CN117126230A - 一种三肽-1、蓝铜肽的合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三肽‑1、蓝铜肽的合成方法及其应用。所述三肽‑1的合成方法首先采用活性酯缩合构建肽链，随后在步骤（2）至步骤（4）或步骤（3）至步骤（4）采用一锅法直接获得中间产物H‑His‑Lys(Boc)‑OH，随后采用活性酯缩合构建最终肽链，且最后保护三肽‑1的保护基只有Boc保护基，脱保护后可直接得到三肽‑1。此外，本发明还请求保护一种蓝铜肽，将三肽‑1与铜盐络合结晶获得。本发明通过一锅法与两次活性酯缩合合成三肽‑1和蓝铜肽，所述方法不需要经过额外的纯化步骤即可获得满足产品纯度要求的三肽‑1和蓝铜肽，其具有高产率、低成本，符合节能减排要求和适合工业化生产的优点。

Description

一种三肽-1、蓝铜肽的合成方法及其应用
技术领域
本发明属于化妆品多肽原料的技术领域，更具体地，涉及一种三肽-1、蓝铜肽的合成方法及其应用。
背景技术
蓝铜肽是Gly-His-Lys（GHK）三肽-1的铜络合物，最早于1973年从人血浆中分离得到。蓝铜肽最早被发现有修复伤口的作用，随着研究的深入，越来越多的功能被开发。作为一种信号肽，蓝铜肽可以作为组织重塑的激活剂，具有促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，皮肤正常胶原蛋白的合成，具有抗炎、抗氧化、提高肌肤弹性，减少皱纹等作用。
蓝铜肽的合成分成两个步骤，第一步是合成母肽（三肽-1），第二步是三肽-1和铜盐络合得到蓝铜肽，根据需要可以制备成醋酸盐或盐酸盐等。
国内对三肽-1和蓝铜肽的合成研究做了很多工作，以下列举了部分：
（1）“GHK和Eptifibatide的合成研究，熊瑛，厦门大学”中介绍以Gly、His和Lys为起始原料，先合成Boc-Gly-OH、H-His(Trt)-OH和H-Lys(Boc)-OH，再通过DCC-HOBt缩法从N端到C端合成Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，脱保护合成三肽-1的方法，从文中看出作者所得的产物纯度和收率都不高，无法进行产业化生产。
（2）专利CN103665102采用Boc-Gly-OSU、His和Boc2O，His Boc保护得到Boc-Gly-His(Boc)-OH，制备活性酯Boc-Gly-His(Boc)-OSU，再与H-Lys(Ac)-OH反应生成Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Ac)-OH，最后TFA脱Boc和Ac保护基得到三肽-1。这个方法是特别之处在于缩合，从具体工作中是比较难实现的，TFA脱乙酰基（Ac）未见其它相关报道。
（3）专利CN107098950采用氯乙酰氯与组氨酸反应得到ClCH2CO-His-OH，然后与三氟乙酸酐反应得到ClCH2CO-His(TFAA)-OH，酰氯化得到ClCH2CO-His(TFAA)-Cl，再与H-Lys(TFAA)-OH反应得到ClCH2CO-His(TFAA)-Lys(TFAA)-OH，最后通过氨水去三氟乙酰基的同时得胺基化得到三肽-1；三氟乙酰基（TFAA）保护的原料的成本较高，N端到C端合成的合成方法容易出现His手性异构的杂质。
（4）专利CN107778349采用Trt-Gly-OH、H-His(Trt)和H-Lys(Trt)-OH通过活性酯缩合法，两次缩合得到Trt-Gly-His(Trt)-Lys(Trt)-OH，最后醋酸全脱保护得到三肽-1；Trt保护氨基本原成本高，原子经济性较差。
（5）专利CN111690037采用Boc-Gly-OH、H-His(Trt)-OH/H-His(Boc)-OH和H-Lys(Boc)-OH为原料通过活性酯缩合法合成Boc-Gly-His(Trt)/His(Boc)-Lys(Boc)-OH，再三氟乙酸脱保护得到三肽-1；采用的也是N端到C端合成合成方法，容易出现His手性异构的杂质。
（6）专利CN113045472以Boc-Gly-OSU、H-His(Trt)-OH、H-Lys（Boc)-OH为原料，先合成Boc-Gly-His(Trt)-OH二肽（油状），再次制备活性酯与H-Lys（Boc)-OH反应得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH（固体），调pH7-8析出纯化，25%的TFA/DCM脱保护得到粗品三肽-1，通过离子交换柱除盐后得到三肽-1；与以上几种方法相比基本没有突出的改进，同样容易出现His手性异构的杂质。
（7）专利CN116143866采用可溶性载体固相合成法以Boc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料合成Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，脱保护得到三肽-1；与固相合成方法类似，成本较高，用什么样的载体没有公开。
（8）专利CN107778349公开了一种低成本合成GHK醋酸盐的方法，该方法将Tit-Gly-His(Tit)-Lys(Trt)-OH在醋酸和三异丙基硅烷中脱保护，生成GHK醋酸盐的方法。该方法虽然可以降低生成GHK醋酸盐的成本，但是在合成GHK-Cu中醋酸根离子过多，会导致GHK-Cu无法析出。
