CN111465327A - 用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和方法 - Google Patents

用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111465327A
CN111465327A CN201880061663.0A CN201880061663A CN111465327A CN 111465327 A CN111465327 A CN 111465327A CN 201880061663 A CN201880061663 A CN 201880061663A CN 111465327 A CN111465327 A CN 111465327A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus
composition
glycoside
bacterial strain
prebiotic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880061663.0A
Other languages
English (en)
Inventor
M.C.泰尔曼
吴永雋
R.巴兰古
M.A.哈谢姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Turknik, University of
Danmarks Tekniskie Universitet
North Carolina State University
University of California
Original Assignee
Turknik, University of
North Carolina State University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Turknik, University of, North Carolina State University filed Critical Turknik, University of
Publication of CN111465327A publication Critical patent/CN111465327A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0104—Alpha-L-rhamnosidase (3.2.1.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01043—Beta-L-rhamnosidase (3.2.1.43)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01086—6-Phospho-beta-glucosidase (3.2.1.86)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本公开涉及微生物群研究和治疗领域。特别是，本公开提供使用益生菌来提高植物化学物质的生物利用度的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括益生菌和益生元植物糖苷的组合，其中所述益生菌能够使所述益生元植物糖苷转化为具有提高的生物利用度的糖苷配基。

Description

用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和 方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2017年7月24日提交的美国临时申请第62/536209号的较早提交日期的权益，其通过参考以其全部结合至本文中。
序列表
序列表仅以电子格式与本申请一起提交，并且通过参考结合至本文中。序列表文本文件“030871-9069_Sequence_Listing.txt”创建于2018年7月23日，大小为8.257字节。
技术领域
本公开涉及微生物群研究和治疗领域。特别是，本公开提供使用益生菌来提高植物化学物质的生物利用度的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括益生菌和益生元植物糖苷的组合，其中益生菌能够使益生元植物糖苷转化为具有提高的生物利用度的糖苷配基。
背景
外源性植物化学物质存在于各种食物来源(比如浆果、水果、坚果、蔬菜)中，并且还存在于饮料(比如葡萄酒和茶)中。这些化合物一般地以糖缀合物存在，以促进储存和溶解性，并调节生物活性。几种植物化学物质(例如一些酚类和多酚类化合物)经抗炎、抗雌激素、心脏保护、抗癌、化学预防、神经保护、抗微生物或抗氧化剂特性呈现出有益的健康作用。这些生物活性根据植物化学物质的糖缀合而变化。在一些情况下，据报道益生菌(例如来自乳杆菌属(lactobacilli)的菌株)与这些糖基化植物化学物质或植物糖苷(PG)相互作用，但这些益生菌的作用及其与PG的生化相互作用的性质尚不完全清楚。
在数千种饮食来源的已知植物化学物质中，很大一部分在人类呈现出积极的健康作用。然而，通常情况下，植物化学物质作为糖缀合物存在，并因此比其糖苷配基衍生物呈现出更低的生物活性和生物利用度，后者的大小较小，并且一般地极性较小。PG的去糖基化可能是调节其生物活性的一个因素。近年来，人类肠道微生物群(HGM)介导的药物和饮食来源的外源性物质(包括植物化学物质)的生物转化对健康的影响已获得广泛关注，但是关于HGM的代谢机制和治疗潜力的了解却非常有限。因此，需要对HGM中各种益生菌的相互作用及其用于增强有益化合物的生物利用度和生物活性的治疗潜力有更深入的了解。
概述
本公开涉及包含益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其中益生菌菌株能够将益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。
本公开还涉及包含所述组合物的营养补充剂。
本公开还涉及用于向受试者提供膳食补充剂的方法。方法包括给予受试者所述组合物或所述营养补充剂。
本公开还涉及补充发酵乳制品的方法。方法包括将所述组合物或所述营养补充剂与发酵乳制品混合。
本公开还涉及在需要它的受试者中治疗病症的方法。方法包括将所述组合物给予受试者以治疗病症，从而治疗病症。
附图简述
图1A-1B包括来自涉及嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) NCFM基于植物糖苷的生长的实验的代表性数据。图1A显示如本文所述的植物糖苷底物的结构和常见来源。图1B为描绘通过质谱分析的植物糖苷利用以及作为最大OD600的生长的代表性图表。
图2A-2B包括说明植物糖苷利用基因座的保守性的代表性转录概况。图2A为显示嗜酸乳杆菌(L. acidophilus) NCFM基于3种植物糖苷的最高上调基因座的代表性图表，其包括转录调控子(LBA0724)、PTS EIIBCA转运蛋白(LBA0725)和糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl) (LBA0726)。图2B为显示基于苦杏仁苷上调的基因座的代表性图表，其包括P-Bgl (LBA0225)、PTS EIIC转运蛋白(LBA0227)和假定蛋白。
图3A-3J为显示各种缺失突变体的生长分析的代表性图表。图3A、3C、3E、3G和3I表示EII PTS转运蛋白突变体的生长分析，和图3B、3D、3F、3H和3J表示磷酸-β-葡萄糖苷酶突变体基于七叶苷(图3A-3B)、水杨苷(图3C-3D)、苦杏仁苷(图3E-3F)、龙胆二糖(图3G-3H)和纤维二糖(图3I-3J)的生长分析。
图4A-4B显示嗜酸乳杆菌NCFM基于植物葡萄糖苷的生长的时间分辨代谢物分析。图4A为显示培养上清液中水杨苷的时程消耗及其糖苷配基水杨醇的出现的代表性图表，如UHPLC-qTOF-MS色谱图中A 270 nm峰下面积可视。图4B显示嗜酸乳杆菌NCFM基于水杨苷、七叶苷和苦杏仁苷的等摩尔混合物的生长的代表性图表。
图5为基于本公开的植物葡萄糖苷利用模型的代表性图解。
图6A-6C显示嗜酸乳杆菌NCFM基于植物葡萄糖苷的生长的时间分辨代谢物分析。图6A为显示水杨苷的时程消耗的代表性图表，图6B为显示七叶苷的时程消耗的代表性图表(图6B)，和图6C为显示苦杏仁苷的时程消耗的代表性图表。
图7为显示来自双歧杆菌属(Bifidobacterium) (Bi)、拟杆菌属(Bacteroides)(Ba)和罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia) (R)的人类肠道共生微生物群基于植物糖苷的生长的代表性图表。
详述
具有治疗活性的植物化合物(例如植物化学物质)通常作为糖缀合物存在，并且在人类饮食中普遍存在。植物化学物质与人类肠道微生物群(HGM)的相互作用与改变的微生物群组成和植物化学物质生物活性相称。尽管这种相互作用可能对健康产生影响，但所涉及的主要类群和基础分子机制仍未表征。另外，据报道，当在体外测定中并且甚至在一些动物模型中进行测试时，来自植物的各种植物化学物质呈现出显著的生物活性。然而，在许多情况下，其在人类的体内功效仍然是有疑问的或仍有待确定。如本领域的普通技术人员将认识到的，植物化学物质对受试者的生物活性和生物利用度取决于许多不同因素，包括(但不限于)吸收、代谢、溶解和/或溶出、渗透、首过代谢和系统前排泄。因此，简单地摄取各种植物化学物质并不总是足以在宿主受试者中引起期望的生理作用或生物活性，这在很大程度上是由于阻碍其对宿主的生物利用度的各种因素。
本公开的研究结果表明益生菌菌株(包括嗜酸乳杆菌)使用专门的摄取和去糖基化机制基于膳食植物糖苷(PG)的生长，伴随着在益生元样转录反应中宿主相互作用基因的显著上调。与母体化合物相比较，一般地具有提高的生物活性的PG的去糖基化部分被外在化，使其可被宿主和其他微生物分类群生物利用。PG利用基因座在嗜酸乳杆菌物种中很大程度上是保守的，与来自其他生态位的乳杆菌属或选自拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)的肠道共生者相比较，这在基于这些化合物的生长方面一般是通用的。因此，本公开提供人类肠道中碳水化合物代谢的令人惊讶和出乎意料的方面，并且突出显示小肠中普遍存在的益生菌(比如嗜酸乳杆菌)在不同植物化学物质的生物转化中的重要作用，这些植物化学物质经人类宿主吸收或通过改变微生物群组成对人类健康发挥有益作用。
如本节和本文的整个公开使用的章节标题仅出于组织目的，而并非旨在为限制性的。
1. 定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。如有冲突，以本文件(包括定义)为准。尽管与本文所述相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是以下描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过参考以其全部结合。本文公开的材料、方法和实例仅为说明性的，而并非旨在为限制性的。
本文使用的术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”及其变体旨在为开放式的过渡性短语、术语或词语，其不排除另外行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。本公开还考虑“包含”本文呈现的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
对于本文列举的数值范围，明确考虑之间具有相同精确度的每个间插数字。例如，对于6-9的范围，除6和9之外还考虑数字7和8；和对于6.0-7.0的范围，明确考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
本文使用的术语“约”或“大约”意指在特定数值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所测定的，该误差范围将部分地取决于该数值如何测量或测定，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可意指在3个或超过3个标准偏差之内。或者，“约”可意指给定数值的至多20%，优选地至多10%，更优选地至多5%，和仍然更优选地至多1%的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可意指在数值的一个数量级之内，优选地在5倍之内，和更优选地在2倍之内。
本文使用的“生物活性”或“生物活性的”涉及给定物质对生命系统、细胞或生物体发挥的作用。通常，物质的生物活性涉及该物质向生命系统、细胞或生物体中的摄取，使得物质可对该生命系统、细胞或生物体发挥生理作用。在一些情况下，细胞或生物体可与一种物质相互作用，以提高该物质在另一细胞或生物体(例如共生关系)中的生物活性。生物活性的提高通常与生物利用度的提高相关。
本文使用的“生物利用度”或“可生物利用的”涉及物质(例如植物化学物质)被吸收到生命系统、细胞或生物体中或在生理活性部位可利用的程度和/或速率。本文使用的术语“生物利用度”可表示考虑到吸收和局部代谢降解两者，作为完整物质到达系统循环的口服给予剂量的分数。如本领域技术人员基于本公开将认识到的，存在许多影响物质生物利用度的因素，包括(但不限于)物质被糖基化或未被糖基化的程度。在一些情况下，生物利用度与细胞渗透性相关，使得细胞渗透性的增加导致生物利用度的提高。通常，物质生物利用度的提高导致细胞或生物体对该物质的摄取和代谢利用，并且还可促进该物质的生物活性。在一些情况下，细胞或生物体可与物质相互作用，以提高该物质在另一细胞或生物体(例如共生关系)中的生物利用度。
