CN114702546B - 一种三肽-29的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三肽‑29的生产工艺,属于生物医药领域,采用依次合成Mca‑Pro‑OH、H‑Gly‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑Pro‑ONp、Fmoc‑Gly‑Pro‑Hyp‑OH,最后将所得Fmoc‑Gly‑Pro‑Hyp‑OH水解得到三肽‑29的工艺路线,采用最小保护,六步反应就可以得到合格的产品,大幅度降低了生产周期,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种三肽-29的生产工艺。
背景技术
三肽-29即胶原三肽H-Gly-Pro-Hyp-OH是一种含有甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸的三肽,由于胶原三肽的分子量很小,因而能够被人体充分吸收,与此同时,胶原三肽还能够极有效的渗入角质层、真皮层和头发根部细胞内,是目前分子量最小的,与皮肤胶原蛋白有相同的基本结构,无需分解,能够被皮肤直接吸收,吸收率高。胶原三肽能促进真皮胶原蛋白生成,真表皮连接层再生,表皮再生和分化,广泛应用于各种高级美容化妆品中,有保湿、滋养、亮肤、紧肤、防皱、修复的功能。
目前常规合成胶原三肽H-Gly-Pro-Hyp-OH采用如申请号为2017112641452的中国发明专利申请公开的三肽-29的液-固相合成方法,其所使用的原料Fmoc-Hyp(tBu)-OH价格较高,自主合成过程繁杂。具体分析来,该工艺路线使用固相合成,存在如下缺点:其一是原料都是使用Fmoc保护的氨基酸,原料价格昂贵,生产周期长,三废排放量大,而且在固相反应过程中,原料至少使用2当量以上,这就造成原料成本大幅度增加,造成资源的浪费;其二是固相合成必须使用配套的、定制的反应器,该固相反应器成本较高,定制价格昂贵,最关键的是该固相反应器不能做到体积很大,这就造成使用该工艺生产H-Gly-Pro-Hyp-OH批产量低、产能低;其三是固相合成使用的树脂价格昂贵,而且无法重复利用;其四是专利中使用液-固相合成方法,有机溶剂使用量巨大,与当今绿色化学、可持续发展理念不符;其五是专利中使用固相合成得到的是三肽-29的TFA(三氟乙酸)盐,众所周知,TFA(三氟乙酸)盐是不能销售的,因此该工艺不利于产业化。以上五点说明现有技术生产三肽-29成本高、三废多、附加值低。
因此,简单快捷、成本较低的合成方法和H-Hyp-OH保护策略研究对广泛使用于化妆品的胶原三肽有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中所存在的上述问题提供了一种三肽-29的生产工艺,其要解决技术问题在于:(1)避免固相合成所使用的Fmoc保护的氨基酸;(2)避免Hyp(羟脯氨酸)上的羟基的保护;(3)使生产工艺不受生产场地的限制,易于放大生产;(4)降低有机溶剂的使用量,减小三废排量;(5)中间体易于生产以及后处理。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种三肽-29的生产工艺,其特征在于,以脯氨酸、氯乙酰氯、氨水、Fmoc-Cl、HONP(对硝基苯酚)、DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、羟脯氨酸为原料,首先脯氨酸与氯乙酰氯在碱性条件下反应制得中间体-1 Mca-Pro-OH,然后中间体-1与氨水反应制得中间体-2 H-Gly-Pro-OH,再将中间体-2与Fmoc-Cl在碱性条件下反应制得中间体-3 Fmoc-Gly-Pro-OH,中间体-3经与HONP、DIC反应制得中间体-4Fmoc-Gly-Pro-ONp,中间体-4再与羟脯氨酸反应制得中间体-5 Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,最后中间体-5经水解得到三肽-29 H-Gly-Pro-Hyp-OH。
上述反应的反应式如下:
进一步的,中间体-1的合成如下:向一容器中加入脯氨酸Pro、水、有机溶剂,保持温度-5-0℃,向料液中滴加氯乙酰氯和有机溶剂的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,滴加过程中固体逐渐溶解,反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、干燥,得Mca-Pro-OH。
进一步的,中间体-2的合成如下:向一容器中加入Mca-Pro-OH及浓氨水,搅拌,反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH。
进一步的,中间体-3的合成如下:向一容器中加入H-Gly-Pro-OH及水、有机溶剂,温度保持在0到10℃,滴加Fmoc-Cl的有机溶剂溶液,保持料液pH在8.5-9,反应完全后,加热浓缩去除其中的有机溶剂,然后降温至常温25℃,调节料液pH为2.0±0.2,析料、过滤、烘干,得到Fmoc-Gly-Pro-OH。