（9）专利CN103665102公开了一种CHK三肽的合成方法，该方法具体是合成Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Ac)-OH后用三氟乙酸脱掉保护，得到GHK的三氟乙酸盐，然后经反向色谱、离子交换色谱生成GHK醋酸盐。该方法的缺点是脱保护的三氟乙酸盐需要经反向色谱纯化除去产物中三氟乙酸，再经过离子交换色谱才能转换成醋酸盐，这种方法成本较高，且不适宜用于大规模生产。
上述报道的固相合成法、可溶性载体法和Pickart等开发的Cbz保护法采用的由C端向N端合成的方法，该类方法所得产物中的手性杂质较少，但固相合成法和可溶性载体法的合成成本过高，不利于工业化大规模生产；Cbz保护法经过改进后，目前还有很有企业在使用，但有几个问题存在：1）要使用氢化特种设备；2）二肽脱Boc时选择性差，会有少量Cbz和His侧链保护基脱落造成后续反应杂质过多，纯化困难；3）在与Cbz-Gly-OH缩合时，中和后的H-His(Cbz/Trt)-Lys(Cbz)-OBn容易产生二酮哌嗪副产物，导致收率下降；4）当His使用Trt保护时需要额外的步骤去除保护基团，Cbz-Gly-His(Trt)-Lys(Cbz)-OBn溶解度差，纯化困难。其它由N端向C端合成的方法都没有考察His异构化情况，产物质量风险较高，有一些工艺使用的保护基兼容性不够或价格高，脱保护时大多使用毒性较高的三氟乙酸，产生的三废多，生产环境成本高。
因此，亟待开发出一种新的高产率、低成本、低污染、适合工业化生产的三肽-1或蓝铜肽合成方法。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种三肽-1的合成方法。所述合成方法对工艺进行整体优化，并采用“一锅法”完成多个步骤，不需要经过额外的纯化步骤即可获得满足产品纯度要求的三肽-1，有效缩短了生产时间和减少工业三废，所述合成方法具有高产率，低成本，符合节能减排要求和适合工业化生产的优点。
本发明的第二个目的在于提供一种三肽-1的合成方法制备获得的三肽-1。
本发明的第三个目的在于提供一种蓝铜肽。
本发明的第四个目的在于提供三肽-1或蓝铜肽在制备化妆品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种三肽-1的合成方法，包括以下步骤：
（1）以Fmoc-His(Trt)-OH为原料，加入反应物，在活化剂参与下反应制备活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1；所述反应物选自HOSU、HONB、HOPHT、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯；
（2）活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1与H-Lys(Boc)-OH进行酰胺化反应合成Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（3）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH脱Fmoc保护基得到H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（4）H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH脱Trt保护基得到H-His-Lys(Boc)-OH；
（5）H-His-Lys(Boc)-OH与Boc-Gly-OR2活性酯进行酰胺化反应合成Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH；
（6）Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH脱Boc保护基获得三肽-1；
其中，所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，或所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应；
R1和R2对应的取代基选自：HOSU、HONB、HOPHT、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯脱去羟基后对应的取代基；
所述合成方法的工艺线路如下：
。
进一步优选地，所述反应物选自HOSU。
优选地，所述步骤（1）中，将Fmoc-His(Trt)-OH的溶液与反应物混合，搅拌，冷却，加入活化剂，制备获得活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1；所述活化剂选自DCC、EDCI或DIC中的一种或多种。
优选地，所述步骤（1）中，Fmoc-His(Trt)-OH与反应物的摩尔比为1：（0.9～1.2）。
优选地，当所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，所述步骤（2）至（4）为：
