CN116381124A - 一种参芍益气活血颗粒的质量的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种参芍益气活血颗粒的质量的检测方法及其应用，该检测方法包括黄芪、姜黄、桂枝的薄层鉴别和参芍益气活血颗粒的特征图谱检测。该薄层鉴别可以在同一色谱条件下同时鉴别黄芪、桂枝和姜黄药材，缩短了检测时间，节约了检测成本；该特征图谱中包含了4个共有峰，并指认了白芍药味，提升质量检测标准，有效的控制产品的质量，为参芍益气活血颗粒内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制参芍益气活血颗粒中原药材的目的。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种参芍益气活血颗粒的质量的检测方法及其应用。
背景技术
参芍益气活血颗粒是根据贵州省遵义市中医院内分泌科临床经验方研制而成的医疗机构制剂，处方由红参、白芍、黄芪、鸡血藤、姜黄、郁金、乌梢蛇、桂枝等药味组成，具有益气养阴，活血祛瘀的功效，用于气虚血瘀所致的肢端麻木或疼痛，四末冰凉，肢体胀痛，身软乏力等症。
参芍益气活血颗粒原有质量标准包括了黄芪薄层鉴别、桂枝薄层鉴别和姜黄薄层鉴和白芍中药效成分芍药苷的含量测定方法；但在检测过程中发现以下问题：(1)黄芪薄层斑点小而模糊，重现性差，影响检验结果的判断；(2)桂枝和姜黄薄层鉴别均出现拖尾现象，斑点Rf值偏小，重现性差，影响检验结果的判断；(3)黄芪、桂枝和姜黄分别进行薄层鉴别，检测时间长，成本高。
为了解决上述问题，有效的提高产品质量，提升参芍益气活血颗粒的质量标准，本发明团队对参芍益气活血颗粒原检测方法进行深入研发、考察，建立了一种用于参芍益气活血颗粒的质量检测方法。该方法在同一色谱条件下同时鉴别黄芪、桂枝和姜黄药材，缩短了检测时间，节约了检测成本，并解决了黄芪、桂枝和姜黄薄层鉴别斑点模糊，斑点Rf值偏小、重现性差等问题；还增加了参芍益气活血颗粒的特征图谱检测，提升质量检测标准，有效的控制产品的质量。为参芍益气活血颗粒内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制参芍益气活血颗粒中原药材的目的。
发明内容
本发明的目的提供参芍益气活血颗粒的质量的检测方法及其应用。
本发明所述参芍益气活血颗粒由红参10～15份、白芍10～15份、黄芪3～8份、鸡血藤3～8份、姜黄3～8份、郁金3～8份、乌梢蛇2～6份、桂枝2～6份组成；
本发明所述检测方法包括：(1)黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别；(2)参芍益气活血颗粒的特征图谱检测。
本发明所述黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别为：取参芍益气活血颗粒1～3g，加乙醇80～120ml，回流提取30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
优先的，
本发明所述黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别为：所述(1)黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别为：取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
本发明所述参芍益气活血颗粒的特征图谱检测为：
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1～2g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理20～40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05～0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
优选的，
本发明所述参芍益气活血颗粒的特征图谱检测为：
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
本申请特征图谱检测中所述超声处理，功率为240W，频率为45kHz。
本申请所述特征图谱检测方法可用于表征白芍药味。
本申请所得的特征图谱中包含4个共有峰，以芍药苷为参照峰，其余峰相对保留时间依次为：0.78±10％、1.08±10％、2.22±10％。
优选的，
本申请所得的特征图谱中包含4个共有峰，以芍药苷为参照峰，其余峰相对保留时间依次为：0.78、1.08、2.22。
本申请所述特征图谱检测在参芍益气活血颗粒以及含白芍药材的制剂中检测的应用。
本发明的有益效果
1、本发明优化了黄芪、桂枝和姜黄的薄层鉴别，在同一色谱条件下同时鉴别黄芪、桂枝和姜黄药材，缩短了检测时间，节约了检测成本，并解决了黄芪、桂枝和姜黄薄层鉴别斑点模糊，斑点Rf值偏小、重现性差等问题。
2、本发明增加了参芍益气活血颗粒特征图谱检测，利用高效液相色谱法，通过对色谱条件进行系统化合理控制，能够同时认定4个共有峰，并表征了白芍药味，为参芍益气活血颗粒内在质量控制提供了新的分析手段，并达到控制参芍益气活血颗粒中原药材目的。
3、本发明的薄层鉴别通过了不同薄层板的比较，结果显示斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两种薄层板均能得到较好的鉴别色谱；通过了不同温度的比较，结果显示有机相选用乙腈，水相选用0.05％磷酸条件下，按0～20min，14～30％A,86～70％B；20～60min，30～50％A,70～50％B进行梯度洗脱，色谱峰较丰富，分离度较好，基线平稳，在低温(5℃)和室温(25℃)环境下斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱；通过了不同湿度的比较，结果显示在低湿度(32％)和高湿度(72％)环境下，均斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱。验证试验表明该薄层鉴别方法重现性好、耐用性好。
