TW201815424A - 用於製備超音波顯影劑之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於製備包括磷脂UCA調配物之磷脂調配物的改良方法。

Description

用於製備超音波顯影劑之方法
在超音波成像應用中，經脂質囊封之氣體微球體用作顯影劑。
本發明提供用於製備基於磷脂之超音波顯影劑的改良方法。本發明部分地基於以下意外的發現：某些基於磷脂之超音波顯影劑調配物對二價金屬陽離子敏感。在特定水準之某些彼等陽離子之存在下，調配物中之磷脂及潛在其他組分沈澱，使得該調配物不可用。迄今為止，並未瞭解到某些二價金屬陽離子能夠如此不利地影響超音波顯影劑調配物。 基於此等發現，本發明涵蓋用於合成防止此種不需要的磷脂沈澱之此類調配物的改良方法以及由此類方法所產生之調配物。亦提供用於在合成經改良超音波顯影劑中使用此等經改良調配物之方法，及該等顯影劑在使對其有需要之個體成像中的用途。 由此，在一個態樣中，本文提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，測量DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者或全部之鈣濃度，將DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，該方法進一步包含量測非水溶劑之鈣濃度。在一些實施例中，DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料之合併鈣濃度量測值為較低的(亦即，對於所量測之原料，無論此類所量測之原料為僅DPPA、僅DPPC、僅MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE、DPPC及MPEG5000-DPPE，或為DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，鈣濃度之總和或合併鈣濃度為較低的)。 在一些實施例中，DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料與非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的(亦即，對於所量測之組分，無論此類所量測之組分為僅DPPA或為DPPA及非水溶劑；僅DPPC或DPPA及非水溶劑；僅MPEG5000-DPPE或MPEG5000-DPPE及非水溶劑；DPPA及DPPC或DPPA、DPPC及非水溶劑；DPPA及MPEG5000-DPPE或DPPA、MPEG5000-DPPE及非水溶劑；DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶劑；DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPA、DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶劑，鈣濃度之總和或合併鈣濃度為較低的)。 在一些實施例中，量測DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度。 在一些實施例中，量測DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度且DPPA、DPPC、MPEG-DPPE原料及非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的。 由此，視實施例而定，僅量測DPPA之鈣濃度，或僅量測DPPC之鈣濃度，或僅量測MPEG5000-DPPE之鈣濃度，或僅量測DPPA及DPPC之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPA及MPEG5000-DPPE之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPC及MPEG5000-DPPE之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPA及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPC及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測MPEG5000-DPPE及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPA、DPPC及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPA、MPEG5000-DPPE及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或僅量測DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)，或量測DPPA、DPPC、MPEG5000-DPPE及非水溶劑之鈣濃度(且將此類濃度相加以得到合併鈣濃度量測值)。應明確的是，得出合併之鈣濃度量測值或表徵值(如下文所論述)涵蓋組分之每一組合。應理解除非另外明確陳述，否則術語DPPA、DPPA脂質、DPPA磷脂、DPPA原料、DPPA脂質原料及DPPA磷脂原料可互換地使用。對於DPPC及MPEG5000-DPPE使用類似的可互換術語。 在另一態樣中，提供前述方法之變型。此類方法包含提供DPPC及MPEG5000-DPPE原料，量測DPPC及MPEG5000-DPPE原料中之一或兩者的鈣濃度，將DPPC及MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，該方法進一步包含量測非水溶劑之鈣濃度。各種前述實施例同等地適用於此方法且應如此理解。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料，量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者或全部之鈣濃度，將具有較低合併鈣濃度量測值的DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，該方法進一步包含量測非水溶劑及DPPA、DPPC、MPEG500-DPPE原料之鈣濃度且該非水溶劑具有較低合併鈣濃度量測值。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含選擇MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其之一者、兩者或全部三者具有鈣濃度表徵值，其中該合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。如此基於具有單獨的或合併鈣濃度表徵值來選擇諸如磷脂原料及/或非水溶劑之組分。