本文使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描绘也定义了互补链的序列。因此，核酸也涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上相同的核酸及其互补物。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可为单链或双链的，或者可含有双链和单链序列两者的一部分。核酸可为基因组和cDNA两者的DNA、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖-和核糖-核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。
本文使用的“受试者”和“患者”可互换地是指任何脊椎动物，包括(但不限于)哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人类灵长类动物(例如猴子，比如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在一些实施方案中，受试者可为人类或非人类。受试者或患者可能正在接受其他形式的治疗。
本文关于核酸使用的“变体”意指(i) 所指涉的核苷酸序列的一部分或片段；(ii)所指涉的核苷酸序列或其部分的互补物；(iii) 与所指涉的核酸或其互补物基本上相同的核酸；或(iv) 在严格条件下与所指涉的核酸、其互补物或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
关于肽或多肽的“变体”意指通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而氨基酸序列不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体也可意指具有与含有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的所指涉的蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白。氨基酸的保守性取代，即用具有相似性质(例如亲水性、荷电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，本领域公认为一般地涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲疏水指数来鉴定。氨基酸的亲疏水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有相似亲疏水指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白功能。一方面，亲疏水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将导致蛋白保留生物功能的取代。在肽的上下文中考虑到氨基酸的亲水性，可计算该肽的最大局部平均亲水性。可用亲水性值彼此在±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受该氨基酸特定侧链的影响。与该观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。
除非本文另外定义，否则关于本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，本文描述的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白和核酸化学以及杂交使用的任何命名法和其技术为本领域众所周知和通常使用的那些。该术语的含义和范围应是明确的；然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。
2. 组合物
本发明涉及微生物群研究和治疗领域。特别是，本公开提供使用益生菌来提高植物化学物质的生物利用度的组合物和方法。本文所述的组合物和方法包括益生菌和益生元植物糖苷的组合，其中益生菌能够将益生元植物糖苷转化为生物利用度提高的糖苷配基。
小肠为吸收营养物和外源性物质的主要部位，这为胃肠道的这一部分中普遍存在的HGM的代谢活性提供额外重要性，其中益生菌(比如乳杆菌属)构成微生物种群的重要部分。本公开提供对益生菌(比如嗜酸乳杆菌NCFM)在利用膳食治疗活性PG方面的多功能性的深刻理解，揭示仅碳水化合物部分被分解代谢，而糖苷配基被外在化，使其对于宿主吸收或与其他HGM生物体进一步相互作用是可生物利用的。
碳水化合物主要由乳杆菌属中的PTS转运蛋白摄取。易位经将磷酰基传递至底物特异性酶II (EII)复合物的酶促级联反应与主要在6’位的糖苷磷酸化偶联。EIIC形成定义EII复合物特异性的易位通道。磷酸化经EIIA和EIIB酶传递，已知其后者与EIIC特异性地相互作用。EII模块由单一基因(例如EIICBA水杨苷和七叶苷摄取系统(LBA0725))编码，或由单独的基因编码以组装磷酸化级联反应。例如，苦杏仁苷EIIC组件(LBA0227)需要来自未由同一基因座编码的EIIA和EIIB模块的偶联。该EIIC在基于其底物苦杏仁苷生长时被上调，而LBA0725 EIICBA基于底物水杨苷和七叶苷以及基于苦杏仁苷被高度上调(表6；图3；和图5)。因此，EIIC的失活引起仅基于底物苦杏仁苷的生长表型受损，而EIICBA的失活导致基于苦杏仁苷以及两种二糖(纤维二糖和龙胆二糖，两者均未被该基因座编码的LBA0225 P-Bgl水解)的生长减少约50% (图3)。
当EIIC系统失活时，缺乏基于苦杏仁苷或龙胆二糖的生长会阻碍仅经EIICBA系统摄取这些化合物。两种转运蛋白的共调控以及EIICBA基于非底物的表型影响的可能基本原理为LBA0725的EIIA和/或EIIB组件有助于使磷酸化与苦杏仁苷EIIC系统以及可能与其他EIIC模块偶联。然而，EIICBA基于非底物的不太明显的表型表明，该转运蛋白的贡献可被其他PTS系统所补充。如目前所知，在本公开之前尚未报道指定给不同家族的PTS系统之间的这种功能重叠。这种重叠可协调不同转运蛋白之间的相互作用，以赋予细菌对多种糖的摄取。
来自本公开的数据表明，人类肠道益生菌(比如嗜酸乳杆菌)在与膳食相关的PG活化中具有重要作用(图5)。例如，水杨苷为止痛和抗风湿药水杨酸的无药理活性的前体。实际上，在人体中口服给予富含水杨苷的柳树皮提取物之后，水杨酸已成为血清中的主要代谢物(86%)。然而，本公开揭示益生菌(比如嗜酸乳杆菌)经水杨醇的去糖基化和外在化而进行该生物活化的步骤，水杨醇变得可被其他微生物群氧化为水杨酸。白蜡树苷也维持嗜酸乳杆菌的生长，为中国和日本草药的活性成分之一，并对健康有几种潜在的积极作用，包括预防氧化应激。嗜酸乳杆菌还将葡萄酒和茶中富含的虎杖苷转化为白藜芦醇，后者为研究最多的治疗性植物化学物质之一，因为其参与防止例如炎症、癌症和肥胖。其他乳杆菌属也参与其他PG的代谢(例如粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)EPI2将大豆产品中存在的异黄酮黄豆苷体外转化为模拟雌激素的糖苷配基雌马酚，其被提议可预防乳腺癌)。
嗜酸乳杆菌菌株的基因组序列的计算机分析揭示了本公开中鉴定的PG利用基因座的保守性，表明该物种代谢PG的潜在能力(表7)。如本文所述，使用4种不同PG进行的生长分析揭示了生长的大物种差异(表3)。通常，嗜酸乳杆菌为基于PG生长最快的菌株之一，并且与来自其他生态位的对应物相比较，来自肠道的乳杆菌属菌株在PG利用方面似乎更好，这表明在适应人类肠道环境方面具有竞争优势。基因绘图分析显示，在基于水杨苷和七叶苷的生长与所测试菌株中存在完整LBA0724-6基因座之间存在相关性，这些菌株属于与分类学密切相关的德氏乳杆菌(L. delbrueckii)进化枝，即嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) (图2A)。相反，在该簇内缺少一个或多个基因或者具有LBA0725转运蛋白基因的片段化形式的菌株不能基于七叶苷和水杨苷生长(表3)。
综合起来，本公开提供了令人惊讶和不可预测的数据，这些数据关于PG的生物转化以及人类肠道适应性嗜酸乳杆菌和密切相关的类群对其生物活性糖苷配基的外在化。PG的生物转化伴随着小肠中植物化学物质活性的调节，这使得这些化合物可生物利用以与宿主和其他HGM类群进一步功能相互作用(图5)。本公开提供了对植物来源的糖苷的代谢及其通过微生物群的生物转化的深刻理解，这对人类健康具有重大影响。
a. 益生菌菌株
本公开的实施方案包括具有各种类型的益生菌菌株(比如来自乳杆菌属的菌株)的组合物。本公开的益生菌菌株通常具有将植物化学物质(例如植物植物化学物质或益生元植物糖苷)转化为生物活性糖苷配基或其衍生物的能力。在一些情况下，本公开的益生菌菌株通过去糖基化机理将植物化学物质转化为糖苷配基，所述机理涉及与磷酸转移酶系统(PTS)相关的一个或多个基因或者调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因。通常，糖苷配基为糖苷上的糖基被羟基取代之后残余的有机化合物。如以下数据所述，从植物化学物质或植物糖苷中去除糖基可提高糖苷配基的生物利用度或生物活性。能够内在化和/或吸收植物化学物质并释放可生物利用和生物活性糖苷配基的益生菌菌株包括(但不限于)嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus)、动物乳杆菌(L. animalis)、卷曲乳杆菌(L. crispatus)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)、肠乳杆菌(L. intestinalis)、詹氏乳杆菌(L. jensenii)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)、植物乳杆菌(L. plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)及其组合。在一些实施方案中，可用于本公开组合物中的益生菌菌株包括以下的一种或多种：嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)LA-1、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus) (ATCC 33620, DSM 20531)、动物乳杆菌(L. animalis) (DSM 20602)、卷曲乳杆菌(L. crispatus) (ATCC 33820, DSM20584)、发酵乳杆菌(L. fermentum) (ATCC 14931)、加氏乳杆菌(L. gasseri) (ATCC33323)、瑞士乳杆菌(L. helveticus) CNRZ32、肠乳杆菌(L. intestinalis) Th4 (ATCC49335, DSM 6629)、詹氏乳杆菌(L. jensenii) (ATCC 25258, 62G, DSM 20557)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)(ATCC 33200)、植物乳杆菌植物亚种(L. plantarum sp.plantarum) (ATCC 14917, LA70)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri) (ATCC 23272, DSM20016)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus) GG (ATCC 53103)或其组合。
本公开的实施方案还可包括具有各种类型的除上述益生乳杆菌属菌株之外并且与上述益生乳杆菌属菌株不同的益生菌菌株的组合物。例如，本公开的组合物可包含能够将益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物的益生菌菌株，以及另外的益生菌菌株，其包括(但不限于)来自以下的细菌菌株：双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)、魏斯氏菌属(Weissella)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、优杆菌属(Eubacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium) XIVa群或其组合，并且在一些情况下为拟杆菌属(Bacteroides)。本领域普通技术人员基于本公开将认识到，还可包含其他益生菌菌株。
本公开的益生菌菌株可通过去糖基化机理将植物化学物质转化为糖苷配基，所述机理涉及与磷酸转移酶系统(PTS)相关的一个或多个基因或者调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因。与PTS系统相关的一个或多个基因包括(但不限于) LicT转录抗终止子、PTS系统的EIICBA组件、糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶或者任何同源糖苷酶和水解酶。与植物糖苷的细胞内水解的调控或调节相关的一个或多个基因包括水解或磷酸化植物糖苷的各种酶，比如糖苷水解酶的GH1-GH128家族的任何成员，例如GH1、GH2、GH3和GH94的成员以及不同糖苷水解酶家族的其他成员，比如GH78推定的α-L-鼠李糖苷酶。在一些实施方案中，基因为植物糖苷水解酶，比如一种或多种磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl)、β-葡萄糖苷酶或鼠李糖苷酶。