（2）H-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温，加入碱溶液，滴加Fmoc-His(Trt)-OR1和碱溶液反应；
（3）将碱溶液加入步骤（2）所得反应液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节pH值调整至2～3，并加热至70～90℃至反应结束，脱去Trt保护基，后处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
在一些更为具体的实施方案中，当所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，所述步骤（2）至（4）为：
（2）H-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温至10～20℃，加入碱溶液，调节pH为9～11，滴加Fmoc-His(Trt)-OR1和碱溶液反应；
（3）将碱溶液加入步骤（2）所得反应液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，去除混合溶剂，降至室温，萃取除去Trt保护基和芴烯，调pH至7～8，降温至5～10℃，获得H-His-Lys(Boc)-OH。
优选地，当所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应，此时，所述Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH分离纯化，所述步骤（3）至（4）为：
（3）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，加入碱溶液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节pH值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，脱去Trt保护基，后处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
在一些更为具体的实施方案中，当所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应，此时所述Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH分离纯化，所述步骤（2）以及步骤（3）至（4）为：
（2）H-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温至10～20℃，加入碱溶液，调节pH为9～11，滴加Fmoc-His(Trt)-OR1和碱溶液反应，反应结束后采用酸溶液调节pH至2～3，萃取，浓缩，获得粗产物Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（3）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，加入碱溶液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，去除混合溶剂，降至室温，萃取除去Fmoc和Trt保护基脱落产生的副产物，调pH至7～8，降温至5～10℃，获得H-His-Lys(Boc)-OH。
优选地，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。进一步优选地，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液。
优选地，所述酸溶液选自醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、盐酸、硫酸或磷酸中的一种或多种。进一步优选地，所述酸溶液选自盐酸。
进一步地，在上述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法进行反应或在上述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法进行反应时，所述步骤（3）生成的H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH二肽无需分离纯化，不存在二酮哌嗪生成风险，可以通过萃取除去芴烯。
优选地，所述步骤（4）中，反应结束后，进行结晶处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
进一步优选地，所述结晶处理包括：反应结束后反应液除去反应中使用的与水互溶的有机溶剂，并用溶剂萃取除去杂质，所得水溶液用碱调pH至7～8，降温至5～10℃，析出H-His-Lys(Boc)-OH。
优选地，所述步骤（5）中，H-His-Lys(Boc)-OH与Boc-Gly-OR2活性酯进行酰胺化反应，合成Boc保护基保护的Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH，随后调节pH至2～3析出。
