CN116370659A - 用于制备超声波造影剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于制备超声波造影剂的方法。本发明提供用于制备磷脂调配物的改进方法，所述磷脂调配物包含磷脂UCA调配物。

Description

用于制备超声波造影剂的方法
本申请是申请日为2017年7月5日、申请号为“201780040503.3”、名称为“用于制备超声波造影剂的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请一般涉及用于制备超声波造影剂的方法。
背景技术
在超声波成像应用中，经脂质囊封的气体微球体用作造影剂。
发明内容
本发明提供用于制备基于磷脂的超声波造影剂的改进方法。本发明部分地基于以下意外的发现：某些基于磷脂的超声波造影剂调配物对二价金属阳离子敏感。在特定水准的某些所述阳离子的存在下，调配物中的磷脂及潜在其它组分沉淀，使得所述调配物不可用。迄今为止，并未了解到某些二价金属阳离子能够如此不利地影响超声波造影剂调配物。
基于这些发现，本发明涵盖用于合成防止这种不需要的磷脂沉淀的这类调配物的改进方法以及由这类方法所产生的调配物。还提供用于在合成经改进超声波造影剂中使用这些经改进调配物的方法，及所述造影剂在使对其有需要的个体成像中的用途。
由此，在一个方面中，本文提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，测量DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中的一或多者或全部的钙浓度，将DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，所述方法进一步包括测量非水溶剂的钙浓度。在一些实施例中，DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料的合并钙浓度测量值为较低的(即，对于所测量的原料，无论这类所测量的原料为仅DPPA、仅DPPC、仅MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE、DPPC及MPEG5000-DPPE，还是为DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，钙浓度的总和或合并钙浓度为较低的)。
在一些实施例中，DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料与非水溶剂的合并钙浓度测量值为较低的(即，对于所测量的组分，无论这类所测量的组分为仅DPPA或为DPPA及非水溶剂；仅DPPC或DPPA及非水溶剂；仅MPEG5000-DPPE或MPEG5000-DPPE及非水溶剂；DPPA及DPPC或DPPA、DPPC及非水溶剂；DPPA及MPEG5000-DPPE或DPPA、MPEG5000-DPPE及非水溶剂；DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶剂；DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPA、DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶剂，钙浓度的总和或合并钙浓度为较低的)。
在一些实施例中，测量DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料的钙浓度。
在一些实施例中，测量DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料的钙浓度且DPPA、DPPC、MPEG-DPPE原料及非水溶剂的合并钙浓度测量值为较低的。
由此，视实施例而定，仅测量DPPA的钙浓度，或仅测量DPPC的钙浓度，或仅测量MPEG5000-DPPE的钙浓度，或仅测量DPPA及DPPC的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPA及MPEG5000-DPPE的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPC及MPEG5000-DPPE的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPA及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPC及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量MPEG5000-DPPE及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPA、DPPC及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPA、MPEG5000-DPPE及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或仅测量DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)，或测量DPPA、DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶剂的钙浓度(且将这些浓度相加以得到合并钙浓度测量值)。应明确的是，得出合并的钙浓度测量值或表征值(如下文所论述)涵盖组分的每一组合。应理解除非另外明确陈述，否则术语DPPA、DPPA脂质、DPPA磷脂、DPPA原料、DPPA脂质原料及DPPA磷脂原料可互换地使用。对于DPPC及MPEG5000-DPPE使用类似的可互换术语。
在另一方面中，提供前述方法的变型。这类方法包括提供DPPC及MPEG5000-DPPE原料，测量DPPC及MPEG5000-DPPE原料中的一或两者的钙浓度，将DPPC及MPEG5000-DPPE原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，所述方法进一步包括测量非水溶剂的钙浓度。各种前述实施例同等地适用于所述方法且应如此理解。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，测量所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中的一或多者或全部的钙浓度，将具有较低合并钙浓度测量值的DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，所述方法进一步包括测量非水溶剂及DPPA、DPPC、MPEG500-DPPE原料的钙浓度且所述非水溶剂具有较低合并钙浓度测量值。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将各自具有钙浓度表征值的MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，其中MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂的合并钙浓度表征值为较低钙浓度，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将各自具有钙浓度表征值的MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，其中MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶剂的合并钙浓度表征值为较低钙浓度，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括选择MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中的一者、两者或全部三者具有钙浓度表征值，其中所述合并钙浓度表征值为较低钙浓度，将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。如此基于具有单独的或合并钙浓度表征值来选择例如磷脂原料及/或非水溶剂的组分。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括选择MPEG5000-DPPE原料及DPPC原料，其中的一或两者具有钙浓度表征值，其中所述合并钙浓度表征值为较低钙浓度，将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。如此基于具有单独的或合并钙浓度表征值来选择例如磷脂原料及/或非水溶剂的组分。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括选择各自具有钙浓度表征值的MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中所述合并钙浓度表征值为较低钙浓度，将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，非水溶剂具有钙浓度表征值，且MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料与所述非水溶剂的合并钙浓度表征值为较低的。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量MPEG5000-DPPE原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的MPEG5000-DPPE原料与DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于115ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量MPEG5000-DPPE原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的MPEG5000-DPPE原料与DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于115ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量DPPC原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的DPPC原料与DPPA原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于90ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量DPPC原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的DPPC原料与MPEG5000-DPPE原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于90ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量DPPA原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的DPPA原料与DPPC原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于780ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括测量非水溶剂的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的非水溶剂与DPPA原料、DPPC原料及MPEG5000-DPPE原料组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，较低钙浓度为小于0.7ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，测量磷脂溶液的钙浓度，及将具有较低钙浓度测量值的磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括选择表征为不具有钙或具有较低钙浓度的MPEG5000-DPPE原料，将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，MPEG5000-DPPE原料进一步表征为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子含量。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成表征为不具有钙或具有较低钙浓度的磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过前述任何方法来制备。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过包括以下的方法来制备：测量MPEG5000-DPPE原料的钙浓度，将具有较低钙浓度测量值的MPEG5000-DPPE原料与DPPA原料、DPPC原料非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过包括以下的方法来制备：将MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，测量磷脂溶液的钙浓度，及将具有较低钙浓度测量值的磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过包括以下的方法来制备：选择表征为不具有钙或具有较低钙浓度的MPEG5000-DPPE原料，将MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过包括以下的方法来制备：将MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成表征为不具有钙或具有较低钙浓度的磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括在低钙或无钙条件中单独地将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与包括PG的非水溶剂组合，以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，无钙或低钙条件为小于0.7ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括在低钙或无钙条件中，以无关顺序的方式，连续地将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，无钙或低钙条件为小于0.7ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括在不含甲醇及甲苯的条件下，将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料组合以形成磷脂掺合物，在低钙或无钙条件中将磷脂掺合物与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，无钙或低钙条件为小于0.7ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与掺合溶剂组合以形成磷脂掺合物，使所述掺合溶剂蒸发以形成经干燥的磷脂掺合物，在低钙或无钙条件中将所述经干燥的磷脂掺合物与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，无钙或低钙条件为小于0.7ppm。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于制备磷脂悬浮液的方法，所述方法包括将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与掺合溶剂组合以形成磷脂掺合物，在不含MTBE的条件下使用第二掺合溶剂使所述磷脂掺合物沉淀，在低钙或无钙条件下将经沉淀的磷脂掺合物与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。在一些实施例中，无钙或低钙条件为小于0.7ppm。
在前述任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂。在前述任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波图像。
本发明在另一方面中进一步提供一种用于使个体成像的方法，所述方法包括将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中所述磷脂悬浮液通过前述方法中的任一者来制备。