4、本发明的特征图谱检测方法通过了流动相及洗脱梯度的考察，结果显示有机相选用乙腈，水相选用0.05％磷酸条件下，按0～20min，14～30％A,86～70％B；20～60min，30～50％A,70～50％B进行梯度洗脱，色谱峰较丰富，分离度较好，基线平稳。
5、本发明的特征图谱检测方法通过了检测波长考察，采用DAD检测器，进行全波长扫描，并对比采集波长210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm下色谱信息，结果显示250nm波长下色谱峰分离度和峰形较好，基线较稳。
6、本发明的特征图谱检测方法通过了供试品提取方式考察，结果表明，超声和回流提取所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，且各峰峰面积差异不大，考虑到超声提取方式更为简便，故选择提取方式为超声提取。
7、本发明的特征图谱检测方法通过了提取溶剂考察，结果以水为溶剂时供试品溶液颜色较深，色谱峰分离效果较差，以乙醇为溶剂时色谱峰分离效果有所改善，但分离效果均不如甲醇为溶剂理想。
8、本发明的特征图谱检测方法通过了提取时间考察，结果20分钟提取不完全、30分钟和40分钟提取效果基本相同，所以选择超声时间为30分钟。
9、本发明的特征图谱检测方法通过了方法学验证，结果显示精密度考察、重复性考察、中间精密度考察、稳定性考察、不同流速考察、不同柱温考察的4个峰的相对保留时间RSD均在0～0.12％范围内，相对峰面积RSD均在0～0.12％范围内，说明该方法重现性、耐用性较好。
说明书附图
图1薄层鉴别图(1黄芪对照药材、2桂枝对照药材、3姜黄素对照品、4供试品(批号：20210409)、5供试品(批号：20210706)、6供试品(批号：20210913)、7黄芪阴性、8桂枝阴性、9姜黄阴性)；
图2参芍益气活血颗粒对照特征图谱；
图3 5批参芍益气活血颗粒特征图谱(R：对照品，S5：20220126，S4：20211218，S3：20210913，S2：20210706，S1：20210409)；
图4流动相及洗脱梯度考察图谱(以甲醇为流动相A％，以0.05％磷酸为流动相B％)；
图5流动相及洗脱梯度考察图谱(以甲醇为流动相A％，以0.1％磷酸为流动相B％)；
图6流动相及洗脱梯度选择图谱(以乙腈为流动相A％，以0.05％磷酸为流动相B％)；
图7流动相及洗脱梯度选择图谱(以乙腈为流动相A％，以0.1％磷酸为流动相B％)；
图8波长考察图谱(波长为210nm)；
图9波长考察图谱(波长为230nm)；
图10波长考察图谱(波长为250nm)；
图11波长考察图谱(波长为270nm)；
图12波长考察图谱(波长为290nm)；
图13波长考察图谱(波长为310nm)；
图14提取方式考察图谱(超声提取)；
图15提取方式考察图谱(回流提取)；
图16提取溶剂考察图谱(提取溶剂为水)；
图17提取溶剂考察图谱(提取溶剂为乙醇)；
图18提取溶剂考察图谱(提取溶剂为甲醇)；
图19提取时间考察图谱(提取20min)；
图20提取时间考察图谱(提取30min)；
图21提取时间考察图谱(提取40min)；
图22精密度考察特征图谱(图中S1-S6依次表示样品1-6针)；
图23重复性考察特征图谱(图中S1-S6依次表示样品1-6针)；
图24中间精密度考察特征图谱(图中S1-S6依次表示样品1-6针)；
图25稳定性考察特征图谱(图中S1-S6考察时间依次为0、2、4、6、8、12小时)；
图26不同流速考察特征图谱(图中S1-S3：流速依次为0.8mL/min、1mL/min、1.2mL/min)；
图27不同柱温考察特征图谱(图中S1-S3：柱温依次为28℃、30℃和32℃)；
图28不同色谱柱考察特征图谱(图中S1：ZORBAX Eclipse XDB-C18；S2:Agilent5TC-C18；S3:XTERRA MS C18)。
具体实施方式
实施例1配方
红参120g、白芍120g、黄芪50g、鸡血藤50g、姜黄50g、郁金50g、乌梢蛇40g、桂枝40g。
实施例2配方
红参100g、白芍100g、黄芪30g、鸡血藤30g、姜黄30g、郁金30g、乌梢蛇20g、桂枝20g。
实施例3配方
红参150g、白芍150g、黄芪80g、鸡血藤80g、姜黄80g、郁金80g、乌梢蛇60g、桂枝60g。
以下实施例4-10分别用于实施例1-3任一配方制备的参芍益气活血颗粒对应实物的薄层鉴别和特征图谱检测。
实施例4
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例5
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒1g，加乙醇8ml，回流提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.06％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例6
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒3g，加乙醇120ml，回流提取60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定2g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例7
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇90ml，回流提取35分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1.5g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理25分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.08％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例8