在一些更为具体的实施方案中，所述步骤（5）中，H-His-Lys(Boc)-OH分散于水和四氢呋喃，加入碱溶液，并调pH 9～10溶解，温度维持5～10℃，加入Boc-Gly-OR2活性酯进行酰胺化反应，反应结束后去除溶剂，调节pH为2～3，萃取，降温，析晶，获得Boc保护基保护的Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH。
优选地，所述步骤（6）中，Boc保护基保护的Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH采用盐酸的醚溶液或酯溶液脱去Boc保护基，得到三肽-1。
进一步优选地，所述盐酸的醚溶液为盐酸的四氢呋喃溶液。当采用盐酸的醚溶液或酯溶液脱去Boc保护基时，制备获得的三肽-1为三肽-1的盐酸盐。
进一步地，本发明请求保护上述三肽-1的合成方法制备获得的三肽-1。
进一步地，本发明请求保护一种蓝铜肽，上述三肽-1中加入铜盐，络合结晶得到蓝铜肽。更具体地，将上述三肽-1溶于水中，加入铜盐，络合结晶得到蓝铜肽。
进一步地，本发明请求保护上述三肽-1或上述蓝铜肽在制备化妆品中的应用。更具体地，所述化妆品包括但不限于爽肤水、乳液、精华、霜、膏、面膜或冻干粉等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供了一种新的“一锅法”合成三肽-1以及蓝铜肽的工艺路线，并且合成了2种新的中间体化合物H-His-Lys(Boc)-OH和Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH。采用本发明“一锅法”的工艺制备获得的三肽-1的收率>90%，远高于每一步都进行纯化操作的收率70%，本申请的工艺更简洁，收率更高，更适合于工业化生产。
（2）本发明使用的Fmoc-His(Trt)-OH、H-Lys(Boc)-OH和Boc-Gly-OH都是常用原料，价格低且容易获得，在反应中依次脱去Fmoc和Trt，终产物前的保护肽Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH仅含有一种保护基Boc，因此脱保护时所用的条件一致。
（3）本发明中，Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH经过盐酸的醚溶液或酯溶液脱去后即得到三肽-1盐酸盐，反应过程中避免使用毒性较高的三氟乙酸以及难结晶的醋酸来脱保护基，产物纯度更高，无需反向色谱、离子交换色谱去除三氟乙酸等，且不需要经过转盐即可与铜盐络合制备高纯度的蓝铜肽，极大的降低生产成本，适合于大规模生产。
（4）本发明的肽链构建使用两次活性酯缩合，分别为Fmoc-His(Trt)-OH和Boc-Gly-OH的活性酯。本法制备过程能很好的保持His的手性，最终产物经LCMS分析没有同分异构体，氨基酸分析显示His手性异构低于0.3%，在分析方法的误差范围，可认定基本没有手性异构杂质。
（5）本发明中，Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH合成H-His-Lys(Boc)-OH的过程中通过调控pH依次脱去Fmoc和Trt保护基。脱去Fmoc和Trt保护基可以降低反应位阻，使Boc-Gly-OR2活性酯的缩合时间更短，产物纯度更高；另一方面便于H-His-Lys(Boc)-OH保护二肽的纯化。
（6）本发明发现H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH在水中析出的纯度远低于H-His-Lys(Boc)-OH。前一步未反应完全的Fmoc-His(Trt)-OH带来的H-His(Trt)-OH是主要杂质，即使再次结晶也很难除去，继续反应生成Gly-His杂质会影响最终产物的纯度。本发明在一锅反应中调节pH依次脱去Fmoc和Trt，通过在合成H-His-Lys(Boc)-OH反应釜内调pH至11～13脱去Fmoc，调pH 2～3并加热至70～90℃反应脱去Trt，反应结束后，调pH至7～8，沉析结晶得到高纯度H-His-Lys(Boc)-OH二肽中间体，以Fmoc-His(Trt)-OH投料计算，收率大于95%。
（7）在整个合成过程中，中间体H-His-Lys(Boc)-OH的结晶纯化效果最好，并且在使用纯化后的H-His-Lys(Boc)-OH进行后续反应时基本没有产生杂质，不需要经过额外的纯化步骤即可获得满足产品纯度要求的三肽-1盐酸盐。经过工序的组合优化，充分利用“一锅法”，步骤（2）至步骤（4）过程的中间体Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH不需要进行分离提纯，有效缩短生产时间和减少工业三废，是一个低成本，符合节能减排要求，适合工业化生产的工艺。
附图说明
图1为实施例1中H-His-Lys(Boc)-OH二肽的HPLC图。
图2为实施例1中H-His-Lys(Boc)-OH二肽的核磁图。
图3为实施例1中Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH的HPLC图。
