CN117844754A - 一种nkt细胞体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种NKT细胞体外扩增方法，属于细胞培养技术领域。该方法包括激活NKT细胞和扩增NKT细胞两个阶段，整个激活扩增过程中均以无血清培养基作为基础培养基，在此基础上添加适宜的细胞因子来进行激活扩增。本发明提供的扩增方法操作简单，成本低，且NKT细胞的扩增数量高、纯度高，具有较强的杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种NKT细胞体外扩增方法。
背景技术
自然杀伤性T细胞(nature killer T cells，NKT cells)发现于1986年，是除NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞之外的第四类淋巴细胞，是一类可引起适应性免疫和固有免疫的特殊T细胞亚群。NKT细胞主要分布于肝脏、骨髓、胸腺、脾及外周血中，少量分布于脐带血中。作为T细胞中一个独立的亚群，虽然数量稀少(约占人外周血单核细胞的1％～5％)，但是在多种疾病，包括自身免疫疾病、感染和恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。
NKT细胞不同于传统的T细胞，兼具NK细胞和T细胞的功能特点，既能表达NK细胞的表面标志(在人类为CD56、CD161)，又能表达T细胞表面标志，如CD3、αβTCR；NKT细胞生物学功能主要包括免疫调节和细胞毒作用。同时诸多临床结果显示NKT细胞过继回输治疗的重要价值，未来将为临床医学带来新的突破。
外周血来源的单个核细胞是NKT细胞过继免疫细胞治疗的主要来源，然而NKT细胞仅占人外周血淋巴细胞总数的1％～5％，因此需要在体外大量扩增培养，来满足临床需求。目前，在NKT细胞常规培养中，大多通过磁珠分选或流式分选后进行扩增培养。但是磁珠分选和流式分选操作流程繁琐，增加了细胞污染的风险，成本较高，得到的NKT细胞数量不足，纯度低，杀伤活性一般，不能达到临床治疗的标准。
专利CN108690830B提供了一种扩增NKT细胞的方法，该方法采用抗体包被的方式激活NKT细胞，操作流程复杂，且该方法培养14天后NKT细胞扩增数量少，NKT细胞纯度低。专利CN107475195B也公开了一种NKT细胞的培养方法，该专利是利用无包被的方式对NKT细胞进行激活和扩增。但该专利在激活扩增过程中使用两种培养基，操作流程繁琐，且培养14天后NKT细胞的扩增倍数低、NKT细胞杀伤活性差。因此，开发出一种高数量、高纯度、高杀伤活性的NKT细胞培养方法显得尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种NKT细胞体外扩增方法，本发明提供的扩增方法操作简单，成本低，且NKT细胞的扩增数量高、纯度高，具有较强的杀伤活性，可用于过继免疫治疗。
为了达到上述目的，本发明提供了一种NKT细胞体外扩增方法，包括如下步骤：
1)第0天，用完全培养基重悬PBMC，在37℃，5％CO2静置培养；
所述完全培养基是以无血清培养基作为基础培养基，添加500～2000U/mL的IFN-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆；
2)第1天，补加浓度为0.1～1μg/mL的CD28抗体、0.1～1μg/mL的CD3抗体、0.05～5ug/mL的CD16抗体、500～5000U/mL的IL-2和10～200ng/mL的IL-7，在37℃，5％CO2继续培养；
3)在37℃，5％CO2继续培养至第7天，得到激活NKT细胞；其中，在该步骤的继续培养过程中补加两次含500～5000U/mL的IL-2、10～200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基；
4)第7天，将激活NKT细胞接种在扩增培养基中，并在扩增培养基中添加扩增培养基体积5％的自体灭活血浆，在37℃，5％CO2进行培养；
所述扩增培养基以无血清培养基作为基础培养基，添加500～5000IU/mL IL-2；
5)第14天后停止培养，收获NKT细胞。
优选的，培养至第7天后，平均每两天补充一次扩增培养基。
优选的，步骤1)中用完全培养基重悬PBMC后，接种密度为1.0～2.0×106cell/mL。
优选的，所述无血浆培养基为NKT细胞无血清培养基。
优选的，步骤3)～4)中补充培养基或接种后，细胞密度在1.0～2.0×106cell/mL。
优选的，步骤1)中所述PBMC从外周血中分离得到。
优选的，采用如下方式从外周血中分离PBMC：
将外周抗凝全血进行离心，离心后，分离管中从下到上依次为红细胞、粒细胞、分离液、分离胶、PBMC和血浆，吸取分离胶上的白膜层，即PBMC。
优选的，所述自体灭活血浆采用如下方法得到：采集白膜层上的血浆，在56℃加热血浆30min，将灭活后的血浆4℃放置30min，室温1000g离心10min，取上清，即为自体灭活血浆。
优选的，步骤5)中收获NKT细胞后还进行取样检测。
