CN116410746B - 用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于β‑胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,该包括以下步骤:1)将1,5‑萘二胺溶解在无水乙醇,向得到的混合液中加入硝酸,搅拌,超声分散,得到前驱液;2)将所述前驱液转移至反应釜中,加热下反应;3)反应结束后冷却至室温,产物离心,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针。本发明提供的荧光探针具有合成方法简单,生物相容性良好,细胞毒性小的优点,并可实现规模化生产;本发明的荧光探针能够实现β‑胡萝卜素浓度的高灵敏度检测,且该检测方法操作简便快捷;本发明提供的荧光探针还能够用于细胞内溶酶体的靶向成像以及斑马鱼成像。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料领域,特别涉及一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法。
背景技术
天然或膳食产品中存在的许多分子(类胡萝卜素、多酚低聚物和表儿茶素)可以作为过氧亚硝酸盐的清除剂和中和剂,尽管其体内过氧亚硝酸中和活性较低。由于类胡萝卜素物质对于人体的潜在有益效果,对类胡萝卜素的准确检测具有研究意义。人类和动物皮肤中有几种类胡萝卜素,包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素,叶黄素、番茄红素等,但其中最丰富的类胡萝卜素是β-胡萝卜素和番茄红素。用于检测β-胡萝卜素的金标准是高效液相色谱法(HPLC)。该技术的局限性在于成本高,因此,需要一种替代的分析方法,快速且具有高灵敏度和特异性。荧光分析方法由于其操作简单、原位、无损和实时检测模式,是生物小分子物质检测中的一种重要手段。因此,荧光分光光度法是检测β-胡萝卜素一种更为合适且经济的方法。所以,结合荧光分光光度法开发更多的β-胡萝卜素检测手段将具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足,提供一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针、其制备方法及应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:提供一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
1)将1,5-萘二胺溶解在无水乙醇,向得到的混合液中加入硝酸,搅拌,超声分散,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至反应釜中,加热下反应;
3)反应结束后冷却至室温,产物离心,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针。
优选的是,所述的用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法包括以下步骤:
1)将1,5-萘二胺溶解在无水乙醇,向得到的混合液中加入硝酸,搅拌,超声分散5-20分钟,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,180-220℃反应1-4小时;
3)反应结束后冷却至室温,产物以8000-14000rpm/min离心2-10分钟,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针;所述洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合物。
优选的是,所述的用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法包括以下步骤:
1)将0.22g1,5-萘二胺溶解在30mL无水乙醇,向得到的混合液中加入500μL质量浓度为65%的浓硝酸,搅拌,超声分散10分钟,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,180-220℃反应1-4小时;
3)反应结束后冷却至室温,产物以10000rpm/min离心5分钟,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针;所述洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合物,且二氯甲烷:甲醇的体积比为100:1。
本发明还提供一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针,其通过如上所述的方法制备得到。
本发明还提供一种如上所述的荧光探针的应用,其用于β-胡萝卜素的检测。
优选的是,所述荧光探针用于β-胡萝卜素检测的方法包括以下步骤:
S1、利用由所述荧光探针配制的已知浓度的荧光探针溶液和已知浓度的β-胡萝卜素溶液构建用于β-胡萝卜素检测的标准曲线,该标准曲线能表征β-胡萝卜素的浓度与荧光强度之间的关系;
S2、对未知浓度的β-胡萝卜素样品溶液进行检测:
将所述荧光探针配制成已知浓度的荧光探针溶液,然后取已知体积的荧光探针溶液加入到已知体积的β-胡萝卜素样品溶液中,测定所得混合溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度,最后对照标准曲线,计算得到样品溶液中β-胡萝卜素的浓度。
优选的是,所述步骤S1具体为:
将所述荧光探针加入乙醇中,配制成已知浓度的荧光探针溶液,均分为若干份,按一定的浓度梯度向每份荧光探针溶液中分别加入不同浓度、等体积的β-胡萝卜素溶液,测试得到的每份混合溶液以及空白荧光探针溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度,混合溶液的荧光强度记为F,空白荧光探针溶液的荧光强度记为F0,将F/F0-1的值作为y轴,对应的β-胡萝卜素的浓度作为x轴,拟合得到标准曲线。
优选的是,所述步骤S2具体为:
将所述荧光探针配制成已知浓度的荧光探针溶液,测定该荧光探针溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度F0′;
然后取已知体积的荧光探针溶液加入到已知体积的β-胡萝卜素样品溶液中,测定所得混合溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度F′,计算F′/F0′-1的值,最后对照标准曲线,计算得到样品溶液中β-胡萝卜素的浓度。
本发明还提供一种如上所述的荧光探针的应用,其用于于斑马鱼的成像,具体方法为:
将所述荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液,将该荧光探针溶液加入斑马鱼的培养液中,15-60分钟后吸出荧光探针溶液,更换新的培养液,将斑马鱼固定后用共聚焦显微镜进行成像。
本发明还提供一种如上所述的荧光探针的应用,其用于溶酶体的靶向成像,具体方法为:
将所述荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液;
将细胞接种到玻璃底培养皿中,在37℃恒温培养箱中孵育24小时后,将培养皿中的培养基替换为含50μg/mL的荧光探针溶液的1640培养基,继续培养30min;用PBS清洗3次后,多聚甲醛固定15min,用PBS清洗3次后,使用共聚焦显微镜进行细胞内溶酶体的靶向成像。
本发明的有益效果是:
本发明提供的荧光探针具有合成方法简单,生物相容性良好,细胞毒性小的优点,并可实现规模化生产;β-胡萝卜素可以通过内滤效应引起本发明的荧光探针的荧光强度的变化,随着β-胡萝卜素的浓度升高,荧光探针的荧光强度显著下降,使得本发明的荧光探针能够实现β-胡萝卜素浓度的高灵敏度检测,且该检测方法操作简便快捷;
本发明提供的荧光探针还能够用于细胞内溶酶体的靶向成像以及斑马鱼成像。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针(碳点)的TEM和HRTEM图像;
图2为实施例1制备的碳点的粒径分布直方图;
图3为实施例1制备的碳点的紫外-可见吸收光谱图;
图4为实施例1制备的碳点的荧光发射和吸收光谱;
图5为实施例1制备的碳点的红外图谱;
图6为实施例1制备的碳点的X射线光电子能谱;
图7为实施例1制备的碳点的细胞毒性测试结果;
图8为实施例1制备的碳点对不同浓度β-胡萝卜素的响应结果;
图9为实施例1制备的碳点的荧光强度与β-胡萝卜素浓度的线性关系;
图10为实施例1制备的碳点对HeLa细胞的溶酶体靶向成像结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本发明提供一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
1)将0.22g1,5-萘二胺溶解在30mL无水乙醇,向得到的混合液中加入500μL质量浓度为65%的浓硝酸,搅拌,超声分散10分钟,充分溶解得到前驱液;
2)将前驱液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,200℃反应2小时;
3)反应结束后冷却至室温,产物以10000rpm/min离心5分钟,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物(鲜艳的橙红色液体),所得产物用旋转蒸发仪进行干燥,得到荧光探针(以下可称为碳点);洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合物,且二氯甲烷:甲醇的体积比为100:1。荧光探针可溶解在无水乙醇或DMSO中,避光保存以备后续使用。
参照图1,为实施例1制备的荧光探针(碳点)的TEM(左图)和HRTEM图像(右图),图2是碳点的粒径分布直方图。从图1可以看出,该碳点呈球形,分散性良好,具有0.21nm的晶格间距。随机测量多个碳点粒径,并绘制直方图,如图2,可以看出碳点粒径分布较均一,平均粒径约为3.10nm。
