CN116751721A - 一株植物乳杆菌121-5及其在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用 - Google Patents
一株植物乳杆菌121-5及其在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌121‑5，涉及微生物技术领域，所述植物乳杆菌121‑5的分类命名为Lactobacillusplantarum，保藏编号为CGMCCNo.27418，于2023年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明植物乳杆菌121‑5具有高β‑葡萄糖苷酶活性，可以高效转化虎杖苷制备白藜芦醇，转化时间短，转化率高；同时转化条件温和、安全可靠、易于大规模制备。本发明菌株直接应用于含虎杖苷的食品药品(食药用植物或果蔬)发酵，以提高发酵产品中白藜芦醇含量，从而提升产品生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种植物乳杆菌121-5及其在高效转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用。
背景技术
白黎芦醇是一种天然活性多酚物质，具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等作用，己被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。白黎芦醇在护肤品中也可起到多重作用，包括抗氧化、抗衰老、抗紫外线、增白及保湿等，因而对多种因素造成的皮肤老化(皱纹和色素沉着)都有独到的功效。因此，白藜芦醇具有广阔的市场前景，其生产制备具有良好的经济效益和社会效益。
然而，白藜芦醇在自然界中含量极少，在植物体内多以糖苷形式即虎杖苷存在，如在虎杖中虎杖苷含量最高可达2％，而白藜芦醇含量仅为0.1％～0.2％。白藜芦醇化学法合成成本较高，因此工业上常用虎杖苷为原料，以化学催化法或生物转化法来生产白藜芦醇。化学催化法主要采用盐酸、硫酸等无机酸作催化剂水解虎杖苷制备白藜芦醇。酸催化水解法的水解温度较高，使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，对环境造成污染。生物转化法主要以β-葡萄糖苷酶或可产生具β-葡萄糖苷酶活性的微生物为催化剂水解虎杖苷制备白藜芦醇。专利201110128953.2公开了一株具有转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖茎内生菌草酸青霉J1，专利201110130127.1公开了一株可高效转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖根内生菌草酸青霉G3，专利201410037538.X公开了一种β-葡萄糖苷酶高产菌米曲霉及利用该菌株转化制备白藜芦醇的方法。专利201611156766.4公开了一株白藜芦醇发酵菌沙福芽孢杆菌，然而这两个种属的菌，不在GRAS认证名单，不属于公认安全的，故不能直接应用于食品的生产。
因此，挖掘具备安全性能的虎杖苷转化白藜芦醇功能菌是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株植物乳杆菌121-5，该菌株具有高效转化虎杖苷为白藜芦醇的能力，转化率为99％。乳酸菌是常见的益生菌，不仅安全性高，可直接食用，而且本发明植物乳杆菌121-5所产的酶具有较高的催化活力、选择性和稳定性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株植物乳杆菌121-5，所述植物乳杆菌121-5的分类命名为Lactobacillusplantarum，保藏编号为CGMCCNo.27418，于2023年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一目的是，提供上述植物乳杆菌121-5在降解糖苷中的应用。
本发明的另一目的是，提供上述植物乳杆菌121-5在利用β-葡萄糖苷酶活性产业中的应用。
本发明的另一目的是，提供上述植物乳杆菌121-5在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用。
本发明的另一目的是，提供一种利用上述植物乳杆菌121-5转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，将虎杖苷于二甲基亚砜中溶解，添加至MRS无糖培养基中，按10％(v/v)接种量接入植物乳杆菌121-5种子液，37℃静置发酵转化4h～16h。
作为优选的技术方案，所述MRS无糖培养基的配方为蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2.6g，七水硫酸镁0.58克，七水硫酸锰0.19g，蒸馏水1.0L，pH6.3。
作为优选的技术方案，所述植物乳杆菌121-5种子液的制备方法为将-80℃保藏的植物乳杆菌121-5连续活化两代，集中于MRS液体培养基中，37℃静止培养16～30h，即得。
本发明一株植物乳杆菌121-5，具有高β-葡萄糖苷酶活性，可以高效转化虎杖苷制备白藜芦醇，转化时间短，转化率高；同时转化条件温和、安全可靠、易于大规模制备。本发明菌株直接应用于含虎杖苷的食品药品(食药用植物或果蔬)发酵，以提高发酵产品中白藜芦醇含量，从而提升产品生物活性。本发明省略了从菌体中提取催化酶和酶活保护的步骤，制备更加简单，生产成本更低，环境压力更小。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为菌株121-5的菌落形态图；
图2为菌株121-5的革兰氏染色镜检图；
图3为菌株121-5的系统发育树；
图4为菌株121-5菌悬液/上清液与pNPG反应后颜色变化结果；
图5为pNP标准曲线；
图6为菌株121-5菌悬液/上清液与pNPG反应后pNP释放量(μM)；
图7为菌株121-5转化虎杖苷生成白藜芦醇的HPLC图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一株植物乳杆菌121-5及其应用，本发明所用原料和试剂121-5以外均为市售可得，对其来源不做具体限定，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
实施例1菌株121-5的分离与鉴定
(1)菌株分离纯化：取陕西西安地区手工发酵蔬菜0.5g，用无菌剪刀将样品剪成0.3×0.3cm小块，加入10mL无菌生理盐水涡旋振荡3min梯度稀释至10-7，分别吸取10-4～10-7稀释液100μL涂布于加有2％碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃静置培养48h，挑取有溶钙圈的菌落，在MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落进行革兰氏染色；选取革兰氏染色阳性且显微形态为杆状的菌株，25％甘油，-80℃冷冻保存备用。