优选的，取样检测NKT细胞中真菌、细菌、支原体和内毒素是否异常。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的NKT细胞体外扩增方法，整个激活扩增过程中均以无血清培养基作为基础培养基，在此基础上添加适宜的细胞因子，整个培养过程使用同一种培养基，操作简单。且本发明提供的方法无需分选，无需滋养层细胞，无需包被，就能从外周血中扩增出NKT细胞，操作简单，成本低。
本发明提供的NKT细胞体外扩增方法，在基础培养基的基础上添加适宜的细胞因子，通过各因子间的协同作用，使得扩增数量高、纯度高，且具有较强的杀伤活性。该方法制备的NKT细胞CD3+CD56+表达率高达90.18％，经过15天培养，NKT细胞可扩增约17000倍，收获45亿NKT细胞，且体外杀瘤活性显著，当效靶比为10：1时NKT细胞杀伤率可到97.1％，满足临床应用的需求。
附图说明
图1为实施例3中NKT细胞扩增数量曲线图；
图2为实施例3中NKT细胞活率曲线图；
图3A为实施例4中第0天NKT细胞CD3+CD56+的比例；
图3B为实施例4中第0天NKT细胞CD4-CD8+的比例；
图3C为实施例4中第0天NKT细胞CD3+CD8+的比例；
图4A为实施例4中第7天NKT细胞CD3+CD56+的比例；
图4B为实施例4中第7天NKT细胞CD4-CD8+的比例；
图4C为实施例4中第7天NKT细胞CD3+CD8+的比例；
图5A为实施例4中第15天NKT细胞CD3+CD56+的阳性表达率；
图5B为实施例4中第15天NKT细胞CD4-CD8+的比例；
图5C为实施例4中第15天NKT细胞CD3+CD8+的比例；
图6为实施例5中的NKT细胞杀伤效果曲线图；
图7为实施例5中的对照组的细胞杀伤效果图；
图8为实施例5中的效靶比10：1时细胞杀伤效果图；
图9为实施例5中的细胞杀伤上清IFN-γ表达水平；
图10为实施例6中培养的NKT细胞纯度；
图11为实施例7中培养的NKT细胞纯度；
图12A为对比例1中CD16的浓度为0ug/mL培养的NKT细胞纯度；
图12B为对比例1中CD16的浓度为2ug/mL培养的NKT细胞纯度。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种NKT细胞体外扩增方法，包括如下步骤：
1)第0天，用完全培养基重悬PBMC，在37℃，5％CO2静置培养；
所述完全培养基是以无血清培养基作为基础培养基，添加500～2000U/mL的IFN-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆；
2)第1天，补加浓度为0.1～1μg/mL的CD28抗体、0.1～1μg/mL的CD3抗体、0.05～5ug/mL的CD16抗体、500～5000U/mL的IL-2和10～200ng/mL的IL-7，在37℃，5％CO2继续培养；
3)在37℃，5％CO2继续培养至第7天，得到激活NKT细胞；其中，在该步骤的继续培养过程中补加两次含500～5000U/mL的IL-2、10～200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基；
4)第7天，将激活NKT细胞接种在扩增培养基中，并在扩增培养基中添加扩增培养基体积5％的自体灭活血浆，在37℃，5％CO2进行培养；
所述扩增培养基以无血清培养基作为基础培养基，添加500～5000IU/mL IL-2；
5)第14天后停止培养，收获NKT细胞。
本发明中，第0天，用完全培养基重悬PBMC，在37℃，5％CO2静置培养；所述完全培养基是以无血清培养基作为基础培养基，添加500～2000U/mL的IFN-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆，优选为添加1000U/mL的IFN-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆。
在本发明中，所述PBMC优选从外周血中分离得到。在本发明中，优选采用如下方式从外周血中分离PBMC：将外周抗凝全血进行离心，离心后，分离管中从下到上依次为红细胞、粒细胞、分离液、分离胶、PBMC和血浆，吸取分离胶上的白膜层，即PBMC。
在本发明中，用完全培养基重悬PBMC后，接种密度优选为1.0～2.0×106cell/mL。在本发明中，所述无血清培养基优选为NKT细胞无血清培养基，更优选为X-VIVO15培养基、Corning88-581-CM培养基或GT-T551培养基。本发明实施例中，采用X-VIVO15培养基(Lonza，货号BEBP02-054Q)。
在本发明中，所述自体灭活血浆优选采用如下方法得到：采集白膜层上的血浆，在56℃加热血浆30min，将灭活后的血浆4℃放置30min，室温1000g离心10min，取上清，即为自体灭活血浆。
在本发明中，第1天，补加浓度为0.1～1μg/mL的CD28抗体、0.1～1μg/mL的CD3抗体、0.05～5ug/mL的CD16抗体、500～5000U/mL的IL-2和10～200ng/mL的IL-7，在37℃，5％CO2继续培养。更优选补加浓度为500ng/mL的CD28抗体、500ng/mL的CD3抗体、2ug/mL的CD16抗体、1000U/mL的IL-2和50ng/mL的IL-7。在本发明中，上述组分的补充量优选为使得细胞密度在1.0×106cell/mL。在本发明中，补充上述组分可以可以刺激诱导NKT的分化。
