栓剂菌株的方法。
适合在本发明药物使用的乳杆菌菌株(即栓剂菌株)可以是任何具有上述识别特性的乳杆菌菌株。可以利用所属领域已知的适当筛选技术从天然物质中检测并分离出乳杆菌菌株。适于本发明的乳杆菌识别特性以及用于筛选这些特性的方法将在下文中作详细讨论。优选的乳杆菌种包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，并且更优选卷曲乳杆菌。从人体阴道内可分离出适宜的乳杆菌菌株。特别优选的乳杆菌菌株是具有卷曲乳杆菌CTV-05菌株所有识别特性的菌株，其中卷曲乳杆菌CTV-05是最优选的。
在本发明的范围内，除了已知的乳杆菌菌种和菌株之外，新鉴别的来自于天然的菌种和菌株或由已知或新鉴别菌株得到的突变菌株均可应用于本发明的药物。可以通过下列方法分离出具有适用于本发明药物的乳杆菌的识别特性的亲代乳杆菌菌株的天然存在的突变体，例如，令亲代菌株经过至少一个化学和/或放射诱变循环，从而加快突变速度，由此提高获得具有改进的所需特性的微生物的可能性。显然，对于所属领域技术人员来说，本发明的突变微生物还包括那些通过基因工程微生物获得如高VEC粘合值(如下定义)百分数的微生物。在此所用的“突变微生物”是一种突变的亲代微生物，其中该微生物的核苷酸组成业已被自然发生的突变作用改性，这是暴露在诱变物下的结果，或是基因工程的结果。
适用于本发明阴道药物内的乳杆菌的一个识别特性是乳杆菌菌株具有至少约50％的阴道上皮细胞(NEC)粘合值百分数，优选该粘合值至少约为65％，并且更优选至少约为80％，首选该值至少约为95％。根据本发明，术语“粘合”和“粘附”可以互换使用。微生物细胞粘附在阴道上皮细胞上是微生物定居及发挥生物作用所必需的。在此，定居是指在细胞或材料上建立微生物繁殖部位，所述材料不必对组织造成侵害或损伤。本发明乳杆菌细胞在阴道上皮细胞上的成功粘附使其能够成功定居在阴道上皮细胞上。根据本发明，“VEC粘合值百分数”的定义是粘附有至少一种乳杆菌细胞的VEC相对于一组被识别VEC总数的百分率。该数值不同于以往常用于测定粘附作用的量度。迄今为止，可通过对染色制剂中预定数目(例如50)的阴道上皮细胞上所粘附的微生物细胞数量进行计数，计算出每个VEC上粘附的微生物细胞的平均数或平均值，从而测出体外的粘附效能。该平均值以前被用作特定微生物菌株的一个效能指标。不受理论的约束，本发明人确信，测定“VEC粘合值百分数”是一种较佳的效能量度。从实践的观点全面地考虑，本发明人认为，若体外粘附作用与人体体内的粘附和定居不相关时，这种粘附作用毫无意义。因此，与将VEC总数中每个VEC的粘附细胞的常规平均值用作体内外效能量度不同，本发明人计算出具有至少一种粘附微生物细胞的VEC细胞占VEC总数的百分比(即VEC粘合值百分数)。本发明人相信该数值更为重要，因为它是一个较好的预示变量，用来表示体内外是否存在大量可接受微生物细胞的VEC。相反，采用常规粘附平均值会产生偏差，由此造成对效能的错误解释。例如，在下列三个方案中，技术人员数出粘附在50个VEC群上的微生物细胞数(即，平均粘附值相对于VEC粘合值百分数)，这些方案对体外粘附效能作出了令人惊奇的不同评估：
A.在总数为50个VEC中，技术人员数出1500个微生物细胞粘附于10个VEC上，余下40个不带有粘附微生物细胞的VEC(80％)(在此方案中，所述的10个VEC上分别粘附有150个微生物细胞)。以常规平均值计算，平均粘附值为30个微生物/细胞，并且VEC粘合值百分数为20％。
B.在总数为50个VEC中，技术人员数出1500个微生物细胞粘附于50个VEC上，没有未粘附微生物细胞的VEC(0％)(在此方案中，所述的50个VEC上分别粘附有30个微生物细胞)。以常规平均值计算，平均粘附值仍然为30个微生物/细胞，但是VEC粘合值百分数为100％。
C.在总数为50个VEC中，技术人员数出600个微生物细胞粘附于40个VEC上，余下10个VEC(20％)不带有粘附微生物细胞(在此方案中，所述的40个VEC上分别粘附有15个微生物细胞)。以常规平均值计算，平均粘附值为12个微生物/细胞，并且VEC粘合值百分数为80％。
所以，采用本发明优选的粘附量度(VEC粘合值百分数)；尽管在方案A和B中粘附于各VEC上的微生物平均数相同，但就其粘附效能来说，方案B中有更多的VEC接受了微生物细胞(方案B为100％，方案A为20％)，所以应选择方案B中的微生物而不是方案A中的微生物。实际上，甚至可以选择方案C中试验的微生物而不是方案A的微生物，这是因为，虽然方案C中微生物的常规平均粘附值是12个微生物/VEC，方案A中为30个微生物/VEC，但在方案C中接受微生物细胞的VEC数更多(方案C为80％，方案A为20％)。由上述方案可看出，本发明VEC粘合值百分数是粘附效能的一个灵敏且相关的计算结果。
本发明人认为，“VEC粘合值百分数”比常规平均粘合值更能够预测出微生物细胞在体内长期定居的结果，尤其在考虑乳杆菌在阴道生态系统中表现出的自我调节过程时。据称，当产过氧化氢的乳杆菌种群因变得“过度拥挤”而自我抑制时，可阻止其在阴道内的过度生长。这种内在的安全因素减小过量阴道乳杆菌导致有害作用的可能性。考虑到这种现象，在本发明中，更优选能够分布在较大范围VEC上的栓剂菌株(例如，具有较高的VEC粘合值百分数)作为栓剂菌株，而不是大量细胞仅粘附于少数VEC上的菌株。后一情况似乎使产过氧化氢乳杆菌在少数过度拥挤的VEC上产生自我抑制，由此减少了微生物长期存活和定居的可能性。能够长时间地定居在体内是本发明产品和方法的最终目的，并且可以认为，以较少的乳杆菌细胞粘附于较大量的VEC上将更加有利于达到本发明的目的。在一个实施方案中，根据菌株在阴道上皮细胞上长期定居至少约1个月的能力，可以鉴别出适用于本发明的药物的离体菌株。
适用于本发明药物的乳杆菌的另一个识别特性是产生过氧化氢(H2O2)的能力。如上所述，乳杆菌的过氧化氢可直接杀死其他微生物。在正常的生长条件下，优选乳杆菌能够产生约大于0.5ppm的过氧化氢。在有效的生长条件下，更优选乳杆菌能够产生至少约10ppm的过氧化氢，并且特别优选乳杆菌能够产生至少约20ppm的过氧化氢，所述有效培养条件是指能够促进过氧化氢生产的任何培养基和条件。所述有效培养条件包括体外生长条件(例如，有效培养基和条件)以及体内生长条件(例如成功定居在阴道上皮细胞上)。
可以通过任何过氧化氢产物测定法来定量测出本发明乳杆菌生产的过氧化氢。例如，当将乳杆菌接种在四甲基联苯胺培养基(TMB)中并在厌氧条件下培养时，通过定量测定产生的蓝色颜料的强度，可以检测出产生的过氧化氢。还可以利用市售的过氧化氢试纸(例如EM Sciences出售的试纸)来测定生产的过氧化氢。
在一实施方案中，适用于本发明药物的乳杆菌的另一识别特性是所述乳杆菌在体内外均能长时间保持遗传稳定性。根据本发明，遗传稳定性是指乳杆菌菌株能够连续增殖出基本保持与母代菌株相同的遗传性能的能力。换言之，基因稳定菌株的连续增殖使其DNA可在一定时间内不获得实质性突变。更重要的是，基因稳定菌株的连续增殖在一定时间内不会使上述识别特性之一相关的DNA获得实质性突变。最重要的是，基因稳定菌株的连续增殖不会使与上述识别特性有关的DNA获得实质性突变(例如显著改变编码蛋白质表型的突变)，所述识别特性是阴道上皮细胞粘合值、产过氧化氢能力，或以代谢失活态粘附于阴道上皮细胞的能力。对于已定居在体内阴道上皮细胞的本发明乳杆菌菌株来说，优选其在至少约12个月、更优选至少约18个月、特别优选至少约24个月的阴道内定居过程中保持体内遗传稳定性。在体外，微生物的培养条件以及本发明阴道药物制剂的制备与储存方式均可影响微生物的遗传稳定性。下面将详细描述该条件。由于本发明所述保藏基质的质量优异，在室温或冷冻温度(2-8℃)下将本发明的乳杆菌菌株保藏在本发明的保藏基质内，其在储存期间的体外遗传稳定性优选至少约为12个月，更优选在体外至少约为18个月，并且特别优选至少约为24个月。可以通过突变评估法或识别选择性的遗传标记物对遗传稳定性作出评价。例如，基于限制性内切核酸酶模式的遗传标记物可以使特定培养物建立起比母代菌株更好的遗传性能。本发明人采用重复序列聚合酶链式反应(Rep PCR)从乳杆菌的40个不同菌株中进行辨别，从而确定特定乳杆菌菌株在经过长期体外储存或在体内阴道上皮细胞定居后的遗传稳定性。
在一个实施方案中，适用于本发明药物的乳杆菌的一个识别特性是生产乳酸的能力。乳酸在体外表现出抑制病原体生长的作用。在有效的生长条件下，优选乳杆菌生产至少约0.75mg/100ml的乳酸，更优选生产至少约4mg/100ml的乳酸，特别优选至少约8.8mg/100ml乳酸。
本发明的另一个实施方案中，适用的乳杆菌菌株具有较大的细胞大小。由Bergey氏鉴定细菌学手册提供的典型乳杆菌尺寸是0.8-1.6μm(宽度)×2.3-11μm(长度)。适用于本发明的优选乳杆菌菌株的细胞是宽约1-约2微米，长约2-约4微米。不受任何理论的约束，本发明人认为，本发明乳杆菌菌株细胞的尺寸较大有利于其在生物竞争性排斥作用中用作保护剂。生物竞争性排斥作用是指，本发明的一种或多种栓剂菌株竞争性抑制不需要的细菌菌株生长的能力。这种排斥作用归因于有益乳杆菌细胞(如栓剂菌株)可占据阴道上皮细胞的有效空间，由此阻止病原体或不需要的微生物细胞粘附其中。
本发明的阴道药物还含有一种保藏基质。微生物细胞被悬浮在保藏基质中用于以给药形式保藏和储存。该基质以及微生物培养基、微生物细胞收集法和保藏过程在保存期间均对细胞的成活力以及再水合(例如在阴道内再水合)后保藏细胞的性能产生极大的影响。本发明的保藏基质可以维持阴道菌株的上述所有所需特性。
本发明的保藏基质由使保藏期间受到的损害最小并提供功能特性的组分组成。如下所述，当将本发明的乳杆菌菌株加入到保藏基质中时，优选将其由生长代谢活动态转化为代谢失活态。适用于本发明阴道药物的乳杆菌菌株的另一识别特性是其能够以代谢失活态粘附于阴道上皮细胞。所以，还应将本发明保藏基质配制成最适合微生物细胞复原的保藏基质，以使微生物细胞在体内再水合时可以立刻自由地粘附在阴道上皮细胞上，进而毫不延迟地恢复其全部代谢活性。