菌株121-5菌落菌落湿润，呈白色圆形，菌落表面光滑略微凸起(参见附图1)其革兰氏染色呈阳性(紫色)，菌体为杆状(参见附图2)。
(2)菌株鉴定：使用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction kit ver2.0)提取菌株121-5的DNA，使用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增：上游引物27F:AGAG TTTG ATCM TGGC TCAG，SEQ IN NO：1；下游引物1492R：GGTT ACCT TGTT ACGA CTT，SEQ IN NO：2。PCR扩增反应体系(50μL)：5.0μL10×Taq酶缓冲液，0.4μmol/L引物，4μL200mmol/L dNTP，40ng DNA模板，1U Taq酶(TaKaRa)，34μL ddH2O。
PCR反应按下述程序进行扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。反应在Bio-Rad PCR仪上进行，并通过l％琼脂糖凝胶电泳检测16S rDNA扩增片段，送交深圳华大基因科技有限公司进行测序。将测序结果与GenBank中序列进行Blast比对，结果表明本发明菌株16SrDNA基因序列(如SEQ IDNO.3所示)与Lactobacillusplantarum SourdoughB16(MG754577)基因序列相似度最高，用MEGA-X软件构建系统进化树(参见附图3)，可知该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，于2023年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.27418；分类学命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum。
实施例2菌株121-5β-葡萄糖苷酶活性及酶定位
将-80℃冷冻保藏的菌株121-5连续活化两代，以1％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养18h～24h，得到发酵液，离心10min(8000r/min，4℃)，分别获得上清液和菌体，上清液备用，菌体使用CPB缓冲液(pH＝6.0)洗涤菌体一次后悬浮于CPB中(pH6.0)，将菌体浓度调整至108cfu/mL。向九十六孔板中先后加入30μL菌悬液(IC)(或上清液CFS)、20μLCPB缓冲液(pH6.0)和100μLpNPG，于37℃孵育30min后立即加入50μL1mol/L碳酸钠溶液来终止反应。
上述测定方法为pNPG法，是一种间接的测定β-葡萄糖苷酶酶活性的方法，其基本原理是测定酶反应产生的产物的浓度变化。pNPG是一种合成物，可以被葡萄糖苷酶水解成为pNP和葡萄糖。其中pNP具有黄色，可以通过比色法来测定酶的活性。
观察结果可知菌株121-5菌悬液为黄色，具有β-葡萄糖苷酶活性，发酵上清液无色，无明显β-葡萄糖苷酶活性(参见附图4)，表明菌株121-5β-葡萄糖苷酶为胞内酶。进一步使用酶标仪测定OD420nm的吸光值，绘制pNP标准曲线(参见附图5)，根据标准曲线计算反应后pNP浓度，结果表明，菌株121-5菌体具有高β-葡萄糖苷酶活性(参见附图6)。
实施例3菌株121-5发酵转化虎杖苷制备白藜芦醇
(1)种子液制备：-80℃冷冻保藏的菌株121-5连续活化两代，接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养22h，得到种子液。
上述MRS培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2.6g，七水硫酸镁0.58克，七水硫酸锰0.19g，蒸馏水1.0L，pH6.3。MRS培养基121℃灭菌20min。
(2)发酵转化：配制200mM虎杖苷母液(DMSO溶解)，再与MRS无糖培养基(不含葡萄糖，其余同步骤1中MRS培养基成分)混合，配制成终浓度为1mM的虎杖苷转化液。取步骤(1)所得的菌株121-5种子液10mL，4℃，8000rpm，10min离心去除上清液，菌体用PBS清洗两遍后，1mLPBS重悬菌体，接入100mL终浓度为1mM虎杖苷转化液中，37℃静置发酵转化6h。
(3)HPLC检测：分别在步骤(2)发酵转化的第0、2、4、6h取样发酵液，冷冻干燥，加入DMSO充分溶解后，以0.45μm滤膜过滤，定容，利用HPLC测定含量虎杖苷和白藜芦醇的含量。
HPLC检测条件为：色谱柱为C18株(150mm*4.6mm，5μm)，流动相甲醇：水(60:40，v/v)，流速为0.8mL/min，柱温30℃，检测波长为279nm。
菌株121-5转化虎杖苷生成白藜芦醇过程HPLC检测结果如图5所示。转化6小时时1mM虎杖苷全部被转化，经计算，白藜芦醇转化率为99％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一株植物乳杆菌121-5，其特征在于，所述植物乳杆菌121-5的分类命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.27418，于2023年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述植物乳杆菌121-5在降解糖苷中的应用。
3.权利要求1所述植物乳杆菌121-5在利用β-葡萄糖苷酶活性产业中的应用。
4.权利要求1所述植物乳杆菌121-5在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用。
5.一种利用权利要求1所述植物乳杆菌121-5转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于，将虎杖苷于二甲基亚砜中溶解，添加至MRS无糖培养基中，按10％接种量接入植物乳杆菌121-5种子液，37℃静置发酵转化4h～16h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述MRS无糖培养基的配方为蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2.6g，七水硫酸镁0.58克，七水硫酸锰0.19g，蒸馏水1.0L，pH 6.3。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌121-5种子液的制备方法为将-80℃保藏的植物乳杆菌121-5连续活化两代，集中于MRS液体培养基中，37℃静止培养16～30h，即得。
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