另外，本公开的益生菌菌株可通过去糖基化机理将植物化学物质转化为糖苷配基，所述机理涉及与磷酸转移酶系统(PTS)相关的一个或多个基因的遗传改变或者调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因的遗传改变。对于本领域普通技术人员基于本公开易于显而易见的是，任何上述基因或基因座的遗传改变均可通过本领域已知的常规手段来实现。取决于期望的功能结果，可改变任何这些基因或基因座，以产生功能丧失等位基因、功能获得等位基因、超效等位基因、亚效等位基因等。通常，遗传改变包括来自一个或多个核酸分子的野生型或参考序列的任何变化。遗传改变非限制性地包括已知序列的核酸分子的至少一个核苷酸的碱基对取代、添加和缺失。
b. 益生元植物糖苷
本公开的实施方案包括具有各种类型的植物化学物质(比如能够转化为糖苷配基的益生元植物糖苷)的组合物。在一些实施方案中，益生元植物糖苷包括(但不限于)芳族糖苷，包括(但不限于)香豆素葡萄糖苷、二苯乙烯类葡萄糖苷、芳基β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇葡萄糖苷衍生物、黄酮醇、酚类、多酚类或其组合。在一些实施方案中，益生元植物糖苷包括(但不限于)葡萄糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、木糖苷、吡喃阿拉伯糖苷、葡萄糖醛酸苷或其组合。在其他实施方案中，益生元植物糖苷包括(但不限于)被单或双芳族环系统异头取代的单-或二-葡萄糖苷。在仍然其他的实施方案中，益生元植物糖苷包括(但不限于)苦杏仁苷、熊果苷、桃叶珊瑚苷、黄豆苷、七叶苷、白蜡树苷、异槲皮苷、虎杖苷、芸香苷水合物、水杨苷、黑芥子硫苷酸钾水合物、香草醛4-O-β-葡萄糖苷或其葡萄糖苷衍生物中的一种或多种。本领域普通技术人员基于本公开将认识到，还可包括其他益生元植物糖苷。
c. 载体和赋形剂
本公开的实施方案还可包括具有各种生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。例如，生理学载体或赋形剂可包括促进包含益生菌菌株和益生元植物糖苷的组合物的形成、消化和/或代谢的各种物质。生理学上可接受的赋形剂和载体可包括(但不限于)以下的一种或多种：纤维素、微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、木糖、脱脂乳、奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶、淀粉、海藻酸、明胶、磷酸氢钙、硬脂酸、交联羧甲基纤维素、二氧化硅、聚乙二醇、半纤维素、果胶、直链淀粉、支链淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，和其组合。在一些实施方案中，益生菌菌株和益生元植物糖苷可与各种非毒性、生理学上可接受的载体组合，用于片剂、小丸剂、胶囊剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、栓剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、硬或软胶囊剂、囊片剂或糖浆剂或酏剂和任何其他适用形式。载体可包括乳糖、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、三硅酸镁、滑石粉、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素、中链甘油三酯、葡聚糖和其他适用于以固体、半固体或液体形式制造制剂的载体。另外，也可使用辅助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂。
3. 营养补充剂
本公开的实施方案还提供包含益生菌菌株、益生元植物糖苷以及生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其可配制成营养补充剂或营养保健品，并且其中益生菌菌株能够使益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。任何上述成分可用于配制这种营养补充剂，使得可将其给予受试者。含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的营养补充剂可以各种形式配制和给予，包括(但不限于)片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、锭剂或栓剂。在一些实施方案中，可将含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的营养补充剂与可发酵乳制品(比如酸奶、奶酪、奶油干酪、松软干酪等)一起配制。
本公开的组合物可根据要使用的给予方式进行配制。例如，在其中组合物为可注射组合物的情况下，其可配制成无菌、无热原和无颗粒的组合物。也可使用等渗添加剂，并且包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液(比如磷酸盐缓冲盐水)为有利的。稳定剂可包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加到制剂中。
组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为功能性分子，比如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂，比如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物，囊泡比如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其他已知的转染促进剂。
4. 使用方法
本公开的实施方案还提供用于使用如上所述的组合物和营养补充剂的方法。本公开涉及通过给予受试者如上所述的含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物或其营养补充剂来向受试者提供膳食补充剂的方法，其中益生菌菌株能够使益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。本公开还涉及通过将如上所述的含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物或其营养补充剂与发酵乳制品混合来补充发酵乳制品的方法，其中益生菌菌株能够使益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。
5. 在受试者中治疗病症的方法
本公开的实施方案还提供用含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物在受试者中治疗一种或多种病症的方法，其中益生菌菌株能够将益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。任何以上营养补充剂制剂均可用于在受试者中治疗一种或多种病症。例如，本公开的组合物可用于治疗与一种或多种植物化学物质或能够使其可生物利用的细菌菌株的缺乏相关的障碍或疾病。在一些情况下，本公开的组合物可用于治疗独立于一种或多种植物化学物质或使其可生物利用的细菌菌株的存在或不存在而存在(或具有病因学)的疾病或障碍。在这种情况下，使用本公开的组合物提高一种或多种植物化学物质的生物利用度或生物活性可治愈、减轻、调节、治疗和/或预防疾病或障碍。在其他情况下，本公开的组合物可用于治疗目前未知与特定植物化学物质的缺乏相关的疾病或障碍。
通常，给予需要治疗的受试者含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物可导致提高益生元植物糖苷的生物利用度和/或生物活性(例如去糖基化)，这治疗疾病或障碍。在不限于特定机理的情况下，治疗疾病或障碍可涉及益生菌菌株(例如已记录的来自乳杆菌属内各种物种的益生菌菌株)与益生元植物糖苷接触并使其内在化。益生菌菌株然后可将植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或糖苷配基衍生物。在一些情况下，在植物糖苷转化为生物活性糖苷配基之后，益生菌可释放糖苷配基，使得宿主受试者或其他微生物类群可生物利用。
可以这种方式治疗的病症包括(但不限于)以下的一种或多种：肥胖、心血管疾病、代谢综合征、癌症、自身免疫性疾病、炎性障碍、消化系统障碍、消化系统相关障碍，或其组合。本领域普通技术人员基于本公开将认识到，还考虑已知受益生元植物糖苷、糖苷配基或其衍生物影响的其他疾病和障碍。
含有益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物的实施方案可以各种形式和以各种剂量配制和给予。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约1 mg-约100 mg范围内的益生菌。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约1 mg-约50 mg、约1 mg-约40 mg、约1 mg-约30 mg、约1 mg-约20 mg或约1 mg-约10 mg范围内的益生菌。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约10 mg-100 mg、约20 mg-约100 mg、约30 mg-约100 mg、约40 mg-约100 mg或约50 mg-约100 mg范围内的益生菌。
另外，组合物可配制成含有剂量在约1 mg-约500 mg范围内的益生元植物糖苷。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约1 mg-约50 mg，约1 mg-约40 mg、约1 mg-约30 mg、约1 mg-约20 mg或约1 mg-约10 mg范围内的益生元植物糖苷。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约10 mg-约100 mg、约20 mg-约100 mg、约30 mg-约100mg、约40 mg-约100 mg、约50 mg-约100 mg、约60 mg-约100 mg、约70 mg-约100 mg、约80mg-约100 mg或约90 mg-约100 mg范围内的益生元植物糖苷。在一些实施方案中，组合物可配制成含有剂量在约100 mg-约500 mg、约150 mg-约500 mg、约200 mg-约500 mg、约300mg-约100 mg、约350 mg-约500 mg、约400 mg-约100 mg或约450 mg-约500 mg范围内的益生元植物糖苷。
给药方案可以变化，这取决于受试者的需要、病症的类型、给药方案以及本领域普通技术人员将会认识到的其他治疗变量。例如，给药可包括每日剂量，使得组合物配制成每天给药一次。给药方案和制剂还可包括每天多次、每周、每两周和每月给予本公开的组合物。
6. 实施例
对于本领域技术人员易于显而易见的是，本文描述的本公开方法的其他合适的修改和改编为易于适用和可理解的，并且可在不背离本公开的范围或者本文公开的方面和实施方案的情况下使用合适的等同方案进行。现已详细描述了本公开，通过参考以下实施例将更清楚地理解本公开，这些实施例仅旨在仅说明本公开的一些方面和实施方案，而不应视为限制本公开的范围。本文参考的所有期刊参考文献、美国专利和出版物的公开内容特此通过参考以其全部结合。
本发明具有多个方面，通过以下非限制性实施例说明。
实施例1
材料和方法
化学品和碳水化合物。以下表1中描述了用于本公开的植物糖苷。使用的所有其他化学品均具有高纯度。
表1 植物糖苷及其支持嗜酸乳杆菌NCFM生长(OD600)的能力。
化合物 CAS号 常见天然来源的实例 供应商 纯度<sup>a</sup> 生长浓度(w/v)<sup>b</sup> <i>OD</i><sub>600</sub>max<sup>c</sup> 基于MS的分解代谢<sup>d</sup>
苦杏仁苷 29883-15-6 杏仁 Sigma ≥99% 1% 0.3 是
熊果苷 497-76-7 梨 Sigma ≥98% 1% 0.0 否
桃叶珊瑚苷 479-98-1 海盘车植物 Chemfaces ≥98% 0.5% 0.0 否
黄豆苷 552-66-9 大豆 AdooQ >98% 0.5% 0.0 ND
七叶苷 531-75-9 蒲公英咖啡 Sigma ≥98% 0.5% 0.4 是
白蜡树苷 524-30-1 奇异果 Chemfaces ≥98% 0.5% 0.4 是
异槲皮苷 482-35-9 洋葱 Sigma ≥90% 0.5% 0.0 否
虎杖苷 65914-17-2 葡萄 Sigma ≥95% 0.5% NA 是
芸香苷水合物 153-18-4 茶 Sigma ≥94% 0.5% 0.1 否
水杨苷 138-52-3 柳树 Sigma ≥99% 1% 0.8 是
黑芥子硫苷酸钾水合物 3952-98-5 花椰菜 Sigma ≥99% 0.5% 0.0 ND
香草醛4-O-β-葡萄糖苷 494-08-6 香草 mybiosource.com 100% 0.5% 1.3 是
a由供应商提供。b单一碳源生长实验中的浓度。c对在96微量滴定板中的200 µl培养物中，于无碳源的半限定培养基中的生长校正的最大光密度(600 nm)，相当于1 cm比色皿中吸光度的约50%。d基于植物糖苷的消耗和/或其代谢物的出现对分解代谢进行的质谱定性分析。ND：未检测到。NA：由于化合物的溶解度低而不适用。
细菌菌株和生长。细菌菌株和质粒如以下表2所示。
表2 用于和构建嗜酸乳杆菌NCFM的基因缺失突变体的菌株。
菌株 来源、基因型或特征/描述
大肠杆菌(<i>Escherichia coli</i>) EC101 RepA<sup>+</sup> JM101; Km<sup>r</sup>; 来自pWV01在染色体中整合的<i>repA</i>基因; 对于基于pORI的质粒+克隆宿主