本发明在其它方面中进一步提供一种包括磷脂溶液的组合物，所述磷脂溶液包括在非水溶剂中的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE且具有较低钙浓度，以及提供包括磷脂溶液的组合物，所述磷脂溶液包括在非水溶剂中的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，其中所述DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及所述非水溶剂具有较低的合并钙离子含量表征值。在一些实施例中，非水溶剂包括丙二醇(例如，丙二醇可为唯一非水溶剂或其可与一或多种其它溶剂组合使用以提供非水溶剂)。在一些实施例中，非水溶剂包括丙二醇及甘油。在一些实施例中，非水溶剂包括缓冲液。在一些实施例中，缓冲液为乙酸盐缓冲液。在一些实施例中，组合物包括全氟化碳气体。在一些实施例中，全氟化碳气体为全氟丙烷。由此，在一些例子中，组合物提供于例如小瓶的容器中，且气体提供于容器的顶部空间中。还提供用于将磷脂溶液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂的方法。所述方法可进一步包括将超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波图像。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，非水溶剂包括(i)丙二醇或(ii)丙二醇及甘油。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，非水溶剂包括缓冲液。在本文所提供的各种方面的一些实施例中，非水溶剂包括乙酸盐缓冲液。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，含水溶剂包括缓冲液。在本文所提供的各种方面的一些实施例中，含水溶剂包括磷酸盐缓冲液。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料单独地与非水溶剂组合以形成磷脂溶液。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料以无关顺序的方式连续地与非水溶剂组合，以形成磷脂溶液。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此组合以形成磷脂混合物且磷脂混合物随后与非水溶剂组合以形成磷脂溶液。所述磷脂混合物可为异质或均质的。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此组合以形成磷脂掺合物且磷脂掺合物随后与非水溶剂组合以形成磷脂溶液。在本文所提供的各种方面的一些实施例中，使用有机溶剂溶解沉淀法形成磷脂掺合物，所述方法包括将DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解于甲醇及甲苯的混合物中，任选地浓缩所述磷脂/甲醇/甲苯混合物，且随后使所述经浓缩的磷脂/甲醇/甲苯混合物与甲基叔丁基醚(MTBE)接触以使磷脂沉淀，以形成磷脂掺合物。在本文所提供的各种方面的一些实施例中，通过以下形成磷脂掺合物：将DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解于除甲醇/甲苯溶剂系统之外的掺合溶剂系统中，任选地浓缩磷脂/溶剂混合物，随后使经浓缩的磷脂/溶剂混合物与甲基叔丁基醚(MTBE)接触以使磷脂沉淀，以形成磷脂掺合物。在本文所提供的各种方面的一些实施例中，通过以下形成磷脂掺合物：将DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解于掺合溶剂系统中(例如但不限于甲醇/甲苯溶剂系统)，且随后使混合物冻干或以其它方式干燥以去除溶剂，留下磷脂掺合物。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述磷脂悬浮液放置于小瓶中，且将全氟化碳气体导入到所述小瓶的顶部空间内。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，所述方法进一步包括用全氟化碳气体来使磷脂悬浮液活化以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，所述方法进一步包括将超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波图像。
在本文所提供的各种方面的一些实施例中，所述方法进一步包括测量DPPA原料及/或DPPC原料及/或磷脂混合物及/或磷脂掺合物的钙浓度。
本发明的这些及其它方面及实施例将在本文中更详细描述。
附图说明
图1为具有不同程度的沉淀的四种磷脂溶液的相片。此图说明如实例中所使用的0、+、++及+++的外观标度定义。
图2为展示连续添加DPPC、MPEG5000-DPPE、DPPA及乙酸钙时的溶液外观的相片。
图3为展示用于如描述于实例中的研究4的滴定溶液外观的相片。
图4为用不同比例的MPEG5000-DPPE及含有较高钙(Ca+2)水准的MPEG5000-DPPE所制备的溶液外观的相片。
图5为展示由含有较高钙或较低钙的单独的磷脂或磷脂掺合物所制成的磷脂含水调配物的过滤流动速率的图表。研究19及23用较低钙组分进行，而研究20及24含有较高钙水准(详情参见表6)。每个图示的点为各研究内在对应时间下三次连续的过滤速率测量值的平均值。
图6为展示由含有较高钙或较低钙的单独的磷脂或磷脂掺合物所制成的磷脂非水调配物的过滤流动速率的图表。研究33及35用较低钙组分进行，而研究34及36含有较高钙水准(详情参见表9)。每个图示的点为各研究内在对应时间下三次连续的过滤速率测量值的平均值。
具体实施方式
本文提供用于制备基于磷脂的超声波造影剂(UCA)的改进方法。这些改进部分地基于以下出人意料的发现：打算用于制备超声波造影剂的某些基于磷脂的调配物对某些二价金属阳离子的存在及量敏感。具体而言，意外地发现当以某些浓度将例如钙的二价金属阳离子引入到基于磷脂的调配物(所述调配物用以生成主要超声波造影剂
Figure BDA0004247567200000091
)中时，引起所述调配物的磷脂及潜在其它组分从溶液沉淀，从而使所述调配物不可用。通常以大规模的批次制造这类调配物且由此例如无意中添加钙将使整个批次不可用。这可引起制造能力降低。
还已发现，出人意料的是，某些磷脂对二价金属阳离子(例如钙)的存在所诱导的沉淀更为敏感。具体而言，在存在某些浓度的二价金属阳离子(例如钙)时，非水溶剂(例如丙二醇)中的DPPA更可能沉淀。对于例如DPPC及DPPE的其它磷脂未观测到这种同样的敏感度，或未观测到同样程度的敏感度。这种不同的沉淀概况可轻易地导致磷脂调配物及最终的UCA具有不同于计划或所需的磷脂组成。由此，二价金属阳离子的存在不仅可能减少UCA的总产量(例如由例如本文所描述的磷脂悬浮液的含沉淀的磷脂调配物的不可过滤性所致)，还可干扰所述UCA的磷脂分布。这是成问题的，因为其可能导致完全未知磷脂含量的UCA调配物。如医药技术中所熟知的，这类UCA调配物的组成必须保持恒定且稳健地可再现，且必须避免批次间变化或以可能的最大程度使其降到最低。
本发明因此提供用于制备如本文所描述的例如磷脂溶液及磷脂悬浮液的磷脂调配物的改进方法。这些方法通过降低磷脂沉淀的可能性来提高这类调配物的产量。其还以更为稳健及可再现的方式产生具有其所期望的磷脂概况及分布的磷脂调配物。这些方法利用本文所描述的新颖及出人意料的发现，且提供所需的磷脂含量及比例的磷脂调配物，无需借助于检测沉淀。
磷脂调配物总体
本文提供用于制备改进的磷脂溶液、磷脂悬浮液及最终UCA调配物的方法。如在一些例子中更详细描述的，UCA调配物可由与例如全氟丙烷的气体组合的非水磷脂溶液形成。在其它例子中，UCA调配物可由以下形成：将非水磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液，所述磷脂悬浮液与例如全氟丙烷的气体组合。这些及其它含磷脂的组合物在本文中统称作磷脂调配物。下文将更详细描述所述特定调配物中的每一者。本发明的磷脂调配物可包括用于制造FDA审批通过的
Figure BDA0004247567200000101
微球体的三种磷脂。这三种磷脂为
(1)1,2-二软脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(在本文中称作DPPC)，
(2)1,2-二软脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(在本文中称作DPPA)，及
(3)N-(甲氧基聚乙二醇5000胺甲酰基)-1,2-二软脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(在本文中称作MPEG5000-DPPE)。
本发明的磷脂调配物可包括DPPC及MPEG5000-DPPE。
在一些例子中，可使用这些磷脂中的一或多者的改质形式。例如，可将1,2-二软脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)结合到聚乙二醇(PEG)。在一些非限制性例子中，结合到DPPE或结合到另一种磷脂的PEG的分子量(MW，或长度)可选自1000-10,000。PEG的MW更通常可为约5000，在这种情况下其称作PEG5000，且在结合到DPPE时称作PEG5000-DPPE。PEG通常结合到例如DPPE的磷脂的磷脂头部基团处，而非脂肪族链末端处。PEG可具有羟基端或甲氧基端，且可分别称作HO-PEG5000或MPEG5000。
举例来说，当结合到DPPE时，结合物可称作HO-PEG5000-DPPE或MPEG5000-DPPE。后一结合物的完整化学名称为N-(甲氧基聚乙二醇5000胺甲酰基)-1,2-二软脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，单钠盐(在本文中称作MPEG5000-DPPE)。
可以约77到90摩尔％DPPC、约5到15摩尔％DPPA及约5到15摩尔％DPPE(包含MPEG5000-DPPE)的摩尔百分比使用DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。各磷脂的优选的比率包含6.0比53.5比40.5(DPPA:DPPC:MPEG5000-DPPE)的重量％比率或10比82比8(10:82:8)(DPPA:DPPC:MPEG5000-DPPE)的摩尔％比率。
本发明的其余部分为方便及简洁起见具体地涉及DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，但应理解本文提供的教示内容打算涵盖单独或以组合形式(例如(但不限于)DPPC与MPEG5000-DPPE的组合)使用这些或其它磷脂的方法及/或单独或以组合形式包括这些或其它磷脂的组合物。
本文所提供的各种方法涉及测量用以制造本文所描述的磷脂调配物的组分的二价金属浓度。用以制造磷脂溶液的组分为尤其重要的，尤其因为沉淀似乎为在磷脂溶液步骤处，而非在磷脂悬浮液步骤处首先观测到的现象。将在本文中，包含在实例中更详细描述可用以测量二价金属阳离子浓度(例如钙及镁浓度)的方法。一些方法可涉及测量仅一种组分，例如MPEG5000-DPPE的二价金属阳离子浓度。其它方法可涉及测量两种或超过两种组分，例如两种或三种磷脂的二价金属阳离子浓度。在一些实施例中，可在进行测量之前将组分组合在一起。其它方法涉及测量用以制造例如磷脂溶液的磷脂调配物的全部组分，包含非水溶剂的二价金属阳离子浓度。这类测量可在组合组分之前或之后进行。例如，可对用以制造磷脂溶液的单独的组分进行测量，或可对所述磷脂溶液自身进行测量。
本文所提供的各种其它方法涉及基于组分的二价金属阳离子浓度选择用以制造磷脂调配物(例如磷脂溶液)的组分。更具体而言，所述方法涉及选择一或多种已表征为或鉴别为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度(包含不具有钙或具有较低钙浓度，或不具有镁或具有较低镁浓度)的组分的方法。一些方法可涉及选择一种表征为或鉴别为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度(包含不具有钙或具有较低钙浓度，或不具有镁或具有较低镁浓度)的组分，例如MPEG5000-DPPE。一些方法可涉及基于组分的合并二价金属阳离子浓度选择两种或超过两种或全部组分。由此，预期DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE以及例如(但不限于)非水溶剂及/或其单独的组分的其它组分可单独地表征为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度，但当一起使用时其合并二价金属阳离子浓度将不再满足不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度的要求且将引起沉淀。由此，在这些及其它例子中，两种、三种或全部组分(例如两种或三种磷脂)可经选择以使得其合并二价金属阳离子浓度表征为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度。
磷脂溶液
如本文中所使用，磷脂溶液指代在非水溶剂中包括一或多种磷脂的组合物。所述磷脂溶液可在非水溶剂中最低限度地包括DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。所述磷脂溶液可在非水溶剂中最低限度地包括DPPC及MPEG5000-DPPE。
如本文中所使用的非水溶剂为使磷脂溶解从而形成溶液(即，磷脂溶液)的溶剂。优选地，存在于磷脂溶液中的非水溶剂为药学上可接受的，尤其因为将所述非水溶剂携载加入向个体(包含人类个体)投与的最终UCA调配物中。在某些实施例中，用以制造磷脂溶液的非水溶剂不为或不包括甲醇或甲苯或甲基叔丁基醚(MTBE)。
磷脂溶液的非水溶剂可为单一溶剂或其可为溶剂的组合。非水溶剂包括(但不限于)丙二醇(其可在本文中称作PG)及甘油(其可在本文中称作G)。二者均提供为液体原料。在一些例子中，磷脂溶液的非水溶剂可仅为PG或其可为PG与G的混合物(其可称作PG/G)。包括至少PG的非水溶剂在本文中可称作包括PG的非水溶剂。所述PG/G混合物包含介于5:1到1:5(重量比重量)范围内的比率。在一些实施例中，使用1:1的PG:G w/w比率(且在本文中称作1:1混合物)。
磷脂溶液可进一步包括一或多种缓冲液。这类缓冲液为能够缓冲例如上文所述的非水溶剂的那些缓冲液。实例包含(但不限于)乙酸盐缓冲液(例如乙酸钠及乙酸的组合)、苯甲酸盐缓冲液(例如苯甲酸钠及苯甲酸的组合)及柳酸盐缓冲液(例如柳酸钠及柳酸的组合)。其它可使用的缓冲液包含二乙醇胺缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、丁二酸盐缓冲液、苹果酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、戊二酸盐缓冲液、乌头缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、甘油酸酯缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液及tris缓冲液。在一些实施例中，使用乙酸盐缓冲液。在打算缓冲液不为磷酸盐缓冲液的情况下，用于非水溶剂中的缓冲液可为非磷酸盐缓冲液。
缓冲液浓度将视所使用缓冲液的类型而变化，如一般技术人员将理解且在其进行确定的技术范围内。非水溶剂中的缓冲液浓度可介于约1mM到约100mM范围内，包含约1mM到约50mM、或约1mM到约20mM、或约1mM到约10mm、或约1mM到约5mM，包含约5mM。
因此，磷脂溶液可包括一或多种磷脂(例如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)、为PG或包括PG的非水溶剂及任选地例如乙酸盐缓冲液的缓冲液。
可以多种方法制造磷脂溶液，下文更详细描述所述方法中的数种。大体而言，非水溶剂可在与磷脂接触之前经升温，且缓冲液(如果使用)可在与磷脂接触之前首先存在于溶剂中。可搅拌所述溶剂及随后的溶液以促进磷脂溶解。
值得注意的是，已发现在非水溶剂中，且由此在制造磷脂溶液的工艺中出现与二价金属阳离子相关的磷脂沉淀。由此，如本文所描述的各种方法包含测量用以制造所述磷脂溶液的各种组分的二价金属阳离子浓度的步骤，包含无论单独或共同使用的磷脂、例如PG及G的非水溶剂、例如乙酸盐缓冲液的缓冲液(如果使用)及其类似者。
在一些实施例中，替代测量磷脂溶液的二价金属阳离子浓度或除测量磷脂溶液的二价金属阳离子浓度之外，可测量磷脂悬浮液的二价金属阳离子浓度。
可进行目测磷脂溶液以检测沉淀，但是这不是必需的。图1为展示具有不同程度的沉淀的各种磷脂溶液的相片。
在一些实施例中，磷脂溶液随后用以制备下文更详细描述的磷脂悬浮液。
在一些实施例中，使磷脂溶液直接与气体(例如全氟化碳气体)接触以制造经磷脂囊封的气体微球体，而非首先使磷脂溶液与含水溶剂接触。即，在一些例子中，通过(非水)磷脂溶液与气体的接触及剧烈摇动(称作活化)制造经磷脂囊封的气体微球体。这类微球体可随后与含水溶剂接触以形成UCA。
磷脂悬浮液
如本文中所使用，磷脂悬浮液指代包括磷脂溶液及含水溶剂的含水磷脂调配物。所述磷脂悬浮液可包括一或多种磷脂，例如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。磷脂悬浮液将最低限度地包括一或多种磷脂(例如一或多种磷脂)、非水溶剂(例如PG)及含水溶剂。
如本文中所使用的含水溶剂为水或包括水作为其主要组分(按重量计)。含水溶剂可进一步包括一或多种盐，且由此可称作含水盐水溶剂。其可另外地或可替代地包括缓冲液，且由此可称作含水缓冲盐水溶剂或含水缓冲溶剂。优选地，无论含水溶剂是否包含盐或缓冲液，其均为药学上可接受的，这是因为类似于磷脂溶液，所述含水溶剂经携载加入向个体(包含人类个体)投与的最终UCA调配物中。
可包含于含水溶剂中的盐包含(但不限于)氯化钠。