本发明的保藏基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。应注意，术语“一种”整体是指一种或多种个体；例如，一种碳水化合物是指一个或多个碳水化合物，或至少是一个碳水化合物。在此术语“一种”、“一种或多种”和“至少一种”可以互换使用。术语“含有”、“包括”和“具有”也可以交换使用。
根据本发明，生物可接受粘合剂是指能够在体内使用(例如在体内没有活性或毒性作用)的粘合剂，其可在保藏过程中将细胞基质固定在下述惰性载体上并可在微生物细胞保藏和储存期间提供保护作用(即，维持细胞成活力)，其中优选蛋白质类粘合剂。适用于本发明保藏基质中的优选的生物可接受粘合剂包括但不限于：水溶性树胶、羧甲基纤维素和/或明胶。生物可接受粘合剂一般是所述保藏基质的约10％-约20％(重量)，优选占所述保藏基质的约14％(重量)。在一个实施方案中，本发明保藏基质含有约占所述保藏基质14％(重量)的明胶。
本发明的保藏基质中所含的抗氧剂可在保藏和储存过程中延缓微生物细胞受到的氧化损害。特别优选的抗氧剂是抗坏血酸钠。通常，所述抗氧剂是所述保藏基质的约0.1％-约1.0％(重量)，优选是保藏基质的约0.5％(重量)。在一个实施方案中，本发明保藏基质含有占所述保藏基质约0.5％(重量)的抗坏血酸钠。
本发明保藏基质所含的多元醇(即多羟基醇类)可在保藏和储存过程中维持细胞蛋白质和细胞膜的天然、非折叠状态。特别是，多元醇与细胞膜之间相互作用并且在保藏过程的脱水步骤中发挥支持作用。适用的多元醇包括但不限于：木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇和/或阿糖醇。多元醇通常占保藏基质的约1％-约12％(重量)，并且优选是保藏基质的约6％(重量)。在一个实施方案中，本发明保藏基质含有约占保藏基质的约6％(重量)的木糖醇。
本发明保藏基质所含的碳水化合物可在保藏和储存过程中维持细胞蛋白质和细胞膜的天然、非折叠态。特别是，碳水化合物可在保藏过程的脱水步骤中维持细胞壁的完整性。优选的碳水化合物包括但不限于：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和/或其他单糖、二糖或多糖。碳水化合物通常占保藏基质的约0.5％-约5％(重量)，并优选占保藏基质的约2.5％(重量)。在一个实施方案中，本发明保藏基质含有约占保藏基质的2.5％(重量)的葡萄糖。
本发明保藏基质所含的蛋白质材料在保藏过程的脱水步骤中为微生物细胞提供进一步的保护作用。优选的蛋白质材料包括但不限于：脱脂乳和白蛋白。蛋白质材料通常占保藏基质的约0.5％-约5％(重量)，并且优选占保藏基质的约1.5％(重量)。在一个实施方案中，本发明保藏基质含有约占保藏基质的1.5％(重量)的脱脂乳。
在本发明的一个实施方案中，所述保藏基质含有：至少占该保藏基质约10％(重量)的生物活性粘合剂，至少为该保藏基质约0.1％(重量)的抗氧剂，至少为该保藏基质约1％(重量)的多元醇，至少占该保藏基质约0.5％(重量)的碳水化合物，和至少占该保藏基质约0.5％(重量)的蛋白质材料。
本发明的一个更优选的保藏基质含有约14％的明胶、约0.5％抗坏血酸钠、约2.5％葡萄糖、约1.5％脱脂乳和约6％木糖醇，以保藏基质重量计。
所述保藏基质的pH对于被保藏微生物细胞的最佳稳定性来说很重要。在基质内制备乳杆菌细胞悬浮液，并调至为不同的pH，可测出该保藏基质的最佳pH。本发明保藏基质的pH通常是约5.0-约7.0，优选pH约为7.0。
除了上述特性以外，适用于本发明阴道药物的保藏基质还可以在体外至少约12个月的时间内保存至少约106个基本纯净且基因稳定的活细胞。如上所述，术语“基本纯净”是指本发明微生物细胞的培养物基本不合有其他不需要的微生物(例如污染物)。上文已讨论了所述细胞遗传稳定性的重要性。在一个更优选的实施方案中，本发明的保藏基质能够在至少约12个月的时间内保存至少约107个、并且特别优选至少约108个基本纯净且基因稳定的活乳杆菌细胞。
在本发明的另一实施方案中，适用于本发明药物的保藏基质优选在至少约18个月的时间内，更优选在至少约24个月的时间内，保存至少约106个基本纯净且基因稳定的活乳杆菌细胞。
本发明的阴道药物既可以储存在室温下，也可以储存在通常约为4℃-约6℃的冷冻温度下。在另一个实施方案中，适用于本发明药物的保藏基质优选能够在至少约12个月的时间内、于室温下保存至少约106个基本纯净且基因稳定的活乳杆菌细胞。在另一个实施方案中，适用于本发明药物的保藏基质优选能够在至少约12个月的时间内、于冷冻温度下保存至少约106个基本纯净且基因稳定的活乳杆菌细胞。
基质所能保藏的活细胞的最低数量对本发明药物的效能是极为重要的，并且这在早于本发明的阴道治疗中已成为问题。具体来说，以药物单位(例如一个栓剂或片剂)分配的基本纯净且基因稳定的活细胞数量直接关系到药物效能的关键问题。在此，术语“效能”是指栓剂菌株表达其生物作用(例如提供具有统计学意义的抗阴道感染的保护作用)的能力。“效价”与每药物单位(即每个栓剂或片剂)中分配的活微生物细胞的数量直接相关。根据本发明，活细胞应具有生长和增殖的能力。就体内有效的乳杆菌药物来说，微生物细胞在阴道上皮细胞上的定居(效价至少约为106)和生物作用(例如由不存在感染态如细菌性阴道病所证实)皆是必须的。本发明人还发现，允许栓剂菌株定居的药物效价不同于显示其生物作用的药物效价。本发明人认为，有效乳杆菌药物必须同时具备将栓剂菌株定居阴道上皮细胞的能力以及生物作用所需的特定效价。具体来说，使栓剂菌株定居在阴道内的微生物活细胞浓度是必需的，但该浓度不一定足以使药物有效。例如，利用本发明的乳杆菌菌株和保藏形式可以在极低的效价(例如105个微生物细胞)下很好地定居在阴道上皮细胞上。但是，在此效价下无法表现其生物作用。所以，要发挥生物作用必须能够定居在阴道上皮细胞上，但缺乏足够效价的定居将无法获得表现生物作用所必须的多种优越性。在体外较长的时间内，以及在向体内阴道上皮细胞的传递时，本发明的保藏基质显示出迄今未发现的、维持生物有效乳杆菌细胞必须效价的能力。
本发明的另一个实施方案涉及了一种制造上述保藏基质的方法。该方法包括步骤(a)提供组分，其中包括：(i)灭菌生物活性粘合剂，其包括水溶性树胶、羧甲基纤维素或明胶；(ii)灭菌蛋白质材料，其包括脱脂乳或白蛋白；(iii)灭菌多元醇，其包括木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇和阿糖醇；(iv)灭菌抗氧剂；(v)灭菌碳水化合物，其包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖；和其它单糖、二糖和低聚糖；和(vi)水；和(b)并且将上述组分混合在一起，形成溶液。所述生物活性粘合剂以液体形式提供，通常需将其加热到约37℃，因为这些粘合剂在室温下似乎是固态。所述保藏基质中的多种组分以及各组分的优选用量已在上文中详细讨论过。可以通过适当的灭菌方法将保藏基质组分灭菌。在一个优选的实施方案中，所述生物活性粘合剂和蛋白质材料可以用高压釜灭菌，而且所述多元醇、碳水化合物和抗氧剂可以经过滤灭菌。在将组分混合形成保藏基质溶液后，可以立刻使用该溶液，或在37℃下短时间放置，或在约-20℃下冷冻。
在一个优选实施方案中，本发明的阴道药物含有惰性载体。在本发明中，惰性载体可以是任何适合在体内使用并且可用于携带或支承本发明细胞悬浮基质(即与微生物细胞结合的保藏基质)的惰性材料，使细胞悬浮基质可以在体外储存和/或体内给药。惰性载体包括但不限于：麦芽糖糊精珠粒和明胶胶囊。下面将对所述载体作详细描述。
本发明的一个实施方案涉及了一种阴道药物，其含有(a)卷曲乳杆菌CTV-05的离体、基本纯净的细菌培养物；(b)一种保藏基质，其中含有约14％明胶，约0.5％抗坏血酸钠，约2.5％葡萄糖，约1.5％脱脂乳和约6％木糖醇。该保藏基质可在体外至少约12个月的时间内保存至少约106个基因稳定的活细胞。此外，该保藏基质保持了卷曲乳杆菌CTV-05的有益特性。这些特性包括，例如，以代谢失活态粘附在阴道上皮细胞的能力，在有效培养条件下生产大于约0.5ppm过氧化氢的能力，或阴道上皮细胞(VEC)粘合值百分数至少约为50％。这些特性在上文中已作详细讨论。
本发明的另一个实施方案涉及了一种阴道药物，其中含有乳杆菌属的至少两种不同离体菌株的基本纯净的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值百分至少约为50％，和(ii)在有效培养条件下，产生大于约0.5ppm的过氧化氢的能力。该阴道药物还含有保藏基质，该保藏基质含有并且保存该细菌培养物。所述基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。该基质可在体外至少约12个月的时间内保存至少约106个基因稳定的活细胞。在一个实施方案中，所述阴道药物还含有惰性载体。
在本发明的该实施方案中，根据各个乳杆菌菌株预防和/或治疗阴道感染的能力来选择每个乳杆菌，所述阴道感染不同于被药物内其他乳杆菌菌株预防或治疗的阴道感染。所述阴道感染可以包括但不限于：细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。例如，在一个优选的实施方案中，所述的阴道药物含有可有效预防细菌性阴道病的第一乳杆菌菌株，以及可有效预防症状性酵母菌阴道炎的第二乳杆菌菌株。在另一个优选实施方案中，第一乳杆菌菌株是卷曲乳杆菌CTV-05，第二乳杆菌菌株是詹氏乳杆菌菌株。
本发明的一个实施方案涉及一种乳杆菌属的离体菌株，这种菌株具有的识别特性包括(a)阴道上皮细胞(VEC)粘合值百分数至少约为50％，和(b)产生多于约0.5ppm的过氧化氢的能力。在另一个实施方案中，优选该离体菌株的VEC粘合值百分数至少约为65％，并且更优选至少约为80％，特别优选至少约为95％。在另一个实施方案中，优选该菌株至少生产约10ppm的过氧化氢，更优选生产至少约20ppm的过氧化氢。