参照图3,为实施例1制备的碳点的紫外-可见吸收光谱图,从图中可以看出,在200-400nm处存在一个宽吸收峰,该吸收峰是由n-π*跃迁所导致。图4为荧光发射和吸收光谱,可以看出,碳点在470nm处有最佳吸收,最大发射为590nm。
参照图5,为实施例1制备的碳点的红外图谱,揭示了碳点的基团特征:位于3326和2985cm-1左右的特征吸收谱带是由于N-H和C-H基团的伸缩振动导致的;位于1605cm-1的吸收峰是由于C=C键伸缩振动导致的;位于1732cm-1以及1038cm-1的峰是由于C和O之间的键的伸缩振动导致的,分别是C=O和C-O。红外光谱表明合成的碳点表面具有N-H、C-H基团,此外还包含了醚键等特殊基团,表明了碳点的成功制备。
参照图6,为实施例1制备的碳点的X射线光电子能谱,得知碳点由四种元素组成,分别是碳元素、氧元素以及氮元素,它们所占的比例分别为51.83%、43.98%以及4.19%。X射线光电子能谱表明碳点的主要元素,也能证明碳点的成功制备。
参照图7,为实施例1制备的碳点的细胞毒性测试结果。碳点的细胞毒性的评估采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测的方法,在加入碳点浓度为0至60μg/mL的浓度时,细胞存活率均在80%以上。细胞毒性测试的结果表明,合成的碳点的毒性较低,生物相容性较好。
参照图8,为实施例1制备的碳点对不同浓度β-胡萝卜素的响应结果,图9为碳点的荧光强度与β-胡萝卜素浓度的线性关系。将不同浓度的β-胡萝卜素加入到碳点溶液中,由于β-胡萝卜素与碳点的竞争吸收激发光,导致碳点溶液的荧光强度下降。图8显示了碳点对不同浓度β-胡萝卜素的荧光响应,在500μg/mL的碳点乙醇溶液中,体系中加入β-胡萝卜素达到277.43μM时,碳点的荧光强度显著下降,荧光强度被抑制到空白组的30%。图9表明,β-胡萝卜素浓度在0-277.43μM区间,β-胡萝卜素浓度与碳点的荧光减弱呈线性关系,相关系数R2达到0.998,这表明该碳点能够应用于β-胡萝卜素的检测。
参照图10,为实施例1制备的碳点对HeLa细胞的溶酶体靶向成像结果。使用50μg/mL的O-CDs(即实施例1制备的碳点)对HeLa细胞孵育30min后,再分别使用Dapi和Lyso-Tracker Green对HeLa细胞进行孵育,用4%多聚甲醛固定后进行共聚焦成像;如图10Merged图像显示,O-CDs的荧光区域主要存在于细胞质部分,O-CDs与Lyso-TrackerGreen的荧光区域几乎完全重合,O-CDs对HeLa细胞溶酶体具有高度靶向性。因此,所制备的橙色碳点具备代替商业染料Lyso-Tracker Green进行溶酶体靶向的潜力。
实施例2
本实施例提供一种实施例1制备的的荧光探针的应用,其用于β-胡萝卜素的检测,具体包括以下步骤:
S1、利用由荧光探针配制的已知浓度的荧光探针溶液和已知浓度的β-胡萝卜素溶液构建用于β-胡萝卜素检测的标准曲线,该标准曲线能表征β-胡萝卜素的浓度与荧光强度之间的关系:
将荧光探针加入乙醇中,配制成浓度为500μg/mL的荧光探针溶液,均分为若干份,每份为3mL,按一定的浓度梯度向每份荧光探针溶液中分别加入不同浓度(1,2,3,9,39,48,57,66,84,114,149μg/mL)、体积均为5mL的β-胡萝卜素溶液,测试得到的每份混合溶液以及空白荧光探针溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度,混合溶液的荧光强度记为F,空白荧光探针溶液的荧光强度记为F0,将F/F0-1的值作为y轴,对应的β-胡萝卜素的浓度作为x轴,做出散点图,线性拟合,得到标准曲线,如图9。
S2、对未知浓度的β-胡萝卜素样品溶液进行检测:
将荧光探针加入乙醇中,配制成浓度为500μg/mL的荧光探针溶液;
在石英皿中加入3mL荧光探针溶液,测定该荧光探针溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度F0′;
向石英皿加入5mL待测的β-胡萝卜素样品溶液中,测定所得混合溶液在470nm激发波长下,590nm处的荧光强度F′,计算F′/F0′-1的值,最后对照标准曲线,计算得到样品溶液中β-胡萝卜素的浓度。
若以上步骤所测得的荧光强度高于标准曲线的范围,计算的F/F0-1的值为负值,则应适当稀释未知溶液的浓度再测;若以上步骤所测得的荧光强度低于标准曲线范围,F/F0-1的值过大,表明未知溶液的茶多酚浓度过低,超出本检测方法的限度。
实施例3
本实施例提供一种实施例1制备的的荧光探针的应用,其用于于斑马鱼的成像,具体方法为:
将荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液,将该荧光探针溶液加入斑马鱼的培养液中,15-60分钟后吸出荧光探针溶液,更换新的培养液,将斑马鱼固定后用共聚焦显微镜进行成像。
实施例4
本实施例提供一种实施例1制备的的荧光探针的应用,其用于细胞内溶酶体的靶向成像,具体方法为:
将荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液;