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1.2g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理35分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.09％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例9
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇95ml，回流提取50分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定2g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.07％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例10
黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别
取参芍益气活血颗粒2.5g，加乙醇110ml，回流提取55分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
参芍益气活血颗粒的特征图谱检测
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.06％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究
1试剂及试药
芍药苷对照品：批号(110736-202145)；来源(中国食品药品检定研究院)；
参芍益气活血颗粒：批号(20210409，20210706，20210913，20211218，20220126)；来源(遵义市中医院)；
水为重蒸水；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2仪器
电子天平(AUW-220D型，日本岛津)；数控超声波清洗器(KQ-500DE，江苏省昆山市超声仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(HH-4，国华电器有限公司)；电子天平(ShimadzuLibror AEL 40SM，赛多利斯)；高效液相色谱仪(LC-2010AHT，日本岛津)。
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；Agilent 5TC-C18(4.6×250mm，5μm)；XTERRA MS C18(4.6×250mm，5μm)。
3参芍益气活血颗粒处方组成
红参120g、白芍120g、黄芪50g、鸡血藤50g、姜黄50g、郁金50g、乌梢蛇40g、桂枝40g。
4黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别的方法的优化
4.1方法为：取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品相应的位置上，显相同颜色斑点，斑点清晰、分离度好，阴性对照无干扰(见图1)，故列入正文，方法学考察如下：
4.1.1试验方法、条件及重现性
方法来源：结合2020版药典及遵义市中医院制剂研究的实际情况而制定了本检测方法。
供试品溶液制备：取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；
对照品溶液制备：取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液。
薄层板：硅胶G(规格：200×100mm)。
点样量：供试品溶液10μl，对照品溶液各2μ1。
展开剂：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20：40：15：2)。
展距：10cm
显色及检视：置紫外光灯(365nm)下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。
用上述方法处理5批次的样品，并按规定的方法展开，结果见表1。
表1重现性试验结果表
| 序号 | 批号 | 结果 |
| 1 | 20210409 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 2 | 20210706 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 3 | 20210913 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 4 | 20211218 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
| 5 | 20220126 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好 |
4.1.2.耐用性
4.1.2.1不同薄层板的比较
比较了青岛海洋化工厂分厂硅胶板商品板和自制硅胶G薄层板(各5批次的样品)，结果见表2。
表2不同薄层板耐用性结果表
| 批号 | 青岛海洋化工厂分厂硅胶板商品板 | 自制硅胶G薄层板 |
| 20210409 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210706 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210913 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20211218 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20220126 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
结果：5批样品不同薄层板均显示斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中。