嗜酸乳杆菌
NCFM 人类肠道分离物
NCK1909 (<i>Δupp</i>) <i>upp</i>基因(LBA0770)内具有0.3 kb框内缺失的NCFM; NCFM缺失突变体的背景/亲本菌株
NCK1910 带有质粒pTRK669的NCK1909 (17)
NCK2416 (<i>ΔLBA0225</i>) 在LBA0225内具有1.3 kb框内缺失的NCK1909
NCK2418 (<i>ΔLBA0227</i>) 在LBA0227内具有1.2 kb框内缺失的NCK1909
NCK2422 (<i>ΔLBA0725</i>) 在LBA0725内具有1.9 kb框内缺失的NCK1909
NCK2424 (<i>ΔLBA0726</i>) 在LBA0726内具有1.3 kb框内缺失的NCK1909
NCK2426 (<i>ΔLBA0225ΔLBA0726</i>) 在LBA0726内具有1.3 kb框内缺失的NCK2416
乳杆菌属菌株在有氧条件下于de Man-Rogosa-Sharpe (MRS)肉汤(DifcoLaboratories, Detroit, MI, USA)中，或者在无氧条件下在MRS琼脂平板(1.5% (w/v),Difco)上，于37℃或42℃下静态繁殖，以消除pTRK669。在存在2 μg mL-1红霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和/或2-5 μg mL-1氯霉素(Sigma)的情况下，选择重组嗜酸乳杆菌菌株。如Goh等所述，在含有2% (w/v)葡萄糖(GSDM)和100 μg mL-1 5-氟尿嘧啶(5-FU) (Sigma)的半限定琼脂培养基上选择无质粒的双重重组体。
为了进行初始生长和基因表达研究，嗜酸乳杆菌NCFM在补充有1%或0.5% (w/v)植物糖苷或碳水化合物(表1)的半限定培养基(SDM)中繁殖3次。对于RNA-seq分析，在指数中期(OD 600 =0.6-0.8)通过离心(3,220 x g, 10 min, 25℃)收获细胞，并储存于-80℃下用于随后的RNA分离。为了进行质谱代谢物分析，分别在生长的0、3、6、9、12和24小时取200 μL样品；通过离心去除细胞；并将上清液储存于-80℃下用于进一步分析。
使用在补充有1% (w/v)葡萄糖的SDM上生长的嗜酸乳杆菌菌株(表2)和其他乳杆菌属物种(表3)的1% (v/v)过夜培养物进行表型生长测定，以分别在96孔微孔板孔(Corning Costar, Corning, NY, USA)中一式两份或一式三份接种200 μL补充有1 % (w/v)所检查碳水化合物(在七叶苷的情况下为0.5％)的SDM。用透明粘合膜密封微孔板，在Fluostar Optima微孔板阅读器(BMG Labtech, Cary, NC, USA)中于37℃下进行温育，并监测细胞光密度(OD 600) 30小时。
表3 已校正为不含碳水化合物的培养基中的生长水平的乳杆菌属物种基于选定植物葡萄糖苷、纤维二糖和葡萄糖的生长。“+++”表示OD600 max > 0.6。“++”表示0.6 >OD600 max > 0.3。“+”表示0.3 > OD600 max > 0.1。“-”表示OD600 max < 0.1。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
在存在卡那霉素(40 μg mL-1)的情况下，于37℃和通风下，在脑心浸液(BHI)肉汤(Difco)中生长用于产生嗜酸乳杆菌基因敲除的大肠杆菌(Escherichia coli)EC101。用红霉素(150 μg mL-1)选择含有基于pTRK935的质粒的重组大肠杆菌(E. coli)EC101。长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum sp. longum) 20219、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum sp. infantis) DSM 20088和卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus) DSM 1896的生长在MRS培养基或补充有1% (w/v)碳源的改良MRS培养基中进行。在补充有碳源的YCFA培养基中培养肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)L1-82。
RNA提取、测序和转录分析。将来自10 mL细胞培养物的沉淀重悬于1 mL TRI试剂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中，并且之后转移至装有0.1 mm玻璃珠的1.5mL敲珠锥形管中(BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA)，并用Mini-Beadbeater-16 (BioSpec Products)以6x1分钟的周期(间歇地在冰上1分钟)破坏细胞。使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research, Irvine, CA, USA)先后进行柱上DNase I处理和对洗脱的RNA进行另外的Turbo DNAse (Thermo Fisher)处理来进行RNA纯化，并使用RNA Clean & Concentrator-5试剂盒(Zymo Research)进行进一步纯化。使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)对RNA的质量进行分析，并通过使用嗜酸乳杆菌NCFM基因特异性引物的PCR证实不存在基因组DNA。文库制备和RNA测序由Roy J. Carver Biotechnology Center, University of Illinois(Urbana-Champaign, IL, USA)的高通量测序和基因分型装置(High-ThroughputSequencing and Genotyping Unit)进行。rRNA去除(Ribo-Zero rRNA Removal Kit,Bacteria, Illumina, San Diego, CA, USA)之后，使用TruSeq链式总RNA库制备试剂盒(TruSeq Stranded Total RNA Library Prep kit) (Illumina)进行文库制备。使用HiSeq2500超高通量测序系统(HiSeq 2500 Ultra-High-Throughput Sequencing System)(Illumina)和Illumina HiSeq SBS Kit v4 (Illumina)进行单端RNA测序，读取长度为160nt。原始读数用bcl2fastq转换软件(v2.17.1.14, Illumina)进行多路分解；对适配子序列进行修整，对质量进行修整以去除错误概率阈值为0.001 (Phred分数, 30)的序列读数，并使用Geneious版本9.0.460进行过滤以去除<20 nt的读数。通过FastQC v0.11.5 (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评价读取质量。然后使用默认设置的Geneious Mapper将所得读数映射于嗜酸乳杆菌NCFM参考基因组。计算的测序覆盖深度为610-692x，和转录分析基于Geneious内计算的标准化每百万中的转录本(nTPM)。除非另外说明，否则差异表达的基因定义为log2比率≥2。
RT-qPCR测定。为了证实RNA-seq转录研究的结果，对所选基因进行逆转录酶定量PCR (RT-qPCR)分析。简而言之，按照制造商的说明使用iTaq通用型SYBR Green一步法试剂盒(iTaq Universal SYBR Green One-Step Kit) (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA, USA)，不同之处是使用50 ng RNA模板和300 nM每种引物(表4)将反应规模降至25 μl。使用iCycler MyiQ单色检测系统(Bio-Rad)，并使用iCycler MyiQ软件v1.0 (Bio-Rad)分析数据。标准曲线的相关系数和PCR效率分别在0.930-0.999和88.7-102.5%之间。
表4 引物
名称 序列 引物用法 SEQ ID NO:
LBA0225A GTAATAGGATCCCAACCATAGTTCATATCAAGTGGAA PCR 1
LBA0225B AAGTTGATGAGCGGCAACAG PCR 2
LBA0225C CTGTTGCCGCTCATCAACTTCAAAATGTGATTAAAACAAATGGCC PCR 3
LBA0225D TTAGTAGAGCTCGACTTGCATGCACCACAAAT PCR 4
LBA0225<i>up</i> TGCTCAAAACGCACATGTTTCA Seq/对照 5
LBA0225<i>down</i> ACTCGTGCTCGTGAACCAAT Seq/对照 6
LBA0225<i>mid</i> GAACACTATGTTCCATCTTAGGAAAA Seq/对照 7
LBA0227A GTAATAGGATCCGGTAGTATTAGCTAATTTAGGAACA PCR 8
LBA0227B TAATGCAACGATTGGTCTTG PCR 9
LBA0227C CAAGACCAATCGTTGCATTACTCTACAAGCAGGAACAACA PCR 10
LBA0227D TTAGTAGAATTCAATCCTTATTTCCGGTAGCT PCR 11
LBA0227<i>up</i> GTTGTTAACGAATCTGTTGATCA Seq/对照 12
LBA0227<i>down</i> ATCGTTTAAAAATTGCCATTGC Seq/对照 13
LBA0227<i>mid</i> TCAACGGTAGATAATGACGA Seq/对照 14
LBA0227.F AGATGCAGAACACGGTGGTC RT-qPCR 15
LBA0227.R GTCCAATAGTCATTCCTGCACC RT-qPCR 16
LBA0383.F TACTCAAAGAAGGCTTACG' RT-qPCR 17
LBA0383.R ATTAACTACGGCTTGAACC RT-qPCR 18
LBA0574.F GGCAACCGTTGTGATGGTTATC RT-qPCR 19
LBA0574.R ACCTTGCAAAGTTTCTTGGGC RT-qPCR 20
LBA0606.F TACCGGTCTTCACCACTTGG RT-qPCR 21
LBA0606.R GCTGCGTATTCTGCAAGGTG RT-qPCR 22
LBA0725A GTAATAGGATCCTCACATTGATTTTGCCGTTACT PCR 23
LBA0725B TCTTTGCCACCAACATCTTT PCR 24
LBA0725C AAAGATGTTGGTGGCAAAGAACATCAGTTAATGGACAAGTGC PCR 25
LBA0725D TTAGTAGAGCTCTCTAGCATCATTACGGCTGT PCR 26
LBA0725<i>up</i> CAGGTTAAAGAGTTTAAATCACAAACA Seq/对照 27
LBA0725<i>down</i> CACGAGCACTTGCAACAAAT Seq/对照 28
LBA0725<i>mid</i> TGAACTGGACATTAGATTCAGACGA Seq/对照 29
LBA0725.F ATCTTCGGTGTTCACTGGGG RT-qPCR 30
LBA0725.R AAACAACCCCGATTTGTGCG RT-qPCR 31
LBA0726A GTAATAGGATCCAAGTCAGTAGATGCAAAATATGA PCR 32
LBA0726B GTAGGCACCTTCAATTTGAT PCR 33
LBA0726C ATCAAATTGAAGGTGCCTACTCACTTAAGAGACTTCCTAAGGA PCR 34
LBA0726D TTAGTAGAATTCAGTCCGCTTGTCATCATAGT PCR 35
LBA0726<i>up</i> AAGGGGGTTCAATGACTCAAA Seq/对照 36
LBA0726<i>down</i> GCTTCATACAAAAATTCAGATTTGACA Seq/对照 37
LBA0726<i>mid</i> TTGTTAAAGGTGAAGTAAAGGTAGG Seq/对照 38
LBA1611.F TGCTTGGTCCTTAGCTGGTG RT-qPCR 39
LBA1611.R CAATGCCGCAGTAACCGAAG RT-qPCR 40
LBA1812.F TCCCAGATACCTGAAACGCC RT-qPCR 41
LBA1812.R AAATGAAGTTTGGCCAGGCG RT-qPCR 42
LBA1872.F CCGCGTTGCAGATACATCAAC RT-qPCR 43
LBA1872.R TCACAACCCACGCTTTATTGG RT-qPCR 44