可包含于含水溶剂中的缓冲液包含(但不限于)磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、苯甲酸盐缓冲液、柳酸盐缓冲液、二乙醇胺缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、丁二酸盐缓冲液、苹果酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、戊二酸盐缓冲液、乌头缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、甘油酸盐缓冲液、葡萄糖酸盐缓冲液及tris(三(羟甲基)甲胺)缓冲液。通常，非水溶剂或含水溶剂任一者包括缓冲液，但不是两者均有。缓冲液浓度将视所使用缓冲液的类型而变化，如一般技术人员将理解且在其进行确定的技术范围内。含水溶剂中的缓冲液浓度可介于约1mM到约100mM范围内，包含约1mM到约50mM、或约10mm到约30mM、或约20mM到约30mM、或约20mM到约25mM，包含约25mM。
因此，磷脂悬浮液可包括一或多种磷脂(例如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)、非水溶剂(其为PG或其包括PG)、含水溶剂(其可包括一或多种例如氯化钠的盐)及任选地缓冲液(例如乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液)。磷脂悬浮液物理上可表征为磷脂悬浮而非溶解于含水溶剂中。
一般通过使非水磷脂溶液与含水溶剂接触来制造磷脂悬浮液。含水溶剂可已包括任何盐及/或任何缓冲液，或者可在与磷脂溶液接触之后添加那些盐及/或缓冲液。可搅拌含水溶剂以便确保磷脂溶液与含水溶剂混合。含水溶剂还可在与磷脂溶液接触之前经升温，所述磷脂溶液在一些例子中也可经升温。
出人意料地，含水溶剂的二价金属阳离子浓度不如非水磷脂溶液(及其组合组分)的二价金属阳离子浓度一样重要。举例来说，已意外地发现一旦制备无沉淀的磷脂溶液，其能够与具有较高二价金属阳离子浓度的含水溶剂组合而不会诱导任何可识别的磷脂沉淀。由此，已出人意料地发现磷脂对于较高二价金属阳离子含量的敏感度仅在磷脂溶液中或在非水溶剂的存在下存在，而不会超出这个范围。类似地，已发现一旦在磷脂溶液中形成沉淀，与含水溶剂(即使经升温的含水溶剂)接触不引起其溶解。迄今为止，并未了解到磷脂(且尤其DPPA)对较高二价金属阳离子水准(例如钙水准)的这种不同的敏感度，且视其为出人意料的发现。
虽然含水溶剂的二价金属阳离子浓度似乎不会诱导一或多种磷脂的沉淀，其确实出人意料地诱导其它组分的沉淀，包含最值得注意的磷酸盐，例如如果磷酸盐缓冲液用于含水溶剂则可存在的磷酸盐。由此，在一些例子中，本文所提供的方法可另外包含测量用以制造(包括磷酸盐的)含水磷脂悬浮液的组分的二价金属阳离子浓度。或者，所述方法可包含选择单独地或以组合形式表征为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度的单独组分或组合组分。
磷脂悬浮液可随后用以制备经磷脂囊封的气体微球体。
经磷脂囊封的气体微球体，及包括其的UCA调配物
显而易见，本发明的基于磷脂的超声波造影剂为经磷脂囊封的气体微球体。可以多种方法来制造这些微球体。例如，可使磷脂溶液与含水溶剂接触以形成磷脂悬浮液，且可使所述磷脂悬浮液与气体(例如全氟化碳气体)接触以形成经磷脂囊封的气体微球体。作为另一实例，可使非水磷脂溶液与气体(例如全氟化碳气体)接触以形成经磷脂囊封的气体微球体。在任一情况下，不论磷脂调配物是非水磷脂溶液还是含水磷脂悬浮液，其均以足够产生经磷脂囊封的气体微球体的方式与所述气体组合。这通常涉及剧烈摇动或其它搅动。充分摇动或搅动通常使用例如
Figure BDA0004247567200000141
的装置来实现，且通常并非以人工方式实现。
磷脂溶液或磷脂悬浮液提供于具有气体顶部空间的容器(例如小瓶)中。通常通过气体交换工艺将全氟化碳气体(例如全氟丙烷)引入到这类容器的顶部空间内。随后剧烈摇晃这个小瓶以便形成经磷脂囊封的气体微球体。由最终用户或医疗人员在即将投与到个体之前进行这种称作活化的工艺。
微球体在其内腔中包括气体，例如全氟化碳气体(包含但不限于全氟丙烷气体)。囊封气体的磷脂壳层可排列为单层或双层，包含单层双层或多层双层。微球体可具有小于10微米，或小于6微米，或小于3微米或更优选地小于2微米的平均直径。这些平均直径意指当分析微球体值群体时，所述群体的平均直径小于10微米，或小于6微米，或小于3微米或更优选地小于2微米。所述微球体可具有介于0.5到3微米，或1到2微米，或1.4到1.8微米，或1.4到1.6微米范围内的平均直径。平均直径可为约1.4微米。
产生经磷脂囊封的气体微球体的工艺称作活化。包括充足浓度的经磷脂囊封的气体微球体的调配物在本文中可称作活化调配物。
应了解“充足”的气体微球体的浓度取决于是使用磷脂溶液(而不介入含水溶剂的使用)还是使用磷脂悬浮液制造所述气体微球体而定。通常，投与到个体的UCA调配物包括每毫升所投与调配物至少约1×107数量级的微球体，或每毫升至少5×107个微球体，或每毫升至少7.5×107个微球体或每毫升至少1×108个微球体，或每毫升至少1×109个微球体，或每毫升约5×109个微球体。在一些例子中，微球体浓度的范围可为每毫升所投与调配物1×107到1×1010个微球体，且更通常地为每毫升5×107到5×109个微球体。
视如何制造气体微球体而定，所述气体微球体可存在于非水溶剂或含水溶剂中。无论如何，在投与到个体之前，其通常在含水溶液中稀释，所述含水溶液可为盐水溶液，或缓冲含水溶液，或缓冲盐水溶液。
通常静脉内投与到个体(包含人类个体)的UCA调配物的pH可在4-8范围内或4.5-7.5范围内。在一些例子中，pH可在约6到约7.5的范围内，或在6.2到约6.8的范围内。在其它例子中，pH可为约6.5(例如，6.5+/-0.5或+/-0.3)。在一些例子中，pH可在5到6.5的范围内，或在5.2到6.3的范围内，或在5.5到6.1的范围内，或在5.6到6的范围内或在5.65到5.95的范围内。在又一例子中，pH可在约5.7到约5.9范围内(例如，在所述范围内的任一端或两端+/-0.1或+/-0.2或+/-0.3)。在另一例子中，pH可为约5.8(例如，5.8+/-0.15或5.8+/-0.1)。
气体优选为大体上不可溶于本文所提供的磷脂调配物，包含磷脂溶液及磷脂悬浮液。气体可为不可溶氟化气体，例如六氟化硫或全氟化碳气体。全氟化碳气体的实例包含全氟丙烷、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷。可使用的气体的实例描述于美国专利第5,656,211号中，且以引用的方式并入本文中。在一重要的实施例中，气体为全氟丙烷。
二价金属阳离子及其测量方法
二价金属阳离子为原子价为2的二价金属离子。这些金属离子包含：钡(2+)、铍(2+)、镉(2+)、钙(2+)、铬(2+)、钴(2+)、铜(2+)、铕(2+)、钆(2+)、锗(2+)、铁(2+)、镧(2+)、铅(2+)、镁(2+)、锰(2+)、汞(2+)、镍(2+)、锇(2+)、铂(2+)、钌(2+)、锶(2+)、锡(2+)、铀(2+)、钒(2+)、钇(2+)及锌(2+)。
在一些实施例中，所关注的二价金属阳离子为钙、镁及锰。在一些实施例中，所关注的二价金属阳离子为钙及镁，且因此仅测量钙及镁，或仅基于组分的钙含量及镁含量选择组分。在一些实施例中，所关注的二价金属阳离子为钙，且因此仅测量钙或仅基于组分的钙浓度选择组分。
二价金属阳离子的影响
如本文所描述，二价金属阳离子可存在于用以制造调配物的一或多种组分中。直到这类组分与非水溶剂组合以形成磷脂溶液(此时例如可诱导磷脂沉淀)或直到这类组分与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液(此时例如可诱导磷酸盐沉淀)为止，可能不会了解到二价金属阳离子的存在。出人意料地，根据本发明发现MPEG5000-DPPE磷脂原料含有足够高浓度的钙及镁，以使得一旦组合，引起至少DPPA磷脂沉淀。由此，二价金属阳离子对不同磷脂可具有不同影响，且磷脂(或其它组分)是否含有足以诱导沉淀的浓度的这类阳离子对于用户可能并非显而易见的。
本发明人发现在制备各种UCA调配物的工艺中，当非水溶剂与包括DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE磷脂的磷脂掺合物组合时，非水溶剂变混浊。进一步确定所述混浊外观很可能是由DPPA磷脂的沉淀所致。然而，本发明人所不知的事实为MPEG5000-DPPE含有高浓度的钙及镁离子，且那些钙及镁浓度很可能引起DPPA沉淀。有趣的是，这类阳离子似乎不影响MPEG5000-DPPE保持在溶液中的能力，且由此用户将不会了解到所述事实，直到这类磷脂在非水混合物中与其它磷脂组合为止。在本文中更详细描述的其它研究发现，当稍后表征为高钙浓度的MPEG5000-DPPE原料与DPPA组合时出现沉淀，无论添加顺序或其它组分(例如其它磷脂，例如DPPC及DPPA)的存在如何。甚至更出人意料的是DPPA在足够高的二价金属阳离子浓度(例如钙及镁浓度)存在下在包括PG的非水溶剂中沉淀，但在具有类似高钙及镁浓度中任一者或两者的含水溶剂中不沉淀的敏感度。换句话说，引起DPPA在包括PG的非水溶剂中沉淀的钙浓度确实没有引起DPPA在含水溶剂中沉淀，且这也是出人意料的。
不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度
如本文中所使用，选择表征或鉴别为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度的组分，其包含无钙或较低钙浓度。这类二价金属阳离子浓度表示为重量比重量度量(即，每单位重量的其中存在所关注组分的基础基质或溶剂的重量中的二价金属阳离子的重量)。微克每克浓度可替代地称作百万分之一或ppm。
这类组分的无钙或较低钙浓度将进一步视使用了多少所述组分，或换句话说有多少这类组分经稀释以形成磷脂溶液或磷脂悬浮液而定。
在最简单的情况下，仅关注一种组分，且仅测量其钙浓度或基于其钙浓度选择仅所述组分。基于本发明，一般技术者将理解且能够确定在所述组分中可耐受多少钙，以便避免磷脂溶液或磷脂悬浮液中的沉淀。
举例来说，磷脂原料(通常以例如粉末的固体形式提供)中的钙浓度表示为每克磷脂的钙重量。一个实例为每克MPEG5000-DPPE的钙重量或每克DPPC的钙重量。当例如两种磷脂的两种组分经组合时，所述度量可为每克经组合的MPEG5000-DPPE及DPPC的钙重量。
无二价金属阳离子(例如无钙)是指这类阳离子的浓度为使用所属领域中已知及/或本文所提供的方法不可检测的。
磷脂原料中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度将视特定组分而定。
在MPEG5000-DPPE磷脂原料中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于510微克/克(即，每克MPEG5000-DPPE的二价金属阳离子微克数)(也称作小于510ppm)，包含小于345ppm，小于230ppm，小于115ppm，小于57.5ppm及小于11.5。
在DPPC磷脂原料中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于390微克/克(即，每克DPPC的二价金属阳离子微克数)(也称作小于390ppm)，包含小于270ppm，小于180ppm，小于90ppm，小于45ppm及小于9ppm。
在DPPA磷脂原料中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于3440微克/克(即，每克DPPA的二价金属阳离子微克数)(也称作小于3440ppm)，包含小于2340ppm，小于1560ppm，小于780ppm，小于390ppm及小于78ppm。
在磷脂掺合物中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于210微克/克(即，每克磷脂掺合物或MPEG5000-DPPE及DPPC及DPPA的合并重量的二价金属阳离子微克数)(也称作小于210ppm)，包含小于150ppm，小于100ppm，小于50ppm，小于25ppm及小于5ppm。
在丙二醇中不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于3.1微克/克(即，每克丙二醇的二价金属阳离子微克数)(也称作小于3.1ppm)，包含小于2.1ppm，小于1.4ppm，小于0.7ppm，小于0.35ppm及小于0.07ppm。
在1:1(重量比重量)丙二醇及甘油混合物中，不具有二价金属阳离子或具有低二价金属阳离子浓度为小于10.4微克/克(即，每克组合的丙二醇及甘油的二价金属阳离子微克数)(也称作小于10.4ppm)，包含小于7.8ppm，小于5.2ppm，小于2.6ppm，小于1.3ppm及小于0.26ppm。
在甘油中不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度为小于20.4微克/克(即，每克甘油的二价金属阳离子微克数)(也称作小于20.4ppm)，包含小于15.3ppm，小于10.2ppm，小于5.10ppm，小于2.6ppm，小于0.51ppm。
在包括仅丙二醇作为非水溶剂的磷脂溶液中不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度为小于3.1微克/克(即，每克磷脂溶液的全部组分的二价金属阳离子微克数)(也称作小于3.1ppm)，包含小于2.1ppm，小于1.4ppm，小于0.7ppm，小于0.35ppm及小于0.07ppm。如将基于磷脂溶液的组成所了解的，按重量计，主要组分为非水溶剂，在这种特定情况下为丙二醇。
应理解相同的浓度限制适用于钙浓度及镁浓度以及合并的钙及镁浓度。
视磷脂溶液的性质而定，本发明涵盖测量磷脂溶液的一或多种组分(包含例如一种、两种或全部三种磷脂原料)中的二价金属阳离子浓度，任选地一起测量例如丙二醇及/或甘油的非水溶剂的二价金属阳离子浓度。如果任何这些组分含有超过上文所述的那些水准的二价金属阳离子浓度，那么预期一旦用这类组分制造磷脂溶液，这类磷脂溶液将易于沉淀。
一些实施例涵盖分析单一组分的二价金属阳离子浓度，且如果这类浓度为“不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度”，那么所述组分可与其余组分合并，即使并未分析这类其余组分的二价金属阳离子浓度。磷脂溶液的组分包含磷脂原料(无论其为单独地提供或作为掺合物提供)、非水溶剂(例如丙二醇及甘油)及任选地缓冲液。
一些实施例涵盖测量磷脂溶液的超过一种但少于全部组分的二价金属阳离子浓度。在一些例子中，如果组分中的一者的二价金属阳离子浓度超过上文所列的“不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度”限制，那么其可能不会用以制备磷脂溶液(或磷脂掺合物)。在一些例子中，无一种组分的二价金属阳离子浓度可表征或鉴别为超出“不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度”。然而，当组合使用这类组分时，合并二价金属阳离子浓度可基于各自贡献给磷脂溶液的量来确定。预期合并二价金属阳离子浓度可能超出或可能不会超出如上文对于磷脂溶液所定义的“不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度”。
如通篇所论述的，本文所阐述的各种水准在提及二价金属阳离子时同等地适用于钙。实例表明磷脂沉淀明显的最低钙浓度为每克非水溶剂约0.7微克钙(参见实例1及2)，另外称作约0.7ppm。由此，非水磷脂溶液中不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度(例如无钙或较低钙浓度)为小于0.7ppm，小于0.35ppm或小于0.07ppm。应理解磷脂溶液中二价金属阳离子浓度小于0.7ppm也视为不具有二价金属离子或具有较低二价金属离子浓度。
可以每克含水溶剂中的二价金属阳离子重量的形式提供含水磷脂悬浮液中的二价金属阳离子浓度。通常，通过在含水溶剂中将非水磷脂溶液稀释约20倍来形成磷脂悬浮液。由此，磷脂悬浮液中不具有二价金属离子或具有较低二价金属离子浓度为每克磷脂悬浮液小于0.035微克。类似地，磷脂悬浮液中源自磷脂溶液的钙浓度为每克磷脂悬浮液小于0.035微克。
引起磷脂沉淀的二价金属阳离子浓度可为随温度变化的。在较高温度下，在观测到沉淀之前可耐受较高浓度的阳离子。在较低温度下，较低浓度的阳离子可引起沉淀出现。
举例来说，在约55℃的温度(例如50-60℃)下，不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子浓度为每克磷脂溶液或非水溶剂小于0.7微克钙的二价金属阳离子浓度。如果在较低温度下制备磷脂溶液，那么所述水准可能略低。或者，如果在较高温度下制备磷脂溶液，那么所述水准可能略高。
钙源
如实例中所表明的，磷脂溶液意外地且独特地对特定水准的钙敏感。迄今为止并未认识到这种独特的敏感度。考虑到钙对于制备磷脂溶液的影响，且由此最终对UCA的影响，测量且由此控制磷脂溶液的钙浓度是重要的。钙可存在于磷脂溶液的每一组分中，包含如下文所描述的磷脂原料及非水溶剂。
钙及镁为周期表第2族中的二价碱土金属。钙为地壳中按质量计第五充足的元素，且阳离子Ca2+也为海水中第五充足的溶解离子。视“硬度”而定，在自来水中以各种水准发现所述离子。总水硬度为Ca2+及Mg2+的摩尔浓度的总和，介于软0-60ppm到极硬≥181范围内。