在本发明中，在37℃，5％CO2继续培养至第7天，得到激活NKT细胞；其中，在该继续培养过程中优选补加两次含500～5000U/mL的IL-2、10～200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基；更优选在第3天和第5天进行添加。在本发明中，上述培养基的补充量优选为使得细胞密度在1.0～2.0×106cell/mL。在本发明中，补充上述组分可以刺激诱导NKT的分化、增殖。
在本发明中，第7天，将激活NKT细胞接种在扩增培养基中，并在扩增培养基中添加扩增培养基体积5％的自体灭活血浆，在37℃，5％CO2进行培养；所述扩增培养基以无血清培养基作为基础培养基，添加500～5000IU/mL IL-2；优选添加1000IU/mL IL-2。在本发明中，在基础培养基中添加500～5000IU/mL IL-2和5％的自体灭活血浆来进行扩增，可以促进NKT细胞的生长、增殖。
在本发明中，培养至第7天后，优选平均每两天补充一次扩增培养基。在本发明中，补充扩增培养基后，细胞密度优选在1.0～2.0×106cell/mL。在本发明中，在扩增过程中补充培养基可以提供充足的养分。
在本发明中，停止培养，收获NKT细胞后，为了确保安全性，无杂菌的感染，优选还进行取样检测，取样检测NKT细胞中真菌、细菌、支原体和内毒素是否异常。本发明对所述检测方法没有特殊限定，采用本领域常规检测方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
其中：
外周血来源:新鲜提取的健康志愿者的外周血，放置不超过1小时；
IL2：安纳吉细胞生物科技生产，货号GMP-2302；
IL7：安纳吉细胞生物科技生产，货号GMP-2307；
CD16抗体：安纳吉细胞生物科技生产，货号GMP-E2306h2；
IFN-γ：安纳吉细胞生物科技生产，货号GMP-A2342H2；
CD3抗体：Biolegend货号：317302；
CD28抗体:Biolegend货号：302902。
实施例1
PBMC分离
将采集的外周抗凝全血倒入人外周血淋巴细胞分离管中，15mL全血/管，20℃，800g，离心15min。分离管中各成分从下到上依次为红细胞、粒细胞、分离液、分离胶、PBMC和血浆。用巴氏小管吸取最上层的血浆，转移至50mL离心管中。然后吸取PBMC白膜层，转移至新的50mL离心管中。RPMI 1640洗涤2次(20℃250g，10min)。用0.9％生理盐水或或无血清培养基将外周血单个核细胞重悬备用。
实施例2
灭活血浆
用巴氏小管采集白膜层上的血浆，收集至离心管中，56℃加热血浆30min。将灭活后的血浆在4℃放置30min后，室温1000g离心10min。取上清，转移至新的离心管中，4℃保存备用。
实施例3
激活NKT细胞
①DAY0：以无血清培养基作为基础培养基，添加1000U/mL的IFN-γ，并添加5％自体灭活血浆作为完全培养基。用完全培养基重悬PBMC，以1.0×106cells/mL的密度种瓶。置于37℃，5％CO2培养箱培养24h。
②DAY1：接种后的细胞在培养到24h后，添加浓度为500ng/mL的CD28抗体、500ng/mL的CD3抗体、2ug/mL的CD16抗体、1000U/mL的IL-2和50ng/mL的IL-7。置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY3：细胞在培养到第3天时，补充含1000U/mL的IL-2、50ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在1.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
④DAY5：细胞在培养到第5天时，补充含1000U/mL的IL-2、50ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
扩增NKT细胞
①DAY7：以无血清培养基作为基础培养基，添加1000IU/mL的IL-2，作为扩增培养基，并添加5％自体灭活血浆，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
②DAY9-13：平均每两天补液一次，以无血清培养基作为基础培养基，添加1000IU/mL的IL-2，作为扩增培养基。补加扩增培养基，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY15：收获NKT细胞。
在NKT细胞培养过程中，记录细胞密度和活率，绘制NKT细胞扩增数量曲线图(图1)、NKT细胞活率曲线图(图2)。
实施例4
NKT细胞表面标志物检测
取第0d、7d和15d的细胞进行NKT细胞表面标志物检测，调整细胞密度为1×106cells/mL，分别用CD3/CD56/CD4/CD8进行染色，采用流式细胞仪进行检测。