本发明乳杆菌属的离体菌株可以具有一种或多种其它的有益识别特性。所述特性如上所述。具体而言，在一个实施方案中，乳杆菌属的离体菌株能够在阴道上皮细胞内持续定居至少约1个月。在另一个实施方案中，乳杆菌属的离体菌株在至少约24个月的阴道定居中维持其遗传稳定性。在另一实施方案中，当菌株处于代谢失活态(即当处于被保藏态时)时，该菌株粘附在阴道上皮细胞上。该菌株的另一个识别特性是能够使菌株在有效生长的条件下至少生产约0.75mg/100ml的乳酸。在一个实施方案中，该菌株宽约1微米-2微米，长约2微米-约4微米。
在一个优选实施方案中，所述离体菌株是从人体阴道上分离的。在一个优选实施方案中，该菌株是卷曲乳杆菌种或詹氏乳杆菌种。特别优选的菌株具有卷曲乳杆菌CTV-05的所有识别特性，并且首选卷曲乳杆菌CTV-05。
本发明的一个实施方案涉及一种基本具有卷曲乳杆菌CTV-05所有识别特性的乳杆菌菌株。该菌株特别适合用来保护女性阴道不受感染。
本发明的一个实施方案涉及一种在保藏基质中保藏微生物细胞以生成阴道药物的方法。该方法包括步骤(a)将至少约106个微生物细胞的培养物悬浮在保藏基质中以形成细胞基质悬浮液，所述保藏基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；(b)将该细胞基质悬浮液加至惰性载体中形成给药组合物；并且从给药组合物中除去水分。
此方法的另一实施方案是将所述给药组合物置于包装内，从而防止运输和储存期间接触到水分和氧。该包装可以是用于该保护的任何合适的材料，例如聚酯薄膜或金属膜袋。在一个实施方案中，可将该给药组合物包装在独立包装内。另一个实施方案是包装在多室包装中，可以按剂量排列。
常规微生物细胞保藏方法一般采用风干、喷雾干燥或冷冻干燥。风干需要的时间很长，有时甚至需要一些高温。喷雾干燥将细胞暴露在热空气、湍流和过量的氧下。冷冻干燥会造成温度上下波动，并且存在形成冰晶的内在危险。本发明所述保藏基质的一个优点在于，该基质允许利用不同的常规干燥方法除去细胞内的水分，且对微生物细胞的损害极小。本发明阴道药物的制备方法优选还应包括处理步骤，这些步骤似乎可减小细胞在收集、分配和保藏期间的应激，从而最大可能地使终产物具有较长的储存期，并能够释放具有上述有益特性的栓剂乳杆菌菌株的活细胞。应避免的应激包括过多处理步骤、温度波动、使用真空、与水分接触以及长时间处理。该方法优选还限制污染微生物的引入，这是市售的乳杆菌制剂普遍存在的问题。下文将详细讨论特别优选的在保藏基质内保藏微生物细胞的方法。
所有微生物保藏方法均需要干燥或除去水分。微生物中的水分可以以游离态和结合态存在。微生物保藏一定要除去足够量的、两种状态的水分，但是过度地除去结合水也会产生问题。保藏过程中的其它疑难因素包括：除去细胞水分所花费的时间以及处理温度。通常，优选在小心控制温度的同时迅速除去水分，当采用较高温度时尤其如此。
本发明提供了用于保藏微生物的最佳方法，该方法被设计为(1)能够将微生物细胞置于保护性基质中，其中，应将从培养基中收获后的微生物细胞立即加入到所述基质内；(2)在保藏过程中的任何时候都应避免将细胞暴露在超过40℃的温度条件下；(3)避免细胞形成冰晶；(4)避免使细胞处于温度波动范围的上限值或下限值；(5)保藏过程的时间较短，最好少于4小时；(6)避免将细胞暴露在真空或压力下；和(7)避免将细胞暴露在携带有污染微生物的空气中。保藏方法的目标是使最终的药物产品能够直接重新水合在阴道环境内。
在一个实施方案中，将微生物细胞保藏在保藏基质内的方法包括，将细胞基质悬浮液涂层在惰性载体上，优选该惰性载体为麦芽糖糊精珠粒。随后将包衣珠粒干燥，优选流化床干燥法。流化床干燥法是所属领域的常规方法。例如，将麦芽糖糊精珠粒置于流化床干燥机内并在33℃下干燥。将气压设定在14psi，将细胞悬浮基质喷雾在麦芽糖糊精珠粒上并且加热升温至38℃。随后将包衣珠粒干燥一定的时间。将包衣的麦芽糖糊精珠粒作为粉末储存，或装入明胶胶囊内，或压缩成片剂。
在本发明的另一实施方案中，以外原形式将本发明的乳杆菌活细胞释放到阴道环境中的合适的栓剂形式通常为硬明胶胶囊。明胶胶囊可以购得并且是所属领域熟知的。在此实施方案中，上述保藏方法还包括将细胞悬浮基质分装到明胶胶囊内，冷冻该明胶胶囊直至细胞悬浮基质形成了非流体基质且将凝胶固定在明胶胶囊内壁上为止，随后在干燥室内将明胶胶囊干燥。可以采用本领域任何已知的方法来完成分装步骤，其中包括手工操作，半自动和自动机构。冷却步骤是在约4℃-约6℃下进行。明胶胶囊的干燥步骤可以包括步骤(i)将水分含量低于约25％且温度约为24℃-约32℃的干燥空气通入到干燥室内；和(ii)除去干燥室中的湿空气。
在此实施方案中，干燥过程需持续约1-约6小时。所述干燥室包括压缩机、至少一个烃类洗涤过滤器和冷气压缩机，该冷气压缩机任选地装有串联的硅胶干燥剂(或其它适用的干燥剂材料)柱。优选的实施方案中，通入干燥室内的空气(干燥空气)应含有少于约25％的水分，更优选少于约15％，特别优选水分含量少于约5％，水分含量甚至可少至0。所述干燥空气应具有约24℃-约32℃的温度。优选的气流速度是每分钟换气2次。这种方法短时间地将微生物细胞保藏在具有室温空气的受控环境内。另外，可以将微生物细胞直接分配在栓剂给药装置中并在同一装置内以就地方式加以保藏，从而尽可能地维持微生物细胞的有益识别特性。
这种将微生物细胞保藏在基质内的方法的一个步骤是将微生物细胞培养物悬浮在保藏基质内。根据本发明，从培养物中收获微生物细胞，立刻将其以最佳的细胞基质比例悬浮在保藏基质中。这种收获和悬浮过程最好但不是必须在Class 100环境中完成。
本发明的乳杆菌细胞可以在任何可使微生物有效生长的培养基中生长，生长中细胞未被污染，也没有失去遗传稳定性，或失去本发明乳杆菌菌株其它的有益识别和功能特性(如上所述)。具体而言，本发明的乳杆菌菌株可以生长在含有可同化有机碳源、可同化氮源、适当盐和痕量金属的培养基中。适合培养本发明乳杆菌菌株的一种优选培养基是MRS培养基。在实施例部分将详细描述MRS培养基。
可以在常规培养条件下培养本发明的乳杆菌微生物，其中包括但不限于琼脂表面培养法或肉汤发酵法。琼脂表面培养和肉汤发酵法均是所属领域技术人员为熟知。优选将所述乳杆菌在厌氧或微需氧下培养。
培养基的温度可以是任何适合于乳杆菌生长的温度。例如，在将接种物接种在培养基前，可将该培养基置于并保存在约20℃-约35℃的温度下，更优选在约25℃-约35℃的温度下。
将本发明乳杆菌菌株的活性生长培养物以足够的量接种在培养基内，经过合理的生长阶段后，达到适于向保藏基质内转移的细胞密度。以细胞干重计，典型细胞接种密度是约106CFU/ml-约109CFU/ml，更优选约108CFU/ml-约109CFU/ml。此后细胞继续生长，细胞密度达到约107CFU/ml-约109CFU/ml，更优选约108CFU/ml。此时，收获细胞，将其保藏在保藏基质中。
在本发明该实施方案的第一步中，当达到预期的细胞密度后，优选采用例如离心法来收获微生物细胞。将至少约107个微生物细胞，更优选至少约108个微生物细胞，特别优选至少约109个微生物细胞悬浮在保藏基质中。在将细胞加入基质之前，用盐水缓冲液洗涤这些细胞。保藏基质与微生物细胞的混合物在此称作细胞悬浮基质。在此后将该基质加至惰性载体的操作过程中，一般将该细胞悬浮基质保持在连续搅拌和30-40℃的条件下。所属领域普通技术人员应该理解在此公开的多种基础培养、收获和悬浮步骤，以及诸如此类的步骤的变型，本发明包括这些变型方案。
本发明的另一个实施方案涉及一种保护女性阴道不被感染的方法。该方法包括给女性施用一种阴道药物，该阴道药物中含有(a)至少约106个离体乳杆菌属菌株的基本纯净的细菌培养物，其具有的识别特性包括(i)VEC粘合值百分数至少约为50％，和(ii)生产大于约0.5ppm的过氧化氢的能力。该阴道药物中还包括(b)保藏基质，其含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白材料。在另一个实施方案中，该阴道药物含有上述惰性载体。所述保存基质可在体外至少约12个月的时间内保藏至少约106个基本纯净并且基因稳定的活细胞。
上述许多实施方案在前面已作了详细描述。本发明的阴道药物可有效地预防多种阴道感染，其中包括但不限于：细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。
按照本发明所述，“保护女性阴道不被感染”是指减少女性出现阴道感染的可能性。最好是将阴道感染的可能性减小到使女性在和阴道感染物接触时未感到不适和/或机能发生改变的程度。例如，“保护女性阴道不被感染”是指在给女性给药时，本发明阴道药物具有防止阴道感染出现或复发的能力。
本发明的一个实施方案涉及了一种治疗阴道感染的方法，该方法是将本发明的阴道药物施用给患阴道感染的妇女。在此，“治疗阴道感染的妇女”是指本发明阴道药物治愈或改善感染症状、迹象或诱发因素的能力。
施用给女性以预防或治疗阴道感染的单剂阴道药物优选含有至少约106个，更优选至少约107，特别优选至少约108个基本纯净且基因稳定的乳杆菌活细胞，这些细胞具有上述识别特性。一个优选的给药方案包括给药剂量和给药次数，而且这些很容易由所属领域技术人员判断。在一个实施方案中，每天至少施用1次单剂量药物并且持续约2天；或，在另一个实施方案中，每天至少施用1次并且约连续3天。在又一个实施方案中，每天至少施用2次并且连续3天。如果需要，所述剂型可以重复给药，例如按月给药。本发明的阴道药物可以经口服、阴道或直肠给药，在此还包括其它可以将所述微生物释放到所需作用部位的给药方式。优选的给药形式是栓剂(例如，片剂或胶囊)。
本发明阴道药物的给药可以与(例如同时、之前和/或之后)其它可有效预防或治疗阴道感染的疗法相结合。例如，可以将阴道药物与抗生素联合给药。
本发明的一个实施方案涉及一种通过给人体施用本发明的药物而减小人体被人免疫缺损病毒(HIV)感染的危险的方法。优选该药物将感染HIV的危险至少减小约2倍，更优选至少减小约4倍，特别优选至少减小约6倍。能够接受这种药物的人体可以是男性，也可以是女性。女性可以经口服、阴道或直肠给药，男性可以经口服或直肠给药。在一个优选的实施方案中，每天施用1次单剂量药物并持续2天。
本发明的另一个实施方案是一种通过给人体施用本发明的上述药物而预防症状性酵母菌阴道炎的方法。在一个优选实施方案中，该药物含有卷曲乳杆菌CTV-05。