还在来自生物柴油的粗甘油萃取物中发现不同浓度的钙及镁。视用于生物柴油生产的种子油而定，钙及镁的水准据报告为分别介于12到163ppm及4到127ppm范围内(J.C.Thompson 2006Applied Engineering in Agriculture第22卷(2):261-265))。甘油的主要供应来自所述生物柴油副产物。能够通过用活性碳处理以去除有机杂质、用碱处理以去除未反应的甘油酯及用离子交换处理以去除盐，来纯化粗甘油萃取物。通过多步骤蒸馏获得高纯度甘油(>99.5％)；由于甘油的高沸点(290℃)，真空是有帮助的。
工业上，从环氧丙烷生产丙二醇。不同的制造商使用200℃(392℉)到220℃(428℉)下的非催化高温工艺，或在离子交换树脂或少量硫酸或碱存在下在150℃(302℉)到180℃(356℉)下进行的催化方法。最终产物含有20％丙二醇、1.5％二丙二醇及少量其它聚丙二醇。进一步纯化产生通常为99.5％或更高的成品工业级别或美国药典/日本药典/欧洲药典/英国药典级别的丙二醇。丙二醇还可从甘油(生物柴油副产物)转化。
药典级别的丙二醇及甘油的钙及镁含量并未如美国药典、欧洲药典、英国药典或日本药典的分析要求证书所定量。
磷脂DPPA含有能够在适合pH下电离的磷酸盐。所述磷酸盐的两个羟基的pKa为6.2及1.8(Tatulian的离子化及结合(Ionization and Binding),511-552PhospholipidHandbook,G Ceve 1993版)。DPPA为以不同的盐形式可商购的。通常使用Na盐，但Ca盐也为可获得的。
DPPC为两性离子且因此不需要相对离子。
MPEG5000-DPPE为经改质DPPE，其对于磷酸盐的羟基及乙醇胺的胺的pKa为1.9及9.3(Tatulian的离子化及结合,511-552Phospholipid Handbook,G Ceve 1993版)。MPEG5000-DPPE为以Na盐形式可获得的。
测量二价金属阳离子浓度的方法
能够使用数种已知技术中的一种进行二价金属阳离子浓度的定量。这些方法包含原子光谱法，例如原子吸收光谱法(AAS)、火焰光度测定法或火焰原子发射光谱法(FAES)、电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)；及其它方法，例如电感耦合等离子体-质谱法或络合滴定。所述光谱方法利用碱金属(第1族)及碱土金属(第II族)的金属离子在因火焰源所提供的热能解离时的吸收或发射特性。ICP-MS为能够检测极低浓度金属的质谱法类型。这通过用电感耦合等离子体使样品电离，且随后使用质谱仪以对那些离子进行分离及定量来实现。这些方法中的一些用于实例中。
络合滴定为另一种用于检测二价金属阳离子浓度的方法。这种方法使用乙二胺四乙酸(EDTA，ethylenediaminetetraacetic acid)与钙及镁离子络合来与呈色指示剂竞争。这提供迅速的比色定量。EDTA与钙及镁离子形成络合物。称作Eriochrome黑色T(ErioT)的蓝色染料用作指示剂。所述蓝色染料还与钙及镁离子形成络合物，在所述过程中颜色从蓝色变成粉红色。染料-金属离子络合物不如EDTA-金属离子络合物稳定。对于滴定，使含有钙及镁离子的样品溶液与过量EDTA反应。添加指示剂且当存在的全部Ca2+及Mg2+离子与EDTA络合时指示剂保持蓝色。
使用氯化镁溶液进行反滴定。其与过量EDTA分子形成络合物，直到全部过量EDTA已络合的终点。氯化镁溶液的剩余的镁离子随后开始与ErioT指示剂络合，立即使其颜色从蓝色变成粉红色。
合成方法
本发明提供用于制备磷脂溶液及磷脂悬浮液的方法，所述磷脂溶液及磷脂悬浮液打算与全氟化碳气体一起使用以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的UCA调配物。在优选实施例中，磷脂为DPPA、DPPC及DPPE(例如MPEG5000-DPPE)。
如下文所描述，可以多种方法制造磷脂溶液。这些方法概括地表征为掺合方法及非掺合方法。初始磷脂原料可呈固态(例如，粉末)形式或呈液态形式。
掺合方法
掺合方法指代其中磷脂彼此紧密掺合以提供对于其磷脂含量及磷脂分布更均匀(且由此更均相)的固态磷脂混合物，且在一些例子中所述固态磷脂混合物具有比简单磷脂混合物高的纯度。
这种方法通过在适合的掺合溶剂系统中溶解或悬浮三种磷脂以产生所述三种磷脂的均相分散液，且随后使所述均匀分布的磷脂与所述溶剂分离。掺合溶剂与磷脂的分离可涉及干燥、冻干、蒸馏及其类似者，或其可包含使用额外的掺合溶剂来沉淀。用于中性脂质的掺合溶剂为例如乙醚或氯仿的相对非极性溶剂。对于自身较为极性的膜相关脂质需要例如醇((例如甲醇及乙醇)的较为极性的掺合溶剂。还可使用氯仿，尤其用于中间极性的脂质。当与甲醇混合时，氯仿成为通用溶剂。二氯甲烷(dichloromethane/methylenedichloride)为类似萃取剂但较不可氧化。己烷可以用于较低极性的脂质。其可用于从水/醇混合物萃取中性脂质。石油醚为具有5-8个碳原子的各种烃的混合物且可在一些例子中用以替代己烷。其它掺合溶剂包含(但不限于)环己烷及甲苯。
如本文中将更详细描述的，通过以下形成某些掺合物：使一或多种所需磷脂((例如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)在掺合溶剂系统中接触以首先溶解这类磷脂，随后任选地浓缩这类溶液，随后从这类溶剂去除掺合溶剂或使磷脂掺合物沉淀。掺合溶剂不应与稍后用以溶解磷脂从而形成磷脂溶液的非水溶剂混淆。还应明确的是，所述沉淀为所需事件且不应与非所需磷脂沉淀混淆，所述非所需磷脂沉淀可能在稍后形成磷脂溶液期间通过钙、另一种二价阳离子或二价阳离子的组合的存在而发生。
一些制备磷脂溶液的方法涉及使磷脂掺合物与非水溶剂接触。存在各种制造磷脂掺合物的方法，包括(但不限于)有机溶剂(或如本文中所使用的掺合溶剂)溶解沉淀法及含水悬浮液冻干法。
有机溶剂溶解沉淀法详细描述于美国专利第8,084,056号及公开国际申请案第WO99/36104号中，两者的全部内容以引用的方式并入本文中。这种方法的一个实施例涉及以下步骤：
(a)使所需磷脂(例如，DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPC及MPEG5000-DPPE)与第一掺合溶剂系统接触。所述系统通常为溶剂的组合，例如CHCl3/MeOH、CH2Cl2/MeOH，及甲苯/MeOH。可能需要将所得溶液升温到足以实现完全溶解的温度。这类温度优选为约25℃到75℃，更优选为约35℃到65℃。溶解之后，可通过热过滤或冷却到室温随后过滤来去除未溶解的杂质。可使用已知的过滤方法(例如，重力过滤、真空过滤或压力过滤)。
(b)随后将溶液浓缩到稠凝胶/半固体。优选通过真空蒸馏进行浓缩。还可使用使溶液浓缩的其它方法，例如旋转蒸发。所述步骤的温度优选为约20℃到60℃，更优选为30℃到50℃。
(c)随后将稠凝胶/半固体分散于第二掺合溶剂中。将混合物制成浆料，优选地接近环境温度(例如，15℃-30℃)。有用的第二掺合溶剂为引起磷脂沉淀的那些溶剂。第二掺合溶剂优选地为甲基叔丁基醚(MTBE)。可使用其它醚及醇。
(d)随后收集添加第二掺合溶剂时所生成的固体。优选地，使用另一份第二掺合溶剂(例如，MTBE)来洗涤所收集固体。可经由真空过滤或离心优选地在环境温度下进行收集。收集之后，优选使固体在约20℃到60℃的温度下在真空中干燥。
所得固体在本文中称作磷脂掺合物。
某些本文所描述的方法使用呈磷脂掺合物形式的磷脂，包含根据上述掺合方法中的任一者所制造的磷脂掺合物。一些方法使用磷脂掺合物，不包括上述根据甲醇/甲苯/MTBE方法所制造的磷脂掺合物，所述方法中甲醇及甲苯混合物用作第一掺合溶剂且MTBE用作第二掺合溶剂。为了清晰起见，上述方法在本文中称作甲醇/甲苯/MTBE磷脂掺合方法。
如本文中所使用，磷脂掺合物区别于其它磷脂混合物，包含如本文所描述的由仅仅以其固体(包含粉末)形式组合磷脂来制备的那些混合物。
在含水悬浮液冻干方法中，使磷脂在高温下悬浮于水中，且随后通过冻干进行浓缩。
出于多种原因，有机溶剂溶解沉淀法相比含水悬浮液/冻干法为优选的，所述原因如美国专利第8,084,056号及公开PCT申请WO 99/36104中所概述，包含使用有机溶解法所产生的均匀分布的磷脂固体。
一些不为上文所述的甲醇/甲苯/MTBE磷脂掺合方法的掺合方法使用除甲醇及甲苯之外的掺合溶剂系统。在这些方法中，磷脂在不含甲醇及不含甲苯的条件(也称作不含甲醇及甲苯的条件)下组合以形成磷脂掺合物。由此，不含甲醇及甲苯的条件指代不包含这些溶剂的两者的条件。
一些掺和方法在掺合溶剂中组合磷脂以形成磷脂掺合物，且随后使所述掺合溶剂完全蒸发(例如通过干燥或蒸馏)以形成经干燥的磷脂掺合物。在本文所提供的方法中，所述经干燥的磷脂掺合物随后与例如PG的非水溶剂接触。
一些掺合方法在含水溶剂中组合磷脂，且随后使所述混合物冻干以形成冻干磷脂组合物。其它掺合方法将磷脂与其它替代水的溶剂系统组合，例如(但不限于)(1)乙醇及环己烷(例如，1:1，v:v)混合物及(2)第三丁醇(叔丁醇或1,1二甲基乙醇)。在溶解于这些各种溶剂中之后，使组合物冻干。可通过历经异丙醇/CO2浴或丙酮/CO2浴来冷冻及在Virtis冻干器上干燥直到产物在外观上呈现干燥及絮状来进行冻干。
各种不为上文所述的甲醇/甲苯/MTBE磷脂掺合方法的掺合方法描述于公开EP0923383(WO1997040858)中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
一些不为上文所述的甲醇/甲苯/MTBE磷脂掺合方法的掺合方法在掺合溶剂中组合磷脂(所述掺合溶剂可为甲苯及甲醇的混合物)以形成磷脂掺合物，且随后使这类磷脂掺合物在无MTBE存在下沉淀。这些方法中，在不含MTBE的条件下出现沉淀。
在其它掺合方法中，DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE(或DPPC及MPEG5000-DPPE)可以其干燥、固体形式组合，且随后可主动及紧密地以干燥形式混合这类组合(例如，人工地搅拌粉末或使用混合装置，例如转鼓仓混合机、绕转螺旋混合机、带状混合机、挤压机、高速旋风式混合机(cyclomix)、亨舍尔混合机(henschel mixer)、劳迪吉型混合机(lodige typemixer)、爱立许型混合机(Eirich type mixer)或其它类型的经设计以用于医药粉末混合的装置，其目的在于制备均匀磷脂掺合物(例如在整个混合物中均匀的磷脂分散)。对用于产生均匀干燥产物的额外的方法可以参考Deveswaran等人，Research J.Pharm.andTech.2(2)：4月-6月，2009)。
非掺合方法
与掺合方法相反，某些非掺合方法涉及简单混合固体磷脂且这倾向于导致较不均匀的(且由此较不均匀地分散或较非均相地分散)混合物。这些后者混合物在本文中称作磷脂混合物(或非掺合磷脂混合物)以将其与磷脂掺合物区分。
制备磷脂溶液的一些方法涉及仅仅使磷脂以其固体形式与非水溶剂接触。所述磷脂可同时或连续地与非水溶剂接触。如果连续地接触，那么可使用任何添加顺序。可单独地将磷脂添加到非水溶剂中，或其可以任何组合首先组合在一起，且随后添加到非水溶剂中。由此，预期可单独且同时地、单独且连续地、组合且同时地及部分组合且连续地将磷脂添加到非水溶剂中。后者的一个实例为，所述磷脂中的两种以固体形式组合在一起，且随后在剩余的磷脂与非水溶剂接触之前或之后与非水溶剂接触的例子。
由此，举例来说，可将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE(或DPPC及MPEG5000-DPPE)磷脂单独地添加到非水溶剂中。这类单独的添加可为连续添加或同时添加。如果为连续的，那么添加顺序可为任何顺序，尽管在一些例子中可第二个或最后添加DPPA，这是因为其为最不充足且最不可溶的，且可通过其它磷脂中的一种的存在促进其溶解。在一些例子中，无论磷脂是否单独地提供、或以简单混合物形式提供、或以磷脂掺合物形式提供，其随后如上文所描述溶解于包括PG或PG/G混合物的非水溶剂中以形成磷脂溶液。磷脂溶液可与气体组合，或其可与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液，所述悬浮液之后与气体接触。
在其它例子中，可通过在例如水、或乙醇及环己烷(例如，1:1，v:v)混合物、或第三丁醇(叔丁醇或1,1二甲基乙醇)中组合磷脂来制备磷脂掺合物，且这类混合物随后经冻干，且使所述经干燥产物在含水溶剂中再悬浮。在这些例子中，最终再悬浮产物可与例如全氟丙烷的气体组合。本发明预期可分析用于所述制备的任何或全部组分的二价金属阳离子浓度，且可对这类单独或合并二价金属阳离子浓度进行定量且将其用以选择及/或制备UCA。
制备超声波造影剂的方法，包含活化
通过组合及剧烈摇动磷脂溶液或磷脂悬浮液与例如全氟化碳气体的气体形成经磷脂囊封的气体微球体。这种工艺在本文中称作活化。如此形成的UCA调配物最低限度地包括磷脂、非水溶剂(例如PG)及气体，且由此活化最低限度地引起气体填充的磷脂微球体。如在本文中更详细描述的，例如
Figure BDA0004247567200000241
的情况，磷脂可存在于含水溶液中，或例如包含例如DEFINITY-II的新颖UCA调配物的情况，磷脂可存在于非水溶液中，由此，在一些例子中，活化包括在气体(例如全氟化碳气体(例如，全氟丙烷))存在下摇动含水磷脂悬浮液。在其它例子中，活化包括在气体(全氟化碳气体(例如，全氟丙烷))存在下摇动磷脂溶液。应理解全氟丙烷、全氟丙烷气体及八氟丙烷在本文中可互换地使用。
如本文中所使用，摇动指代搅动溶液(无论含水或非水)以使得气体从容器(例如，小瓶)内的局部周围环境引入到溶液中的运动。搅动溶液及导致气体引入的任何类型的运动可用于摇动。摇动必须具有足够的力量或速率以使得一段时间后形成泡沫。优选地，摇动具有足够的力量或速率，以使得泡沫在较短时间段内形成，如由特定UCA调配物所指定。由此，在一些例子中，这类摇动进行约30秒，或约45秒，或约60秒，或约75秒，或约90秒，或约120秒，包含例如30秒，或45秒，或60秒，或75秒，或90秒，或120秒。在一些例子中，活化可进行介于60到120秒的范围内、或90到120秒的范围内的时间段。
本发明预期在一些例子中，摇动时间(或持续时间)将视经活化的UCA调配物的类型而变化。举例来说，在一些例子中，含水UCA调配物相比非水性UCA调配物可摇动较短时间段。本发明预期在这类例子中，摇动速率(或摇动速度，因为这些术语在本文中可互换地使用)可为恒定。由此，例如活化或摇动装置的活化或摇动装置可设定为以一个速率(例如，根据每分钟摇动动作的数目来定义)摇动持续两个或多于两个不同的预定时间段。
本发明进一步预期在一些例子中，摇动速率将视经活化的UCA调配物的类型而变化。举例来说，在一些例子中，(含水)磷脂悬浮液相比(非水)磷脂溶液可以较慢摇动速率摇动。本发明预期在这类例子中，摇动时间(或持续时间，因为那些术语在本文中可互换地使用)可为恒定。
如下文所描述可用
Figure BDA0004247567200000251
使
Figure BDA0004247567200000252
活化。
Figure BDA0004247567200000253
活化涉及在全氟丙烷存在下剧烈摇动(含水)磷脂悬浮液，在使用
Figure BDA0004247567200000254
的情况下持续约45秒。除非另外指示，否则关于活化时间的术语“约”意指标注时间的+/-20％(即，45+/-9秒)的时间。
还可用
Figure BDA0004247567200000255
使DEFINITY-II活化。DEFINITY-II活化涉及在全氟丙烷存在下剧烈摇动(非水)磷脂溶液，持续约60到120秒。在一些例子中，使DEFINITY-II活化约75秒(即，75+/-15秒)。可使DEFINITY-II活化更长时间段，包含90到120秒。
可通过涡漩(例如通过涡流)、左右或上下运动摇动。此外，可组合不同类型的运动。可通过摇动容纳含水或非水磷脂溶液的容器(例如，小瓶)，或通过在不摇动容器(例如，小瓶)自身的情况下摇动容器(例如，小瓶)内的含水或非水溶液来进行摇动。通过机器进行摇动以便使工艺标准化。机械摇动器为所属领域中已知的，且其摇动机构或装置可用于本发明的装置中。实例包含例如那些用于牙科应用的拌和器。剧烈摇动涵盖每分钟至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少4500、至少5000或更多个摇动动作。在一些例子中，剧烈摇动包含每分钟摇动4000到4800个范围内的摇动动作。例如
Figure BDA0004247567200000256
以每分钟摇动4530个“8字形”回转为目标，且耐受每分钟4077到4756个回转的范围内的摇动速率。涡流涵盖每分钟至少250、至少500、至少750、至少1000或更多个回转。以每分钟至少1000个回转的速率的涡流为剧烈摇动的实例，且在一些例子中更优选。以每分钟1800个回转的涡流为最优选。
摇动速率可影响所需摇动持续时间。较快摇动速率将倾向于减少实现最优选微泡形成所需摇动时间的持续时间。举例来说，以4530rpm摇动45秒持续时间将在
Figure BDA0004247567200000257