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含選擇MPEG5000-DPPE原料及DPPC原料，其之一或兩者具有鈣濃度表徵值，其中該合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，將該MPEG5000-DPPE原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。如此基於具有單獨的或合併鈣濃度表徵值來選擇諸如磷脂原料及/或非水溶劑之組分。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含選擇各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中該合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，非水溶劑具有鈣濃度表徵值，且MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料與該非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低的。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於115 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的MPEG5000-DPPE原料與DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於115 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量測DPPC原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的DPPC原料與DPPA原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於90 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量測DPPC原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的DPPC原料與MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於90 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量測DPPA原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的DPPA原料與DPPC原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於780 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含量非水溶劑之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的非水溶劑與DPPA原料、DPPC原料及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，較低鈣濃度為小於0.7 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，量測磷脂溶液之鈣濃度，及將具有較低鈣濃度量測值的磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料，將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，MPEG5000-DPPE原料進一步表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子含量。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由前述任何方法來製備。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由包含以下之方法來製備：量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度，將具有較低鈣濃度量測值的MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由包含以下之方法來製備：將MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，量測磷脂溶液之鈣濃度，及將具有較低鈣濃度量測值的磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由包含以下之方法來製備：選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料，將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由包含以下之方法來製備：將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含在低鈣或無鈣條件中單獨地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含PG之非水溶劑合併，以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，無鈣或低鈣條件為小於0.7 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含在低鈣或無鈣條件中，以無關順序之方式，連續地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，無鈣或低鈣條件為小於0.7 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含在不含甲醇及甲苯之條件下，將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂摻合物，在低鈣或無鈣條件中將磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，無鈣或低鈣條件為小於0.7 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物，使該摻合溶劑蒸發以形成經乾燥之磷脂摻合物，在低鈣或無鈣條件中將該經乾燥之磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，無鈣或低鈣條件為小於0.7 ppm。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於製備磷脂懸浮液之方法，該方法包含將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物，在不含MTBE之條件下使用第二摻合溶劑使該磷脂摻合物沈澱，在低鈣或無鈣條件下將經沈澱之磷脂摻合物與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。