进一步的,中间体-4的合成如下:向一容器中加入Fmoc-Gly-Pro-OH、HONP及有机溶剂,温度保持0到10度,滴加DIC的有机溶剂溶液,滴加完后,升温至20-25度,反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp。
进一步的,中间体-5的合成如下:向Fmoc-Gly-Pro-ONp中加入水、羟脯氨酸,保持内温5-10度,控制料液pH为8.5-9.0,待Fmoc-Gly-Pro-ONp反应完,加热浓缩反应液,然后将料液内温降至0度以下,调节料液pH为2.0±0.2,析料、过滤、烘干,得到Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH。
进一步的,中间体-5的水解反应如下:将Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于一容器中,加入水、有机溶剂,温度保持45-50度,控制料液pH为12.0-12.5,反应完全后,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除有机溶剂,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入萃取溶剂萃取杂质,水相pH调至3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用结晶溶剂结晶,过滤、烘干,得到三肽-29H-Gly-Pro-Hyp-OH。
更进一步的,中间体-1、中间体-3的合成过程以及中间体-5的水解过程中所用的有机溶剂采用甲苯、乙醇、THF、乙腈、1,4-二氧六环中的至少一种。
更进一步的,中间体-5的水解过程中,所述萃取溶剂采用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲叔醚、DCM中的至少一种,结晶溶剂采用甲醇与惰性溶剂的混合物,其中惰性溶剂采用乙醚、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、THF中的至少一种;结晶溶剂优选甲醇与乙醚以体积比为2:1的混合物,或甲醇与乙腈以1:2的混合物,或甲醇与乙醇以1:3的混合物,或甲醇与乙酸乙酯以1:1的混合物,或甲醇与THF以1:1的混合物。
本发明的有益效果是:本发明采用常见氨基酸为原料,避免了固相合成所使用的Fmoc保护的氨基酸以及避免了Hyp(羟脯氨酸)上的羟基的保护,通过液相合成方法,采用依次合成Mca-Pro-OH、H-Gly-Pro-OH、Fmoc-Gly-Pro-OH、Fmoc-Gly-Pro-ONp、Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,最后将所得Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH水解得到三肽-29的工艺路线,采用最小保护,六步反应就可以得到合格的产品,大幅度降低了生产周期,降低了生产成本。
具体分析本发明的增益效果,其一,本发明工艺完全避免了固相合成所使用的Fmoc保护的氨基酸,使用的是最为常见的、价格便宜的氨基酸原料,最重要的一点是,本发明还使用了氨基酸的前体,氯乙酰氯这一常见的化工原料,该原料具有价格低廉,货源充足等优点;其二,在合成酰胺的过程中,Hyp(羟脯氨酸)上的羟基也是能够和自身的氨基竞争,参与和羧酸的反应,导致中间体纯度低,纯化困难;传统方法是对Hyp(羟脯氨酸)上的羟基进行上保护基,以避免羟基参与反应,但这必然导致反应步骤增多,原料成本增加,工艺繁琐;本发明工艺完全避免了Hyp(羟脯氨酸)上的羟基的保护,只需使用价格低廉Hyp(羟脯氨酸)即可,所以省去了对Hyp(羟脯氨酸)上的羟基上保护基和脱保护基的步骤,节省了生产步骤,提高了总收率,减少了三废排量,降低了总成本;其三,本发明工艺完全避免了固相合成这一工艺,完全采用液相合成,其优点有对生产场地没有特别的要求,一般的化工、制药生产车间就能满足该工艺,而且液相合成能够实现固相不能实现的公斤级、百公斤级、甚至吨级规模生产;其四,相比上述专利中提到的固相生产,本发明工艺使用的有机溶剂量小,产生的三废量少,符合环保的要求;其五,H-Gly-Pro-Hyp-OH是一个三肽,易溶于水,尤其该三肽含有Hyp(羟脯氨酸),所以更加易于溶于水,其本身还具有易于吸潮的性质,现有的生产工艺导致生产过程中中间体的收率低,难以纯化,保存,本发明工艺采用了Fmoc保护基保护中间体,由于Fmoc保护基具有三个芳香环,空间位阻巨大,疏水性强,使得本发明工艺生产的中间体易于纯化、后处理简单,只需要加水析出,然后经过滤、洗涤、干燥即可,而且由于Fmoc保护基空间位阻巨大,使得各中间体几乎能够避免消旋的风险,所以采用本工艺得到的H-Gly-Pro-Hyp-OH具有含量高、纯度高、消旋程度极低等优点。
具体实施方式