图4为实施例1中Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH的核磁图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本说明书中和以下的实施例中，下述单词、短语或缩写所代表的意思或物质为：
一锅法：又称为“一锅合成法”，是指在一个反应器中使反应物连续进行多步反应，不经中间体的分离纯化，以提高反应效率的一种化学反应策略。此法可以避免在后处理过程中冗长的分离过程和中间体化合物的纯化过程。
Fmoc：芴甲氧羰基。
Boc：叔丁氧羰基。
Cbz：苄氧羰基。
Trt：三苯甲基。
His：组氨酸。
Lys：赖氨酸。
Gly：甘氨酸。
Bn：苄基。
实施例1 三肽-1的合成
（1）活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1的制备
Fmoc-His(Trt)-OH（62.0g，0.1mol）溶解于四氢呋喃（300ml），加入N-羟基-丁二酰亚胺（HOSU）（12.7g，0.11mol），搅拌冷却至0-10℃，保温滴加二环己胺碳二亚胺（DCC）（22.7g，0.11mol）四氢呋喃（150ml）溶液，加毕保温反应2-3小时，过滤除去不溶物，滤液直接用于下一步反应。
（2）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的合成
H-Lys(Boc)-OH（24.6g，0.1mol）分散于水（200ml）和四氢呋喃（200ml）中，降温至10-20℃，滴加20%氢氧化钠水溶液（20.0g，0.1mol），H-Lys(Boc)-OH溶解，pH10-11，同时滴加步骤（1）所制备的活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1溶液和20%氢氧化钠水溶液，使pH维持在9-11，进行反应，加毕保温继续反应30分钟后升至室温，用2N盐酸调pH值2-3，用乙酸乙酯萃取两遍，萃取液浓缩后得 Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗产物，HPLC分析纯度90-95%，主要杂质为Fmoc-His(Trt)-OH。
（3）和（4）“一锅法”合成H-His-Lys(Boc)-OH
步骤（2）制备获得的Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗品分散于水和四氢呋喃，室温水浴，滴加20%的氢氧化钠水溶液（60.0g，0.3mol），控制pH 11-13，温度不高于40℃，Fmoc保护基完全反应后，加入正庚烷萃取，分离去除正庚烷层，水层用盐酸调pH至2-3，并升温至70-90℃反应，反应完全后蒸去四氢呋喃，降至室温，用正庚烷萃取除去Trt保护基脱落产生的副产物，水溶液调pH至7-8，降温至5-10℃，结晶12小时，过滤收集固体得到H-His-Lys(Boc)-OH 36.59g，收率96.0%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算），HPLC>95%。其HPLC图如图1所示，核磁图如图2所示，数据如下所示。
1H-NMR（400MHz，D2O+NaOD）：1.10-1.20（m,2H），1.30-1.40（m,11H），1.50-1.70（m,2H），2.90-3.05（m,4H），3.65-3.70（m,1H），4.00-4.08（m,1H），6.88（m,1H），7.65-7.70（m,1H）。
（5）Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH的合成
Boc-Gly-OH（17.5g，0.1mol）溶解于四氢呋喃（200ml），加入N-羟基-丁二酰亚胺（HOSU）（12.6g，0.11mol），搅拌冷却至0-10℃，保温滴加二环己胺碳二亚胺（DCC）（27.7g，0.11mol）四氢呋喃（150ml）溶液，加毕保温反应2-3小时，过滤除去不溶物，获得Boc-Gly-OR2活性酯溶液直接用于后续反应。步骤（3）和步骤（4）“一锅法”制得的H-His-Lys(Boc)-OH分散于水和四氢呋喃，加入20%的氢氧化钠水溶液，调pH 9-10溶解，温度维持5-10℃，滴加上述所得Boc-Gly-OR2活性酯溶液进行反应，反应结束后蒸去四氢呋喃，2N盐酸调pH 2-3，二氯甲烷萃取两次，水层降温至15℃以下，保温析晶24小时，过滤收率固体得Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH 51.3g，收率99%（以H-His-Lys(Boc)-OH计算），HPLC纯度＞98%。其HPLC图如图3所示，核磁图如图4所示，数据如下所示。
1H-NMR（500MHz，CD3OD）：1.30-1.52（m,22H），1.65-1.75（m,1H），1.90-1.97（m,1H），3.00-3.07（t,2H），3.20-3.30（m,1H），3.33（s,1H），3.76（s,2H），4.24-4.26（m,1H），4.70-4.73（m,1H），7.24（s,1H），8.43（s,1H）。
（6）三肽-1盐酸盐（GHK盐）的合成