将细胞接种到35mm玻璃底培养皿中(每皿105个细胞),在37℃恒温培养箱中孵育24小时后,培养皿中的培养基被50μg/mL O-CDs的1640培养基替换,继续培养30min。用PBS清洗3次后,细胞被4%多聚甲醛固定15min,用PBS清洗3次后,使用共聚焦显微镜进行细胞内溶酶体的靶向成像。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将1,5-萘二胺溶解在无水乙醇,向得到的混合液中加入硝酸,搅拌,超声分散,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至反应釜中,加热下反应;
3)反应结束后冷却至室温,产物离心,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将1,5-萘二胺溶解在无水乙醇,向得到的混合液中加入硝酸,搅拌,超声分散5-20分钟,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,180-220℃反应1-4小时;
3)反应结束后冷却至室温,产物以8000-14000 rpm/min离心2-10分钟,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针;所述洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合物。
3.根据权利要求2所述的用于β-胡萝卜素检测的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将0.22 g1,5-萘二胺溶解在30 mL无水乙醇,向得到的混合液中加入500 μL质量浓度为65%的浓硝酸,搅拌,超声分散10分钟,得到前驱液;
2)将所述前驱液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,200℃反应2小时;
3)反应结束后冷却至室温,产物以10000 rpm/min离心5分钟,去沉淀,取上清液,通过柱层析纯化,用洗脱液洗脱收集目标产物,所得产物旋转干燥,得到所述荧光探针;所述洗脱液为二氯甲烷和甲醇的混合物,且二氯甲烷:甲醇的体积比为100:1。
4.一种用于β-胡萝卜素检测的荧光探针,其特征在于,其通过如权利要求1-3中任意一项所述的方法制备得到。
5.一种如权利要求4所述的荧光探针的应用,其特征在于,其用于β-胡萝卜素的检测。
6.根据权利要求5所述的荧光探针的应用,其特征在于,所述荧光探针用于β-胡萝卜素检测的方法包括以下步骤:
S1、利用由所述荧光探针配制的已知浓度的荧光探针溶液和已知浓度的β-胡萝卜素溶液构建用于β-胡萝卜素检测的标准曲线,该标准曲线能表征β-胡萝卜素的浓度与荧光强度之间的关系;
S2、对未知浓度的β-胡萝卜素样品溶液进行检测:
将所述荧光探针配制成已知浓度的荧光探针溶液,然后取已知体积的荧光探针溶液加入到已知体积的β-胡萝卜素样品溶液中,测定所得混合溶液在470 nm激发波长下,590 nm处的荧光强度,最后对照标准曲线,计算得到样品溶液中β-胡萝卜素的浓度。
7.根据权利要求6所述的荧光探针的应用,其特征在于,所述步骤S1具体为:
将所述荧光探针加入乙醇中,配制成已知浓度的荧光探针溶液,均分为若干份,按一定的浓度梯度向每份荧光探针溶液中分别加入不同浓度、等体积的β-胡萝卜素溶液,测试得到的每份混合溶液以及空白荧光探针溶液在470 nm激发波长下,590 nm处的荧光强度,混合溶液的荧光强度记为F,空白荧光探针溶液的荧光强度记为F0,将F0/F-1的值作为y轴,对应的β-胡萝卜素的浓度作为x轴,拟合得到标准曲线。
8.根据权利要求7所述的荧光探针的应用,其特征在于,所述步骤S2具体为:
将所述荧光探针配制成已知浓度的荧光探针溶液,测定该荧光探针溶液在470 nm激发波长下,590 nm处的荧光强度F0´;
然后取已知体积的荧光探针溶液加入到已知体积的β-胡萝卜素样品溶液中,测定所得混合溶液在470 nm激发波长下,590 nm处的荧光强度F´,计算F0´/F´-1的值,最后对照标准曲线,计算得到样品溶液中β-胡萝卜素的浓度。
9.一种如权利要求4所述的荧光探针的应用,其特征在于,其用于于斑马鱼的成像,具体方法为:
将所述荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液,将该荧光探针溶液加入斑马鱼的培养液中,15-60分钟后吸出荧光探针溶液,更换新的培养液,将斑马鱼固定后用共聚焦显微镜进行成像。
10.一种如权利要求4所述的荧光探针的应用,其特征在于,其用于溶酶体的靶向成像,具体方法为:
将所述荧光探针溶于DMSO中,得到荧光探针溶液;
将细胞接种到玻璃底培养皿中,在37℃恒温培养箱中孵育24小时后,将培养皿中的培养基替换为含50 μg/mL的荧光探针溶液的1640培养基,继续培养30min;用PBS清洗3次后,多聚甲醛固定15min,用PBS清洗3次后,使用共聚焦显微镜进行细胞内溶酶体的靶向成像。
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