上实现3398个总回转。以3000rpm摇动将要求68秒以实现相同数目的回转。所要求的持续时间及摇动速度还将受行进路径的形状及摇动的幅度影响。容器中液体达到的速度及对改变方向施加的力将影响气体并入。这些方面将基于摇动器臂长及路径、容器形状及尺寸、填充容量及调配物粘度受影响。水在15℃下的粘度大致为1.14cps。(Khattab,I.S.等人,293至323K的丙二醇与水混合物的密度、粘度、表面张力和摩尔体积以及相互关系(Density,viscosity,surface tension,and molar volume of propylene glycol+water mixturesfrom 293to 323K and correlations),Jouyban-Acree model Arabian Journal ofChemistry(2012)。对比而言，丙二醇在25℃下的粘度为42cp(Khattab,I.S.等人,293至323K的丙二醇与水混合物的密度、粘度、表面张力和摩尔体积以及相互关系,Jouyban-Acree model Arabian Journal of Chemistry(2012))且甘油在15℃下的粘度为2200cp(Secut JB,Oberstak HE甘油及其水溶液的粘度(Viscosity of Glycerol and ItsAqueous Solutions)Industrial and Engineering Chemistry 43.9 2117-2120 1951)。DEFINITY-II在15℃下具有1150cps的较高粘度。这是因为
Figure BDA0004247567200000261
主要为水，其比DEFINITY-II粘度低许多。
可通过泡沫存在于含水或非水溶液顶部及溶液变白来检测活化时的充气微球体的形成。
在低于所采用磷脂的凝胶态到液晶态相转变温度的温度下进行活化。通过“凝胶态到液晶态相转变温度”，其意指磷脂层(例如脂质单层或双层)将从凝胶态转化到液晶态的温度。这种转变描述于例如Chapman等人，J.Biol.Chem.1974 249,2512-2521中。各种磷脂的凝胶态到液晶态相转变温度将对所属领域的技术人员为显而易见的，且描述于例如Gregoriadis编,Liposome Technology,第I卷,1-18(CRC出版社，1984)及Derek Marsh,CRCHandbook of Lipid Bilayers(CRC出版社，Boca Raton,Fla.1990)，第139页中。剧烈摇动可基于摇动速度、持续时间、摇动器臂长及路径、容器形状及尺寸、填充容量及调配物粘度引起调配物变热。
鉴于本发明，所属领域的技术人员将理解可在磷脂或磷脂微球体经受本文所提供的方法之前或之后对其进行操纵。举例来说，在摇动完成之后，充气微球体可从其容器(例如，小瓶)中抽取出来。可通过以下来实现抽取：将注射器的针或无针尖端(例如，
Figure BDA0004247567200000262
)插入到容器中(包含到泡沫中，如果适宜)，及通过抽回柱塞将预定量的液体吸入到注射器的机筒中；或通过添加含水液体，混合，及通过抽回柱塞将预定量的液体吸入到注射器的机筒中。作为另一实例，充气微球体可经过滤以获得大体上均一尺寸的微球体。过滤组合件可含有可能为或可能不为彼此紧邻的超过一个过滤器。
使用超声波造影剂以使个体成像的方法
本文还提供使用经磷脂囊封的气体微球体及其调配物的方法。气体微球体及其调配物可在人类或非人类个体中活体内使用，或其可在活体外使用。其可以用于诊断或治疗目的或用于组合的诊断及治疗目的。
当用于人类个体中时，经磷脂囊封的气体微球体及其调配物可直接(纯净的)使用或可进一步在溶液(包含药学上可接受的溶液)中稀释且以一或多次推注或通过连续输液来投与。投与通常为静脉内注射。随后在不久之后进行成像。成像应用可针对心脏或其可涉及对超声波成像敏感的身体的另一区域。成像可为身体的一或多个器官或区域的成像，包含(但不限于)心脏、血管、心血管、肝、肾及头。
本发明的个体包含(但不限于)人类及动物。在一些例子中人类为优选的。动物包含例如狗及猫的宠物，及农业或奖金动物，例如(但不限于)公牛及马。
以有效量投与UCA。有效量将为促进或引起预期的活体内反应及/或应用的量。在例如超声波应用的成像应用的情形中，有效量可为允许个体或个体的区域成像的经磷脂囊封的气体微球体的量。
实例
1实例方法
1.1磷脂及磷脂掺合物及试剂
磷脂以单独的粉末形式使用，以粉末形式组合在一起且以混合物形式使用，或通过溶解及干燥掺合在一起(下文描述详情)。除非在掺合物中进行直接测量，否则单独的磷脂的含量测量值用以估计非水浓缩物或含水制剂中的最终钙或镁浓度。具有较低钙的溶剂用于全部研究。
1.1.1磷脂掺合物
一种磷脂掺合物(LB)通过以下来制备：将DPPC、DPPA、MPEG5000-DPPE(0.401:0.045:0.304[wt:wt:wt])溶解于甲苯/甲醇中，用真空及加热浓缩，且随后通过添加甲基叔丁基醚(MTBE)来制成浆料。收集固体材料，用MTBE洗涤且经干燥(与专利US8084056一致)。或者，在55℃下将DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE(0.401:0.045:0.304[wt:wt:wt])溶解于甲醇中。随后使甲醇蒸发且以磷脂掺合物形式回收固体。类似地，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE(0.401:0.045:0.304[wt:wt:wt])作为固体粉末组合在一起且用刮勺将所述粉末混合在一起。
1.1.1.1用于磷脂掺合物的残余溶剂法
使用GC顶部空间通过FID测定磷脂掺合物中的残余溶剂。将样品称重，转移到另外的20cc顶部空间小瓶中且溶解于N-甲基吡咯烷酮中。在N-甲基吡咯烷酮中制备一组残余溶剂标准品。使用GC顶部空间通过FID分析标准品及样品。各残余溶剂的浓度根据所述溶剂的校准曲线计算。
1.1.2钙测量
使用ICP-MS或AA对单独的脂质、脂质掺合物、甘油及丙二醇中的钙水准进行定量。还利用这些方法在一些样品中测量镁及其它金属离子。
1.1.1.2 ICP-MS(电感耦合等离子体-质谱)法
样品通过以下来制备：将其称入预清洁的石英消化罐中。添加基质加标(matrixspike)，且随后与硝酸及盐酸混合。在封闭的容器微波消化系统中消化样品。冷却后添加内标溶液，且经稀释，且通过ICP-MS使用He碰撞模式来分析。
1.1.1.3 AA(原子吸收光谱)法
样品通过以下来制备：称入干燥的“痕量金属清除”消化容器，且用硝酸及盐酸溶解，且与H2O2一起回流。用水洗涤样品溶液且过滤。一组标准品用以校准AA，且随后从校准曲线读取样品的吸光度。单独脂质、磷脂掺合物及调配物溶剂的结果提供于表1中。
表1.单独脂质、脂质掺合物及溶剂中的Ca+2及Mg+2水准a
物质 Ca+2(ppm)b Mg+2(ppm)b
磷脂掺合物，批次1c 未检测到 未检测到
磷脂掺合物批次2c,d 370 54
MPEG5000-DPPE(高Ca+2)批次1 980 150
MPEG5000-DPPE(高Ca+2)批次2 520 110
MPEG5000-DPPE(低Ca+2) 4 未测定
DPPC批次1 未检测到 未检测到
DPPC批次2 7 未测定
DPPA 19 未测定
丙二醇 未检测到 未测定
甘油 0.7 未测定
a通过ICP-MS测定
b ppm＝百万分之一且等效于μg/g
c磷脂掺合物由DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE(0.401:0.045:0.304[wt:wt:wt])组成
d使用MPEG5000-DPPE(高Ca+2)批次1制备脂质掺合物，批次2
1.2含水调配物制备
1.2.1非水磷脂浓缩物：
在于55℃到70℃下恒定搅拌的情况下通过以下来制备磷脂浓缩物：以任何顺序将单独脂质(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE低Ca+2或MPEG5000-DPPE高Ca+2或组合)、将磷脂掺合物(LB)、或将含有高水准Ca+2的LB添加到25-115ml丙二醇(PG)、或1:1v/v丙二醇/甘油(PG/G)或甘油媒介物中。在一些情况下，在无DPPA的情况下或在于添加脂质之前添加乙酸钙的情况下制备脂质浓缩物。
1.2.2含水调配物：
在于55℃到70℃下恒定搅拌的情况下通过向400到500mL水中添加以下来制备含水调配物：七水合磷酸氢二钠；单水合磷酸二氢钠；氯化钠；丙二醇；甘油及最终的非水磷脂浓缩物。在一些情况下，在将非水磷脂浓缩物添加到本体混配溶液中之前或之后添加乙酸钙。在其它情况下，不包含磷酸盐缓冲液。
1.3非水调配物制备
1.3.1非水调配物
在于60℃±5℃下恒定搅拌的情况下，将以任何顺序的单独脂质(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE低Ca+2或MPEG5000-DPPE高Ca+2或两者的组合)、LB或含有高水准Ca+2的LB添加到25到100mL含有0.005M乙酸盐缓冲液(90/10，乙酸钠/冰乙酸)媒介物的丙二醇(PG)中。在溶解之后，随后添加甘油以产生非水调配物。
1.4使用储备溶液添加钙及/或镁
1.4.1初步研究
于丙二醇中制备仅乙酸钙、仅乙酸镁的储备溶液及两者的混合物(分别为25.4μgCa+2/g、28.0μg Mg+2/g及14.0μg Ca+2/g与12.7μg Mg+2/g)。单独的储备溶液以等分添加到33mL含有脂质掺合物(15mg/mL)的丙二醇中达到至多总共1mL。将所述溶液与仅丙二醇相比较，且记录首先展示混浊的溶液。
1.4.2使用参考标度之后续研究
于丙二醇(299Ca+2μg/g)、丙二醇及甘油(299Ca+2μg/g)或水(6085Ca+2μg/g)中制备单水合乙酸钙的储备溶液，且媒介物在添加到丙二醇、非水磷脂浓缩物或含水调配物中(在添加非水磷脂浓缩物之前或之后)时匹配。添加钙原料最大值为始终＜总容积的12％。
一些非水磷脂浓缩物用乙酸钙来滴定。通过目视检查以0、+、++、+++标度评估外观。图1提供用于测定的标度，且使用以15毫克总脂质/毫升调配于丙二醇中的低Ca+2脂质(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE；0.401:0.045:0.304[wt:wt:wt])来产生。
1.5过滤：
1.5.1含水调配物
所制备的磷脂含水悬浮液样品在过滤之前保持在55℃下。将样品放置于55℃温度经控制的60mL注射器中，所述注射器附接有13mm亲水性的聚偏二氟乙烯(PVDF)0.22μm膜针筒过滤器。将5psi氮气排出压力施加于注射器。通过随时间对过滤溶液进行称重且每30秒读取一次来测定流动速率。计算每时间点的流动速率，且将在9到10分钟之间的平均流动与初始流动(0到1分钟)相比且以百分比表示。过滤全程连同样品一起收集预过滤样品用于磷脂浓度分析。
1.5.2非水调配物
所制备的磷脂非水溶液的样品在过滤之前保持在60℃下。将样品放置于60℃温度经控制的60mL注射器中，所述注射器附接有25mm亲水性聚醚砜(PES)0.2μm膜针筒过滤器。将10psi氮气排出压力施加于注射器。通过随时间对过滤溶液进行称重且每30秒读取一次来测定流动速率。计算每时间点的流动速率，且将在8到9分钟之间的平均流动与初始流动(0到1分钟)相比且以百分比表示。当过滤器经升温时发现澄清溶液中的流动速率随着时间增加。如上文所概述收集样品。
1.6磷脂分析：
在一些情况下分析样品的磷脂含量。将样品转移到HPLC小瓶且通过逆相HPLC分离及电晕电雾式检测器(CAD；用于侧链不同脂质种类的使用电雾式检测的高效液相色谱法(HPLC With Charged Aerosol Detection for the Measurement of Different LipidClasses),I.N.Acworth,P.H.Gamache,R.McCarthy及D.Asa,ESA Biosciences Inc.,Chelmsford,MA,USA；J.Waraska及I.N.Acworth,American Biotechnology Laboratory,2008年1月)来分析，且相对于参考标准品来定量。
1.7产物制备及测试
1.7.1含水调配物
将经过滤的含水调配物(参见章节1.5.1)等分(1.76mL)到2cc惠顿小瓶中，顶部空间空气用全氟丙烷(PFP)气体替换，所述瓶用韦斯特(West)灰色丁基塞子密封，且用铝密封件卷边。
1.7.2非水调配物
将经过滤的含水调配物(参见章节1.5.2)等分(0.35mL)到2cc惠顿小瓶中，顶部空间空气用全氟丙烷(PFP)气体替换，所述瓶用韦斯特(West)灰色丁基塞子密封，且用铝密封件卷边。
1.7.3Sysmex微球体尺寸测定(sizing)：
使用粒径分析仪(Malvern FPIA-3000Sysmex)分析样品的数目及尺寸分布。最优选使用
Figure BDA0004247567200000301
活化含水或非水样品，用盐水稀释经活化产物的一部分，且随后转移到Sysmex的样品容器。Sysmex使用适合的外鞘溶液且使用低功率场及高功率场两者分析样品以产生指定尺寸范围(在目前研究中1到80μm)的尺寸测定数据。
1.7.4活化产物的超声波造影：
使用Philips Sonos 5500临床超声波成像系统测量所选择样品的声衰减。在用
Figure BDA0004247567200000302
最优选活化之后，将10微升样品在室温下吸取加入到含有200ml 0.9％盐水的250mL烧杯内。圆形带叶片的38mm直径搅拌棒保持溶液均一性且充当声反射器。超声波系统的s3临床换能器位于烧杯的顶部，恰好进入溶液中且在搅拌棒上缘的上方4.8cm处。随后在引入样品之后的10秒时开始，数字采集五秒的120Hz图像且写入磁盘。美国系统以IBS模式使用，对于所有深度TGC固定于最小值下，且禁用LGC。机械指数(MI)为0.2以及功率设定最大值以下18dB。接收增益固定为90且压缩固定为0。对于经测试的各样品，在样品注入之前(空白组)及之后获取美国数据采集。
使用Philips QLab 2.0版进行图像分析，其读取由美国系统产生的文件且以dB为单位计算IBS模式的数值。所关注区域在搅拌棒上绘出且将dB值导出到Excel。随后在完整5秒(大致360视频图框)采集内对这些值进行平均。通过从平均空白组ROI值减去平均样品ROI值(两者均以dB为单位)获得衰减测量值。将所述测量值除以美国换能器与搅拌棒上缘之间距离的两倍以得到以dB/cm为单位的衰减。数值随后除以所计算的烧杯内微泡浓度且根据每百万微泡/毫升的每厘米dB衰减来表示。
实例1：将钙添加到非水磷脂溶液中的影响
这个实例表明钙及镁离子对于磷脂沉淀的影响。
实例1.1：对于将钙及镁添加到非水溶液中的影响的初始研究
在初始研究中，将表征为具有较低二价金属离子浓度的脂质掺合物(LB，批次1)(实例方法中的表1)在55℃±5℃下添加到丙二醇中且搅拌。通过目测验证磷脂已完全溶解且所得溶液为澄清的。用钙(25.4μg Ca+2/g)、镁(28.0μg Mg+2/g)或组合(1:1以制造含有14.0μg Ca+2/g及12.7μg Mg+2/g的溶液)滴定所述LB溶液且分别在3.60μg Ca+2/g、4.23μgMg+2/g及2.35μg/g组合金属离子/g非水磷脂溶液下展示混浊。
实例1.2：对于将钙添加到非水溶液中的影响之后续研究
实验如下进行：将表征为具有较低二价金属离子浓度的DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(实例方法中的表1)单独地(以表2中所展示的顺序)添加或作为混合物或掺合物添加到经加热(55℃±5℃)及经搅拌的丙二醇(PG)中或丙二醇与甘油的1:1混合物(PG/G)中。通过目测验证磷脂已完全溶解且所得溶液为澄清的(＝0：等级标度参见实例方法章节1.4.2，图1)。图2说明当连续添加DPPC、MPEG5000-DPPE、DPPA及乙酸钙原料(添加1mL每毫升299μg Ca+2的原料以产生具有每克溶液11.1μg Ca+2的脂质浓缩物)时脂质浓缩物在丙二醇中的外观。脂质浓缩物并未变混浊，直到添加钙。
通过一系列少量添加的钙滴定PG或1:1混合物PG/G中的磷脂溶液。每次添加之后，评定溶液的澄清度(等级标度参见实例方法章节1.4.2，图1)，且在表2中展示产生+、++及+++评分的最低钙浓度。图3展示用于研究4滴定的代表性溶液。
表2.将钙添加到非水磷脂溶液中的影响
Figure BDA0004247567200000321
a定义于方法章节1.4中
b用乙酸钙储备溶液(299μg Ca+2/g储备溶液)滴定
c通过将单独的磷脂添加到丙二醇(25mL)中来实现DPPA(0.9mg/ml)、DPPC(8.02mg/ml)及MPEG5000-DPPE(6.08mg/ml)最终浓度
d磷脂掺合物(15mg/ml)，在55℃下利用甲醇溶解磷脂随后干燥，溶解于25mL丙二醇中来制造
e磷脂混合物：DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE(0.045:0.401:0.304)，粉末经搅拌在一起且用于在25mL丙二醇中混配。最终浓度为15mg/mLf通过将单独的磷脂[DPPA(0.9mg/mL)、DPPC(8.02mg/mL)及MPEG5000-DPPE(6.08
mg/mL)]添加到25mL，1:1(v/v)丙二醇:甘油中来制造磷脂溶液
g通过将单独的磷脂[DPPA(0.225mg/mL)、DPPC(2.00mg/mL)及MPEG5000-DPPE(1.70mg/mL)]添加到100mL，1:1(v/v)丙二醇:甘油中来制造磷脂溶液
钙滴定在磷脂溶液中产生明显随浓度变化的沉淀，无论磷脂是如何添加(单独地、作为混合物或作为掺合物)到丙二醇中(参见表2)。脂质不可溶于仅甘油或25mL 1:1PG/G任一者中，但当添加到100mL 1:1PG/G(研究8)中时确实获得澄清溶液。钙在脂质溶液中产生随浓度变化的沉淀，与初始发现一致(参见表2)。总体而言，这些滴定研究指示产生沉淀的最低钙浓度、镁浓度及组合浓度为1.5μg Ca+2/g、4.23μg Mg+2/g及2.35μg组合金属离子/g非水磷脂溶液。
实例2：含有钙的磷脂溶液组分在混合时的影响
实例2.1：PG中的钙