下面对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
步骤一:合成Mca-Pro-OH(中间体-1)
5L三口瓶中,加入270g Pro、540ml水、540ml甲苯,保持温度-5-0℃,向料液中滴加292g的氯乙酰氯和146ml甲苯的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,经TLC检测反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、烘干,得414g Mca-Pro-OH,收率92.3%。
步骤二:合成H-Gly-Pro-OH (中间体-2)
5L三口瓶中,加入Mca-Pro-OH、3L浓氨水,搅拌,经TLC检测反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH。
步骤三:合成Fmoc-Gly-Pro-OH(中间体-3)
5L三口瓶中,加入H-Gly-Pro-OH、1242ml水、1242ml THF ,温度保持在0到10℃,滴加615g Fmoc-Cl的THF(300ml)溶液,同时调节料液pH为8.5-9,经TLC检测反应完全后,加热浓缩掉去除THF,然后降至常温,用浓盐酸调节料液pH为2.0±0.2,料液中析出大量固体,过滤、烘干后,得到760gFmoc-Gly-Pro-OH,收率:89.2%(以Mca-Pro-OH计算)。
步骤四:合成Fmoc-Gly-Pro-ONp(中间体-4)
5L三口瓶中,加入260g Fmoc-Gly-Pro-OH、1300ml THF、101g HONP,温度保持0到10度,滴加DIC(92g)的THF(50ml)溶液,滴完,升温至20-25度,经TLC检测反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp备用。
步骤五:合成Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5)
向步骤四所得中间体-4中加入1020ml水、96g羟脯氨酸,保持温度5-10度,滴加氢氧化钠控制料液pH为8.5-9.0,经TLC检测中间体-4反应完,加热浓缩反应液,然后将料液温度降至0度,调节料液pH为2.0±0.2,析出大量固体,过滤,滤饼烘干后得到 308g固体Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,收率92%。
步骤六:合成H-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5的水解)
将 300g Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于3L三口瓶中,加入600ml水、600ml THF,内温保持45-50度,用氢氧化钠控制料液pH为12.0-12.5,经TLC检测反应完全,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除THF,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入乙酸乙酯萃取杂质,水相再用浓盐酸调为3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用甲醇:乙醚=2:1(体积比)的结晶溶剂结晶,过滤,烘干,得到145.2g H-Gly-Pro-Hyp-OH,HPLC纯度99.4%,收率86.1%(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
实施例2
步骤一:合成Mca-Pro-OH(中间体-1)
5L三口瓶中,加入200g Pro、400ml水、400ml乙酸乙酯,保持温度-5-0℃,向料液中滴加216g的氯乙酰氯和108ml乙酸乙酯的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,经TLC检测反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、烘干,得303g Mca-Pro-OH,收率91.1%。
步骤二:合成H-Gly-Pro-OH (中间体-2)
5L三口瓶中,加入Mca-Pro-OH、3L浓氨水,搅拌,经TLC检测反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH。
步骤三:合成Fmoc-Gly-Pro-OH(中间体-3)
5L三口瓶中,加入H-Gly-Pro-OH、600ml水、600ml 甲苯 ,温度保持在0到10℃,滴加450gFmoc-Cl的甲苯(225ml)溶液,同时调节料液pH为8.5-9,经TLC检测反应完全后,加热浓缩掉去除甲苯,然后降至常温,用浓盐酸调节料液pH为2.0±0.2,料液中析出大量固体,过滤、烘干后,得到553gFmoc-Gly-Pro-OH,收率:88.7%(以Mca-Pro-OH计算)。
步骤四:合成Fmoc-Gly-Pro-ONp(中间体-4)
