CN117740994A - 一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法 - Google Patents

一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种伤筋正骨酊的双酯型生物碱限量检查方法。所述方法是使用乌头双酯型生物碱提取物作为对照提取物溶液，进行液相色谱检测，能同时检测伤筋正骨酊中的新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，新乌头碱、次乌头碱和乌头碱均属于乌头双酯型生物碱类，便于控制伤筋正骨酊中的毒性成分。

Description

一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法
技术领域
本发明涉及制剂多种成分测定方法，特别是一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法。
背景技术
伤筋正骨酊具有消肿镇痛的功效，用于跌打扭伤及骨折，脱臼的外用制剂。其处方由细辛、独活、泽兰、莪术、草乌、乌药、威灵仙、续断、过江龙、天南星、当归、两面针、半夏、川乌、石菖蒲、良姜、买麻藤、丢了棒、穿破石、大皂角、小驳骨、十八症、小罗伞、大驳骨、木香、桂枝、徐长卿、白芷、薄荷脑、冰片、樟脑组成。
伤筋正骨酊中含有草乌药材，而草乌药材含有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等醋型生物碱成分，这些生物碱既是有效成分又是毒性成分，药材的炮制方法不同，其毒性成分量差异较大，使用中若有不慎即可引起中毒，目前对含有乌头类药材的中成药研究中，多数仅控制了乌头碱的限度问，但该类药物中还含有次乌头碱和新乌头碱也属于双醋型生物碱，应与乌头碱一起加以控制。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，能同时检测伤筋正骨酊中的新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，新乌头碱、次乌头碱和乌头碱均属于乌头双酯型生物碱类，便于控制伤筋正骨酊中的毒性成分，该分析方法灵敏度高、专属性好，稳定可行。
本发明的技术方案：
一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，包括有以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤筋正骨酊，置圆底烧瓶中，减压回收溶剂，转移至分液漏斗中，加水洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用硫酸溶液调pH值至1.5-2.5，加乙醚洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至8-12，用乙醚振摇提取3-7次，每次15-25ml，合并乙醚液，挥干，残渣加硫酸溶液使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚振摇提取，水液置量瓶中，用硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各15-25μg的溶液，即得对照提取物溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为235nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于5000。
(4)分别精密吸取对照提取物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,测定,即得。
前述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密量取本品45-55ml，置200-300ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至8-12ml，转移至分液漏斗中，加水8-12ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用0.8-1.2mol/L硫酸溶液调pH值至1.8-2.2，加乙醚15-25ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚15-25ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至9-11，用乙醚振摇提取4-6次，每次18-22ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液7-9ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚8-12ml振摇提取，水液置8-12ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
具体的说，前述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密量取本品50ml，置250ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
前述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(2)中，对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各18-22μg的溶液，即得对照提取物溶液。
具体的说，前述步骤(2)中，对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各20μg的溶液，即得对照提取物溶液。
前述步骤(3)中，0.04mol/L乙酸铵溶液用浓氨试液调pH值至9.0，为流动相B。
前述步骤(3)中，梯度洗脱如下：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明能同时检测伤筋正骨酊中的新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，新乌头碱、次乌头碱和乌头碱均属于具有药效和毒性的乌头双酯型生物碱，为了便于控制乌头双酯型生物碱的限度，研究建立了伤筋正骨酊中乌头双酯型生物碱的含量测定方法，并制定上、下限，确定伤筋正骨酊中每1ml含双酯型生物碱以新乌头碱(C33H45NO11)、次乌头碱(C33H45NO10)和乌头碱(34H47NO11)的总量计，应控制在0.06μg～1.40μg范围。该分析方法灵敏度高、专属性好，稳定可行。