4.1.2.2不同温度的比较
比较了低温(5℃)和室温(25℃)环境条件下自制板展开效果，结果见表3。
表3低温(5℃)室温(25℃)环境条件下自制板展开效果表
| 批号 | 低温(5℃) | 室温(25℃) |
| 20210409 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210706 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210913 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20211218 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20220126 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
结果：不同环境温度的5批样品均显示斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中。
4.1.2.3不同湿度的比较
比较了低湿度(32％)和高湿度(72％)环境下自制板展开效果，结果见表4。
表4低湿度(32％)和高湿度(72％)环境下自制板展开效果表
| 批号 | 低湿度(32％) | 高湿度(72％) |
| 20210409 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210706 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20210913 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20211218 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
| 20220126 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 | 斑点清新，分离度符合要求，Rf值适中 |
结果：不同湿度的5批样品均显示斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中。
经上述方法学验证试验，结果表明在不同薄层板、温度、湿度条件下，色谱图斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，不同条件下均能得到较好的鉴别色谱。验证试验表明重现性好、耐用性好。
5参芍益气活血颗粒的特征图谱检测特征图谱构建
5.1方法
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B；按表5中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为30℃；检测波长为250nm，检测时间60min。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
表5梯度洗脱表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～20 | 14～30 | 86～70 |
| 20～60 | 30～50 | 70～50 |
参照物溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m L含60μg的溶液，作为参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约1g，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理(功率240W，频率45kHz)30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
参芍益气活血颗粒特征图谱中应呈现4个特征峰，其中峰2应与芍药苷对照品参照物保留时间一致，以2号峰为S峰，计算特征峰1、3、4的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.78(峰1)、1.80(峰3)、2.22(峰4)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行评价，若待鉴别样品与参芍益气活血颗粒对照特征图谱(图2)一致则为参芍益气活血颗粒。
5.2检测
按“5.1”项下的方法处理5批次的样品，并按规定的方法检测特征图谱，结果见图3。
5.2.1流动相及洗脱梯度考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，筛选甲醇和乙腈作为有机相，水相分别选用0.05％磷酸、0.1％磷酸，按表6、表7、表8、表9设定梯度进行洗脱。结果见图4、图5、图6、图7。
表6梯度洗脱程序1
| 时间(分钟) | 甲醇A(％) | 0.05％磷酸B(％) |
| 0～20 | 14～30 | 86～70 |
| 20～60 | 30～50 | 70～50 |
表7梯度洗脱程序2
| 时间(分钟) | 甲醇A(％) | 0.1％磷酸B(％) |
| 0～20 | 14～30 | 86～70 |
| 20～60 | 30～50 | 70～50 |
表8梯度洗脱程序3
| 时间(分钟) | 乙腈A(％) | 0.05％磷酸B(％) |
| 0～20 | 14～30 | 86～70 |
| 20～60 | 30～50 | 70～50 |
表9梯度洗脱程序4
结果：由图4、图5、图6、图7可知，有机相选用乙腈，水相选用0.05％磷酸条件下，按0～20min，14～30％A,86～70％B；20～60min，30～50％A,70～50％B进行梯度洗脱，色谱峰较丰富，分离度较好，基线平稳，因此选择该参数为流动相。
5.2.2检测波长考察
采用DAD检测器，进行全波长扫描，并对比采集波长210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、310nm下色谱信息，结果显示250nm波长下色谱峰分离度和峰形较好，基线较稳，优于其它波长，因此选用250nm作为检测波长。结果见图8、图9、图10、图11、图12、图13。