5L三口瓶中,加入200g Fmoc-Gly-Pro-OH、1.0L 甲苯、77.6g HONP,温度保持0到10度,滴加DIC(71g)的甲苯(50ml)溶液,滴完,升温至20-25度,经TLC检测反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp备用。
步骤五:合成Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5)
向步骤四所得中间体-4中加入780ml水、73.1g羟脯氨酸,保持温度5-10度,滴加氢氧化钠控制料液pH为8.5-9.0,经TLC检测中间体-4反应完,加热浓缩反应液,然后将料液温度降至0度,调节料液pH为2.0±0.2,析出大量固体,过滤,滤饼烘干后得到 232g固体Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,收率90.3%。
步骤六:合成H-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5的水解)
将 230g Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于3L三口瓶中,加入460ml水、4460ml 甲苯,内温保持45-50度,用氢氧化钠控制料液pH为12.0-12.5,经TLC检测反应完全,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除甲苯,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入乙酸丁酯萃取杂质,水相再用浓盐酸调为3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用甲醇:乙腈=1:2(体积比)的结晶溶剂结晶,过滤,烘干,得到111g H-Gly-Pro-Hyp-OH,HPLC纯度99.3%,收率85.8%(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
实施例3
步骤一:合成Mca-Pro-OH(中间体-1)
5L三口瓶中,加入230g Pro、460ml水、460ml乙腈,保持温度-5-0℃,向料液中滴加249g的氯乙酰氯和150ml乙腈的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,经TLC检测反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、烘干,得357g Mca-Pro-OH,收率93.3%。
步骤二:合成H-Gly-Pro-OH (中间体-2)
5L三口瓶中,加入Mca-Pro-OH、3L浓氨水,搅拌,经TLC检测反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH。
步骤三:合成Fmoc-Gly-Pro-OH(中间体-3)
5L三口瓶中,加入H-Gly-Pro-OH、1071ml水、1071ml乙酸乙酯,温度保持在0到10℃,滴加530g Fmoc-Cl的乙酸乙酯(265ml)溶液,同时调节料液pH为8.5-9,经TLC检测反应完全后,加热浓缩掉去除乙酸乙酯,然后降至常温,用浓盐酸调节料液pH为2.0±0.2,料液中析出大量固体,过滤、烘干后,得到649gFmoc-Gly-Pro-OH,收率:88.3%(以Mca-Pro-OH计算)。
步骤四:合成Fmoc-Gly-Pro-ONp(中间体-4)
5L三口瓶中,加入230g Fmoc-Gly-Pro-OH、1150ml乙酸乙酯、89.5g HONP,温度保持0到10度,滴加DIC(81g)的乙酸乙酯(40ml)溶液,滴完,升温至20-25度,经TLC检测反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp备用。
步骤五:合成Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5)
向步骤四所得中间体-4中加入900ml水、84g羟脯氨酸,保持温度5-10度,滴加氢氧化钠控制料液pH为8.5-9.0,经TLC检测中间体-4反应完,加热浓缩反应液,然后将料液温度降至0度,调节料液pH为2.0±0.2,析出大量固体,过滤,滤饼烘干后得到 270g固体Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,收率91.5%。
步骤六:合成H-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5的水解)