本发明的一个实施方案是一种防止早产(preterm birth)的方法。如上文所述，细菌性阴道病是一种妊娠中最常见的生殖器感染。在妊娠的第4-6月被诊断患有细菌性阴道病的妇女比未患有细菌性阴道病的妇女多40％可能生下早产、低出生体重儿。本发明预防早产的方法包括给妊娠妇女施用(a)抗生素和(b)本发明上述阴道药物。优选的剂量是上文中用该阴道药物预防阴道感染的给药剂量。适合与本发明阴道药物联合给药的抗生素包括任何可有效治疗阴道感染的抗生素。这些抗生素为所属领域公知。
本发明的另一实施方案涉及一种有助于雌激素在阴道和肠中代谢的方法。雌激素过多是妇女所患的一种病症，可利用本发明的药物治疗该病症。本发明的乳杆菌菌株似乎有助于雌激素在阴道和肠内进行适度代谢。此方法包括给女性施用本发明的上述药物。该药物可以经阴道、口服或直肠给药。剂量范围基本类似于治疗阴道感染所用的剂量。
如上所述，虽然本发明药物的上述讨论主要针对用本发明药物来治疗阴道感染，但本发明的药物不只是局限在治疗阴道感染或只与阴道有关。例如，可利用本发明的药物治疗胃肠道疾病或感染。在这种情况中，该药物称作胃肠道药物。本发明的胃肠道药物具有本发明阴道药物的全部区别特征，其含有乳杆菌属离体菌株的基本纯净的细菌培养物，其所具备的识别特性包括(i)阴道上皮细胞(VEC)粘合值百分数至少约为50％和(ii)生产约0.5ppm以上的过氧化氢的能力。在另一个实施方案中，适合治疗胃肠道感染的起始菌株具有低于阴道用药物的VEC粘合值和/或过氧化氢生产值，但仍然保持了胃肠道药物的有效性。所述胃肠道药物还含有保藏基质，其含有并保藏所述细菌培养物。该基质含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料。该基质能够在体外至少约12个月的时间里保存至少约105个基因稳定的活细胞。所述胃肠道药物可含有惰性载体，其包括麦芽糖珠粒或明胶胶囊。适用于胃肠道的药物可经过任何使微生物药物到达并粘附在胃肠道细胞上的途径给药。所述给药方式包括但不限于口服和直肠给药。
下列实施例用来说明本发明但不对本发明的保护范围构成限定。
实施例
实施例1
以下的实施例验证了选择适合用于本发明的乳杆菌属菌株的方法。
从6名健康、无性病史妇女的阴道中分离出6种乳杆菌菌株，评估这6种不同乳杆菌菌株的一系列有益特性。需要对这6种菌株的纯度、对阴道上皮细胞的粘附能力、遗传性能的稳定性、产过氧化氢的能力，以及长期储存的成活稳定性进行评估。入选的适用菌株应具备：纯度(即，无污染微生物)，可通过对母代菌株的基本纯净培养物的维持能力来确定；阴道上皮细胞粘合值百分数至少约为80％；稳定的遗传性能，通过鉴别其中培养细胞的遗传性能和母代菌株相同的菌株，从而评估遗传性能是否稳定；可接受的产过氧化氢能力，利用在TMB培养基中厌氧孵育生成的亮蓝色颜料来评估；可接受的成活稳定性，根据本发明药物在至少约12个月期间在4-6℃和室温条件下保持107-108菌落形成单位(CFU)的能力来评估。
以菌株CTV-05(卷曲乳杆菌)作为栓剂菌株的最佳选择是基于：粘附试验；对病原微生物的体外抑制作用；和，在不同条件的储存中，保藏态菌株的有益特性(例如以代谢失活态粘附在阴道上皮细胞的能力)的稳定性。生长在MRS培养基上的CTV-05细胞宽1-2微米、长2-4微米。
采用下列特定方法来检测是否存在本发明适合的乳杆菌菌株的有益特性。
(1.1)菌株的纯度：利用DNA指纹法特异性地区分开栓剂菌株和其它菌株，以确定栓剂菌株的纯度(即，在培养物中不存在污染微生物)。DNA指纹法是由重复序列聚合酶链式反应(Rep PCR)来完成。为了确定Rep PCR法是否能够区分开栓剂菌株(CTV-05)和内源性卷曲乳杆菌，从育龄妇女的阴道回收40种卷曲乳杆菌菌株，将它们与CTV-05进行比较。利用全染色体DNA同源物(whole chromosomal DNA homology)对卷曲乳杆菌ATCC33197的调控来测定卷曲乳杆菌种的同一性。所有分离出的卷曲乳杆菌均在4072和1400碱基对处具有双带，在3500、750、520、350和220碱基对处为单带，这提示了这些重复DNA序列是所有卷曲乳杆菌所共有的(未列出数据)。栓剂菌株(CTV-05)在2500-1500碱基对区域内存在不同于其它菌株的四个带。在此碱基对区域中，CTV-05的指纹由2500和1500碱基对处的强带以及2000和1736碱基对处的低扩增带组成(未列出数据)。
(1.2)对阴道上皮细胞(VEC)的粘附作用：取样后立刻将阴道上皮细胞转移到pH为7.2的MEM组织培养基中，将其在注射器中洗涤3次并且经8μ滤器(微孔)过滤，该滤器可以保留下阴道细胞但允许细菌通过。将总共105个经洗涤的阴道细胞加入到109乳杆菌/ml的悬浮液(用计数室计算)中，在37℃下孵育2.5小时。经洗涤和过滤后除去未粘附的乳杆菌，用革兰氏染液将阴道细胞染色。对粘附在上皮细胞上的乳杆菌数量进行计数，并且用装有照相机的光学显微镜记录。计算出粘附在每个细胞上的乳杆菌细胞的平均数(平均粘附值)和VEC粘合值百分数。VEC粘合值百分数是指至少粘附有一种乳杆菌的VEC数相对于一组被识别VEC的总数的百分比，用该值可以判断出一种特定菌株是否具有可入选的有益粘附特性。由于进行中的粘附研究需要经常提供阴道上皮细胞，所以应将阴道上皮细胞预洗涤并且储存在-70℃下直至使用为止。该技术为新收集的阴道上皮细胞提供了参比结果，这种细胞具有1小时的寿命。
表1和表2表示使用冷冻VEC的体外粘附试验，这些VEC来自于最常见的ABO血型的供体。表1所示的体外试验结果证实了活性生长的菌株CTV-05在VEC上的粘附作用。菌株CTV-05(Lot LB-022)以栓剂形式被保藏(在实施例3将详细描述)。在试验前，将栓剂在室温(RT)和冰箱(Ref.)温度下储存5.5个月。应注意，上述试验中所用的菌株CTV-05的细胞不处于活性生长代谢态是重要的。将含有CTV-05的栓剂直接置于McIlVaine氏缓冲液(pH4.5)中，但微生物细胞预先不能生长为活化态。随后将细胞直接加入VEC。结果是(1)CTV-05/50个VEC的对数平均粘附值(X±1标准偏差)，(2)在总数为50个VEC中每个VEC上粘附的CTV-05的实际范围，和(3)VEC粘合值百分数(％VEC ADH)。表1中的术语含义如下：1X±1STD＝LAB/50个VEC的对数平均粘附值，±1标准偏差；2范围＝在总数为50个VEC中每个VEC上粘附的LAB的实际范围；3％VEC ADH＝在冷冻(Ref.)和/或室温(RT)条件下储存5.5个月后，由50VEC表现出的LAB菌株CTV-05(Lot LB-022)粘附的百分率；和*抚育菌母。
                                                 表1
     血型 年龄 周期(天数) 培养物H2O2 LAB 量度 VEC阴性对照 LB-022冷冻 LB-022室温
 ABO Rh
 O 阳性   33 7 阳性   X±1STD1 0 28.5±2.3 26.5±2.1
  范围2 0-3 4-＞200 4-103％
  ％VEC ADH3 10％ 100％ 100
 O 阳性   32 15 阳性   X±1STD 0 17.4±2.9 18.9±3.5
  范围 0 0-112 0-＞200
  ％VEC ADH 0％ 94％ 98％
 O 阳性   38 20 无生长   X±1STD 1.5 26.5±2.1 27.3±2.4
  范围 0-6 5-＞200 0-＞200
  ％VEC ADH 16％ 100％ 98％
 O 阴性   23 17 阳性   X±1STD 0 18.3±2.5 25.0±2.5
  范围 0-1 0-8B 3-＞200
  ％VEC ADH 2％ 98％ 100％
 A 阴性   *26 8mos 酵母   X±1STD 0 27.7±2.4 34.4±2.4
  范围 0-5 0-＞200 3-＞200
％VEC ADH 6％ 98％ 100％
 A 阳性   31 3 阳性   X±1STD 2.9 30.2±3.0 30.2±3.1
  范围 0-87 1-＞200 1-＞200
  ％VEC ADH 40％ 100％ 100％
 A 阳性   24 37 阴性   X±1STD 2.4 20.4±2.7 26.2±2.6
  范围 0-79 2-125 3-144
％VEC ADH 48％ 100％ 100％
B 阳性 35 13 无生长   X±1 STD 3.4 5.8±3.5 6.1±6.1
  范围 0-28 0-65 0-184
  ％VEC ADH 16％ 86％ 84％
  总平均值#LAB/VEC％VEC/ADH 1.317.3％ 21.997％ 24.397.75％
来自8个VEC供体的菌株CTV-05的细胞在室温下储存后，其平均粘附值为21.9个细胞/VEC。来自8个VEC供体的菌株CTV-05的细胞在冷冻条件下储存后，其平均粘附值为24.3个细胞/VEC。各个VEC供体的粘附范围都相当宽(即，0-200个CTV-05细胞/VEC)。然而，表现出粘附有栓剂菌株的至少一种细胞的VEC的百分率(VEC粘合值百分数)对在室温储存的CTV-05为97％，对在冷冻温度下储存的CTV-05为97.75％。
这些结果表明，CTV-05菌株细胞在体内较容易定居在人体VEC上，这是由于它们在从栓剂释放后能够立刻仍以代谢失活态粘附在体外VEC上。一旦保藏细胞粘附在VEC上，就可以预知它们能够复苏并且增殖(即定居)，而不是从阴道环境中流失。
表2表示多个试验的结果，其中，将由肉汤或琼脂培养基得到的失活CTV-05直接加至存在于McIlvaines缓冲液(pH4.5)中的VEC。随后将该缓冲液直接加入来自人体的预冷冻VEC中。另外再将活性生长CTV-05加至预冷的VEC中。表2列出与上表1相同的参数。表2的结果表明，失活CTV-05(即来自保藏态)可粘附在VEC上，其粘附作用等同于或优于以代谢活化态加入到VEC的CTV-05。
                                                         表2