①DAY0：检测CD3+CD56+阳性表达率，检测PBMC中NKT细胞的初始比例，以及功能指标CD4和CD8、CD3和CD8的细胞表型分析，具体结果见图3。
②DAY7：检测CD3+CD56+阳性表达率，检测激活后NKT细胞的比例，以及功能指标CD4和CD8、CD3和CD8的细胞表型分析，具体结果见图4。
③DAY15：检测CD3+CD56+阳性表达率，检测收获时NKT细胞的比例，以及功能指标CD4和CD8、CD3和CD8的细胞表型分析，具体结果见图5。
由图3～5可以看出，在NKT细胞培养过程中，NKT细胞纯度(CD3+CD56+)逐渐升高，由初始的4.2％变为90.18％。
实施例5
NKT细胞杀伤功能验证
取对数生长期的K562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为1×105个/mL，每孔取100μL铺于96孔培养板中。将实施例3获得的第15d的NKT细胞调整密度为5×105个/mL、1×106个/mL、2×106个/mL，加入96孔培养板中，每孔100μL，效靶比分别为5：1、10：1、20：1，每组设3个复孔。接种方式如下：
空白组(a值)：无血清培养基(100μL)+RPMI 1640(100μL)
效应组(b值)：NKT细胞(100μL)+RPMI 1640(100μL)
对照组(c值)：K562细胞(100μL)+无血清培养基(100μL)
实验组(d值)：K562细胞(100μL)+NKT细胞(100μL)
将接种好的细胞，置于37℃，5％CO2条件下共培养24小时后，每孔加10μLCCK-8试剂，混匀后，置于37℃，5％CO2条件下继续培养2-3小时，酶标仪波长450nm测定吸光度。按下式计算杀伤活性：杀瘤效率＝[1-{(d值-a值)-(b值-a值)/(c值-a值)}]×100％。具体结果如图6-8所示。
图6-8可以看出，本发明制备的NKT细胞对肿瘤K562细胞株具有较高的杀伤活性，在10：1的效靶比下第15天杀伤率即可达到97.1％(如图6-8)。
在细胞杀伤(具体操作如实施例5)24h后，取上清检测IFN-γ的表达水平，具体如图9所示。结果显示，在NKT细胞杀伤靶细胞过程中，NKT细胞大量释放IFN-γ，具备较高的杀伤潜能。
实施例6
激活NKT细胞
①DAY0：以无血清培养基作为基础培养基，添加500U/mL的IFN-γ，并添加5％自体灭活血浆作为完全培养基。用完全培养基重悬PBMC，以1.0×106cells/mL的密度种瓶。置于37℃，5％CO2培养箱培养24h。
②DAY1：接种后的细胞在培养到24h后，添加浓度为100ng/mL的CD28抗体、1000ng/mL的CD3抗体、0.5ug/mL的CD16抗体、5000U/mL的IL-2和10ng/mL的IL-7。置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY3：细胞在培养到第3天时，补充含500U/mL的IL-2、200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在1.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
④DAY5：细胞在培养到第5天时，补充含500U/mL的IL-2、200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
扩增NKT细胞
①DAY7：以无血清培养基作为基础培养基，添加500IU/mL的IL-2，作为扩增培养基，并添加5％自体灭活血浆，将细胞密度控制在1.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
②DAY9-13：平均每两天补液一次。补加扩增培养基，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY15：收获NKT细胞。
在NKT细胞培养过程中，记录细胞纯度，细胞数量和细胞活率，如图10所示。
实施例7
激活NKT细胞
①DAY0：以无血清培养基作为基础培养基，添加2000U/mL的IFN-γ，并添加5％自体灭活血浆作为完全培养基。用完全培养基重悬PBMC，以2.0×106cells/mL的密度种瓶。置于37℃，5％CO2培养箱培养24h。
②DAY1：接种后的细胞在培养到24h后，添加浓度为1000ng/mL的CD28抗体、1000ng/mL的CD3抗体、5ug/mL的CD16抗体、500U/mL的IL-2和200ng/mL的IL-7。置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY3：细胞在培养到第3天时，补充含5000U/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在2.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
④DAY5：细胞在培养到第5天时，补充含5000U/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基，将细胞密度控制在2.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