附图说明
图1：流动相(1)叠加色谱图；
图2：流动相(2)乌头双酯型生物碱对照提取物色谱图；
图3：流动相(2)样品+对照品色谱图；
图4：流动相(3)乌头双酯型生物碱对照色谱图；
图5：流动相(3)200201样品+对照色谱图；
图6：流动相(4)乌头双酯型生物碱对照品色谱图；
图7：流动相(4)样品+对照品色谱图；
图8：流动相洗脱程序调整1乌头双酯型生物碱对照品色谱图；
图9：流动相洗脱程序调整1样品+对照品色谱图；
图10：流动相梯度洗脱程序调整2乌头双酯型生物碱对照品色谱图；
图11：流动相梯度洗脱程序调整2样+对照品色谱图；
图12：专属性试验色谱图；
图13：新乌头碱线性关系考察图；
图14：次乌头碱线性关系考察图；
图15：乌头碱线性关系考察图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤筋正骨酊50ml，置250ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物(已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量)适量，精密称定，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各20μg的溶液，即得对照提取物溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液(用浓氨试液调pH值至9.0)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235nm。
(4)分别精密吸取对照提取物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,测定,即得。
实施例2
(1)供试品溶液的制备：精密量取本品45ml，置200ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至8ml，转移至分液漏斗中，加水8ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用0.8mol/L硫酸溶液调pH值至1.8，加乙醚15ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚15ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至9，用乙醚振摇提取4次，每次18ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液7ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚8ml振摇提取，水液置8ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物(已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量)适量，精密称定，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各18μg的溶液，即得对照提取物溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液(用浓氨试液调pH值至9.0)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235nm。
(4)分别精密吸取对照提取物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,测定,即得。
实施例3
(1)供试品溶液的制备：精密量取本品55ml，置300ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至12ml，转移至分液漏斗中，加水12ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1.2mol/L硫酸溶液调pH值至2.2，加乙醚25ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚25ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至11，用乙醚振摇提取6次，每次22ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液9ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚12ml振摇提取，水液置12ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物(已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量)适量，精密称定，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各22μg的溶液，即得对照提取物溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液(用浓氨试液调pH值至9.0)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235nm。
(4)分别精密吸取对照提取物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,测定,即得。
发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
1仪器与试药