研究9如下进行：将表征为具有较低钙浓度的DPPC、MPEG5000-DPPE及DPPA粉末(参见实例方法中的表1)单独地(以表3中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的含有11μg/g钙的PG中。评定澄清度(参见章节1.4)且在DPPC溶解之后溶液为澄清的，在添加DPPA之后变为且保持混浊，且在添加MPEG5000-DPPE之后保持混浊。观测到的混浊度评分为+++(图1，章节1.4)。这与当这些磷脂(包含DPPA)添加到含有较低钙的PG(研究1的初始溶液)中时所产生的澄清溶液相反。这进一步通过研究12来强调，其中仅含有高Ca+2水准的磷脂DPPC及MPEG5000-DPPE经溶解且所述溶液即使在钙的存在下仍保持澄清。
实例2.2：脂质掺合物中来自MPEG5000-DPPE的钙
对磷脂掺合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沉淀出磷脂掺合物来制造)进行初始实验，所述磷脂掺合物含有DPPC、DPPA及分别含有较低(未检测到Ca+2及1μgMg+2/g，MPEG5000-DPPE)或较高(980μg Ca+2/g及150μg Mg+2/g，MPEG5000-DPPE批次1)钙及镁的MPEG5000-DPPE，将其添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的丙二醇中。混合两种脂质掺合物以提供大致为0、1.75、4.11及12.9μg组合Ca+2及Mg+2/g非水磷脂溶液的样品。1.75μg组合Ca+2及Mg+2/g非水磷脂溶液展示混浊。
后续研究10及11如下进行：将含有DPPC、DPPA及含有较高(980ppm Ca+2，150ppm Mg+2，批次1)或较低(4ppm Ca+2)钙的MPEG5000-DPPE的磷脂掺合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沉淀出磷脂掺合物来制造)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的PG中。评定澄清度(参见章节1.4)且在含有较高钙(测量为370ppm Ca+2及54ppm Mg+2)的磷脂掺合物的情况下观测到轻微混浊(+；参见章节1.4中的实例方法)。这与通过溶解含有较低钙(不可检测水准的Ca+2及Mg+2)的磷脂掺合物(参见表3)所产生的澄清溶液相反。
表3.含有钙的磷脂溶液组分在混合时的影响
Figure BDA0004247567200000331
a定义于方法章节1.4中
b通过将单独的磷脂添加到丙二醇(25mL)中来实现DPPA(0.9mg/mL)、DPPC(8.02mg/mL)及MPEG5000-DPPE(6.08mg/mL)最终浓度
c当DPPC溶解时溶液为澄清的，在添加MPEG5000-DPPE之后保持澄清在添加DPPA之后变混浊
d DPPC(8.02mg/mL)及含有Ca+2的MPEG5000-DPPE(6.08mg/mL；980ppm Ca+2及150ppm
Mg+2)；通过将单独的磷脂添加到丙二醇(25mL)中来实现最终浓度，不添加DPPA e当添加DPPC及MPEG5000-DPPE时溶液为澄清的f使用甲苯及甲醇以溶解磷脂且添加MTBE以沉淀出磷脂掺合物，溶解于中25mL丙二醇中，来制造磷脂掺合物(15mg/mL)
实例2.3：来自单独地添加的MPEG5000-DPPE的钙
研究13到17如下进行：将表征为具有较低钙浓度的DPPA及DPPC(参见实例方法中的表1)单独地(以表4中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的PG中。添加含有不同的比例的“较低”及“较高”钙及镁物质的MPEG5000-DPPE。评定澄清度(参见章节1.4，图1中的实例方法)且观测到随钙及镁浓度变化的沉淀(参见表4及图4)。
表4.来自作为单独的组分添加的MPEG5000-DPPE的钙及镁
Figure BDA0004247567200000341
a定义于方法章节1.4中
b通过将单独的磷脂添加到丙二醇(25mL)中来实现DPPA(0.9mg/mL)、DPPC(8.02mg/mL)及MPEG5000-DPPE(6.08mg/mL)最终浓度
c MPEG5000-DPPE的百分比；相对于总计的较低Ca+2[4ppm]及较高Ca+2[520ppm Ca+2，110
ppm Mg+2]
d n/p＝未进行；磷脂[DPPC(8.02mg/mL)及DPPA(0.9mg/mL)]未溶解于丙烯及二醇溶剂系统
e丙二醇及甘油50:50(v/v)
实例2的概述
这些研究总体上表明在非水溶剂中或经由磷脂掺合物或以作为个别化合物的MPEG5000-DPPE添加时，钙的添加均引起沉淀。对于实例2有影响的浓度与实例1中的那些浓度相比是类似的。产生混浊(+)的最低钙浓度为0.7μg/g Ca+2(0.8μg/g总Ca+2及Mg+2)。其类似于实例1中所发现的1.5到2.6μg/g的浓度。
实例3：将非水磷脂溶液添加到含水溶剂中
实例3.1：非水磷脂溶液中的钙对向含水溶剂中添加的影响
进行一系列研究以检查在转移到含水调配物中之前非水磷脂溶液中的钙的影响。这些研究涉及以下步骤：1)制备非水磷脂溶液，2)制备含水溶液及3)组合来自1及2的溶液。
实例3.1.1：制备非水溶液：在磷脂溶解之后将钙添加到非水溶液中
与实例2一致，研究19、20及22中的第一步骤如下：将表征为具有低钙浓度的DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(参见实例方法中的表1)个别地(以表5中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃，除研究22之外，其为加热到70℃)且经搅拌的丙二醇中。通过目测证实磷脂已完全溶解且所得溶液为澄清的(参见章节1.4中的实例方法，图1)。如表5中所指示添加乙酸钙[Ca(OAc)2]于丙二醇中的溶液，所述溶液经搅拌且观测外观中的变化，与溶剂空白组相比较且记录澄清度的评定。当添加乙酸钙时，溶液变混浊。这些丙二醇浓缩物如下文所描述转移到水相。
实例3.1.2制备非水溶液：MPEG5000-DPPE中的钙
研究21及25中的第一步骤如下：将DPPC、DPPA(未包含于研究25中)及含有钙的MPEG5000-DPPE粉末(980ppm，MPEG5000-DPPE批次1；参见实例方法中的表1)个别地(以表5中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的PG中。评定澄清度且在研究21中添加DPPA之后观测到显著混浊(+++；参见章节1.4中的实例方法，图1)，且在添加MPEG5000-DPPE之后保持混浊，而在不含有DPPA的研究25中未观测到混浊。这些非水磷脂溶液如下文所描述转移到水相。
实例3.1.3：制备非水溶液：脂质掺合物中来自MPEG5000-DPPE的钙
与实例2一致，研究23及24中的第一步骤如下进行：将含有DPPC、DPPA及分别含有较低(4ppm批次2)或较高(980ppm，MPEG5000-DPPE批次1)钙的MPEG5000-DPPE的磷脂掺合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沉淀出磷脂掺合物来制造)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的丙二醇中。评定澄清度且在含有较高钙的磷脂掺合物的情况下观测到显著混浊(+++；参见章节1.4，图1中的实例方法)。这与通过溶解含有较低钙的磷脂掺合物(参见表5)所产生的澄清溶液相反。这些非水磷脂溶液如下文所描述转移到水相。
实例3.1.4：制备非水溶液：添加磷脂之前PG中的钙
与实例2一致，研究28及30中的第一步骤如下进行：将表征为具有较低钙浓度的DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(参见实例方法中的表1)单独地(以表5中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的PG中，PG分别含有11μg/g钙或含有添加磷脂之后所添加的钙。评定澄清度(参见章节1.4，图1中的实例方法)且在研究28中，在DPPC及MPEG5000-DPPE溶解之后溶液为澄清的，但在添加DPPA之后变为且保持混浊。在研究30中，在DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE溶解之后溶液为澄清的，且在添加Ca+2之后变混浊。两个研究的混浊度均评分为+++(参见表5)。这些非水磷脂溶液如下文所描述转移到水相。
实例3.2：制备含水溶液：
对于全部研究，含水溶液如下制备：在另一分开的容器中，将氯化钠(NaCl)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)及磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)添加到在搅拌容器中的水中，且混合直到溶解。还按需要添加丙二醇及甘油，如此最终添加的磷脂浓缩物将重新构成为8:1:1水:甘油:丙二醇组合物。所述经搅拌的溶液保持在55℃±5℃下(除其中含水溶液保持在70℃下的研究22以外)。
实例3.3：组合非水溶液及含水溶液
对于全部研究，将非水磷脂浓缩物添加到含水溶液中是如下进行的：添加丙二醇中的温热磷脂且以100到150rpm搅拌。记录目测结果且指出用于完全分散或溶解(澄清或混浊任一者)的时间。随后收集这些含水悬浮液且在55℃下在5psi排出压力下通过0.2μm过滤器过滤。测量流动速率且收集样品以用于磷脂测量(程序参见实例方法)。分析过滤前及过滤后样品以确定与过滤有关的磷脂损失水准。
表5.非水磷脂溶液中的二价金属离子对向含水溶剂中添加的影响
Figure BDA0004247567200000361
Figure BDA0004247567200000371
a通过在55℃下以所列顺序将DPPC(C)、MPEG5000-DPPE(E)及DPPA(A)以0.401:0.304:0.045的比率溶解在丙二醇中来制备15mg/mL的磷脂浓缩物。
b将磷脂浓缩物添加到混配容器中，所述混配容器含有：在每毫升混配溶液中，水(800mg)；七水合磷酸氢二钠(2.16mg)；单水合磷酸二氢钠(2.34mg)；氯化钠(4.84mg)、甘油(126mg)及丙二醇(51.75mg)。物质在55℃下以所列顺序组合。
c定义于方法章节1.4.2中
d具有CAD检测的HPLC描述于章节1.6中
e在添加脂质之后，在转移到含水混配溶液中之前，1mL、2mL及2mL(分别为研究20、
22及30)每g PG 299μg Ca+2的原料
f含有Ca+2(6.08mg/mL；520及110ppm Ca+2及Mg+2)的MPEG5000-DPPE用于实验g全部混配均在70℃下进行
h含有Ca+2(6.08mg/mL；980及150ppm Ca+2及Mg+2)的MPEG5000-DPPE用于实验i使用甲苯及甲醇以溶解脂质且添加MTBE以沉淀出脂质掺合物来制造。将所得脂质掺合物添加到25mL丙二醇(15mg/mL)中。研究23使用低Ca+2脂质掺合物且研究24使用含有Ca+2及Mg+2(分别为370及54μg/g)的脂质掺合物。
k在添加脂质之前，添加1mL每g PG 299μg Ca+2的原料
与前述实例一致，这些研究展示当存在较高的钙或钙及镁时，非水磷脂溶液中出现沉淀。无论钙是在添加磷脂之前存在于丙二醇中、在添加磷脂之后添加还是与磷脂组分中的一种一起(与MPEG5000-DPPE一起或在磷脂掺合物中)添加，均出现所述沉淀。一旦沉淀形成，在与含水溶剂混合时其不分散。这产生混浊含水制剂，所述含水制剂具有减小的初始过滤速率且经常阻塞0.2μm过滤器(表5；图5)。混浊含水制剂的滤过物为澄清的，但磷脂测量指示DPPA水准始终降低。这影响对于单独地添加的磷脂及以掺合物形式添加的磷脂两者均为明显的。
实例3.4：将非水磷脂溶液添加到含有钙的含水溶剂中的影响
进行一系列研究以检查溶液含水中的钙对于磷脂悬浮液制备的影响。这些研究涉及以下步骤：1)制备非水磷脂溶液，2)制备含水溶液及3)组合来自1及2的溶液。
实例3.4.1：制备非水溶液
与实例1一致，研究26、27及29中的第一步骤如下进行：将表征为具有较低钙浓度的DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(参见实例方法中的表1)单独地(以表6中所展示的顺序)添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的丙二醇中。通过目测验证磷脂完全溶解且所得溶液为澄清的。这些丙二醇浓缩物如下文所描述转移到水相。
实例3.4.2：制备含水溶液
在另一分开的容器中，将氯化钠(NaCl)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)及磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)添加到在搅拌容器中的水中，且混合直到溶解(对于研究29，调配物不包含磷酸盐)。还按需要添加丙二醇及甘油，如此最终添加的非水磷脂溶液将重新构成为8:1:1水:甘油:丙二醇组合物。在一些研究中，如表6中所指示添加乙酸钙[Ca(OAc)2]水溶液。所述含水溶液经搅拌，保持在55℃±5℃下。鉴别出在无任何磷脂存在下添加48.4μg/g钙引起含水溶液中显著的絮凝(参见表6，研究A)。在12.2μg/g钙下，含水溶液中无沉淀产生(参见表6，研究B)。
实例3.4.3：组合非水溶液及含水溶液
对于全部研究，将非水磷脂浓缩物添加到含水溶液中是如下进行的：添加溶解于丙二醇中的温热磷脂且以100到150rpm搅拌。记录目测结果且指出用于完全分散或溶解稳定(澄清或混浊任一者)的时间。对于研究27，含水调配物初始为澄清的。钙经滴定且在≥30.4μg/g的浓度下形成混浊沉淀(参见表6)。然而，注意到在48.4μg/g下，不含磷脂的含水溶液已显著沉淀(研究A；表6)。在研究27中，在仅未影响含水溶液的钙水准下(基于研究B，表6，12.2μg/g)，未发现对于含水磷脂调配物澄清度的影响。这在研究26中得到确认，其中在与非水磷脂浓缩物组合之前，将钙添加到含水溶液中(12.2μg/g)。这进一步在研究29中扩展，其中含水溶液不包含磷酸盐缓冲液。初始地，在与非水磷脂浓缩物组合之前将钙添加到含水溶液中(12.2μg/g)且调配物为澄清的。在添加磷脂之后将额外的钙添加到所述调配物中直到96μg/g且未观测到沉淀。
随后收集来自研究26及29的含水调配物且在55℃下在5psi排出压力下通过0.2μm过滤器过滤。在10分钟处的流动速率与初始流动相比未减小；全部样品经过滤且总体上过滤类似于不含钙的制剂(参见研究19、23及25)。收集过滤前及过滤后样品且相比较以确定与过滤有关的磷脂损失。没有明显的显著磷脂损失(参见表6)。
表6.将非水磷脂溶液添加到含有二价金属离子的含水溶剂中的影响
Figure BDA0004247567200000381
Figure BDA0004247567200000391
a全部混配均在55℃下进行。将非水磷脂溶液添加到含水混配容器中，除非在脚注中另外指示，否则所述混配容器含有：水(800mg)；七水合磷酸钠(2.16mg/mL)、单水合磷酸钠(2.34
mg/mL)、氯化钠(4.84mg/mL)、甘油(126mg)及丙二醇(51.75mg)。
b“A”为DPPA(0.9mg/mL)，“C”为DPPC(8.02mg/mL)且“E”为MPEG5000-DPPE(6.08
mg/mL)，将其以所列顺序添加到25mL丙二醇中
c定义于方法章节1.4中
d具有CAD检测的HPLC描述于章节1.6中
e在将脂质浓缩物添加到含水混配容器中之前，对于研究26、29、A及B分别添加1mL、1mL、4mL及1mL乙酸钙浓缩物(每g水6.085mg Ca+2)。
这些研究表明，即使在高达96μg/g时，钙仍不引起磷脂在含水调配物中沉淀。然而，在高于12.2μg/g的钙水准下，磷酸盐开始沉淀。
实例4：二价金属离子对于磷脂溶解于缓冲丙二醇中且伴随添加甘油的影响
实例4.1：缓冲非水磷脂浓缩物中的钙滴定
研究31及32如下进行：将表征为具有较低钙浓度的DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(参见实例方法中的表1)单独地(以表7中所展示的顺序)添加或以磷脂掺合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沉淀出脂质掺合物来制造)形式添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的乙酸缓冲的丙二醇。通过目测验证脂质已完全溶解且所得溶液为澄清的(参见章节1.4中的实例方法)。乙酸钙[Ca(OAc)2]于丙二醇中的溶液用以通过一系列少量添加来滴定磷脂溶液。溶液经搅拌且如在每次添加之后与空白组溶剂相比较，观测在滴定期间外观中的变化，且记录对澄清度的评定。得到基于所述评定的混浊度评分(方法参见章节1.4，图1)且在表7中展示产生+、++及+++评分的最低钙浓度。
表7.钙对于磷脂溶解于缓冲丙二醇中的影响
Figure BDA0004247567200000401
a将单独的脂质[DPPC(4.01mg)、DPPA(0.45mg)及MPEG5000-DPPE(3.04mg)，以所列顺序]或脂质掺合物(7.5mg)在60℃下伴随搅拌添加到每毫升含有乙酸钠(0.74mg)及乙酸(0.06mg)的丙二醇中。
b定义于方法章节1.4中
c使用甲苯及甲醇以溶解脂质且添加MTBE以沉淀出脂质掺合物来制造。