将 250g Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于3L三口瓶中,加入500ml水、500ml乙醇,内温保持45-50度,用氢氧化钠控制料液pH为12.0-12.5,经TLC检测反应完全,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除乙醇,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入甲叔醚萃取杂质,水相再用浓盐酸调为3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用甲醇:乙醇=1:3(体积比)的结晶溶剂结晶,过滤,烘干,得到119.9g H-Gly-Pro-Hyp-OH,HPLC纯度99.2%,收率85.3%(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
实施例4
步骤一:合成Mca-Pro-OH(中间体-1)
5L三口瓶中,加入240g Pro、480ml水、480ml 1,4-二氧六环,保持温度-5-0℃,向料液中滴加259g的氯乙酰氯和130ml 1,4-二氧六环的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,经TLC检测反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、烘干,得366g Mca-Pro-OH,收率91.6%。
步骤二:合成H-Gly-Pro-OH (中间体-2)
5L三口瓶中,加入Mca-Pro-OH、3L浓氨水,搅拌,经TLC检测反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH。
步骤三:合成Fmoc-Gly-Pro-OH(中间体-3)
5L三口瓶中,加入H-Gly-Pro-OH、1098ml水、1098ml 1,4-二氧六环,温度保持在0到10℃,滴加544g Fmoc-Cl的1,4-二氧六环(272ml)溶液,同时调节料液pH为8.5-9,经TLC检测反应完全后,加热浓缩掉去除1,4-二氧六环,然后降至常温,用浓盐酸调节料液pH为2.0±0.2,料液中析出大量固体,过滤、烘干后,得到679gFmoc-Gly-Pro-OH,收率:90.1%(以Mca-Pro-OH计算)。
步骤四:合成Fmoc-Gly-Pro-ONp(中间体-4)
5L三口瓶中,加入240g Fmoc-Gly-Pro-OH、1200ml 1,4-二氧六环、93g HONP,温度保持0到10度,滴加DIC(85g)的1,4-二氧六环(44ml)溶液,滴完,升温至20-25度,经TLC检测反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp备用。
步骤五:合成Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5)
向步骤四所得中间体-4中加入1L水、88g羟脯氨酸,保持温度5-10度,滴加氢氧化钠控制料液pH为8.5-9.0,经TLC检测中间体-4反应完,加热浓缩反应液,然后将料液温度降至0度,调节料液pH为2.0±0.2,析出大量固体,过滤,滤饼烘干后得到 280g固体Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,收率90.8%。
步骤六:合成H-Gly-Pro-Hyp-OH(中间体-5的水解)
将 260g Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于3L三口瓶中,加入520ml水、520ml 1,4-二氧六环,内温保持45-50度,用氢氧化钠控制料液pH为12.0-12.5,经TLC检测反应完全,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除1,4-二氧六环,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入DCM萃取杂质,水相再用浓盐酸调为3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用甲醇:乙酸乙酯=1:1(体积比)的结晶溶剂结晶,过滤,烘干,得到228g H-Gly-Pro-Hyp-OH,HPLC纯度99.1%,收率84.2%(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
本发明上述实施例的工艺制得的三肽-29纯度达99以上,产品收率达84.2%-86.1%。
对比例1
本对比例的工艺步骤基本同实施例1,所不同的是,步骤六结晶溶剂中不采用惰性溶剂,将其中的乙醚替换为等质量的甲醇,同样结晶环境进行结晶,结果没有析出固体。
原因分析:由于甲醇的极性很大,对产品的溶解度很好,导致同样结晶环境下析不出固体。
对比例2
本对比例的工艺步骤基本同实施例1,所不同的是,将步骤六结晶溶剂中的甲醇替换为等质量的DMF,同样结晶环境进行结晶,得到三肽-29的纯度约为98.3%,收率约为36.4%(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH),收率较低。