赛默飞U3000高效液相色谱仪；岛津LC-20AT高效液相色谱仪；赛默飞Vanquish高效液相色谱仪；赛多利斯CPA225D十万分之一电子天平；818型奥立龙pH计；RE-5203型旋转蒸发器；DRHH-S4型数显恒温水浴锅；乙腈为色谱纯，批号为0211128，购自MREOA公司；硫酸为分析纯，批号为20190509购自国药集团化学度剂有限公司；乙酸铵为分析纯，批号为1404161，购自西陇化工股份有限公司；氨水为分析纯，批号为20161102，购自重庆江川化工有限公司；水为纯化水；伤筋正骨酊，试验样品批号191201、190901、200201、200301、2000302、200303、220101、220301；缺川乌、草乌阴性样品220701；乌头双酯型生物碱对照提取物(中国食品药品检定研究院，批号：112029-201601，含新乌头碱为31.7％、含次乌头碱为30.0％、含乌头碱为31.8％)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件的选择
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用JADE-PAK C18(4.6×250mm,5μm，柱号：UJ2212AQU193)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.04mol/L的乙酸铵溶液(用浓氨试液调pH值至9.0)为流动相B，按下表中(表1)的规定进行梯度洗脱。检测波长为235nm，流速为1.0ml/min，柱温30℃，测定效果较好。
表1流动相梯度洗脱程序表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 28 72
10 28 72
15 32 68
45 40 60
65 40 60
2 1.1波长选择
采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-M20A检测器进行二极管阵列波长扫描，选择于229nm、235nm、240nm、245nm波长处的峰面积进行对比，结果于235nm处有较大的峰面积值，并参考2020年版中国药典相关方法，故选择235nm作为检测波长。再在此波长处进行对照品和供试品峰的纯度检测，结果均未检出不纯物。
2.1.2流动相选择
流动相(1)：参照2015年版《中国药典)一部川乌含量测定项方法，以乙腈-四氢呋喃(25：15)为流动相A，0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为235nm，进样测定。结果供试品主成分峰的分离度不符合规定，且阴性样有干扰峰，故不选择，见表2，图1。
表2流动相(1)梯度洗脱表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～48 15～26 85～74
48～49 26～35 74～65
49～58 35 65
58～65 35～15 65～85
流动相(2)：参照2020年版《中国药典)一部川乌含量测定项方法，以乙腈为流动相A，0.2％冰醋酸溶液(用三乙胺调pH值为8.3)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为235nm，进样测定，见表3～表4，图2～图3。
表3流动相(2)梯度洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～44 21～31 79～69
44～65 31～35 69～65
65～90 35 65
表4流动相(2)试验结果表
试验结果表明：本流动相试验的样品+对照品色谱图中第2个成分峰的分离度小于1.5，不符合规定，故不选择。
流动相(3)：参照2020年版《中国药典)一部风湿骨痛片含量测定项方法，以乙腈为流动相A，0.1mol/L乙酸铵溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为235nm，进样测定，见表5～表6，图4～图5。
表5流动相(3)梯度洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～48 15～26 85～74
48～49 26～35 74～65
49～70 35 65
70～80 35～15 65～85
表6流动相(3)试验结果表
试验结果表明，本流动相试验的样+对照品色谱图中第3个成分的分离度不符合规定，不选择。
流动相(4)：参照文献《HPLC法同时测定附子中6种单酯和双酯型生物碱》方法，以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液(用氨水调pH值为9.0)为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱。流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为235nm，进样测定，见表7～表8，图6～图7。
表7流动相(4)梯度洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～10 28 72
10～15 28～33 72～67
15～45 33～50 67～50
45～60 50 50
表8流动相(4)试验结果表
试验结果表明：本流动相试验中的保留时间、峰分离度、理论板数较佳，但第2个峰面积过大，包含了杂质峰，需进一步调整梯度洗脱程序。
2.1.3流动相洗脱程序考察
在流动相(4)的基础上进行梯度洗脱程序调整，以确定最佳参数。
梯度洗脱程序调整1(表9)，结果见表10，图8～图9。
表9流动相梯度洗脱程序调1整表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～10 28 72
10～15 28～33 72～67
15～45 33～43 67～57
45～65 43 57
表10梯度洗脱程序调整1结果表
试验结果表明：本梯度洗脱程序的样品+对照品色谱图中，各成分峰的分离度均符合规定，但分析时间过长，不利于样品分析，故不选择。
梯度洗脱程序调整2(表11)，结果见表12，图10～图11。
表11流动相梯度洗脱程序调整2表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～10 28 72
10～15 28～32 72～68
15～45 32～40 68～60
45～65 40 60
表12梯度洗脱程序调整2结果表
试验结果表明：本梯度洗脱程序的样品+对照品色谱图中，各成分的分离度均大于1.5，符合规定，且各成分的峰面积相差不大，理论板数均在70000以上，各参数指标均表现良好，故选择。
2.1.4流动相pH选择
在确定流动相梯度洗脱程序后，考察流动相B(0.04mol/L乙酸铵溶液)的pH值，设定pH为8.8、9.0、9.2、9.5，按“2.1”项色谱条件，进样对照品和样+对照品溶液各20μl，测定，结果见表13。