                  供体资料 量度                   冷冻VECs，Mcllvmines缓冲液pH4.5
  血型   年龄 人种     周期天数 革兰氏菌株分值 VEC阴性对照     活化LAB             失活LAB
  琼脂   内汤
  A+   25 C     17   9 X±1STD NA     13.0±5.0   未检测   3.1±3.2
范围 0-1     0-＞200   0-＞200
％VEC ADH 1％     66％   38％
  B+   35 C     13   9 X±1STD NA     5.7±3.3   19.4±3.9   7.3±4.7
范围 0-5     0-61   1-＞200   0-＞200
％VEC ADH 16％     68％   100％   60％
  A+   24 C     37   8 X±1STD NA 8.5±3.3 58.9±2.1 10.9±3.6
范围 0-5     0-133   7-＞200   0-＞200
％VEC ADH 24％     94％   100％   98％
  0+   38 C     20   6 X±1STD NA     14.1±2.3   60.9±2.1   15.9±3.1
范围 0     1-122   11-＞200   1-66
％VEC ADH 0％     100％   200％   100％
  A-   26 C     8mos.   4 X±1STD NA     52.1±3.6   未检测   6.5±3.0
范围 0-3     0-＞200   0-56
％VEC ADH 10％     96％   99％
  0+   22 C     7   4 X±1STD NA     36.3±2.7   未检测   7.8±3.1
范围 0-16     0-＞200   0-96
％VEC ADH 4.8％     92％   92％
  A+   31 C     3   4 X±1STD NA     17.7±3.2   96.1±2.3   6.4±3.9
范围 0-3 0-＞200 14-200 0-＞200
％VEC ADH 6％     94％   0-＞200   46％
AB+ 39 B 24 4 X±1STD NA 5.1±3.4 47.3±2.5 7.1±3.5
范围 0-3     0-109   2-＞200   0-178
％VEC ADH 6％     70％   100％   72％
  0+   33 C     7   2 X±1STD NA     51.9±3.0   21.4±2.5   5.7±2.8
范围 0-5     0-＞200   1-＞200   1-98
％VEC ADH 14％     94％   100％   100％
  0+   32 C     15   2 X±1STD NA     16.4±4.0   1.9±2.1   6.9±3.3
范围 0-5     0-216   0-11   1-＞200
％VEC ADH 8％     96％   38％   80％
总平均值 ％LAB/VEC 22.1 43.7   7.76
％粘附值     77.6   91.1   78.4
(1.3)遗传性能的稳定性：在适当的时候，进行基于限制性内切酶图谱的遗传标识分布，以确定保藏后的遗传性能稳定性，从而证实栓剂菌株在人体体内试验中的定居性能，并用作市售制剂中菌株识别的一种方法。在心浸液肉汤中，乳杆菌生长至中对数相(mid log phase)，该肉汤中还添加有葡萄糖、淀粉和1％血清。用10mm Tris缓冲液抽提DNA，该缓冲液中含有50mM EDTA、变溶菌素(Miles实验室，Naperville，IL)及迄今已证实对于嗜酸乳杆菌有效的赖氨酸溶液。分别选用3种限制性内切酶用于各个分离物：HindIII，BamHI和EcoR1(Bethesda研究实验室，Inc，Gaithersburg，MD)。在Tris硼酸盐缓冲液(pH8.3)中，令DNA片段在0.7％琼脂糖凝胶(Seakem-Me；FMS Corp.，Marine Colloids Division，Rockland，ME)中和25V下电泳15小时。用1μg/ml溴化乙锭将凝胶染色30分钟。用短波长紫外线显示出DNA片段并照相。按照下列公式计算出DNA指纹间限制性内切酶的相似程度：
相似程度＝100％-(Nd×100)/Ns
其中Ns代表被对比的2个DNA指纹带的总数，Nd代表只出现在1个指纹中的带的数目。我们已研制出一种检测菌株特异性的标识DNA探针，可以用该探针来鉴别栓剂菌株。DNA同源性试验同样证明栓剂菌株存在于任何给定点。
(1.4)产过氧化氢的性能：将菌株接种在四甲基联苯胺培养基(TMB)中并且在37℃和厌氧条件下孵育2-3天。产过氧化氢菌落在与环境空气接触时可产生出一种蓝色颜料。另外可采用EM Science生产的过氧化氢检测试纸。将被试剂浸渍的试纸部分插入乳杆菌菌落，所得蓝色的强度作为过氧化氢浓度的定量量度。
(1.5)成活力的稳定性：保留各个评估过的菌株样本以用于室温和冷冻条件的储存期实验。在选定的时间间隔时，利用平板计数技术和MRS琼脂来测试样本中菌落形成单位的数量。测试在55℃、45℃、35℃、室温和冷冻温度下保存期间明胶胶囊栓剂中的CTV-05菌株。此试验是一种储存期加速(accelerated shelf-life storage)模型，可用于检验市售产品在整个全球分销网络运输时可能遇到的不利条件下的稳定性。图1表示高温试验的结果，和图2提供了低温长期储存的结果。冷冻产品的菌落数在5个月中维持稳定在108/个栓剂，菌落也未失去其有益特性。储存在室温下的产品中的菌落数在4周内一直稳定在108/个栓剂。在第4周和第9周之间，菌落数减少到9.8×107/个栓剂，并且维持在107/个栓剂25个月。产过氧化氢能力在此期间也能够维持稳定。
在pH为4.0-7.0的范围内评估保藏基质对微生物存活力的作用(未列出数据)。这个pH范围代表从正常妇女pH(4.0-4.5)、细菌性阴道病妇女pH(5.0-6.0)和行经妇女pH(7.0)观察到的pH范围。微生物的成活力在整个pH范围内可以被接受，其中以pH7.0最佳。
实施例2
以下实施例表示细胞与保藏基质的最佳比例的测定，该比例可提供高成活数量的保藏菌株CTV-05的细胞。
进行测定悬浮培养基的保藏能力的试验，试验通过在每1体积培养基中加入不同数量的菌株CTV-05的细胞而进行。令乳杆菌在2平方英寸的MRS琼脂平板上厌氧生长。2平方英寸的琼脂等同于10ml肉汤。各平板的预期产量为2×109CFU。将被接种的基质保藏在30微升的等份样本中。表3给出最佳结果，该结果是在第8号平板中用48小时的老CTV-05菌株细胞/5ml基质的配比而得到的。该数据还进一步证实，细胞对保藏基质的最佳比例能够提供高成活数量的保藏CTV-05菌株细胞。
平板号 预期产量/30μl                                实际产量
           24小时的生长期            48小时的生长期
干燥前 干燥后  干燥前     干燥后
4 5.3×107 7.9×107 1.1×107  6.0×108     6.1×108
6 7.9×107 1.9×108 2.1×107  7.8×108     3.0×108
8 1.1×108 6.9×107 3.6×107  9.8×108     4.3×108
10 1.3×108 6.7×107 4.0×107  1.5×109     4.1×108
实施例3
本实施例描述一种制备本发明阴道药物的具体方法。
所有试验中使用的MRS培养基组成如下：10g第3号细菌用腙蛋白胨，10g细菌用牛肉膏，5g细菌用酵母抽提物，20g细菌用葡萄糖提取物、1g吐温80，2g柠檬酸铵，5g醋酸钠，0.1g硫酸镁，0.05g硫酸锰和2g磷酸氢二钾，用试剂级水将上述组分稀释至1000ml。所谓MRS琼脂，是指将10g琼脂加入到上述混合物中。在25℃下将该培养基调至pH6.5±0.2。
保藏基质制备如下。将2X明胶(例如137.5g/500ml试剂级水)和4X脱脂乳(例如15g/250ml试剂级水)在约121℃下压热约15分钟。将4X木糖醇(例如59g/250ml试剂级水)和4X葡萄糖(例如25g/250ml试剂级水)混合在一起，调至pH7.2-7.4，并且用0.22微米的滤器过滤灭菌。随后将灭菌的组分混合成一种溶液(明胶基质)并且储存在2-8℃下。将抗坏血酸制备成5％(重量)溶液，用0.22微米的滤器过滤灭菌，将其分成适合使用的等份体积，并且储存在-20℃下。在制造阴道药物时，将明胶基质熔融并且调节(temper)至约35℃，并将5％的抗坏血酸溶液加入明胶基质中，抗坏血酸溶液和明胶基质的配比为1∶10，形成保藏基质。
为了制造阴道药物，将约106-约109CFU/ml培养基的乳杆菌菌株接种在MRS培养基中。在20-35℃和厌氧或微量需氧条件下培养接种物，直至培养物的细胞密度从约107达到约109CFU/ml培养物为止。
在1400-1600rpm下离心5分钟后收获细胞。将上清液倾析到废容器中，或捞出其它副产物。将细胞球粒重新悬浮在磷酸盐缓冲液盐水(PBS)内并且在1400-1600rpm下离心5分钟。弃去该洗涤步骤中所得的上清液。随后将压实的细胞重新悬浮在1份磷酸盐缓冲液和10份保藏基质中。轻轻和完全地将该细胞基质悬浮液混合，并且在连续搅拌的同时储存在35℃±5℃下。
为了形成完整的阴道药物，装配出带有灭菌元件的流化床干燥器以备使用。将麦芽糖糊精珠粒置于流化床干燥器内，并且在33℃下干燥直至充分干燥为止。随后将气压设定在14psi，用蠕动泵将上述细胞悬浮基质喷雾到麦芽糖糊精珠粒上。在将50％的细胞基质悬浮液喷雾到麦芽糖糊精珠粒上后，加热升温至38℃。待将所有细胞基质悬浮液喷雾到珠粒上后，再在约38℃下将包衣珠粒干燥约15-30分钟。冷冻包衣的麦芽糖糊精珠粒，作为粉末储存，装入明胶胶囊中，或压缩成片剂，以用作阴道药物。