实例4.2：缓冲非水磷脂浓缩物中来自MPEG5000-DPPE的钙滴定
研究33到36如下进行：将DPPC、DPPA及含有较高(980ppm，批次1)或较低Ca+2(4ppm)的MPEG5000-DPPE单独地(以表8中所展示的顺序)添加或以磷脂掺合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沉淀出脂质掺合物来制造)形式添加到经加热(55℃±5℃)且经搅拌的乙酸缓冲的丙二醇。评定澄清度(参见实例方法章节1.4)且对于含有较高钙的磷脂掺合物观测到混浊(+或++；参见实例方法，图1)。这与通过溶解含有较低钙的磷脂掺合物(参见表8)所产生的澄清溶液相反。
实例4.3：添加甘油
在以300rpm搅拌下将甘油转移到这些缓冲非水磷脂溶液中。许多气泡滞留在混合溶液中但一旦搅拌棒停止则得到清除。记录目测结果且标注澄清度水准(澄清或混浊任一者)。随后收集这些PG/G溶液且在60℃下在10psi排出压力下通过0.2μm过滤器过滤。测量流动速率且收集用于磷脂测量的样品。比较过滤前及过滤后样品以确定与过滤有关的磷脂损失。
表8.钙对于磷脂溶解于缓冲丙二醇及添加甘油的影响
Figure BDA0004247567200000402
Figure BDA0004247567200000411
a将单独的脂质[DPPC(4.01mg)、DPPA(0.45mg)及MPEG5000-DPPE(3.04mg)，以所列顺序]或脂质掺合物(7.5mg)在60℃下伴随搅拌添加到每毫升含有乙酸钠(0.74mg)及乙酸(0.06mg)的丙二醇中。
b用甘油1:1(v/v)稀释含有乙酸盐缓冲液及磷脂的丙二醇。
c定义于方法章节1.4中
d具有CAD检测的HPLC描述于章节1.6中
e使用甲苯及甲醇以溶解及添加MTBE以沉淀出脂质掺合物来制造脂质掺合物，较低Ca+2
(批次1)用于研究33且较高Ca+2(370Ca+2及54ppm Mg+2；批次2)用于研究34。
f含有Ca+2(3.04mg/mL；980及150ppm Ca+2及Mg+2；批次1)的MPEG5000-DPPE用于所述实验
这些研究展示沉淀以随钙浓度变化的方式出现于缓冲非水磷脂溶液中。无论所述缓冲非水磷脂溶液是用单独的磷脂制造还是用脂质掺合物制造且处于并非显著不同的浓度，均出现所述沉淀。对于缓冲溶液引起初始沉淀的浓度(5.8到11.3μg/g Ca+2)高于非缓冲溶液(1.5-2.3μg Ca+2/g：参见表2，研究1到4)，指示缓冲液的影响，
如在非缓冲溶液中所发现的，来自脂质掺合物的钙在缓冲非水磷脂溶液中引起沉淀。一旦沉淀形成，在与甘油混合时其不分散。这产生混浊非水调配物，所述非水调配物具有减小的初始过滤速率且经常阻塞0.2μm过滤器(表8；图6)。混浊制剂的滤过物为澄清的，但磷脂测量指示DPPA水准略微降低。
实例5：微球体形成及制品的声检测
实例5.1：含水磷脂悬浮液
研究37及38如下进行：在小瓶中制备来自研究19及23的经过滤物质(参见实例方法章节1.7.1)。在
Figure BDA0004247567200000413
之后，分析活化样品的微球体尺寸及数目(参见方法章节1.7.3)及临床超声波声属性(参见方法章节1.7.4)，参见表9。
表9.含水磷脂悬浮液微球体数目及尺寸及声活动性。
Figure BDA0004247567200000412
a对于1到80微米范围内微球体的平均微球体直径。
b对于1到80微米范围内微球体的平均微球体浓度。
C详情参见实例方法章节
这些研究表明当组分具有较低钙浓度时，可使用单独的磷脂或磷脂掺合物来产生含水磷脂悬浮液。两种产物均具有在
Figure BDA0004247567200000421
的说明书(参见
Figure BDA0004247567200000422
药品说明书)内的微球体直径，且对于临床超声波机器具有较强超声波声衰减。
方面及实施例
下文列举本发明所提供的各种方面及实施例。
条项1.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，
测量所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中的一或多者的钙浓度，
将所述DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项2.如条项1的方法，其进一步包括测量所述非水溶剂的钙浓度。
条项3.如条项1的方法，其中所述DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料的合并钙浓度测量值为较低的。
条项4.如条项1或3的方法，其中所述DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料及所述非水溶剂的合并钙浓度测量值为较低的。
条项5.如条项1的方法，其中测量所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料的钙浓度。
条项6.如条项2的方法，其中测量所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料的钙浓度且所述DPPA、DPPC、MPEG-DPPE原料及所述非水溶剂的合并钙浓度测量值为较低的。
条项7.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，
测量所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中的一或多者的钙浓度，
将具有较低合并钙浓度测量值的DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项8.如条项7的方法，其中测量所述非水溶剂的钙浓度且所述DPPA、DPPC、MPEG500-DPPE原料及所述非水溶剂具有较低合并钙浓度测量值。
条项9.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
将各自具有钙浓度表征值的MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，其中所述MPEG5000-DPPE原料、所述DPPA原料、所述DPPC原料及所述非水溶剂的合并钙浓度表征值为较低钙浓度，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项10.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
选择MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中的一者、两者或全部三者具有钙浓度表征值，其中合并钙浓度表征值为较低钙浓度，
将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项11.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
选择各自具有钙浓度表征值的MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中合并钙浓度表征值为较低钙浓度，
将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项12.如条项11的方法，其中所述非水溶剂具有钙浓度表征值，且所述MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料及所述非水溶剂的合并钙浓度表征值为较低的。
条项13.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
测量MPEG5000-DPPE原料的钙浓度，
将具有较低钙浓度测量值的MPEG5000-DPPE原料与DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项14.如条项11的方法，其中所述非水溶剂包括(i)丙二醇或(ii)丙二醇及甘油。
条项15.如条项13或14的方法，其中所述非水溶剂包括缓冲液。
条项16.如条项13或14的方法，其中所述非水溶剂包括乙酸盐缓冲液。
条项17.如条项13或14的方法，其中所述含水溶剂包括缓冲液。
条项18.如条项13或14的方法，其中所述含水溶剂包括磷酸盐缓冲液。
条项19.如条项13到18中任一项的方法，其中所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料单独地与所述非水溶剂组合以形成所述磷脂溶液。
条项20.如条项13到18中任一项的方法，其中将所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料以无关顺序的方式连续地与所述非水溶剂组合，以形成所述磷脂溶液。
条项21.如条项13到18中任一项的方法，其中所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此组合以形成磷脂混合物，且所述磷脂混合物随后与所述非水溶剂组合以形成所述磷脂溶液。
条项22.如条项13到18中任一项的方法，其中所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此组合以形成磷脂掺合物，且所述磷脂掺合物随后与所述非水溶剂组合以形成所述磷脂溶液。
条项23.如条项22的方法，其中使用有机溶剂溶解沉淀法形成所述磷脂掺合物，所述方法包括将所述DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解于甲醇及甲苯的混合物中，任选地浓缩所述磷脂/甲醇/甲苯混合物，且随后使所述经浓缩的磷脂/甲醇/甲苯混合物与甲基叔丁基醚(MTBE)接触以使所述磷脂沉淀，以形成所述磷脂掺合物。
条项24.如条项13到23中任一项的方法，其中所述较低钙浓度为小于115ppm。
条项25.如条项13到24中任一项的方法，其进一步包括将所述磷脂悬浮液放置在小瓶中，且将全氟化碳气体导入到所述小瓶的顶部空间内。
条项26.如条项25的方法，其进一步包括用所述全氟化碳气体活化所述磷脂悬浮液以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂。
条项27.如条项26的方法，其进一步包括将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波图像。
条项28.如条项13到27中任一项的方法，其进一步包括测量所述DPPA原料及/或DPPC原料及/或磷脂混合物及/或磷脂掺合物的钙浓度。
条项29.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
测量DPPC原料的钙浓度，
将具有较低钙浓度测量值的DPPC原料与DPPA原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项30.如条项29的方法，其中所述较低钙浓度为小于90ppm。
条项31.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
测量DPPA原料的钙浓度，
将具有较低钙浓度测量值的DPPA原料与DPPC原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项32.如条项31的方法，其中所述较低钙浓度为小于780ppm。
条项33.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
测量非水溶剂的钙浓度，
将具有较低钙浓度测量值的非水溶剂与DPPA原料、DPPC原料及MPEG5000-DPPE原料组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项34.如条项33的方法，其中所述较低钙浓度为小于0.7ppm。
条项35.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
选择表征为不具有钙或具有较低钙浓度的MPEG5000-DPPE原料，
将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项36.如条项35的方法，其中所述MPEG5000-DPPE原料进一步表征为不具有二价金属阳离子或具有较低二价金属阳离子含量。
条项37.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
将MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成表征为不具有钙或具有较低钙浓度的磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项38.一种用于使个体成像的方法，其包括
将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，
将所述超声波造影剂投与到个体，及
获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中通过如条项1到37中任一项的方法来制备所述磷脂悬浮液。
条项39.一种用于使个体成像的方法，其包括
将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，
将所述超声波造影剂投与到个体，及
获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中通过包括以下的方法来制备所述磷脂悬浮液：
测量MPEG5000-DPPE原料的钙浓度，
将具有较低钙浓度测量值的MPEG5000-DPPE原料与DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成所述磷脂悬浮液。
条项40.一种用于使个体成像的方法，其包括
将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，
将所述超声波造影剂投与到个体，及
获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中通过包括以下的方法来制备所述磷脂悬浮液：
选择表征为不具有钙或具有较低钙浓度的MPEG5000-DPPE原料，
将所述MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项41.一种用于使个体成像的方法，其包括
将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，
将所述超声波造影剂投与到个体，及
获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中通过包括以下的方法来制备所述磷脂悬浮液：
将MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶剂组合以形成表征为不具有钙或具有较低钙浓度的磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项42.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
在低钙或无钙条件下，单独地将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与包括丙二醇(PG)的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项43.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
在低钙或无钙条件下，以无关顺序的方式，连续地将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项44.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
在不含甲醇及甲苯的条件下，将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料组合以形成磷脂掺合物，
在低钙或无钙条件下，将所述磷脂掺合物与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项45.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与掺合溶剂组合以形成磷脂掺合物，
使所述掺合溶剂蒸发以形成经干燥的磷脂掺合物，
在低钙或无钙条件下，将所述经干燥的磷脂掺合物与包括PG的非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项46.一种用于制备磷脂悬浮液的方法，其包括
将DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料与掺合溶剂组合以形成磷脂掺合物，
在不含MTBE的条件下使用第二掺合溶剂使所述磷脂掺合物沉淀，
在低钙或无钙条件下，将经沉淀的磷脂掺合物与非水溶剂组合以形成磷脂溶液，及
将所述磷脂溶液与含水溶剂组合以形成磷脂悬浮液。
条项47.如条项42到46中任一项的方法，其中所述无钙或较低钙浓度为小于0.7ppm。
条项48.如条项42到47中任一项的方法，其进一步包括将所述磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂。
条项49.如条项48的方法，其进一步包括将所述超声波造影剂投与到个体，及获得所述个体的一或多个造影增强型超声波图像。