表13流动相pH考察结果表
试验结果表明：流动相B的pH值越大，各成分峰的保留时间越大，峰面积未产生明显变化，当pH为9.0时，各成分峰的分离度与理论板数最佳，故选择流动相B的pH值为9.0。
2.2溶液制备
对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物(已标示新乌头碱含量31.7％、次乌头碱含量30％和乌头碱含量31.8％)适量，精密称定，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各约20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备：精密吸取样品(伤筋正骨酊)50ml，置250ml烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至约10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，移至分液漏斗中，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
样品+标准品溶液的制备：精密吸取样品(伤筋正骨酊)50ml，置250ml烧瓶中，精密加入各含20μg/ml乌头双酯型生物碱对照提取物溶液5ml，40℃以下减压回收溶剂至约10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚溶液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性样品溶液的制备：精密吸取样品((伤筋正骨酊200201)50ml，置250ml烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至约10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.1样品前处理方法选择
方法一：参照2015年版《中国药典》一部川乌的含量测定方法，取样品(伤筋正骨酊)25ml蒸干，残渣加三氯甲烷-异丙醇-(1：1)溶解。结果显示，供试品溶液蒸干后不溶于溶剂，且水浴温过高，主成分会损失，故不选择。
方法二：参照2020年版《中国药典》一部川乌含量测定方法，取本品(伤筋正骨酊)30ml，40℃以下蒸干，残渣加乙醚20ml使溶解，再加水20ml用稀硫酸调pH值至2，用乙醚提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH至9，再用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下蒸干，残渣加0.01％盐酸甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。结果显示，供试品溶液中杂质过多，影响主成分峰的分离，不选择。
方法三：参照2020年版《中国药典》一部风湿骨痛片含量测定方法，采用以阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱提取。结果显示，样品(伤筋正骨酊)中加入对照品溶液的回收率过低，提示处理过程中主成分损失多，不选择。
方法四：在方法二的基础上进行优化，把溶剂0.01％盐酸甲醇改成0.02mol/L硫酸溶液，再用乙醚洗去酯溶性物质，取水溶液测定。即方法为：取本品(伤筋正骨酊)50ml，置250ml圆底烧瓶中，40℃以下蒸至约10ml，移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，用乙醚提取2次，每次20ml，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH至10，再用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下蒸干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，移至分液漏斗中，再用10ml乙醚振摇提取，取水液，置10ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。结果显示，供试品溶液中杂质减少，主成分峰的分离度符合规定，故选择。
2.2.2提取溶剂选择
采用乙醚、三氯甲烷作为提取溶剂，照方法四制备供试品溶液，结果显示，采用三氯甲烷作溶剂时，提取时出现黑色固体块状物质堵塞分液漏斗出液孔而无法进行试验，不选择。采用乙醚作为溶剂时，出现轻微黑色絮状物质，不影响提取试验，故选择乙醚作为提取溶剂。
2.2.3样品提取次数考察
按“2.2”项供试品溶液的制备方法中“用浓氨试液调pH值为10后，用乙醚振摇提取，设定提取3次、4次、5次、6次，同时测定样品和样+对照品溶液，计算回收率，结果显示，提取5次后，加样回收率不再增加，表明提取5次已提取完全，试验结果见表14。
表14样品提取次数考察结果表
2.3测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3专属性试验
标准制备工艺条件下，制备川乌草乌的阴性样品，按上述色谱条件检测，阴性样品在与对照品色谱图相应位置未见吸收峰；测定样品中新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰的保留时间，与对照品相对应成分峰的保留时间一致，结果见图12。
4系统适用性试验
按上述色谱条件测定制剂样品，双酯型生物碱各成分峰的拖尾因子良好，分离度均符合规定，乌头碱峰的理论板数在5000以上。
5线性关系考察