实施例4
以下的实施例用于证明Rep PCR对评估不同批次卷曲乳杆菌栓剂的有效性。
评估在约2年期内制得的6个不同批次卷曲乳杆菌CTV-05的纯度和遗传指纹稳定性。当在富含碎肉的肉汤中进行厌氧孵育时，所有被评估的批次均未被污染。此外，将不同批次的卷曲乳杆菌以小规模制备，而按比例扩大制备的批次皆具有相同的指纹(未列出数据)。这些数据显示，卷曲乳杆菌CTV-05栓剂在储存数年后仍保持成活力、纯度和遗传稳定性。另外，批次间的栓剂菌株DNA“指纹”未出现差异(未列出数据)。
实施例5
以下的实施例验证了，存在于栓剂内的本发明乳杆菌可在体内重新定居在正常、健康妇女阴道内。
在此开放性试验中，将含有约109个产过氧化氢活的卷曲乳杆菌CTV-05的乳杆菌栓剂施用给9名妇女，每天给药2次共3天。这9名妇女均无生殖器感染记录，并且其中8名妇女具有内源性乳杆菌记录。在使用了最后一个栓剂胶囊后跟踪观察2-3天，所有妇女均有栓剂菌株定居，并且其中8名妇女的菌株可连续定居1个月。在显微镜下，无一妇女有感染迹象(例如，通过评估阴道血涂片的白细胞)，并且没人抱怨有副作用。
许多妇女的阴道和直肠已定居有乳杆菌，所以可采用重复序列聚合酶链式反应(Rep PCR)技术作出卷曲乳杆菌的栓剂菌株的指纹，由此从内源性乳杆菌菌株区分出栓剂菌株。由第一临床中试试验获得的指纹结果表明，卷曲乳杆菌CTV-05栓剂的遗传指纹在阴道定居数月后保持不变。
患者102的记录是定居有非卷曲乳杆菌。在使用栓剂后1周时随访，有3种乳杆菌菌株定居，其中包括(1)栓剂菌株，卷曲乳杆菌CTV-05；(2)与她以往记录相同的菌株定居；和(3)一种与CTV-05和所记录菌株不同的新乳杆菌菌株(未列出数据)。在1个月随访时，患者仍定居有卷曲乳杆菌CTV-05，以及第一次随访时存在的乳杆菌菌株和记录在册的菌株(未列出数据)。1年后对该患者进行评估，发现她只定居有栓剂菌株，卷曲乳杆菌CTV-05。这些试验证明，本发明人能够取得卷曲乳杆菌CTV-05的栓剂菌株的指纹，并且也证明经过阴道定居数月后仍包括在体内保持这种遗传指纹。
患者103的记录定居有乳杆菌，但不是卷曲乳杆菌。在使用CTV-05栓剂(每天2次共3天)后1周随访，她定居有CTV-05和另一种乳杆菌菌株(未列出数据)。4周后，该妇女仍然定居有CTV-05和第一次随访时携带的乳杆菌菌株(未列出数据)。
实施例6
本实施例是一个验证本发明乳杆菌可在体内在栓剂内重新定居在阴道病复发妇女的阴道内的体内试验。
在此试验中，一组患有复发细菌性阴道病(BV)的妇女接受2％氯林可霉素膏的治疗，每天1次共3天，随后用含有卷曲乳杆菌CTV-05菌株的乳杆菌栓剂治疗，每天2次共3天。用氯林可霉素单独治疗一组相同诊所的患有相同复发细菌性阴道病的妇女作为比较。对这些妇女在治疗完毕后的第1周、1个月和3-4个月时进行随访。评估患者阴道内存在的产过氧化氢乳杆菌，以及是否有细菌性阴道病感染。
此试验的结果如表4所示。表4显示，在患有复发细菌性阴道病的妇女中，在治疗后各个阶段的评估中，用氯林可霉素霜和卷曲乳杆菌CTV-05栓剂共同治疗的一组妇女具有比只用氯林可霉素霜治疗的妇女明显定居有更高百分数的产过氧化氢乳杆菌。
        定居有产过氧化氢乳杆菌妇女的百分率
 评估时间 只用氯林可霉素治疗n＝15 用氯林可霉素和乳杆菌栓剂治疗n＝15
 用药前 5(33％) 4(27％)
 治疗后1周 1(7％) 10(67％)
 治疗1个月 6(40％) 12(80％)
 治疗后3个月 5(33％) 10(67％)
为了确定存在的产过氧化氢乳杆菌是否归功于所用栓剂，在严格杂交条件下用来自栓剂菌株的纯化DNA对这些乳杆菌的DNA杂交。此外，通过4-甲基系散形基(4-methylumbelliferyl)底物来检测预形成的酶，从而测定各分离物的指纹。在只接受氯林可霉素治疗的一组妇女中，无一妇女获得与栓剂相同的乳杆菌菌株。相反，用氯林可霉素和乳杆菌栓剂共同治疗组的所有妇女均在治疗后定居有含栓剂菌株的乳杆菌菌株。
表5显示，接受氯林可霉素和卷曲乳杆菌CTV-05治疗的妇女在治疗后1个月时，未感染细菌性阴道病的妇女达到100％，与其相比，只接受氯林可霉素治疗的妇女中仅有53％未感染细菌性阴道病。同样，在治疗后的第3个月，在接受氯林可霉素和卷曲乳杆菌联合治疗的妇女中，未感染细菌性阴道病的妇女达到54％，而只接受接受氯林可霉素治疗的妇女中只有26％未被感染。这些数据表明，本发明的卷曲乳杆菌CTV-05可以降低细菌性阴道病的复发。
           无细菌性阴道病妇女的百分率
评估时间 只用氯林可霉素治疗 用氯林可霉素和乳杆菌栓剂治疗
治疗后1周 13/15(87％) 15/15(100％)
治疗1个月 8/15(53％) 13/13(100％)
治疗后3个月 4/15(26％) 7/13(54％)
实施例7
以下的实施例是一个验证本发明乳杆菌可在体内在栓剂中重新定居在患有细菌性阴道病妇女阴道中的体内试验。
在此试验中，给13名患有细菌性阴道病的妇女施用卷曲乳杆菌CTV-05栓剂，每天2次共7天。本试验的目的是评价乳杆菌栓剂是否适合治疗细菌性阴道病。在10名妇女中有1人在1周后的回访时，其细菌性阴道病已被治愈。乳杆菌培养物在基线活动，而且随访表明，10名患细菌性阴道病的妇女中有7人已成功地定居有栓剂菌株(未列出数据)。这些妇女中无一人因使用了卷曲乳杆菌CTV-05而产生副作用，并且她们在目测和显微镜下均无炎症迹象。
实施例5、6和7中的试验证明，本发明乳杆菌可在栓剂中将乳杆菌重新定居在阴道内。约有50名妇女在临床试验中接受卷曲乳杆菌CTV-05栓剂的治疗。这些妇女中无一人因使用了栓剂而产生副作用。这些中试验数据还表明，具有菌株CTV-05优选特性的卷曲乳杆菌在以明胶胶囊形式插入阴道内给药时，能够1)成功地定居在具有正常阴道菌丛的妇女的阴道内，并且这种定居可在1个月后仍保持在80％以上；2)可以定居在患有活动性细菌性阴道病的妇女中；3)治疗后仍可定居在患有细菌性阴道病的妇女中；4)可以减少治疗后细菌性阴道病的复发(如实施例5所示，在治疗后1个月，可降低所有个体细菌性阴道病的复发)。此外，本发明人开发了一种取指纹的方法，该方法可以鉴别人体试验中卷曲乳杆菌的栓剂菌株。
实施例8
本实施例证明，本发明保藏基质对维持微生物在保藏及储存期间的成活力优于工业生产标准脱脂乳基质。
冷冻干燥(例如冻干)在长期微生物保藏中早已成为一种可接受的方法。脱脂乳是一种被美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)采用的标准冷藏基质，并且常用于乳品工业。在下列试验中，本发明人根据若干参数证实本发明保藏基质优于此脱脂乳工业标准。
将已在MRS琼脂上生长24小时的5ml悬浮细胞接种在500mlMRS肉汤中以使卷曲乳杆菌CTV-05细胞生长，所述细胞在35℃经厌氧条件孵育。在厌氧条件下接种的肉汤在35℃下孵育48小时后，将肉汤离心浓缩得到乳杆菌。
将从500ml肉汤得到的全部细胞产物与50ml本发明保藏基质或50ml10％脱脂乳混合，形成悬浮液。随后将各悬浮液等分为两个半份。分出各悬浮液的一半以便风干，风干时的干燥剂为硅胶(LB107＝保藏基质和LB109＝脱脂乳)，同时分出各悬浮液的另一半冻干(LB106＝保藏基质和LB108＝冻干)。
将产物悬浮和/或再水合在MRS肉汤中，并且用MRS肉汤配制出10倍稀释液，从而得到保藏前后的菌落形成单位(CFU)数。在MRS琼脂上制备出3个连续稀释液的涂布平板，并且在厌氧条件和35℃下孵育48小时。
如表6所示，在两种保藏过程中，当将微生物保藏在本发明的保藏基质中时，其成活力没有显著损失，但是，保藏在工业标准脱脂乳中的微生物在两种保藏过程中失去了1个对数的成活力。
                         表6
 批次 基质 方法            CFU
  保藏前     保藏后
 LB-106 保藏基质 冷冻干燥   9.5E+08     5.4E+08
 LB-107 保藏基质 风干   9.5E+08     8.4E+08
 LB-108 脱脂乳 冷冻干燥   5.8E+08     7.9E+07
 LB-109 脱脂乳 风干   5.8E+08     2.8E+07
将等份的上述各参照批次储存在35℃和44.5℃下，以进行加速储存期研究。在6小时间隔时，按照上述方法测定CFU。结果如图8-11中所示。
表7列出实际CFU数。数据被转换为对数，从而绘制出附图。
                                                                表7
组成 温度                                           相对时间(小时)的CFU
 0  6  12 18  24  30  36  42 48
保藏基质风干5LB-107 35℃44.5℃ 8.40E+088.40E+08 8.10E+083.50E+08 5.60E+081.80E+08 4.10E+078.60E+05 2.80E+082.30E+07 3.00E+086.40E+05 2.40E+086.80E+05 2.60E+081.30E+06 5.70E+087.10E+08
脱腊乳风干LB-109 35℃44.5℃ 2.80E+072.80E+07 4.10E+063.10E+05 2.60E+068.20E+04 8.80E+043.70E+04 1.40E+061.00E+01 3.30E+061.00E+01 1.30E+053.10E+03 1.70E+053.00E+03 3.70E+051.00E+01
保藏基质LO冻干LB-106 35℃44.5℃ 5.40E+085.40E+08 3.00E+081.10E+08 2.40E+085.80E+07 1.10E+081.00E+01 9.80E+071.00E+01 5.90E+071.00E+01 1.90E+081.00E+01 3.10E+071.00E+01 1.30E+071.00E+01