DNA操纵和转化。使用ZR真菌/细菌DNA MiniPrep试剂盒(ZR Fungal/Bacterial DNAMiniPrep kit) (Zymo Research)分离来自嗜酸乳杆菌NCFM及其突变体的基因组DNA。使用QIAprep Spin MiniPrep试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)分离质粒DNA。限制性内切酶来自Roche (Roche, Basel, Switzerland)，和T4 DNA连接酶来自NEB (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA, USA)。PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(PfuUltra II fusion HSDNA polymerase) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)用于克隆，和Choice-Taq Blue DNA聚合酶(Denville Scientific, South Plainfield, NJ, USA)用于重组体的PCR筛选。在0.8% (w/V)琼脂糖凝胶上分析PCR扩增子，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction kit) (Qiagen)进行提取。DNA测序由EtonBiosciences (Durham, NC, USA)进行。
基因缺失突变体的构建。除了分别编码两个PTS系统的EIIC和EIICBA组件的LBA0227和LBA0725基因之外，使用基于upp的反向可选择性基因替换系统删除嗜酸乳杆菌NCFM基因LBA0225和LBA0726，其两者编码糖苷水解酶家族1 (GH1)酶的P-Bgl。简而言之，通过用两个引物对(例如LBA0225A/LBA0225B和LBA0225C/LBA0225D，表4)扩增缺失靶标的650-750 bp的上游和下游侧翼区域来构建框内缺失。通过使用重叠延伸PCR(SOE-PCR63)进行剪接来连接所得的纯化产物，并进行扩增以确定缺失等位基因。将包含侧翼限制性内切酶位点的SOE-PCR产物克隆在pTRK935整合载体的BamHI和SacI/EcoRI位点内，并转化到大肠杆菌EC101中。通过DNA测序确认所得重组质粒(pTRK1113-6)，并将其电穿孔到含有pTRK669辅助质粒的嗜酸乳杆菌NCK1910 (表2)中，且如先前所述进行单交换和双交换重组体的回收。携带新基因缺失等位基因的重组体通过菌落PCR分离，所述PCR使用表示为up/down (例如LBA0225up/LBA0225down)的引物对，其退火至扩增子的侧翼区域。采用上述引物对和表示为mid的引物(例如LBA0225mid)通过DNA测序来验证序列完整性和框内缺失。突变为90-96%编码区域的框内缺失。
使用质谱分析嗜酸乳杆菌NCFM培养上清液中植物糖苷的摄取。通过超高效液相色谱-二极管阵列检测-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-DAD-Q-TOF-MS)分析24小时期间基于苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷或水杨苷作为碳源生长的嗜酸乳杆菌NCFM培养物的上清液。样品用甲醇以1:20 (v/v)稀释，并使用1.5 μL注射体积。使用配备有UV/vis光谱二极管阵列检测器的Agilent Infinity 1290 UHPLC系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA,USA)在Agilent Poroshell 120苯基己基柱(2.1 × 150 mm, 2.7 μm)上进行分离。分离在60℃下以0.35 mL min-1进行，线性梯度由水(A)和乙腈(B)组成，两者均用20 mM甲酸缓冲，以10% B开始并在15分钟内增加至100%且保持2分钟，在0.1分钟内恢复到10%并保持3分钟。MS检测在配备有Agilent Dual Jet Stream电喷雾离子源的Agilent 6550 iFunnel QTOFMS上进行，干燥气体温度为160℃和气流为13 L min-1，而鞘气温度为300℃和流速为16 Lmin-1。以ESI模式进行电离，毛细管电压设置为4000 V和喷嘴电压设置为500 V。质谱以MS模式记录质心数据为m/z 85-1700，采集速率为10个光谱s-1。为了避免残留，将针座以4 mLmin-1分别使用以下进行反冲洗15 s：i) 水中(1:1 v/v)的异丙醇: 0.2%氢氧化铵(w/v)；ii) 含有2%甲酸的乙腈(w/v)；iii) 含有2%甲酸的水。用Agilent MassHunterQualitative Analysis B.07.00软件包(Agilent Technologies)处理数据，并从植物糖苷及其主要代谢物的标准曲线获得摩尔浓度。使用先前鉴定的化合物列表以及标准化学修饰进行目标化合物搜索。
实施例2
嗜酸乳杆菌NCFM基于营养相关的植物糖苷(PG)的生长
基于12种化学上不同、营养相关和/或治疗活性PG评估嗜酸乳杆菌NCFM的生长(图1，表1)。图1A提供本文所述的植物糖苷底物的结构和常见来源。支持嗜酸乳杆菌生长的化合物以绿色表示。R1：β-D-Glcp；R2：龙胆二糖苷(β-D-Glcp-(1,6)-D-Glcp)；R3：芸香糖苷(α-L-Rhaf-(1,6)-D-Glcp)。图1B中的图表描绘通过质谱分析的植物糖苷利用以及作为最大OD600的生长。由于虎杖苷的溶解度低，OD600不能用作生长指标，并且该化合物的利用通过乳酸盐产生以及基于代谢物分析的高利用水平得以证实。
生氰性二葡萄糖苷苦杏仁苷、香豆素葡萄糖苷七叶苷和白蜡树苷、醇葡萄糖苷水杨苷和醛葡萄糖苷香草醛4-O-β-葡萄糖苷均支持在96孔板中的200 µL培养物中生长至最大OD600nm为0.3-1.3。使用OD600nm作为生长指标妨碍了二苯乙烯类虎杖苷的溶解性不佳，但是基于该生物活性化合物的生长通过乳酸盐产生和代谢物分析得以验证。还测试了来自不同生态位的另外乳杆菌属菌株基于PG苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷和水杨苷以及对照二糖(纤维二糖)和葡萄糖的生长。嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌植物亚种和鼠李糖乳杆菌菌株一起显示出基于PG的多方面生长(表3)。通常，与来自其他生态环境的对应物相比较，在从人类肠道生态位分离的菌株中，基于PG生长的能力更为普遍。
实施例3
基于植物糖苷的生长在嗜酸乳杆菌NCFM中引起益生元样转录反应
通过RNA-seq分析了嗜酸乳杆菌NCFM基于乳糖、葡萄糖以及支持生长的PG苦杏仁苷、七叶苷和水杨苷(其基于生物利用度和化学多样性进行选择)的生长的指数早-中期的总体转录。与葡萄糖相比较，基于乳糖和PG的生长差异上调1832个预测的蛋白编码基因的不足10%(表5)。仅2%的基因基于PG高度上调(表5)。通常，差异值高于2.0认为是相关的，并且表明显著上调；差异值低于-2.0认为是相关的，并且表明显著下调。
表5 如通过RNA-Seq分析的嗜酸乳杆菌NCFM基于苦杏仁苷(AM)、七叶苷(ES)、水杨苷(SA)、乳糖(Lac)、葡萄糖(Glu)和无碳源生长的差异上调基因。注释根据直系同源基因簇分类着色。差异标准化每百万中的转录本(TPM)比率(DE)根据级别着色：粗体(DE≥4)，粗体下划线(DE≥2)，常规(1.9≥DE≥-1.9)，斜体下划线(-2≥DE)，斜体(-4≥DE)。
Figure 686505DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 790596DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 508016DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 903225DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
在上调的基因中，55个由两种或更多种PG共享，而58、35和0个分别对苦杏仁苷、七叶苷和水杨苷是独特诱导的，表明与水杨苷相比较，对苦杏仁苷和在较小程度上对七叶苷具有较广泛和独特的细胞反应。引人注意的是，支持最低生长的苦杏仁苷上调了最高数量的基因(116个基因)，其次是七叶苷(87个)和水杨苷(33个)。碳水化合物的代谢和转运基因占差异转录组的约三分之一。转录反应还揭示了编码预计与粘液、纤维蛋白原和上皮细胞粘附相关的蛋白的基因上调(例如LBA0649、LBA1392、LBA1633和LBA1709，表5和表6)。
表6 基于苦杏仁苷(Amy)、七叶苷(Esc)和水杨苷(Sal)生长的嗜酸乳杆菌NCFM的转录组中高度上调的基因。所包含的基因显示出与葡萄糖(Glc)相比较，植物糖苷的标准化每百万中的转录本(nTPM)的log2差异表达比率≥4。
基因座标签 注释<sup>*</sup> COG<sup>†</sup> Log<sub>2</sub>比率Amy/Glc<sup>‡</sup> Log<sub>2</sub>比率Esc/Glc<sup>‡</sup> Log<sub>2</sub>比率Sal/Glc<sup>‡</sup>
LBA0227 PTS EIIC G 9.9 0.8 0.9
LBA0725 PTS EIICBA G 9.7 9.8 8.9
LBA0726 磷酸-β-葡萄糖苷酶(GH1) G 7.2 6.9 6.2
LBA1436 甘油摄取促进蛋白 G 7.2 4.9 3.8
LBA0631 假定蛋白 - 7.2 2.9 2.9
LBA1435 假定蛋白 S 7.1 5 3.6
LBA1434 二羟基丙酮激酶 G 6.7 4.5 3.3
LBA1869 β-磷酸葡萄糖变位酶 R 6.7 4.2 2.4
LBA1684 PTS EIIA G 6.6 2.9 2.6
LBA0225 磷酸-β-葡萄糖苷酶(GH1) G 6.5 -0.2 -0.1
LBA0724 转录调控子(抗终止子) K 6.4 5.5 5.3
LBA0228 转录调控子 G 6.3 0.9 0.1
LBA1433 二羟基丙酮激酶 G 6 3.7 2.7
LBA0728 假定蛋白 R 6 4.8 4.1
LBA0555 肌球蛋白交叉反应抗原/脂肪酸水合酶 S 6 2 1.4
LBA1974 丙酮酸氧化酶 E 5.5 3.6 1.8
LBA1689 麦芽糖-6’-磷酸葡萄糖苷酶(GH4) G 5.3 1.8 3.7
LBA1812 α-葡萄糖苷酶II (GH31) G 5.3 2.8 2.2
LBA1701 蜜二糖操纵子调控蛋白 K 5.3 4.9 1
LBA0466 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ATP) C 5.2 2 1.3
LBA0492 假定蛋白 - 5 3.7 2
LBA0606 PTS EIIBC G 4.9 2.8 2.5
LBA0491 PTS EIIC G 4.7 3.4 1.5
LBA1797 假定蛋白 - 4.7 2.6 1.3
LBA0877 PTS EIIA G 4.6 3 1.3
LBA1873 乙酸激酶 C 4.6 0.8 1.2
LBA1709 粘液结合蛋白前体 - 4.5 3.6 0.5
LBA1632 NAD依赖性醛脱氢酶 C 4.4 3.3 2
LBA1401 过氧化物酶(Npx) R 4.4 3.1 2.7
LBA0876 PTS EIIC G 4.4 2.9 2.4
LBA1871 新普鲁兰酶(GH13) G 4.3 2.1 0.9
LBA1411 延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基 C 4 1.7 1.4
*注释当可能时基于同源性或功能特征。†COG：直系同源基因簇分类；C：能量产生与转化；E：氨基酸代谢与转运；G：碳水化合物代谢与转运；K：转录；R：仅一般功能预测；和S：功能未知。‡相对于葡萄糖，标准化每百万中的转录本的差异转录log2比率。
引人关注的是，编码细胞防御氧化还原酶(例如过氧化物酶(LBA1401)和氧化还原酶(LBA1025))的基因也被上调，表明可能存在外源性应激反应(表5和表6)。多药外排ABC输出系统也被上调(例如LBA0574-0575以及41种假定蛋白，表5)。总之，基于PG的生长似乎通过增加宿主相互作用和粘附而促进与益生菌作用相关的特性，在用PG芸香苷和根皮苷进行预处理之后对鼠李糖乳杆菌也观察到这种情况。
实施例4
特定PTS摄取系统和专门的磷酸-β-葡萄糖苷酶对于基于植物β-葡萄糖苷的生长至关重要
两个基因座在基于PG生长后高度差异性上调(表5和表6)，这也用qRT-PCR分析得到证实(数据未显示)。第一基因座包括4个基因，其对所有3种PG均高度上调(log2比率4.1-8.9，对应于17-478倍上调)。这些基因编码LicT转录抗终止子(LBA0724)、PTS系统的EIICBA组件(LBA0725)、根据CAZy数据库的糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl;LBA0726)和假定蛋白(LBA0728)。图2提供植物糖苷利用基因座的转录概况和保守性。RNA读取覆盖了苦杏仁苷(深绿色)、七叶苷(浅绿色)、水杨苷(青绿色)和葡萄糖(浅灰色)。图2A显示基于3种植物糖苷的嗜酸乳杆菌NCFM的最高上调基因座，其编码转录调控子(LBA0724)、PTS EIIBCA转运蛋白(LBA0725)和糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl)(LBA0726)和假定蛋白(白色)。图2B提供仅基于苦杏仁苷上调的基因座，其还编码P-Bgl(LBA0225)和PTS EIIC转运蛋白(LBA0227)。显示了在来自德氏菌(delbrueckii)群的选定乳杆菌属中基因座的保守性以及与嗜酸乳杆菌NCFM相比较的氨基酸序列同一性。红色垂直线表示骨架边界。预测的不依赖rho的转录终止子显示为发夹环，总体置信度分数在0-100的范围内。