条项50.一种用于使个体成像的方法，其包括
将磷脂悬浮液与全氟化碳气体组合以形成包括经磷脂囊封的气体微球体的超声波造影剂，
将所述超声波造影剂投与到个体，及
获得所述个体的一或多个造影增强型超声波造影图像，其中通过如条项42到47中任一项的方法来制备所述磷脂悬浮液。
条项51.一种组合物，其包括
包括非水溶剂中的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE且具有较低钙浓度的磷脂溶液。
条项52.一种组合物，其包括
包括非水溶剂中的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE的磷脂溶液，其中所述DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及所述非水溶剂具有较低的合并钙离子含量表征值。
条项53.如条项51或52的组合物，其中所述非水溶剂包括丙二醇。
条项54.如条项51或52的组合物，其中所述非水溶剂包括丙二醇及甘油。
条项55.条项51到54中任一项的组合物，其中所述非水溶剂包括缓冲液。
条项56.如条项55的组合物，其中所述缓冲液为乙酸盐缓冲液。
条项57.如条项51到56中任一项的组合物，其进一步包括全氟化碳气体。
条项58.如条项57的组合物，其中所述全氟化碳气体为全氟丙烷。
条项59.一种使个体超声波造影成像的方法，其包括
(a)用全氟化碳气体活化磷脂悬浮液以形成经脂质囊封的气体微球体，其中所述磷脂悬浮液包括具有一或多种磷脂及非水溶剂的磷脂溶液，其中的一或多者具有较低钙浓度表征值，
(b)将所述经脂质囊封的气体微球体投与到个体，及
(c)获得所述个体的超声波图像。
条项60.如条项59的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项61.如条项59的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项62.如条项61的方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE以10比82比8(10:82:8)的摩尔％比率存在。
条项63.如条项60到62中任一项的方法，其中对于DPPA，较低钙浓度表征值为小于780ppm，对于DPPC为小于90ppm，且对于MPEG5000-DPPE为小于115ppm。
条项64.如条项59到63中任一项的方法，其中所述非水溶剂包括(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
条项65.如条项59到64中任一项的方法，其中对于所述非水溶剂，较低钙浓度表征值为小于0.7ppm。
条项66.如条项59到65中任一项的方法，其中所述磷脂溶液不具有可检测的磷脂沉淀。
条项67.一种使个体超声波造影成像的方法，其包括
(a)用全氟化碳气体活化磷脂悬浮液以形成经脂质囊封的气体微球体，其中所述磷脂悬浮液包括具有一或多种磷脂及非水溶剂且在不含甲醇及甲苯的条件及不含甲基叔丁基醚的条件下制造的磷脂溶液，其中所述磷脂中的一或多者及非水溶剂具有较低钙浓度，
(b)将所述经脂质囊封的气体微球体投与到个体，及
(c)获得所述个体的超声波图像。
条项68.如条项67的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项69.如条项67的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项70.如条项69的方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE以10比82比8(10:82:8)的摩尔％比率存在。
条项71.如条项67到70中任一项的方法，其中对于DPPA，较低钙浓度为小于780ppm，对于DPPC为小于90ppm，且对于MPEG5000-DPPE为小于115ppm。
条项72.如条项67到71中任一项的方法，其中所述非水溶剂包括(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
条项73.如条项67到72中任一项的方法，其中对于所述非水溶剂，较低钙浓度为小于0.7ppm。
条项74.如条项67到73中任一项的方法，其中所述磷脂溶液不具有可检测的磷脂沉淀。
条项75.一种用于制备经脂质囊封的气体微球体的方法，其包括
将一或多种磷脂及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，其中所述磷脂中的一或多者及/或所述非水溶剂具有较低钙浓度表征值，
将所述磷脂溶液与含水溶液组合以形成磷脂悬浮液，及
用全氟化碳气体活化所述磷脂悬浮液以形成经脂质囊封的气体微球体。
条项76.如条项75的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项77.如条项75的方法，其中所述一或多种磷脂包括DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项78.如条项77的方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE以10比82比8(10:82:8)的摩尔％比率存在。
条项79.如条项75到78中任一项的方法，其中对于DPPA，较低钙浓度表征值为小于780ppm，对于DPPC为小于90ppm，且对于MPEG5000-DPPE为小于115ppm。
条项80.如条项75到79中任一项的方法，其中所述非水溶剂包括(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
条项81.如条项75到80中任一项的方法，其中对于所述非水溶剂，较低钙浓度表征值为小于0.7ppm。
条项82.如条项75到81中任一项的方法，其中所述磷脂溶液不具有可检测的磷脂沉淀。
条项83.一种用于制备经脂质囊封的气体微球体的方法，其包括
在不含甲醇及甲苯且不含甲基叔丁基醚的条件下，将一或多种磷脂及非水溶剂组合以形成磷脂溶液，其中所述磷脂中的一或多者及/或所述非水溶剂具有较低钙浓度，
将所述磷脂溶液与含水溶液组合以形成磷脂悬浮液，及
用全氟化碳气体活化所述磷脂悬浮液，以形成经脂质囊封的气体微球体。
条项84.如条项83的方法，其中所述一或多种脂质包括(a)DPPC及MPEG5000-DPPE，或(b)DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及/或(c)呈10比82比8(10:82:8)的摩尔％比率的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
条项85.如条项84的方法，其中对于DPPA，较低钙浓度为小于780ppm，对于DPPC为小于90ppm，且对于MPEG5000-DPPE为小于115ppm。
条项86.如条项83到85中任一项的方法，其中所述非水溶剂包括(a)丙二醇，或(b)丙二醇及甘油。
条项87.如条项83到86中任一项的方法，其中对于所述非水溶剂，较低钙浓度为小于0.7ppm。
条项88.如条项83到87中任一项的方法，其中所述磷脂溶液不具有可检测的磷脂沉淀。
条项89.如条项67到74中任一项的方法，其中所述磷脂中的一或多者或所述非水溶剂具有较低钙浓度表征值。
条项90.如条项89的方法，其中所述较低钙浓度表征值使用原子吸收光谱法来测定。
条项91.如条项67到74中任一项的方法，其中所述较低钙浓度使用原子吸收光谱法来测定。
等效物
虽然本文中已描述及说明数种创造性实施例，但一般技术者将易于设想用于执行本文所描述的功能及/或获得本文所描述的结果及/或获得本文所描述的优点中的一或多者的多种其它手段及/或结构，且将这类变化及/或修改中的每一者视为在本文所描述的创造性实施例的范围内。更一般化地，所属领域的技术人员将易于了解本文所描述的所有参数、尺寸、物质及配置打算为示范性且实际参数、尺寸、材料及/或配置将视使用创造性教示所针对的一或多个特定应用而定。所属领域的技术人员在仅使用常规实验的情况下将认识到或能够确定本文中所描述的特定创造性实施例的许多等效物。因此，应理解前述实施例仅借助于实施例呈现，且在所附权利要求书及其等效物的范围内，创造性实施例可以与特定所描述及所主张不同的方式实践。本发明的创造性实施例涉及本文所描述的每个单独的特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法。另外，如果这类特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法相互间无不一致，那么两种或多于两种这类特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法的任何组合包含于本发明的创造性范围内。
如本文所定义及使用的全部定义应理解为相对于辞典定义、以引用的方式并入的文献中的定义及/或所定义术语的普通含义起支配作用。
本文所公开的全部文献、专利及专利申请案关于各者所引用的主题以引用的方式并入，其在一些情况下可涵盖文件的全文。
除非明确相反指示，否则如本文在说明书及权利要求书中所使用的不定冠词“一(a)”及“一(an)”应理解为意指“至少一”。
如本文在说明书及权利要求书中使用的短语“及/或”应理解为意指如此结合的要素的“任一者或两者”，即，在一些情况下结合地存在且在其它情况下未结合地存在的要素。使用“及/或”列出的多个要素应以相同方式解释，即，如此结合的“一或多个”要素。可任选地存在除了通过“及/或”条项所具体鉴别的要素以外的其它要素，无论与具体鉴别的那些要素相关或不相关。由此，作为非限制性实例，提及“A及/或B”在结合例如“包括”的开放式措辞使用时，在一个实施例中，可仅指A(任选地包含除了B以外的要素)；在另一实施例中，可仅指B(任选地包含除了A以外的要素)；在又一实施例中，可指A及B两者(任选地包含其它要素)；等等。
如本文在说明书及权利要求书中所使用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“及/或”相同的含义。举例来说，当分隔列表中的项目时，“或”或“及/或”应解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一者(且还包含至少一者)及(任选地)额外未列出项目。仅明确相反指示的术语，例如“中的仅一者”或“中的恰好一者”或当用于权利要求书中时“由……组成”将指包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般来说，如本文中所使用的术语“或”当放在例如“任一者”、“中的一者”、“中的仅一者”或“中的恰好一者”等排他性术语之前时应仅解释为指示排他性替代物(即，“一个或另一个但非两者”)。当用于权利要求书中时，“基本上由……组成”应具有如在专利法律的领域中所使用的一般含义。
如本文在说明书及权利要求书中所使用，关于一或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一或多个要素的至少一个要素，但未必包含要素的列表内具体列出的每一及每个要素中的至少一者，且不排除要素列表中的要素的任何组合。所述定义还允许可任选地存在除了短语“至少一个”所指的要素的列表内具体鉴别的要素以外的要素，而无论与具体鉴别的那些要素是相关还是不相关。由此，作为非限制性实例，“A及B中的至少一者”(或等效地“A或B中的至少一者”或，等效地“A及/或B中的至少一者”)可在一个实施例中指至少一个(任选地包含超过一个)A而不存在B(且任选地包含除B以外的要素)；在另一实施例中，指至少一个(任选地包含超过一个)B而不存在A(且任选地包含除A之外的要素)；在又一实施例中，指至少一个(任选地包含超过一个)A及至少一个(任选地包含超过一个)B(且任选地包含其它要素)；等等。
还应理解除非明确相反地指示，否则在本文中所主张的包含超过一种步骤或行为的任何方法中，所述方法的步骤或行为的顺序并非必需限制于叙述所述方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书中以及在上文说明书中，例如“包括”、“包含”、“携载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由……组成”及其类似者的全部过渡性短语应理解为开放的，即，意指包含但不限于。仅过渡短语“由……组成”及“主要由……组成”应分别为封闭或半封闭过渡性短语，如美国专利局手册专利考察程序章节2111.03中所阐述。

Claims (15)

1.一种包含磷脂混合物或掺合物的组合物，所述磷脂混合物或掺合物包含一或多种磷脂，其中所述一或多种磷脂包含PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE选择为具有小于115百万分率(ppm)的二价金属离子浓度。
2.一种包含磷脂掺合物的组合物，所述磷脂掺合物包含：
(a)一或多种磷脂，和
(b)无，或甲醇、甲苯和甲基叔丁基醚MTBE的一种或两种但不是全部三种。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述一或多种磷脂包含PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE具有小于115百万分率(ppm)的二价金属离子浓度。
4.一种包含磷脂溶液的组合物，其中所述磷脂溶液
(a)包含一或多种磷脂，
(b)具有小于0.7百万分率(ppm)的二价金属离子浓度，并且
(c)包含无，或甲醇、甲苯和甲基叔丁基醚MTBE的一种或两种但不是全部三种。
5.一种包含磷脂溶液的组合物，其中所述磷脂溶液
(a)包含一或多种磷脂，其中所述磷脂中的一或多种是PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE选择为具有小于115百万分率(ppm)的二价金属离子浓度，和
(b)具有小于0.7百万分率(ppm)的二价金属离子浓度。
6.一种组合物，其包含与全氟丙烷气体接触的磷脂悬浮液，其中所述磷脂悬浮液包含
(a)盐水溶液，和
(b)磷脂溶液
(i)包含一或多种磷脂，
(ii)具有小于0.7百万分率(ppm)的二价金属离子浓度，和
(iii)包含无，或甲醇、甲苯和甲基叔丁基醚MTBE的一种或两种但不是全部三种。
7.一种组合物，其包含与全氟丙烷气体接触的磷脂悬浮液，其中所述磷脂悬浮液包含
(a)盐水溶液，和
(b)磷脂溶液
(i)包含一或多种磷脂，其中所述磷脂中的一或多种是PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE选择为具有小于115百万分率(ppm)的二价金属离子浓度，和
(ii)具有小于0.7百万分率(ppm)的二价金属离子浓度。
8.一种磷脂溶液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂溶液
(a)包含一或多种磷脂，
(b)具有小于0.7ppm的二价金属离子浓度，和
(c)包含无，或甲醇、甲苯和甲基叔丁基醚MTBE的一种或两种但不是全部三种。
9.一种磷脂溶液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂溶液
(a)包含一或多种磷脂，其中所述磷脂中的一或多种是PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE选择为具有小于115ppm的二价金属离子浓度，和
(b)具有小于0.7百万分率(ppm)的二价金属离子浓度。
10.一种磷脂溶液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂溶液
(a)具有小于0.7ppm的二价金属离子浓度，和
(b)由一方法产生，所述方法包含选择具有小于115ppm的二价金属离子浓度的PEG5000-DPPE以及将所述PEG5000-DPPE与一或多种磷脂结合。
11.一种磷脂悬浮液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂悬浮液包括
(a)盐水溶液，和
(b)磷脂溶液，其
(i)包含一或多种磷脂，
(ii)具有小于0.7ppm的二价金属离子浓度，和
(iii)包含无，或甲醇、甲苯和甲基叔丁基醚MTBE的一种或两种但不是全部三种。
12.一种磷脂悬浮液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂悬浮液包括
(a)盐水溶液，和
(b)磷脂溶液，其
(i)包含一或多种磷脂，其中所述磷脂中的一或多种是PEG5000-DPPE，所述PEG5000-DPPE选择为具有小于115ppm的二价金属离子浓度，和
(ii)具有小于0.7ppm的二价金属离子浓度。
13.一种磷脂悬浮液在制备药物中的用途，所述药物用于形成用在超声诊断成像和/或疗法中的试剂，其中所述磷脂悬浮液包括
(a)盐水溶液，和
(b)磷脂溶液
(i)具有小于0.7ppm的二价金属离子浓度，和
(ii)由一方法产生，所述方法包含选择具有小于115ppm的二价金属离子浓度的PEG5000-DPPE以及将所述PEG5000-DPPE与一或多种磷脂结合。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的用途，其中所述磷脂悬浮液与全氟化碳气体接触。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述全氟化碳气体是全氟丙烷气体。
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