CN117821590A - 引物在制备检测prrt2基因移码突变的试剂盒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种引物在制备检测PRRT2基因移码突变的试剂盒中的应用，包括扩增PRRT2基因的c.748C位点突变的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测基因组中PRRT2基因的移码突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对癌症的病因和发病机制的研究有重要的参考意义。

Description

引物在制备检测PRRT2基因移码突变的试剂盒中的应用
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测PRRT2基因移码突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测基因组DNA的PRRT2基因移码突变情况。
背景技术
PRRT2基因包含4个外显子，其中2、3、4外显子编码具有特殊拓扑结构的II型跨膜蛋白，由340个氨基酸组成，N端富含脯氨酸，含2个氨基酸残基的C端位于胞外，还存在2个跨膜区域和1小段的胞内区域。PRRT2蛋白是一种中枢神经系统特异表达的膜蛋白，主要表达于中枢神经系统神经元的突触前膜。提到PRRT2基因通常考虑肌张力不全(dystonia，DYT)，发作性运动障碍(PKD，Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia)、良性家族性婴儿癫痫(BFIE)、婴儿惊厥伴阵发性舞蹈症(ICCA)、散发性良性婴儿癫痫(BIE)、热性惊厥(FS，Febrile Seizures)和幼儿肌阵挛性癫痫(ECME)等疾病，主要由于PRRT2基因的突变导致SNARE复合物(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment proteinreceptor)调节功能的丧失，使神经递质释放失调，导致各种异常。
另外有大量报导PRRT2基因和癌症相关。DNA错配修复(MMR)系统在癌症中有重要地位，因为这个系统正常的情况下能纠正DNA复制错误从而维持基因组的稳定性。MMR缺乏在胆管癌中有观察到，但其对这些肿瘤基因组的影响尚不清楚。为了识别胆管癌中MMR相关突变情况对基因组进行了全基因组测序，共检测到1196个突变与MMR正常样品相比高1.5倍。在所有不同的突变类别，单核苷酸重复序列的移码在癌症样品中显著增加。其中发现PRRT2基因的移码突变频繁出现。通过对PRRT2的进一步研究揭示了该基因在癌症生物学中的重要作用，胆管癌相关PRRT2突变细胞系都显示出细胞增殖、迁移增加而野生型PRRT2细胞系显示对癌细胞的抑制作用。由于PRRT2在癌症中的作用还在研究和探讨中，所以本发明就在此基础上探讨新的突变在胆管癌中的作用，为癌症的预防，治疗提供理论基础。
Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对PRRT2基因突变进行检测可发现PRRT2基因已知和未知的全部类型的异常，为临床治疗、用药提供依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测基因组DNA的PRRT2基因移码突变情况。所述检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的引物，包括：
扩增PRRT2基因的c.748C位点的引物，其碱基序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG；
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG；
本发明还提供了检测检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定检测PRRT2基因的c.748C位点是否发生移码突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增PRRT2基因的c.748C位点的引物，其碱基序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG；
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG；
本发明还提供了一种检测PRRT2基因的c.748C位点的试剂盒，包括：
(i)血液基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增PRRT2基因的c.748C位点的引物，其碱基序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
本发明还提供了一种引物在制备检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的试剂盒中的应用，所述引物包括：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG。
有益效果：本发明只用1对引物，检测PRRT2基因c.748delC突变，高效简便。其中还发现了c.748delC是一个新突变(未见文献报道，属首次发现)，在本次检测中胆管癌样本都出现了这个改变而正常对照样本中没有发现，并且由于c.748delC突变导致其后的氨基酸发生移码突变。本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度，荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为正常样本N1的测序演示图，其中最上边的横方框显示了的氨基酸改变，第二横方框内的序列是标准序列，第三横方框内的是样本N1的测序序列。竖框显示c.748未发生C的缺失。
图2为胆管癌样本D2的测序演示图，其中最上边的横方框显示了的氨基酸改变，第二横方框内的序列是标准序列，第三横方框内的是样本D2的测序序列。竖框显示c.748发生C的缺失。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的引物，该引物是针对PRRT2基因的c.748C位点移码突变所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增PRRT2基因的c.748C位点移码突变碱基的引物，其碱基序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG；
一种检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；CDH1上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测PRRT2基因的c.748C和c.751T位点移码突变的上、下游引物(3.2μm)。
实施例2
血液基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察。(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与PRRT2(NG_032039)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
本实施例取了两例肠癌样本和两例正常样本的全血进行实验。
4例样本的EDTA抗凝全血，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阴性，空白对照各一份。检测结果见下表，测序如图1和图2所示。
样本 c.748del C c.751T>C 移码后碱基序列 移码后氨基酸序列
N1 未发生delC 突变为C CAC CCC AGC TCC CAG TTG GCA HPSSQLA
N2 未发生delC 突变为C CAC CCC AGC TCC CAG TTG GCA HPSSQLA
D1 发生delC 突变为C CAC CCC AGC TCC AGT TGG CAG HPSSSWQ
D2 发生delC 突变为C CAC CCC AGC TCC AGT TGG CAG HPSSSWQ
注：N表示正常样本，D表示肠癌样本
结果显示，肠癌样本由于c.748del C而发生移码，见表格中下划线的位置，本来三个碱基决定一个氨基酸的位置移动，导致氨基酸(见表中的下划线部分)由QLA变成了SWQ，这样引起翻译的蛋白质和原来完全不同，功能也会改变。

Claims (3)

1.一种引物在制备检测PRRT2基因的c.748C位点移码突变的试剂盒中的应用，其特征在于，包括：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增PRRT2基因的c.748C和c.751T位点的引物，其碱基序列为：
SEQ1-F：AGACAGGAATGTGGCCCAA
SEQ1-R：CCAGAGGCTCTATTGCAGCG；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
SEQ2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
SEQ2-R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
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