步骤（5）所得Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH（51.3，0.095mol）溶解于（四氢呋喃200ml），滴加4M HCl 四氢呋喃溶液（200ml）反应，滴毕反应2小时，过滤收集固体得GHK.HCl34.9 g收率97.5% ，总收率92.6%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算），氨基酸测定His R/S =0.003，Lys R/S = 0，HPLC纯度＞98%。
实施例2 三肽-1的合成
本实施例和实施例1的区别在于：步骤（2）、（3）、（4）采用“一锅法”进行制备：步骤（2）反应结束后不进行pH调整和萃取步骤，直接滴加20%的氢氧化钠水溶液脱Fmoc保护基，所用的氢氧化钠为Fmoc-His(Trt)-OH的4-5倍当量；其它操作同实施例1。步骤（4）中制备获得的H-His-Lys(Boc)-OH的收率95.0%。
所得GHK.HCl与实施例1基本一致，总收率91.5%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算），HPLC纯度＞98%。
实施例3 三肽-1的合成
本实施例和实施例1的区别在于：步骤（3）中脱Fmoc保护基反应完全后，不使用正庚烷萃取，直接调pH至2-3进行步骤（4）反应。步骤（4）中制备获得的H-His-Lys(Boc)-OH收率95.5%。
实施例4 蓝铜肽（GHK-Cu）的合成
实施例1所得GHK.HCl（20.0g，53.1mmol）溶解于80ml纯化水，加入CuCl2.H2O（9.0g，53.1mmol），搅拌溶解成清液，减压浓缩至约40ml，降温至0-5℃，保温10小时，过滤收集固体得到蓝铜钛22.8g，收率98.0%，HPLC纯度>99%。
实施例5 蓝铜肽（GHK-Cu）的合成
实施例2所得GHK.HCl（20.0g，53.1mmol）溶解于80ml纯化水，加入CuCl2.H2O（9.0g，53.1mmol），搅拌溶解成清液，减压浓缩至约40ml，降温至0-5℃，保温10小时，过滤收集固体得到蓝铜钛22.6g，收率97.0%，HPLC纯度>99%。
实施例6 三肽-1的合成
GHK.HCl（37.7g，100mmol）溶解乙醇（200ml），常温水浴下滴加二乙胺（8.0g，110mmol)，搅拌1小时，冷却至10-15℃，过滤收集固体，并用10-15℃洗两次，干燥得到三肽-1 34.0g 收率100%。
对比例 1 三肽-1（GHK）的合成
本对比例和实施例1的区别在于：
步骤（3）脱Fmoc保护基完全反应后，加入正庚烷萃取，分去正庚烷，水层减压除去余下的四氢呋喃，pH调至6-7，保温5-10℃搅拌10小时以上，过滤收集固体得到H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH粗产品53.1g，收率85%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算），HPLC分析纯度85-90%，主要杂质为H-His(Trt)-OH。
步骤（4）H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶解水和四氢呋喃，滴加盐酸调pH至2-3并升温至70-90℃，Trt保护基完全脱去后，蒸去四氢呋喃，降至室温，用正庚烷萃取除去Trt保护基，水溶液调pH至7-8，降温至5-10℃，结晶12小时，过滤收集固体得到H-His-Lys(Boc)-OH28.8g，收率75%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算），HPLC>98%。
最终所得GHK.HCl 总收率70%（以Fmoc-His(Trt)-OH用量计算）。
对比例 2 三肽-1（GHK）的合成
本对比例和实施例3的区别在于：
步骤（4）不进行；
步骤（5）Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的合成：
H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH分散于水和四氢呋喃，加入20%的氢氧化钠水溶液，控制pH 9-10，温度维持5-10℃，滴加Boc-Gly-OH活性酯溶液反应，反应结束后，蒸去四氢呋喃，2N盐酸调pH 2-3，降温15℃以下，保温析晶24小时，过滤收率固体，HPLC纯度约80%，主要杂质为Boc-Gly-His(Trt)-OH。
步骤（6）三肽-1三氟乙酸盐的合成：