在一些實施例中，無鈣或低鈣條件為小於0.7 ppm。 在前述任何方法之一些實施例中，該方法進一步包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。在前述任何方法之一些實施例中，該方法進一步包含將超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。 本發明在另一態樣中進一步提供一種用於使個體成像之方法，該方法包含將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑，將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中該磷脂懸浮液藉由前述方法中之任一者來製備。 本發明在其他態樣中進一步提供一種包含磷脂溶液之組合物，該磷脂溶液包含在非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE且具有較低鈣濃度，以及提供包含磷脂溶液之組合物，該磷脂溶液包含在非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，其中該DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及該非水溶劑具有較低的合併鈣離子含量表徵值。在一些實施例中，非水溶劑包含丙二醇(例如，丙二醇可為唯一非水溶劑或其可與一或多種其他溶劑組合使用以提供非水溶劑)。在一些實施例中，非水溶劑包含丙二醇及甘油。在一些實施例中，非水溶劑包含緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為乙酸鹽緩衝液。在一些實施例中，組合物包含全氟化碳氣體。在一些實施例中，全氟化碳氣體為全氟丙烷。由此，在一些例子中，組合物係提供於諸如小瓶之容器中，且氣體係提供於容器之頂部空間中。亦提供用於將磷脂溶液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑的方法。該方法可進一步包含將超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，非水溶劑包含(i)丙二醇或(ii)丙二醇及甘油。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，非水溶劑包含緩衝液。在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，非水溶劑包含乙酸鹽緩衝液。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，含水溶劑包含緩衝液。在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，含水溶劑包含磷酸鹽緩衝液。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料單獨地與非水溶劑組合以形成磷脂溶液。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料以無關順序之方式連續地與非水溶劑組合，以形成磷脂溶液。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂混合物且磷脂混合物隨後與非水溶劑組合以形成磷脂溶液。該磷脂混合物可為異質或均質的。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂摻合物且磷脂摻合物隨後與非水溶劑組合以形成磷脂溶液。在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，使用有機溶劑溶解沈澱法形成磷脂摻合物，該方法包含將DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解於甲醇及甲苯之混合物中，視情況濃縮該磷脂/甲醇/甲苯混合物，且隨後使該經濃縮之磷脂/甲醇/甲苯混合物與甲基第三丁基醚(MTBE)接觸以使磷脂沈澱，以形成磷脂摻合物。在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，藉由以下形成磷脂摻合物：將DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解於除甲醇/甲苯溶劑系統之外的摻合溶劑系統中，視情況濃縮磷脂/溶劑混合物，隨後使經濃縮之磷脂/溶劑混合物與甲基第三丁基醚(MTBE)接觸以使磷脂沈澱，以形成磷脂摻合物。在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，藉由以下形成磷脂摻合物：將DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解於摻合溶劑系統中(諸如但不限於甲醇/甲苯溶劑系統)，且隨後使混合物凍乾或以其他方式乾燥以移除溶劑，留下磷脂摻合物。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，該方法進一步包含將該磷脂懸浮液置放於小瓶中，且將全氟化碳氣體導入至該小瓶的頂部空間內。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，該方法進一步包含用全氟化碳氣體來使磷脂懸浮液活化以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，該方法進一步包含將超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。 在本文所提供之各種態樣的一些實施例中，該方法進一步包含量測DPPA原料及/或DPPC原料及/或磷脂混合物及/或磷脂摻合物之鈣濃度。 本發明之此等及其他態樣及實施例將在本文中更詳細描述。