这些基因，除了属于乳杆菌属核心基因组的转录程度较低的LBA0728之外，均属于PG转录组中上调程度最高的前10%基因之一(表5)。仅对苦杏仁苷转录应答的第二基因座编码GH1的另一P-Bgl (LBA0225)、发散转录的PTS EIIC组件(LBA0227)和转录调控子(LBA0228) (图2B)。这两个基因座在嗜酸乳杆菌物种中严格保守，并且在来自德氏菌群的相关乳杆菌属中一定程度上保守(图2，表7)。
表7 在该项工作中鉴定的NCBI生物数据库中的嗜酸乳杆菌菌株中植物糖苷利用基因座的保守性(通过其基因座标签和登录号注释)。
Figure 904548DEST_PATH_IMAGE010
表7显示氨基酸同一性和序列覆盖(如果其小于嗜酸乳杆菌NCFM中的100%蛋白)。
为了确定这两个基因座的功能意义，使用基于upp的反向可选择性基因替换系统(表2)构建每个PTS EII和P-Bgl基因的单缺失以及两个P-Bgl基因的双缺失，并分析突变菌株的生长表型(图3)。表型生长分析基于β-葡萄糖苷七叶苷、水杨苷、苦杏仁苷以及二糖(龙胆二糖和纤维二糖)的EII PTS转运蛋白(图3A、3C、3E、3G和3I)和磷酸-β-葡萄糖苷酶(图3B、3D、3F、3H和3J)的缺失突变体。背景Δupp菌株显示为灰色填充图，和突变菌株的生长显示为：PTS EIIC (LBA0227，粉红色三角形)、磷酸-β-葡萄糖苷酶(LBA0225，浅蓝色三角形)、PTS EIICBA (LBA0725，黄色正方形)、第二磷酸-β-葡萄糖苷酶(LBA0726，淡紫色正方形)和双磷酸-β-葡萄糖苷酶突变体(LBA0225/LBA0726，黑色星形)。该配色方案与用于图2中基因座的配色方案一致。
ΔLBA0725突变体(失活PTS EIICBA)的生长基于七叶苷和水杨苷被消除，基于苦杏仁苷被严重减少，而基于纤维二糖和龙胆二糖则适度减少。基于七叶苷和水杨苷的生长被消除，使得该EIICBA被鉴定为这些PG的唯一转运蛋白，但基于其他化合物的生长减少表明该转运系统的另外作用。缺少功能性P-Bgl的ΔLBA0726突变体的生长概况对于PG相似，但基于纤维二糖和龙胆二糖两者的生长均不受影响。该表型还支持P-Bgl (LBA0726)对PG七叶苷和水杨苷的异常特异性(图3)。因此，该基因座的特异性可归因于PG的摄取和水解，优选不同的单葡萄糖基化的小芳族糖苷配基。
基于苦杏仁苷和龙胆二糖两者(两者共具β-(1,6)-二葡萄糖苷部分(图1))消除了仅由苦杏仁苷上调的第二基因座中ΔLBA0227突变体(失活EIIC)的生长(图3E、3G)。对于水杨苷和七叶苷的表型是不变的(图3A、3C)。这些数据为该PTS EIIC转运蛋白对苦杏仁苷和龙胆二糖的特异性提供了令人信服的证据，这与先前报道的对龙胆二糖的反应上调一致。P-Bgl突变体(ΔLBA0225)的表型也支持该特异性。缺少来自第一基因座的P-Bgl的Δ LBA0726突变体基于苦杏仁苷的生长严重减少(图3F)，但基于龙胆二糖却没有(图3H)，表明该酶在苦杏仁苷分解代谢中的作用。实际上，只有双重P-Bgl突变体才能消除基于苦杏仁苷的生长(图3F)。鉴定野黑樱苷(苦杏仁苷的单去葡萄糖基化形式)水平低(表8)表明，苦杏仁苷的去糖基化以两步进行，其中非还原性β-(1,6)-连接的葡萄糖基被识别β-(1,6)-龙胆二糖部分的P-Bgl (LBA0225)和裂解单葡萄糖基化化合物的第二P-Bgl (LBA0726)依序裂解，以释放糖苷配基部分。
表8 如通过UHPLC-qTOF-MS分析的嗜酸乳杆菌NCFM培养上清液中的植物糖苷及其代谢物。接种之前在培养物中鉴定出的起始植物糖苷底物以粗体加下划线显示。糖苷配基以粗体显示，并从24小时培养上清液样品进行代谢物分析。
Figure 727011DEST_PATH_IMAGE012
*基于苦杏仁苷(Amy)、熊果苷(Arb)、桃叶珊瑚苷(Auc)、七叶苷(Esc)、白蜡树苷(Fra)、虎杖苷(PD)、异槲皮苷(IQ)、芸香苷(Rut)、水杨苷(Sal)或香草醛4-O-β-葡萄糖苷(Van)生长的嗜酸乳杆菌NCFM的上清液。†在UV检测器中测量的保留时间。‡在MS检测器中的保留时间。§通过与标准化合物比较确认。¶未检测到。#在几个峰中洗脱的化合物，其中记录最显著的一个。
基于这些数据，可将编码PTS EIIC转运蛋白(LBA0227)和磷酸-β-葡萄糖苷酶(LBA0225)的基因座特异性归因于具有β-(1,6)-二葡萄糖苷基序的化合物，像龙胆二糖和苦杏仁苷。然而，具有龙胆二糖部分的PG (像苦杏仁苷)的完全去糖基化需要第二P-Bgl(LBA0726)的另外活性。
实施例5
嗜酸乳杆菌偏好支持最高生长的PG并将生物活性糖苷配基外在化
监测嗜酸乳杆菌NCFM的生长，并在0和24小时分析培养上清液中的代谢物。PG均在预培养培养基中鉴定(表8)。支持生长的PG (图1)的消耗与生长(最终OD600)成比例，并且在培养上清液中鉴定出缺少葡萄糖基部分(失去162 Da，表8)的相应糖苷配基。从糖苷配基白藜芦醇的消耗程度(图1)、鉴定(表8)和乳酸盐产生证实了虎杖苷的生长。唯一偏离这一趋势的为没有苦杏仁苷的糖苷配基(扁桃腈)。取而代之的是，苦杏仁苷利用的主要代谢物为苯甲醛，由于其挥发性只能通过UV检测。不支持生长的PG仍然存在且在24小时未检测到任何代谢物。
还监测了培养上清液中3种最可获得的PG - 水杨苷、七叶苷和苦杏仁苷及其代谢物的浓度的时间变化。水杨苷的浓度在整个生长期均降低(图4A和图6)，而在指数期期间观察到糖苷配基水杨醇的趋势相反。图4提供基于植物葡萄糖苷生长的嗜酸乳杆菌NCFM的时间分辨代谢物分析。在培养上清液中水杨苷的时程消耗及其糖苷配基水杨醇的出现可视为图4A中的UHPLC-qTOF-MS色谱图中的A270 nm峰下面积。嗜酸乳杆菌NCFM在基于水杨苷、七叶苷和苦杏仁苷的等摩尔混合物的生长期间对植物糖苷的偏好如图4B所示。优选水杨苷，其次是七叶苷，而苦杏仁苷在24小时之后几乎不消耗。植物糖苷的糖苷配基和乳酸盐的浓度随着生长而提高。值得注意的是，水杨苷的糖苷配基部分本身不能支持嗜酸乳杆菌的生长(数据未显示)。对七叶苷观察到相同模式，其随着生长的前12小时期间糖苷配基代谢物七叶苷原浓度的提高而被消耗(图6)。
培养上清液中苦杏仁苷的浓度也随着苯甲醛的增加而稳定地降低(图6)。然而，与其他两种PG形成对比，在24小时生长期间仅利用了初始苦杏仁苷的约三分之一，并且苦杏仁苷和苯甲醛的总浓度随着时间的推移不变。鉴定出苦杏仁苷的单去葡萄糖基化代谢物(即野黑樱苷)水平低(表8)。尽管在前6小时内鉴定出了糖苷配基扁桃腈([M+CH3COO]-加合物, m/z 192.0664)，但苦杏仁苷的主要代谢物为苯甲醛，其为通过扁桃腈的氰化氢消除反应产生。该反应被腈裂解酶催化，但是据报道也自发发生。这是该分析中可能的情况，因为嗜酸乳杆菌没有编码腈裂解酶基因。痕量东莨菪素(七叶苷糖苷配基的甲基化形式) (表8)的检测为对PG糖苷配基进行酶促修饰的唯一证据，但是该物类的匮乏使得对该修饰的特异性产生怀疑。综合起来，代谢物分析支持嗜酸乳杆菌主要输出未经酶促修饰的非碳水化合物部分。外在化的机理尚不清楚，但是输出系统(例如在七叶苷情况下的ATP结合盒输出蛋白(LBA0573-5))在转录组中被上调(表5)。
为了评估随机还是根据特定偏好摄取苦杏仁苷、七叶苷和水杨苷，对基于等摩尔浓度的这些PG生长的嗜酸乳杆菌NCFM的上清液进行分析。引人注目地，水杨苷为第一种完全消耗的化合物，其次是七叶苷，而大量的苦杏仁苷在生长24小时之后仍然存在(图4B)，这确定了嗜酸乳杆菌在支持最佳生长的PG利用中的明确偏好。
应当理解，前述详述和所附实施例仅为说明性的，并且不应视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物来定义。
对所公开实施方案的各种改变和修改为本领域技术人员显而易见的。在不背离其精神和范围的情况下，可进行这样的改变和修改，非限制性地包括与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些。
出于完整性的原因，本发明的各个方面在以下编号的条款中阐述：
条款1. 一种包含益生菌菌株、益生元植物糖苷和生理学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，其中所述益生菌菌株能够使所述益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。
条款2. 条款1的组合物，其中所述益生菌菌株包含来自乳杆菌属的细菌物种。
条款3. 条款2的组合物，其中所述细菌物种为嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus)、动物乳杆菌(L. animalis)、卷曲乳杆菌(L. crispatus)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)、肠乳杆菌(L. intestinalis)、詹氏乳杆菌(L. jensenii)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)、植物乳杆菌(L. plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)及其组合。
条款4. 条款3的组合物，其中所述细菌菌株选自嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)LA-1、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus) (ATCC 33620,DSM 20531)、动物乳杆菌(L. animalis) (DSM 20602)、卷曲乳杆菌(L. crispatus) (ATCC33820, DSM 20584)、发酵乳杆菌(L. fermentum) (ATCC 14931)、加氏乳杆菌(L. gasseri) (ATCC 33323)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)CNRZ32、肠乳杆菌(L. intestinalis) Th4 (ATCC 49335, DSM 6629)、詹氏乳杆菌(L. jensenii) (ATCC 25258,62G, DSM 20557)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)(ATCC 33200)、植物乳杆菌植物亚种(L. plantarum sp. plantarum) (ATCC 14917, LA70)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri) (ATCC23272, DSM 20016)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus) GG (ATCC 53103)及其组合。
条款5. 条款4的组合物，其中所述细菌菌株为嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM。
条款6. 条款1-5中任何一项的组合物，其进一步包含至少第二益生菌菌株，所述第二益生菌菌株不是来自乳杆菌属的细菌物种。
条款7. 条款6的组合物，其中所述至少第二益生菌菌株包括来自以下的细菌菌株：拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)、魏斯氏菌属(Weissella)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、优杆菌属(Eubacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium) XIVa群，或其组合。
条款8. 条款1-7中任何一项的组合物，其中所述益生菌菌株包含与磷酸转移酶系统(PTS)相关的一个或多个基因的遗传改变。
条款9. 条款8的组合物，其中所述一个或多个基因包括LicT转录抗终止子、PTS系统的EIICBA组件、糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶或者任何同源葡萄糖苷酶和水解酶中的一个或多个。
条款10. 条款1-9中任何一项的组合物，其中所述益生菌菌株包含调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因的遗传改变。
条款11. 条款10的组合物，其中所述调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因编码水解或磷酸化所述植物糖苷的酶。
条款12. 条款11的组合物，其中所述酶包括植物糖苷水解酶。
条款13. 条款12的组合物，其中所述益生元植物糖苷水解酶包括一种或多种磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl)、β-葡萄糖苷酶或鼠李糖苷酶。
条款14. 条款1-13中任何一项的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括芳族糖苷、香豆素葡萄糖苷、二苯乙烯类葡萄糖苷、芳基β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇葡萄糖苷衍生物、黄酮醇、酚类、多酚类或其组合。
条款15. 条款1-14中任何一项的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括葡萄糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、木糖苷、吡喃阿拉伯糖苷、葡萄糖醛酸苷或其组合。
条款16. 条款1-15中任何一项的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括被单或双芳族环系统异头取代的单-或二-葡萄糖苷。