步骤（5）制备获得的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶解于三异丙基硅烷（3%）、三氟乙酸（47%）和二氯甲烷（50%）的混合液中，常温反应2小时，加入10体积甲基叔丁基醚析出固体，过滤收集得三肽-1的三氟乙酸盐粗品，HPLC分析纯度为90%，收率为85%，杂质H-Gly-His-OH约6.8%。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例为申请人真实试验结果加以论证。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种三肽-1的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以Fmoc-His(Trt)-OH为原料，加入反应物，在活化剂参与下反应制备活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1；所述反应物选自HOSU、HONB、HOPHT、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯；
（2）活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1与H-Lys(Boc)-OH进行酰胺化反应合成Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（3）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH脱Fmoc保护基得到H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH；
（4）H-His(Trt)-Lys(Boc)-OH脱Trt保护基得到H-His-Lys(Boc)-OH；
（5）H-His-Lys(Boc)-OH与Boc-Gly-OR2活性酯进行酰胺化反应合成Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH；
（6）Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH脱Boc保护基获得三肽-1；
其中，所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应，或所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应；
R1和R2对应的取代基选自：HOSU、HONB、HOPHT、2,4-二氯苯酚或五氟苯酚酯脱去羟基后对应的取代基；
所述合成方法的工艺线路如下：
。
2.根据权利要求1所述三肽-1的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）中，将Fmoc-His(Trt)-OH的溶液与反应物混合，搅拌，冷却，加入活化剂，制备获得活性酯Fmoc-His(Trt)-OR1；所述活化剂选自DCC、EDCI或DIC中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述三肽-1的合成方法，其特征在于，当所述步骤（2）至步骤（4）采用一锅法反应时，所述步骤（2）至（4）为：
（2）H-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，降温，加入碱溶液，滴加Fmoc-His(Trt)-OR1和碱溶液反应；
（3）将碱溶液加入步骤（2）所得反应液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节pH值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，脱去Trt保护基，后处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
4.根据权利要求1所述三肽-1的合成方法，其特征在于，当所述步骤（3）至步骤（4）采用一锅法反应时，所述步骤（3）至（4）为：
（3）Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-OH溶解于水，或水与四氢呋喃、乙二醇二甲醇或叔丁醇的混合溶剂，加入碱溶液，pH控制在11～13，反应结束脱去Fmoc保护基；
（4）将步骤（3）所得反应液用酸溶液调节pH值调整至2～3或将步骤（3）所得反应液萃取后水层用酸溶液调节pH值调整至2～3，加热至70～90℃至反应结束，脱去Trt保护基，后处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
5.根据权利要求3或4所述三肽-1的合成方法，其特征在于，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；所述酸溶液选自醋酸、柠檬酸、抗坏血酸、盐酸、硫酸或磷酸中的一种或多种。
6.根据权利要求3或4所述三肽-1的合成方法，其特征在于，所述步骤（4）中，反应结束后，进行结晶处理获得H-His-Lys(Boc)-OH。
7.根据权利要求1所述三肽-1的合成方法，其特征在于，所述步骤（6）中，Boc-Gly-His-Lys(Boc)-OH采用盐酸的醚溶液或酯溶液脱去Boc保护基，获得三肽-1。
8.权利要求1～7任一项所述三肽-1的合成方法制备获得的三肽-1。
9.一种蓝铜肽，其特征在于，权利要求8所述三肽-1中加入铜盐，络合结晶，得到所述蓝铜肽。
10.权利要求8所述三肽-1或权利要求9所述蓝铜肽在制备化妆品中的应用。
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