扩增NKT细胞
①DAY7：以无血清培养基作为基础培养基，添加5000IU/mL的IL-2，作为扩增培养基，并添加5％自体灭活血浆，将细胞密度控制在2.0×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
②DAY9-13：平均每两天补液一次。补加扩增培养基，将细胞密度控制在1×106cells/mL，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
③DAY15：收获NKT细胞。
在NKT细胞培养过程中，记录细胞纯度，细胞数量和细胞活率，如图11所示。
对比例1
将实施例1中获得的PBMC进行接种培养，分为1组和2组，2组为本发明提供的方案，作为对照，其中1组和2组的区别仅在于：在培养过程中，第1天1组和2组在培养基中添加CD16浓度分别为0ug/mL、2ug/mL，其余的细胞因子种类及终浓度均不变(即2组和实施例1～3操作相同；1组仅是与实施例3中添加的组分不同，其他与实施例1～3也相同)。经过15d培养，收获NKT细胞，记录细胞数量和细胞活率(见表1)，并按照实施例4进行表型检测(见图12)。
表1收获时细胞数量和活率
| 组别 | 细胞数量(个) | 细胞活率(％) |
| 1组 | 2.6E9 | 81.88 |
| 2组 | 4.9E9 | 95.13 |
由表1和图12可以看出，经过15天的培养，CD16浓度为0ug/mL时，NKT细胞纯度为27.03％，CD16浓度为2μg/mL时，NKT细胞纯度为90.18％。同时，CD16浓度为0ug/mL时，细胞数量及活率均有所下降。结果表明，在NKT细胞激活早期，添加CD16有利于提高NKT细胞的纯度，促进NKT细胞的增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种NKT细胞体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)第0天，用完全培养基重悬PBMC，在37℃，5％CO2静置培养；
所述完全培养基是以无血清培养基作为基础培养基，添加500～2000U/mL的IFN-γ和基础培养基体积5％的自体灭活血浆；
2)第1天，补加浓度为0.1～1μg/mL的CD28抗体、0.1～1μg/mL的CD3抗体、0.05～5ug/mL的CD16抗体、500～5000U/mL的IL-2和10～200ng/mL的IL-7，在37℃，5％CO2继续培养；
3)在37℃，5％CO2继续培养至第7天，得到激活NKT细胞；其中，在该步骤的继续培养过程中补加两次含500～5000U/mL的IL-2、10～200ng/mL的IL-7及5％自体灭活血浆的无血清培养基；
4)第7天，将激活NKT细胞接种在扩增培养基中，并在扩增培养基中添加扩增培养基体积5％的自体灭活血浆，在37℃，5％CO2进行培养；
所述扩增培养基以无血清培养基作为基础培养基，添加500～5000IU/mLIL-2；
5)第14天后停止培养，收获NKT细胞。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，培养至第7天后，平均每两天补充一次扩增培养基。
3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)中用完全培养基重悬PBMC后，接种密度为1.0～2.0×106cell/mL。
4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述无血浆培养基为NKT细胞无血清培养基。
5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤3)～4)中补充培养基或接种后，细胞密度在1.0～2.0×106cell/mL。
6.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤1)中所述PBMC从外周血中分离得到。
7.根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于，采用如下方式从外周血中分离PBMC：
将外周抗凝全血进行离心，离心后，分离管中从下到上依次为红细胞、粒细胞、分离液、分离胶、PBMC和血浆，吸取分离胶上的白膜层，即PBMC。
8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述自体灭活血浆采用如下方法得到：采集白膜层上的血浆，在56℃加热血浆30min，将灭活后的血浆4℃放置30min，室温1000g离心10min，取上清，即为自体灭活血浆。
9.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤5)中收获NKT细胞后还进行取样检测。
10.根据权利要求9所述的扩增方法，其特征在于，取样检测NKT细胞中真菌、细菌、支原体和内毒素是否异常。
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