条款17. 条款1-16中任何一项的组合物，其中所述益生元植物糖苷为苦杏仁苷、熊果苷、桃叶珊瑚苷、黄豆苷、七叶苷、白蜡树苷、异槲皮苷、虎杖苷、芸香苷水合物、水杨苷、黑芥子硫苷酸钾水合物、香草醛4-O-β-葡萄糖苷或其葡萄糖苷衍生物中的一种或多种。
条款18. 条款1-17中任何一项的组合物，其中所述益生元植物糖苷为虎杖苷。
条款19. 条款1-18中任何一项的组合物，其中所述生理学上可接受的赋形剂包括以下的一种或多种：纤维素、微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、木糖、脱脂乳、奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶、淀粉、海藻酸、明胶、磷酸氢钙、硬脂酸、交联羧甲基纤维素、二氧化硅、聚乙二醇、半纤维素、果胶、直链淀粉、支链淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，及其组合。
条款20. 一种包含条款1-19中任何一项的组合物的营养补充剂。
条款21. 一种用于提供给受试者膳食补充剂的方法，所述方法包括给予所述受试者条款1-19中任何一项的组合物或条款20的营养补充剂。
条款22. 一种补充发酵乳制品的方法，所述方法包括将条款1-19中任何一项的组合物或条款20的营养补充剂与发酵乳制品混合。
条款23. 一种在需要它的受试者中治疗病症的方法，所述方法包括给予所述受试者条款1-19中任何一项的组合物或条款20的营养补充剂，从而治疗所述病症。
条款24. 条款23的方法，其中所述病症为以下的一种或多种：肥胖、心血管疾病、代谢综合征、癌症、自身免疫性疾病、炎性障碍、消化系统障碍、消化系统相关障碍，或其组合。
条款25. 条款23的方法，其中所述组合物或营养补充剂以片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、锭剂或栓剂的形式给予。
条款26. 条款23的方法，其中治疗所述受试者包括所述益生菌菌株使所述益生元植物糖苷内在化，使所述益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物，和释放所述生物活性糖苷配基，其中所述生物活性糖苷配基被所述受试者吸收。
Figure IDA0002421464000000011
Figure IDA0002421464000000021
Figure IDA0002421464000000031
Figure IDA0002421464000000041
Figure IDA0002421464000000051
Figure IDA0002421464000000061
Figure IDA0002421464000000071
Figure IDA0002421464000000081

Claims (26)

1.一种组合物，其包含：
益生菌菌株；
益生元植物糖苷；和
生理学上可接受的载体和/或赋形剂；
其中所述益生菌菌株能够使所述益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物。
2.权利要求1的组合物，其中所述益生菌菌株包含来自乳杆菌属的细菌物种。
3. 权利要求2的组合物，其中所述细菌物种为嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus)、动物乳杆菌(L. animalis)、卷曲乳杆菌(L. crispatus)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)、肠乳杆菌(L. intestinalis)、詹氏乳杆菌(L. jensenii)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)、植物乳杆菌(L. plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)及其组合。
4. 权利要求3的组合物，其中所述细菌菌株选自嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)LA-1、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM、食淀粉乳杆菌(L. amylovorus) (ATCC 33620, DSM20531)、动物乳杆菌(L. animalis) (DSM 20602)、卷曲乳杆菌(L. crispatus) (ATCC33820, DSM 20584)、发酵乳杆菌(L. fermentum) (ATCC 14931)、加氏乳杆菌(L. gasseri) (ATCC 33323)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)CNRZ32、肠乳杆菌(L. intestinalis) Th4 (ATCC 49335, DSM 6629)、詹氏乳杆菌(L. jensenii) (ATCC 25258,62G, DSM 20557)、约翰逊乳杆菌(L. johnsonii)(ATCC 33200)、植物乳杆菌植物亚种(L. plantarum sp. plantarum) (ATCC 14917, LA70)、罗伊氏乳杆菌(L. reuteri) (ATCC23272, DSM 20016)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus) GG (ATCC 53103)及其组合。
5. 权利要求4的组合物，其中所述细菌菌株为嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)NCFM。
6.权利要求1的组合物，其进一步包含至少第二益生菌菌株，所述第二益生菌菌株不是来自乳杆菌属的细菌物种。
7. 权利要求6的组合物，其中所述至少第二益生菌菌株包括来自以下的细菌菌株：拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)、魏斯氏菌属(Weissella)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、优杆菌属(Eubacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium) XIVa群，或其组合。
8.权利要求1的组合物，其中所述益生菌菌株包含与磷酸转移酶系统(PTS)相关的一个或多个基因的遗传改变。
9. 权利要求8的组合物，其中所述一个或多个基因包括LicT转录抗终止子、PTS系统的EIICBA组件、糖苷水解酶家族1 (GH1)的磷酸-β-葡萄糖苷酶或者任何同源糖苷酶和水解酶中的一个或多个。
10.权利要求1的组合物，其中所述益生菌菌株包含调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因的遗传改变。
11.权利要求10的组合物，其中所述调控植物糖苷的细胞内水解的一个或多个基因编码水解或磷酸化所述植物糖苷的酶。
12.权利要求11的组合物，其中所述酶包括植物糖苷水解酶。
13.权利要求12的组合物，其中所述益生元植物糖苷水解酶包括一种或多种磷酸-β-葡萄糖苷酶(P-Bgl)、β-葡萄糖苷酶或鼠李糖苷酶。
14.权利要求1的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括芳族糖苷、香豆素葡萄糖苷、二苯乙烯类葡萄糖苷、芳基β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇葡萄糖苷衍生物、黄酮醇、酚类、多酚类或其组合。
15.权利要求1的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括葡萄糖苷、果糖苷、鼠李糖苷、木糖苷、吡喃阿拉伯糖苷、葡萄糖醛酸苷或其组合。
16.权利要求1的组合物，其中所述益生元植物糖苷包括被单或双芳族环系统异头取代的单-或二-葡萄糖苷。
17.权利要求1的组合物，其中所述益生元植物糖苷为苦杏仁苷、熊果苷、桃叶珊瑚苷、黄豆苷、七叶苷、白蜡树苷、异槲皮苷、虎杖苷、芸香苷水合物、水杨苷、黑芥子硫苷酸钾水合物、香草醛4-O-β-葡萄糖苷或其葡萄糖苷衍生物中的一种或多种。
18.权利要求1的组合物，其中所述益生元植物糖苷为虎杖苷。
19.权利要求1的组合物，其中所述生理学上可接受的赋形剂包括以下的一种或多种：纤维素、微晶纤维素、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、木糖、脱脂乳、奶粉、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶、淀粉、海藻酸、明胶、磷酸氢钙、硬脂酸、交联羧甲基纤维素、二氧化硅、聚乙二醇、半纤维素、果胶、直链淀粉、支链淀粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮，及其组合。
20.一种包含权利要求1的组合物的营养补充剂。
21.一种用于提供给受试者膳食补充剂的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1的组合物。
22.一种补充发酵乳制品的方法，所述方法包括将权利要求1的组合物混合。
23.一种在需要它的受试者中治疗病症的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1的组合物，从而治疗所述病症。
24.权利要求23的方法，其中所述病症为以下的一种或多种：肥胖、心血管疾病、代谢综合征、癌症、自身免疫性疾病、炎性障碍、消化系统障碍、消化系统相关障碍，或其组合。
25.权利要求23的方法，其中所述组合物或营养补充剂以片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、锭剂或栓剂的形式给予。
26.权利要求23的方法，其中治疗所述受试者包括：
所述益生菌菌株使所述益生元植物糖苷内在化，使所述益生元植物糖苷转化为生物活性糖苷配基或其衍生物，和释放所述生物活性糖苷配基；
其中所述生物活性糖苷配基被所述受试者吸收。
CN201880061663.0A 2017-07-24 2018-07-23 用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和方法 Pending CN111465327A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762536209P 2017-07-24 2017-07-24
US62/536209 2017-07-24
PCT/US2018/043305 WO2019023136A1 (en) 2017-07-24 2018-07-23 COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING BIOAVAILABILITY AND BIOACTIVITY OF PHYTOHEMICAL COMPOUNDS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111465327A true CN111465327A (zh) 2020-07-28

Family

ID=65041420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880061663.0A Pending CN111465327A (zh) 2017-07-24 2018-07-23 用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200222474A1 (zh)
EP (1) EP3657956A4 (zh)
CN (1) CN111465327A (zh)
CA (1) CA3070606A1 (zh)
WO (1) WO2019023136A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410321A (zh) * 2020-11-26 2021-02-26 昆明理工大学 一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用
CN115568547A (zh) * 2022-10-13 2023-01-06 尚好科技有限公司 乳酸菌在降解欧李仁中苦杏仁苷中的应用
CN116751721A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 陕西省微生物研究所 一株植物乳杆菌121-5及其在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用
CN117159596A (zh) * 2023-07-17 2023-12-05 浙江大学 肠乳杆菌atcc 49335在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用
CN117180317A (zh) * 2023-11-02 2023-12-08 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 詹氏乳杆菌来源纳米囊泡在制备防治卵巢早衰治疗药物中的应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220160797A1 (en) * 2019-04-01 2022-05-26 North Carolina State University Probiotic bacteria capable of adaptive response to pomegranate extract and methods of production and use thereof