精密量取乌头双酯型生物碱对照提取物13.56mg，置100ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度C0溶液，取C0溶液5ml，置10ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即浓度C1溶液，取C0溶液5ml，置20ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即浓度C2溶液，取C2溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即浓度C3溶液，取C3溶液1ml，置10ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即浓度C4溶液，取C3溶液1ml，25ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，即浓度C5溶液，结果制得：新乌头碱浓度分别为42.9852μg/ml、21.4926μg/ml、10.7463μg/ml、1.07463μg/ml、0.107463μg/ml，次乌头碱浓度分别为40.68μg/ml、20.34μg/ml、10.17μg/ml、1.017μg/ml、0.1017μg/ml，乌头碱浓度分别为43.1208μg/ml、21.5604μg/ml、10.7802μg/ml、1.07802μg/ml、0.107802μg/ml的溶液，精密吸取上述对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以乌头双酯型生物碱浓度X(μg/ml)为横坐标，峰面积Y(mAU)纵坐标，作图。新乌头碱回归方程y＝0.46042x-0.02166，相关系数r＝0.99998；次乌头碱回归方程y＝0.48520x+0.03165，相关系数r＝0.99998；乌头碱回归方程y＝0.45100x+0.03984，r＝0.99992。以对照提取物测定所得峰面积代入前述回归方程计算含量，所得结果与真实含量平均偏差小于1％，故可认为标准曲线近似过原点。由此含量测定可采用外标一点法计算，结果见表15～表17，图13～图15。
试验结果表明∶新乌头碱在0.107463～42.9852μg/ml范围内有良好的线性关系，次乌头碱在0.1017～40.68μg/ml范围内有良好的线性关系，乌头碱在0.107802～43.1208μg/ml范围内有良好的线性关系。
表15新乌头碱线性关系考察结果表
表16次乌头碱线性关系考察结果表
表17乌头碱线性关系考察结果表
6定量限和检测限试验
取空白基线一段，测量其噪声峰高，取乌头双酯型生物碱对照提取物溶液(新乌头碱浓度为15.42526μg/ml、次乌头碱浓度为14.384μg/ml、乌头碱浓度为15.48704μg/ml)，用0.02mol/L硫酸溶液逐级稀释制成一系列溶液。以各成分的信噪比(S/N)为10时的浓度为定量限，信噪比(S/N)为3时的浓度为检测限，结果新乌头碱的定量限为0.154μg/ml，检测限为0.062μg/ml；次乌头碱的定量限为0.146μg/ml，检测限为0.058μg/ml；乌头碱的定量限为0.155μg/ml，检测限为0.062μg/ml。
7精密度试验
精密量取同一乌头双酯型生物碱对照提取物溶液进样量20μl，连续进样6次，记录色谱图，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0.46％，0.64％，0.44％，试验结果表明精密度良好。见表18～表20。
表18新乌头碱精密度试验结果(19.42576μg/ml)
表19次乌头碱精密度试验结果(18.394μg/ml)
表20乌头碱精密度试验结果(19.48704μg/ml)
8稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h连续进样5次，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0.52％，0.17％，0.55％，试验结果表明，供试品溶液在8小时内稳定性良好。见表21～表23。
表21新乌头碱稳定性试验结果
表22次乌头碱稳定性试验结果
表23乌头碱稳定性试验结果
9重复性试验
取同一批伤筋正骨酊(220101)，精密量取50ml，按“2.2”项下的方法共制备6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，计算新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量：平均含量分别为0、0.1111μg/ml、0.25380μg/ml，RSD分别为0、1.48％、1.09％。试验结果表明，重复性良好。见表24～表26。
表24新乌头碱重复性试验结果
表25次乌头碱重复性试验结果
表26乌头碱重复性试验结果
10加样回收率试验
取同一批(批号220301)已知含量的伤筋正骨酊9份，精密吸取50ml，置250ml圆底烧瓶中；另精密称取乌头双酯型生物碱对照提取物13.32mg，置20ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取4ml、5ml、6ml，各置50ml量瓶中，加0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，得80％、100％、120％水平浓度的储备液。精密吸取各水平浓度的储备液5ml，各三份，置加有样品的250ml圆底烧瓶中，按“供试品溶液的制备”方法制备样品，按含量测定项下的方法进行测定，记录色谱图，计算回收率。试验结果表明，加样回收率良好。见表27～表29。
表27新乌头碱加样回收率试验结果
表28次乌头碱加样回收率试验结果
表29乌头碱加样回收率试验结果
11样品中双酯型生物碱含量测定及限度范围
采用验证的方法测定27批伤筋正骨酊的双酯型生物碱含量，结果见表30。
表30样品中双酯型生物碱含量测定结果表
从上表可以看出，27批样品的双酯型生物碱含量最低为0.0915μg/ml，最高为1.0558μg/ml，由于药材来源产地不同可能产生偏差，故按检测最低含量的70％，最高含量的130％确定限度范围，即本品每1ml含双酯型生物碱以新乌头碱(C33H45NO11)、次乌头碱(C33H45NO10)和乌头碱(C34H47NO11)的总量计，应为0.06μg～1.40μg。
12耐用性考察
12.1色谱柱考察
采用shim-pack GIST C18 250*4.6mm、JADE-PAK C18250*4.6mm、thermo HyperGOLO C18250*4.6mm、waters XSelect CSH C18 250*4.6mm色谱柱进行考察，按“2.1”项色谱条件测定样+对照品溶液，结果除了shim-pack GIST C18 250*4.6mm外，其它3家牌子色谱柱的分离度均符合规定，结果见表31。
表31色谱柱考察结果表
试验结果表明：shim-pack GIST C18 250×4.6mm色谱柱的分离度不符合规定，其余3个品牌色谱柱的分离度均符合规定，但JADE-PAK C18250*×4.6mm的理论板数最高，分离度最大，故建议使用JADE-PAK C18250×4.6mm色谱柱。
12.2柱温考察
设定柱温为20℃、25℃、30℃、35℃，按“2.1”项色谱条件测定样品+对照品溶液，结果随着柱温升高，保留时间轻微增大，分离度逐渐减小，但均符合规定，理论板数未产生明显变化。结果见表32。