原因分析:由于DMF的极性特别大,且对有机物以及部分无机物均具有很好的溶解度,所以同样结晶比例、环境下,结晶收率很低。
对比例3
本对比例的工艺步骤基本同实施例1,所不同的是,步骤六结晶pH控制在为2.5±0.2,得到三肽-29的纯度是99.1%,收率73.7%,(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
原因分析:收率明显降低是由于在该pH(2.5±0.2)条件下,H-Gly-Pro-Hyp-OH形成内盐的比例降低,所以导致其结晶收率低。
对比例4
本对比例的工艺步骤基本同实施例1,所不同的是,步骤六结晶pH控制在3.5±0.2,得到三肽-29的纯度是99.4%,收率69.6%,(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
原因分析:收率明显降低是由于在该pH(3.5±0.2)条件下,H-Gly-Pro-Hyp-OH形成内盐的比例降低,所以导致其结晶收率低。
对比例5
本对比例的工艺步骤基本同实施例1,所不同的是,步骤六结晶pH控制在4.0±0.2,得到三肽-29的纯度是99.4%,收率30.1%,(相对于Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH)。
原因分析:收率明显降低是由于在该pH(4.0±0.2)条件下,H-Gly-Pro-Hyp-OH形成内盐的比例明显降低,所以导致其结晶收率很低。
Claims (1)
1.一种三肽-29的生产工艺,其特征在于,以脯氨酸、氯乙酰氯、氨水、Fmoc-Cl、对硝基苯酚、DIC、羟脯氨酸为原料,
首先脯氨酸与氯乙酰氯在碱性条件下反应制得中间体-1 Mca-Pro-OH,中间体-1的合成如下:向一容器中加入脯氨酸Pro、水、有机溶剂,有机溶剂采用甲苯、乙酸乙酯、THF、乙腈、1,4-二氧六环中的至少一种,保持温度-5-0℃,向料液中滴加氯乙酰氯和有机溶剂的混合溶液,加料和滴加过程中保持体系pH在8.5-9.0,反应完后,保持温度0-5度,调节料液pH为2.0±0.2,搅拌、抽滤,滤饼洗涤、干燥,得Mca-Pro-OH;
然后中间体-1与氨水反应制得中间体-2 H-Gly-Pro-OH,中间体-2的合成如下:向一容器中加入Mca-Pro-OH及浓氨水,搅拌,反应完全后,加热浓缩反应液,得到H-Gly-Pro-OH;
再将中间体-2与Fmoc-Cl在碱性条件下反应制得中间体-3 Fmoc-Gly-Pro-OH,中间体-3的合成如下:向一容器中加入H-Gly-Pro-OH及水、有机溶剂,有机溶剂采用甲苯、乙酸乙酯、THF、乙腈、1,4-二氧六环中的至少一种,温度保持在0到10℃,滴加Fmoc-Cl的有机溶剂溶液,保持料液pH在8.5-9,反应完全后,加热浓缩去除其中的有机溶剂,然后降温至常温,调节料液pH为2.0±0.2,析料、过滤、烘干,得到Fmoc-Gly-Pro-OH;
中间体-3经与对硝基苯酚、DIC反应制得中间体-4 Fmoc-Gly-Pro-ONp,中间体-4的合成如下:向一容器中加入Fmoc-Gly-Pro-OH、HONP及有机溶剂,温度保持0到10度,滴加DIC的有机溶剂溶液,滴加完后,升温至20-25度,反应完全后,得到Fmoc-Gly-Pro-ONp;
中间体-4再与羟脯氨酸反应制得中间体-5 Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH,中间体-5的合成如下:向Fmoc-Gly-Pro-ONp中加入水、羟脯氨酸,保持温度5-10度,控制料液pH为8.5-9.0,待Fmoc-Gly-Pro-ONp反应完,加热浓缩反应液,然后将料液温度降至0度以下,调节料液pH为2.0±0.2,析料、过滤、烘干,得到Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH;
最后中间体-5经水解并用结晶溶剂结晶得到三肽-29 H-Gly-Pro-Hyp-OH,中间体-5的水解反应如下:将Fmoc-Gly-Pro-Hyp-OH 置于一容器中,加入水、有机溶剂,有机溶剂采用甲苯、乙酸乙酯、THF、乙腈、1,4-二氧六环中的至少一种,温度保持45-50度,控制料液pH为12.0-12.5,反应完全后,将料液pH调为8.0±0.2,加热浓缩去除有机溶剂,然后将料液pH调为8.5-9.0,加入萃取溶剂萃取杂质,萃取溶剂采用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲叔醚、DCM中的至少一种,水相pH调至3.0±0.2,加热浓缩反应液,经脱盐后,用结晶溶剂结晶,过滤、烘干,得到三肽-29 H-Gly-Pro-Hyp-OH;结晶溶剂采用甲醇与惰性溶剂的混合物,其中惰性溶剂采用乙醚、乙腈、乙醇、乙酸乙酯中的至少一种,结晶溶剂采用甲醇与乙醚以体积比为2:1的混合物,或甲醇与乙腈以1:2的混合物,或甲醇与乙醇以1:3的混合物,或甲醇与乙酸乙酯以1:1的混合物。
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