US11730778B2 (en) * 2019-09-24 2023-08-22 Access Business Group International Llc Method of increasing the level and production of metabolized phytonutrients in a subject
CN110638845B (zh) * 2019-11-08 2020-07-14 爱优诺营养品有限公司 一种菌剂组合物及其在改善厌食症功能性奶粉上的应用
CN114686549A (zh) * 2022-04-29 2022-07-01 陕西嘉禾生物科技股份有限公司 一种利用芦丁制备酶改性异槲皮素的方法
WO2024020197A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 The Children's Medical Center Corporation Gut microbiome bacteria and enzymes that metabolize dietary and medicinal plant small molecules to affect gut microbiome

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101516392A (zh) * 2006-08-24 2009-08-26 雀巢产品技术援助有限公司 黄酮类化合物的持久吸收
US20120251511A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-04 Eric Donald Murphy Composition and products for enabling the production of equol in vivo

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1545206B1 (en) * 2002-07-24 2020-03-04 Children's Hospital Medical Center Compositions and products containing enantiomeric equol, and methods for their making
US20040071685A1 (en) * 2002-10-09 2004-04-15 Devin Houston Compositions and methods for increasing the bioavailability of plant polyphenols
US8101393B2 (en) * 2006-02-10 2012-01-24 Bp Corporation North America Inc. Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
RU2013106896A (ru) * 2010-07-16 2014-08-27 Глюком А/С Синтез новых производных сиалоолигосахаридов
BR112017005665A2 (pt) * 2014-09-18 2017-12-12 Genomatica Inc organismos microbianos não naturais com eficiência energética melhorada

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101516392A (zh) * 2006-08-24 2009-08-26 雀巢产品技术援助有限公司 黄酮类化合物的持久吸收
US20120251511A1 (en) * 2011-03-28 2012-10-04 Eric Donald Murphy Composition and products for enabling the production of equol in vivo

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TODD R. KLAENHAMMER等: "Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health", 《FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS》 *
W.K.DING等: "Enhancing the biotransformation of isoflavones in soymilk supplemented with lactose using probiotic bacteria during extended fermentation", 《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410321A (zh) * 2020-11-26 2021-02-26 昆明理工大学 一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用
CN112410321B (zh) * 2020-11-26 2022-01-28 昆明理工大学 一种β-葡萄糖苷酶Ttbgl3及其应用
CN115568547A (zh) * 2022-10-13 2023-01-06 尚好科技有限公司 乳酸菌在降解欧李仁中苦杏仁苷中的应用
CN117159596A (zh) * 2023-07-17 2023-12-05 浙江大学 肠乳杆菌atcc 49335在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用
CN116751721A (zh) * 2023-07-18 2023-09-15 陕西省微生物研究所 一株植物乳杆菌121-5及其在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用
CN116751721B (zh) * 2023-07-18 2024-02-13 陕西省微生物研究所 一株植物乳杆菌121-5及其在转化虎杖苷制备白藜芦醇中的应用
CN117180317A (zh) * 2023-11-02 2023-12-08 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 詹氏乳杆菌来源纳米囊泡在制备防治卵巢早衰治疗药物中的应用
CN117180317B (zh) * 2023-11-02 2024-01-26 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 詹氏乳杆菌来源纳米囊泡在制备防治卵巢早衰治疗药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019023136A1 (en) 2019-01-31
EP3657956A4 (en) 2020-12-30
EP3657956A1 (en) 2020-06-03
US20200222474A1 (en) 2020-07-16
CA3070606A1 (en) 2019-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111465327A (zh) 用于提高植物化学物质生物利用度和生物活性的组合物和方法
Theilmann et al. Lactobacillus acidophilus metabolizes dietary plant glucosides and externalizes their bioactive phytochemicals
EP3380108B1 (en) Designed bacterial compositions
Yao et al. Pantothenic acid, vitamin C, and biotin play important roles in the growth of Lactobacillus helveticus
Santos et al. Pseudovitamin is the corrinoid produced by Lactobacillus reuteri CRL1098 under anaerobic conditions
CN110049760A (zh) 用于治疗炎性疾病的组合物及其用途以及益生菌组合物
JP4811760B2 (ja) ダイゼイン資化によるエコール生成能を改善するための腸内細菌およびその利用
Firrman et al. The effect of quercetin on genetic expression of the commensal gut microbes Bifidobacterium catenulatum, Enterococcus caccae and Ruminococcus gauvreauii
Quivey Jr et al. Functional profiling in Streptococcus mutans: construction and examination of a genomic collection of gene deletion mutants
Wang et al. Exopolysaccharide, isolated from a novel strain Bifidobacterium breve lw01 possess an anticancer effect on head and neck cancer–genetic and biochemical evidences
Mazlan et al. Biotransformation of Momordica charantia fresh juice by Lactobacillus plantarum BET003 and its putative anti-diabetic potential
EP2402429B1 (en) Equol-producing bacterium and use thereof
Shkoporov et al. Ruthenibacterium lactatiformans gen. nov., sp. nov., an anaerobic, lactate-producing member of the family Ruminococcaceae isolated from human faeces
JP2008061584A (ja) エクオール生産能を持つ微生物及び飲食品、医薬品、動物飼料およびその製造法
Rattanaprasert et al. Genes involved in galactooligosaccharide metabolism in Lactobacillus reuteri and their ecological role in the gastrointestinal tract
US20220160797A1 (en) Probiotic bacteria capable of adaptive response to pomegranate extract and methods of production and use thereof
Krzyściak et al. The usefulness of biotyping in the determination of selected pathogenicity determinants in Streptococcus mutans
Vitali et al. Molecular and phenotypic traits of in-vitro-selected mutants of Bifidobacterium resistant to rifaximin
Cao et al. MLST analysis of genetic diversity of Bacillus coagulans strains to evaluate effects on constipation model
WO2019118510A1 (en) Defined therapeutic microbiota and methods of use thereof
EP3793372B1 (en) Lactobacillus amylovorus sgl 14: probiotic activity and reduction of enteric oxalate
Wang et al. Pelagibacterium lentulum sp. nov., a marine bacterium from the culture broth of Picochlorum sp. 122
Dong et al. Gut Eggerthella lenta promotes the efficacy of resveratrol through reductive metabolism
Goris et al. Flavonoid-modifying capabilities of the gut microbiome–an in silico study
US20230372453A1 (en) Engineered probiotics for expression of fiber-synthesizing enzymes in gut

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200728