表32柱温考察结果表
12.3流速考察
设定流速为0.8ml/分钟、1.0ml/分钟、1.2ml/分钟，按“2.1”项色谱条件测定样+对照品溶液，结果随着流速的增加，主成分峰的保留时间、理论板数、分离度逐渐减小，但分离度大于1.5，符合规定，结果见表33。
表33流速考察结果表
12.4不同仪器考察
按“2.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，在戴安Vanquish高效液相色谱仪和岛津LC-20AT高效液相色谱仪测定同一批伤筋正骨酊(批号：230501)的双酯型生物碱含量，结果两台仪器检出的含量相对平均偏差为1.08％，未产生明显变化，表明本方法在不同仪器上检测的耐用性良好，结果见表34。
表34不同仪器考察结果表
12.5成分定位试验
按“2.1”色谱条件，分别进样乌头双酯型生物碱对照提取物溶液、新乌碱对照品溶液、次乌头碱对照品溶液，结果乌头双酯型生物碱对照提取物色谱图中，第1个成分为新乌头碱，第2个成分为次乌头碱，第3个成分为乌头碱。

Claims (7)

1.一种伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：包括有以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取伤筋正骨酊，置圆底烧瓶中，减压回收溶剂，转移至分液漏斗中，加水洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用硫酸溶液调pH值至1.5-2.5，加乙醚洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至8-12，用乙醚振摇提取3-7次，每次15-25ml，合并乙醚液，挥干，残渣加硫酸溶液使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚振摇提取，水液置量瓶中，用硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各15-25μg的溶液，即得对照提取物溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.04mol/L乙酸铵溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为235nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于5000。
(4)分别精密吸取对照提取物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,测定,即得。
2.如权利要求1所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密量取本品45-55ml，置200-300ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至8-12ml，转移至分液漏斗中，加水8-12ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用0.8-1.2mol/L硫酸溶液调pH值至1.8-2.2，加乙醚15-25ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚15-25ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至9-11，用乙醚振摇提取4-6次，每次18-22ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液7-9ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚8-12ml振摇提取，水液置8-12ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.如权利要求1所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(1)中，供试品溶液的制备：精密量取本品50ml，置250ml圆底烧瓶中，40℃以下减压回收溶剂至10ml，转移至分液漏斗中，加水10ml洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，用1mol/L硫酸溶液调pH值至2，加乙醚20ml洗涤烧瓶，乙醚液并入分液漏斗中，振摇提取，弃去乙醚液，再加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液用浓氨试液调pH值至10，用乙醚振摇提取5次，每次20ml，合并乙醚液，40℃以下挥干，残渣加0.02mol/L硫酸溶液8ml使溶解，转移至分液漏斗中，加乙醚10ml振摇提取，水液置10ml量瓶中，用0.02mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
4.如权利要求1所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(2)中，对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各18-22μg的溶液，即得对照提取物溶液。
5.如权利要求2所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(2)中，对照提取物溶液的制备：取乌头双酯型生物碱对照提取物，精密称定，所述乌头双酯型生物碱对照提取物已标示新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量，加0.02mol/L硫酸溶液使溶解，制成每1ml含新乌头碱、次乌头碱、乌头碱各20μg的溶液，即得对照提取物溶液。
6.如权利要求1所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(3)中，0.04mol/L乙酸铵溶液用浓氨试液调pH值至9.0，为流动相B。
7.如权利要求1所述伤筋正骨酊的乌头双酯型生物碱限量检查方法，其特征在于：所述步骤(3)中，梯度洗脱如下：
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