5.2.3供试品制备方法选择
5.2.3.1提取方式考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，加甲醇25mL，分别进行加热回流和超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，按“5.1”项下的色谱条件测定各标识峰峰面积，结果表明，超声和回流提取所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，且各峰峰面积差异不大，考虑到超声提取方式更为简便，故选择提取方式为超声提取。结果见表10，图14、图15。
表10不同提取方式考察表
5.2.3.2提取溶剂考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，平行制备3份，分别加入水、乙醇和甲醇各25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相同的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，按“5.1”项下的色谱条件测定各标识峰峰面积。通过比较得出，以水为溶剂时供试品溶液颜色较深，色谱峰分离效果较差，以乙醇为溶剂时色谱峰分离效果有所改善，但分离效果均不如甲醇为溶剂理想。因此选择甲醇为最佳提取溶剂。结果见图16、图17、图18。
5.2.3.3提取时间考察
分别设置超声时间为20分钟、30分钟、40分钟，考察各标识峰峰面积，结果表明，20分钟提取不完全、30分钟和40分钟提取效果基本相同，所以选择超声时间为30分钟。具体数据详见表11、图19、图20、图21。
表11提取时间考察表
5.2.4方法学验证
5.2.4.1精密度考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按“5.1”项下的色谱条件测定，连续进样6针，测定仪器精密度。以芍药苷的特征峰(峰2)为参照峰，计算其它峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见表12、表13，图22。
表12精密度考察保留时间及相对保留时间表
表13精密度考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表12、表13和图22可知，4个标识峰的相对保留时间RSD在0.0～0.1％范围内，相对峰面积RSD在0.1～2.50％范围内，表明仪器的精密度良好。
5.2.4.2重复性考察
采用岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，共取6份，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按“5.1”项下的色谱条件测定。以芍药苷的特征峰(峰2)为参照峰，计算其它峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见表14、表15，图23。
表14重复性考察保留时间及相对保留时间表
表15重复性考察峰面积及相对峰面积表
重复性实验结果显示：六个重复性实验样品的4个标识峰的相对保留时间RSD在0.0～0.1％范围内，相对峰面积RSD在0.1～2.50％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
5.2.4.3中间精密度考察
采用Waters 2695高效液相色谱仪，取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，共取6份，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按“5.1”项下的色谱条件测定。以芍药苷的特征峰(峰2)为参照峰，计算其它峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见表16、表17，图24。
表16中间精密度考察保留时间及相对保留时间表
表17中间精密度考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表16、表17和图24可知，六个样品的4个标识峰的相对保留时间RSD在0.0～0.1％范围内，相对峰面积RSD在0.1～2.50％范围内。表明该特征图谱的中间精密度较好，该特征图谱方法在不同仪器间符合分析要求。
5.2.4.3耐用性考察
5.2.4.3.1稳定性考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h按“5.1”项下的色谱条件测定，记录各共有峰保留时间和峰面积，以芍药苷的特征峰(峰2)为参照峰，计算其它峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果见表18、表19，图25。
表18稳定性考察保留时间及相对保留时间表
表19稳定性考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表18、表19，图25可知，经过考察12h溶液稳定性，4个标识峰的相对保留时间RSD在0.0～0.1％范围内，相对峰面积RSD在0.1～2.50％范围内。表明所采用的参芍益气活血颗粒特征图谱分析方法稳定、可靠、重现性好。
5.2.4.3.2不同流速考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按“5.1”项下的色谱条件测定。考察流速0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，考察实验方法对于不同流速的耐用性。不同流速对应的保留时间及相对保留时间如表15所示，不同流速对应的峰面积及相对峰面积见表20、表21，图26。
表20不同流速考察保留时间及相对保留时间表