脱腊乳冻干LB-108 35℃44.5℃ 7.90E+077.90E+07 1.80E+064.50E+06 6.70E+059.00E+04 7.40E+051.00E+03 1.10E+051.00E+01 7.10E+041.00E+03 5.00E+041.00E+03 4.20E+041.00E+01 1.50E+031.00E+01
图3表示风干细胞/本发明保藏基质悬浮液LB-107批次的结果。该批次在保藏过程中没有失去成活力，并且在35℃下储存48小时后也未失去生存力，但当在44.5℃下储存48小时后损失了2个对数的成活力。
图4表示风干细胞/脱脂乳悬浮液LB-109批次的结果。该批次在保藏过程中失去了1个对数的成活力，并且在35℃下储存48小时时损失大于2个对数的成活力，在44.5℃下储存的产物在24-48小时后基本失去全部成活力。
图5表示冷冻干燥细胞/本发明保藏基质悬浮液LB-106批次的结果。该批次在保藏过程中没有损失成活力，并且在35℃下储存18小时时也未损失成活力，但当在35℃下储存48小时时损失1个对数的生存力。产物在44.5℃下储存18小时就基本损失所有的成活力。
图6表示冷冻干燥细胞/脱脂乳悬浮液LB-108批次的结果。该批次在保藏过程中失去1对数的成活力，并且在35℃下储存48小时后失去4个以上对数的成活力。在44.5℃下储存的产物在24-48小时后基本上失去全部的成活力。
总之，在保藏过程中通过风干或冷冻干燥期间，用本发明保藏基质制备的批次优于工业标准脱脂乳的批次。用本发明保藏基质储存的批次的批次均优于任一个脱脂乳批次的成活力，这证明本发明的保藏基质优于工业标准脱脂乳基质。
实施例9
以下的实施例是加速及实际储存期试验，这些试验证明利用本发明保藏基质保藏的细胞在冷冻和室温条件下储存时均保持稳定。本实施例还证明本发明保藏基质的多种用途。
图7和表8给出试验的数据，其中将上述实施例8的细胞/保藏基质悬浮液保藏在流化床干燥机内的麦芽糖糊精上，随后使其处于加速储存期条件下。对于这些试验，产物的稳定性被定义为符合产物释放标准的CFU值。可接受的CFU值是106-108/栓剂。这些数据显示，本发明的保藏基质在35℃下储存48小时未损失成活力。在44.5℃下储存的产物可保持18小时的稳定性。在该条件下储存18-24小时时，其成活力降低1个对数，但在大约相同的水平下保持42小时。保藏48小时后成活力继续降低1个对数。该试验还表明，和实施例8中的风干或冻干的悬浮基质相比，经流化床干燥法涂层在麦芽糖糊精上的细胞/本发明的保藏基质悬浮液无论是在35℃下储存还是在44.5℃下储存均是最稳定的。
                                                             表8
                                                保藏基质-在麦芽糖糊精上经流化床干燥LB-096
  温度                                                   相对时间(小时)的CFU
0.00 6 12 18 24 30 36 42 48
  35℃   1.60E+08   2.00E+08   9.00E+07   1.70E+08   3.00E+08   1.10E+08   2.00E+08   2.00E+08   1.30E+08
  44.5℃   1.60E+08   1.40E+08   1.20E+08   1.20E+08   4.10E+07   9.60E+07   1.10E+08   4.40E+07   6.60E+08
这些数据与在另一加速储存期研究中所得的加速和实际时间很好地相关，后一试验CTV-05通过风干保藏在本发明保藏基质中。表9表明，冷冻(2-8℃)储存的产物的CFU值可在25个月内稳定在108CFU。在室温下储存(25℃±5℃)的产物的CFU值在2个月内从108CFU降到107CFU，但在25个月内维持稳定在107CFU。图8表示同一产物在35℃、45℃和55℃的加速储存期研究中的结果。在35℃下，产物在约2.3天内失去小于1个对数的成活力。在45℃下，产物在约2.3天内失去约2个对数的成活力。在55℃下，产物在0.5天内迅速失去成活力。比较这些加速与实际储存期试验的结果有理由推断，在35℃下稳定48小时的产物将在2-8℃或室温储存下稳定25个月。
                   表9
样本放置期             CFU/栓剂
    室温[25℃±5℃]     冷冻[2-8℃]
1周     3.80E+08     未做
2周     3.20E+08     未做
3周     3.05E+08     未做
1个月     1.30E+08     5.20E+08
2个月     9.80E+07     2.20E+08
3个月     1.83E+07     2.30E+08
4个月     3.25E+07     未做
5个月     3.80E+07     2.80E+08
6个月     1.70E+07     1.70E+08
7个月     1.60E+07     2.60E+08
9个月     4.70E+07     3.10E+08
11个月     2.80E+07     2.50E+08
15个月     2.20E+06     9.20E+07
18个月     4.70E+06     1.50E+07
25个月     1.60E+07     5.00E+08
实施例10
以下的实施例描述了，可利用细胞壁脂肪酸从不同乳杆菌菌株的较大样本中特异性地识别出栓剂乳杆菌菌株。
在该试验中，以双盲方式(in a blinded manner)评估从阴道中得到的242种乳杆菌菌株。应用所属领域的标准方法抽提细菌的完整细胞壁。随后利用气相色谱法分析细胞壁的脂肪酸甲酯。随后用MIDI计算机程序来寻找与已知栓剂菌株的细胞壁脂肪酸分布“最吻合”的细胞脂肪酸分布。该计算机程序是本发明人为所述阴道菌株定编的程序库。
在242种被分析的乳杆菌菌株中，19种栓剂卷曲乳杆菌菌株均被正确地识别出来(即，该分析法的灵敏度为100％)(未给出数据)。此外，识别出40种与栓剂类似的分离物(即，该分析法的特异性为82％)(未列出数据)。所以，在大量乳杆菌菌株样本中，细胞壁脂肪酸分析法是用于识别和跟踪栓剂菌株的一种有效且高灵敏度的特异性方法。
实施例11
以下的实施例证明了卷曲乳杆菌CTV-05对白色假丝酵母的临床分离物的抑制作用，而其他乳杆菌分离物没有这种抑制作用。
在5mm的斜面上令MRS琼脂硬化。穿过平板径长用卷曲乳杆菌CTV-05加条纹，并且在厌氧和室温环境下令其生长24、48或72小时。在相同的条件下培养对照菌株：CTV-01詹氏卷曲乳杆菌、CTV-02卷曲乳杆菌、CTV-03卷曲乳杆菌和CTV-04卷曲乳杆菌。将含有或不含有10mM CNNaS(硫氰酸钠，据报导是抑制酵母生长的抑制剂)的YM琼脂叠铺在平板上。该琼脂叠层接种有白色假丝酵母ATCC 14053 60193(子宫颈分离物)或白色假丝酵母ATCC 14053(人体血液分离物)两种菌株之一。测量抑制区面积。在室温环境下生长的卷曲乳杆菌CTV-05细胞较弱，其无法抑制含有或不含有CNNaS的假丝酵母菌。相反，在厌氧条件下生长24、48或72小时的卷曲乳杆菌CTV-05细胞可有效地抑制上述两种假丝酵母菌的生长。在培养基中加入CNNaS没有提高抑制的效能。所以，卷曲乳杆菌CTV-05可在体外抑制酵母菌的生长。表10显示5种被测临床产过氧化氢乳杆菌分离物对白色假丝酵母ATCC 60193的子宫颈分离物生长的抑制能力。结果表明，具有本发明乳杆菌菌株识别特性的卷曲乳杆菌CTV-05在抑制酵母微生物生长中明显优于其他任何分离物。
                      表10
  乳杆菌生物     生物的生长期     抑制区(mm)
  卷曲乳杆菌CTV-05     48小时72小时     70-0mm70-0mm
  詹氏乳杆菌CTV-01     48小时     1-0mm
  卷曲乳杆菌CTV-02     48小时     3-0mm
  卷曲乳杆菌CTV-03     48小时     轻度抑制
  卷曲乳杆菌CTV-04     48小时     5-2mm
本发明虽然详细描述了多个实施方案，但对于所属领域技术人员来说改进和变化这些实施方案是显而易见的。但应理解，这些改进和变化均属于本发明如权利要求书所定义的保护范围中。

Claims (46)

1.一种阴道药物，其中含有：
(a)一种乳杆菌属离体菌株的基本纯净的细菌培养物，所述菌株具有下列识别特性，包括：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
(b)一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
2.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株在有效培养条件下具有生产至少10ppm过氧化氢的能力。
3.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株在体内持续定居在阴道上皮细胞中至少1个月。
4.权利要求1所述的阴道药物，其中当所述菌株处于代谢失活态时粘附在阴道上皮细胞上。
5.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株的单细胞宽1微米-2微米，并且长2微米-4微米。
6.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株在有效培养条件下生产至少0.75mg/100ml乳酸。
7.权利要求1所述的阴道药物，其中所述基质可在体外保存至少107个活细胞至少12个月。
8.权利要求1所述的阴道药物，其中所述基质可在体外4℃-6℃的温度下保存至少106个活细胞至少12个月。
9.权利要求1所述的阴道药物，其中所述基质可在体外室温条件下保存至少106个活细胞至少12个月。