表21不同流速考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表20、表21，图26可知，不同流速下各色谱峰分离度较好，4个标识峰的相对保留时间RSD在0.0～0.1％范围内，相对峰面积RSD在0.1～2.50％范围内。表明该方法对流速的耐用性较好。
5.2.4.4不同柱温考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按“5.1”项下的色谱条件测定。本实验考察了柱温28℃、30℃及32℃，考察实验方法对于不同柱温的耐用性。不同柱温对应的保留时间及相对保留时间如表17所示，不同柱温对应的峰面积及相对峰面积见表22、表23，图27。
表22不同柱温考察保留时间及相对保留时间表
表23不同柱温考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表22、表23，图27可知，4个峰的相对保留时间RSD均在0～0.12％范围内，相对峰面积RSD均在0～0.12％范围内，说明该方法对柱温的耐用性较好。
5.2.4.5不同色谱柱考察
取参芍益气活血颗粒样品(20210913)适量，研细，取约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试液，采用不同型号色谱柱测定，考察实验方法对于不同色谱柱的耐用性。结果见表24、表25，图28。
表24不同色谱柱考察保留时间及相对保留时间表
表25不同色谱柱考察峰面积及相对峰面积表
结果：由表24、表25，图28可知，本方法对固定相的选择特异性不高，色谱柱峰型、分离度等各方面表现均较为优秀，因此该方法对色谱柱选择的耐用性良好。
综上，本发明通过优化黄芪、姜黄、桂枝的薄层鉴别，并构建参芍益气活血颗粒的特征图谱，加强了制剂专属性鉴别和整体质量控制，进一步提升了制剂质量标准，从而保证制剂的安全性、稳定性和质量可控性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种参芍益气活血颗粒的质量的检测方法，所述颗粒由红参10～15份、白芍10～15份、黄芪3～8份、鸡血藤3～8份、姜黄3～8份、郁金3～8份、乌梢蛇2～6份、桂枝2～6份组成；其特征在于，所述检测方法包括：(1)黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别；(2)参芍益气活血颗粒的特征图谱检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述(1)黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别为：取参芍益气活血颗粒1～3g，加乙醇80～120ml，回流提取30～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述(1)黄芪、姜黄和桂枝的薄层鉴别为：取参芍益气活血颗粒2g，加乙醇100ml，回流提取45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另分别取黄芪对照药材和桂枝对照药材，按供试品处理方法制成对照药材溶液；再取姜黄素对照品，加乙醇制成0.5mg/ml的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以比例为20：40：15：2的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述(2)参芍益气活血颗粒的特征图谱检测为：
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1～2g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理20～40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05～0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述(2)本发明所述参芍益气活血颗粒的特征图谱检测为：
(1)供试品溶液的制备：取参芍益气活血颗粒，研细，精密称定1g，置25mL量瓶中，加甲醇15mL，超声处理30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(2)对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱具体为：0～20min，14～30％A，86～70％B；20～60min，30％～50％A,70％～50％B；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：250nm；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.根据权利要求4～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述超声处理，功率为240W，频率为45kHz。
7.根据权利要求4～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述特征图谱检测方法可用于表征白芍药味。
8.根据权利要求4～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所得的特征图谱中包含4个共有峰，以芍药苷为参照峰，其余峰相对保留时间依次为：0.78±10％、1.08±10％、2.22±10％。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，本申请所得的特征图谱中包含4个共有峰，以芍药苷为参照峰，其余峰相对保留时间依次为：0.78、1.08、2.22。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述特征图谱检测在参芍益气活血颗粒以及含白芍药材的制剂中检测的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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