10.权利要求1所述的阴道药物，其中所述基质的pH为5.0-7.0。
11.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株是卷曲乳杆菌。
12.权利要求1所述的阴道药物，其中所述菌株是詹氏乳杆菌。
13.权利要求1所述的阴道药物，其中所述药物还含有惰性载体。
14.一种乳杆菌属的离体菌株，其具有的识别特性包括：
(a)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(b)在有效培养条件下生产大于0.5ppm过氧化氢的能力。
15.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株的VEC粘合值百分数至少为65％。
16.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株在有效培养条件下具有产生至少10ppm过氧化氢的能力。
17.权利要求14所述的离体菌株，其中当所述菌株处于代谢失活态时该菌株粘附在阴道上皮细胞上。
18.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株可在体内阴道上皮细胞上持续定居至少1个月。
19.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株在体内至少24个月的阴道定居中保持遗传稳定性。
20.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株在有效培养条件下生产至少0.75mg/100ml乳酸。
21.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株的单细胞宽1微米-2微米，并且长2微米-4微米。
22.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株是卷曲乳杆菌。
23.权利要求14所述的离体菌株，其中所述菌株是詹氏乳杆菌。
24.一种用于保藏微生物细胞的保藏基质，其中含有：
(a)生物活性粘合剂，选自水溶性树胶、羧甲基纤维素或明胶；
(b)抗氧剂；
(c)多元醇，选自木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇或阿糖醇；
(d)碳水化合物，选自葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，以及其他单糖、二糖或低聚糖；和
(e)蛋白质材料，选自脱脂乳或白蛋白；
其中该基质可在体外至少12个月的时间内保存至少106个基本纯净并且基因稳定的活细胞。
25.权利要求24所述的保藏基质，其中所述抗氧剂是抗坏血酸钠。
26.权利要求24所述的保藏基质，其中所述生物活性粘合剂至少是该基质总重量的10％，所述抗氧剂至少是该基质总重量的0.1％，所述多元醇至少是该基质总重量的1％，所述碳水化合物至少是该基质总重量的0.5％，并且所述蛋白质材料至少是该基质总重量的0.5％。
27.权利要求24所述的保藏基质，其中所述生物活性粘合剂至少是该基质总重量的14％，所述抗氧剂至少是该基质总重量的0.5％，所述多元醇至少是该基质总重量的6％，所述碳水化合物至少是该基质总重量的2.5％，并且所述蛋白质材料至少是该基质总重量的1.5％。
28.权利要求27所述的保藏基质，其含有14％明胶、0.5％抗坏血酸钠、2.5％葡萄糖、1.5％脱脂乳和6％木糖醇，以该保藏基质重量计。
29.一种制备用于保藏微生物细胞的保藏基质的方法，其包括：
(a)提供组分，所述组分基本由如下物质组成：
(i)灭菌的生物活性粘合剂，选自水溶性树胶、羧甲基纤维素或明胶，其中所述生物活性粘合剂是以液体提供；
(ii)灭菌的蛋白质材料，选自脱脂乳或白蛋白；
(iii)灭菌的多元醇，选自木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇或阿糖醇；
(iv)灭菌的抗氧剂；
(v)灭菌的碳水化合物，选自葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，以及其他单糖、二糖或低聚糖；和
(vi)水；和
(b)将上述组分混合在一起形成溶液。
30.一种在保藏基质中保藏微生物的方法，其中包括：
(a)将至少106个微生物细胞的培养物悬浮在保藏基质中以形成细胞基质悬浮液；所述保藏基质含有：
(i)生物活性粘合剂，选自水溶性树胶、羧甲基纤维素或明胶；
(ii)抗氧剂；
(iii)多元醇，选自木糖醇、核糖醇、甘油、半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、山梨醇或阿糖醇；
(iv)碳水化合物，选自葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，以及其他单糖、二糖或低聚糖；和
(v)蛋白质材料，选自脱脂乳或白蛋白；
(b)将该细胞基质悬浮液加入到惰性载体，形成给药组合物；和
(c)从给药组合物中除去水分。
31.权利要求30所述的方法，其中所述惰性载体选自麦芽糖糊精珠粒或明胶胶囊。
32.权利要求30所述的方法，其中所述惰性载体是麦芽糖糊精珠粒，其中所述的加料步骤(b)包括将所述细胞基质悬浮液涂层在麦芽糖糊精珠粒上，并且其中所述的除水步骤(c)包括将该珠粒经流化床干燥器干燥。
33.权利要求30所述的方法，其中所述惰性载体是明胶胶囊，并且其中所述的除水步骤(c)包括冷却该明胶胶囊，直至所述细胞悬浮液基质形成非流体基质，并且在干燥室中将该明胶胶囊干燥，所用干燥法包括：
(i)将水分含量低于25％、温度为24℃-32℃的干燥空气供入到所述的干燥室中；和
(ii)从所述干燥室内除去湿空气。
34.权利要求33所述的方法，其中所述干燥室包括压缩机、至少一个烃类洗涤过滤器和冷气压缩机。
35.权利要求33所述的方法，其中所述干燥空气含有少于15％的水分。
36.权利要求30所述的方法，该方法还包括将所述给药组合物置于包装内，该包装可以保护给药组合物在运输和储存期间不接触水分和氧。
37.一种乳杆菌属离体菌株的至少106个细胞的基本纯净的细菌培养物在制备保护女性阴道不被感染的阴道药物中的用途，其中所述乳杆菌属具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；
所述阴道药物还包含一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
38.权利要求37所述的用途，其中所述阴道感染是一种选自细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病的感染。
39.一种乳杆菌属离体菌株的至少106个细胞的基本纯净的细菌培养物在制备治疗阴道感染的阴道药物中的用途，其中所述乳杆菌属具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下可生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
所述阴道药物还包含一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
40.一种乳杆菌属离体菌株的至少106个细胞的基本纯净的细菌培养物在制备减小人体感染人免疫缺损病毒的危险性的药物中的用途，其中所述乳杆菌属具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下可生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
所述药物还包含一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
41.权利要求40所述的用途，其中施用所述的药物可将人体感染人免疫缺损病毒的危险性减小至少2倍。
42.一种乳杆菌属离体菌株的至少106个细胞的基本纯净的细菌培养物在制备预防人体感染症状性酵母菌阴道炎的药物中的用途，其中所述乳杆菌属具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下可生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
所述药物还包含一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
43.一种乳杆菌属离体菌株的至少106个细胞的基本纯净的细菌培养物在制备预防早产发生的药物中的用途，其中所述乳杆菌属具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下可生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
所述药物还包含一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
44.一种阴道药物，其中含有：
(a)一种乳杆菌属的至少两种离体菌株的基本纯净的细菌培养物，所述菌株具有下列识别特性：
(i)阴道上皮细胞粘合值百分数至少为50％；和
(ii)在有效培养条件下可生产大于0.5ppm过氧化氢的能力；和
(b)一种保藏基质，含有生物活性粘合剂、抗氧剂、多元醇、碳水化合物和蛋白质材料；
其中该基质可在体外至少12个月的时间里保存至少106个基本纯净且基因稳定的活细胞。
45.权利要求44所述的阴道药物，其中所述药物可有效地治疗至少两种阴道感染，所述阴道感染选自：细菌性阴道病、症状性酵母菌阴道炎、淋病、衣原体病、滴虫病、人免疫缺损病毒感染、泌尿道感染或骨盆炎性疾病。
46.权利要求44所述的阴道药物，其中所述细菌培养物含有：对第一种阴道感染有效的第一乳杆菌属菌株，和可有效治疗第二种阴道感染的第二乳杆菌属菌株。
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