本文提供用於製備基於磷脂之超音波顯影劑(UCA)的改良方法。此等改良部分地基於以下出人意料的發現：意欲用於製備超音波顯影劑之某些基於磷脂之調配物對某些二價金屬陽離子之存在及量敏感。具體言之，意外地發現當以某些濃度將諸如鈣之二價金屬陽離子引入至基於磷脂之調配物(該調配物用以生成主要超音波顯影劑DEFINITY® )中時，引起該調配物之磷脂及潛在其他組分自溶液沈澱，從而使該調配物不可用。通常以大規模之批次製造此類調配物且由此例如無意中添加鈣將使整個批次不可用。此可引起製造能力減少。 亦已發現，出人意料的是，某些磷脂對二價金屬陽離子(諸如鈣)之存在所誘導的沈澱更為敏感。具體言之，在存在某些濃度之二價金屬陽離子(諸如鈣)時，非水溶劑(諸如丙二醇)中之DPPA更可能沈澱。對於諸如DPPC及DPPE之其他磷脂未觀測到此同樣的敏感度，或未觀測到同樣程度之敏感度。此不同的沈澱概況可輕易地導致磷脂調配物及最終之UCA具有不同於計劃或所需之磷脂組成。由此，二價金屬陽離子之存在不僅可能減少UCA之總產量(例如由諸如本文所描述之磷脂懸浮液的含沈澱之磷脂調配物之不可過濾性所致)，亦可干擾該UCA之磷脂分佈。此係成問題的，因為其可能導致完全未知磷脂含量之UCA調配物。如醫藥技術中所熟知的，此類UCA調配物之組成必須保持恆定且穩健地可再現，且必須避免批次間變化或以可能之最大程度使其降到最低。 本發明因此提供用於製備如本文所描述之諸如磷脂溶液及磷脂懸浮液之磷脂調配物的改良方法。此等方法藉由降低磷脂沈澱之可能性來提高此類調配物之產量。其亦以更為穩健及可再現之方式產生具有其所期望的磷脂概況及分佈之磷脂調配物。此等方法利用本文所描述之新穎及出人意料之發現，且提供所需之磷脂含量及比例的磷脂調配物，無需借助於偵測沈澱。 磷脂調配物總體 本文提供用於製備改良之磷脂溶液、磷脂懸浮液及最終UCA調配物的方法。如在一些例子中更詳細描述的，UCA調配物可由與諸如全氟丙烷之氣體組合的非水磷脂溶液形成。在其他例子中，UCA調配物可由以下形成：將非水磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液，該磷脂懸浮液與諸如全氟丙烷之氣體組合。此等及其他含磷脂之組合物在本文中統稱作磷脂調配物。下文將更詳細描述該等特定調配物中之每一者。本發明之磷脂調配物可包含用於製造FDA審批通過之DEFINITY® 微球體的三種磷脂。此三種磷脂為 (1) 1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼(在本文中稱作DPPC)， (2) 1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷脂酸(在本文中稱作DPPA)，及 (3) N-(甲氧基聚乙二醇5000胺甲醯基)-1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(在本文中稱作MPEG5000-DPPE)。 本發明之磷脂調配物可包含DPPC及MPEG5000-DPPE。 在一些例子中，可使用此等磷脂中之一或多者的改質形式。例如，可將1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(DPPE)結合至聚乙二醇(PEG)。在一些非限制性例子中，結合至DPPE或結合至另一種磷脂之PEG的分子量(MW，或長度)可選自1000-10,000。PEG之MW更通常可為約5000，在此情況下其稱作PEG5000，且在結合至DPPE時稱作PEG5000-DPPE。PEG通常結合至諸如DPPE之磷脂的磷脂頭部基團處，而非脂族鏈末端處。PEG可具有羥基端或甲氧基端，且可分別稱作HO-PEG5000或MPEG5000。 舉例而言，當結合至DPPE時，結合物可稱作HO-PEG5000-DPPE或MPEG5000-DPPE。後一結合物之完整化學名稱係N-(甲氧基聚乙二醇5000胺甲醯基)-1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺，單鈉鹽(在本文中稱作MPEG5000-DPPE)。 可以約77至90莫耳% DPPC、約5至15莫耳% DPPA及約5至15莫耳% DPPE (包括MPEG5000-DPPE)之莫耳百分比使用DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。各磷脂之較佳的比率包括6.0比53.5比40.5 (DPPA : DPPC : MPEG5000-DPPE)之重量%比率或10比82比8 (10 : 82 : 8)(DPPA : DPPC : MPEG5000-DPPE)之莫耳%比率。 本發明之其餘部分為方便及簡潔起見具體地涉及DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE，但應理解本文提供之教示內容意欲涵蓋單獨或以組合形式(諸如(但不限於) DPPC與MPEG5000-DPPE之組合)使用此等或其他磷脂之方法及/或單獨或以組合形式包含此等或其他磷脂之組合物。 本文所提供之各種方法涉及量測用以製造本文所描述之磷脂調配物之組分的二價金屬濃度。用以製造磷脂溶液之組分為尤其重要的，尤其因為沈澱似乎為在磷脂溶液步驟處，而非在磷脂懸浮液步驟處首先觀測到的現象。將在本文中，包括在實例中更詳細描述可用以量測二價金屬陽離子濃度(諸如鈣及鎂濃度)之方法。一些方法可涉及量測僅一種組分，諸如MPEG5000-DPPE之二價金屬陽離子濃度。其他方法可涉及量測兩種或超過兩種組分，諸如兩種或三種磷脂之二價金屬陽離子濃度。在一些實施例中，可在進行量測之前將組分組合在一起。再其他方法涉及量測用以製造諸如磷脂溶液之磷脂調配物的全部組分，包括非水溶劑的二價金屬陽離子濃度。此類量測可在組合組分之前或之後進行。例如，可對用以製造磷脂溶液之單獨的組分進行量測，或可對該磷脂溶液自身進行量測。 本文所提供之各種其他方法涉及基於組分之二價金屬陽離子濃度選擇用以製造磷脂調配物(諸如磷脂溶液)之組分。更具體言之，該方法涉及選擇一或多種已表徵為或鑑別為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度(包括不具有鈣或具有較低鈣濃度，或不具有鎂或具有較低鎂濃度)之組分的方法。一些方法可涉及選擇一種表徵為或鑑別為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度(包括不具有鈣或具有較低鈣濃度，或不具有鎂或具有較低鎂濃度)之組分，諸如MPEG5000-DPPE。一些方法可涉及基於組分之合併二價金屬陽離子濃度選擇兩種或超過兩種或全部組分。由此，預期DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE以及諸如(但不限於)非水溶劑及/或其單獨的組分之其他組分可單獨地表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度，但當一起使用時其合併二價金屬陽離子濃度將不再滿足不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度之要求且將引起沈澱。由此，在此等及其他例子中，兩種、三種或全部組分(諸如兩種或三種磷脂)可經選擇以使得其合併二價金屬陽離子濃度表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度。 磷脂溶液 如本文中所使用，磷脂溶液係指在非水溶劑中包含一或多種磷脂之組合物。該磷脂溶液可在非水溶劑中最低限度地包含DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。該磷脂溶液可在非水溶劑中最低限度地包含DPPC及MPEG5000-DPPE。 如本文中所使用之非水溶劑為使磷脂溶解從而形成溶液(即，磷脂溶液)之溶劑。較佳地，存在於磷脂溶液中之非水溶劑為醫藥學上可接受的，尤其因為將該非水溶劑攜載加入向個體(包括人類個體)投與之最終UCA調配物中。在某些實施例中，用以製造磷脂溶液之非水溶劑不為或不包含甲醇或甲苯或甲基第三丁基醚(MTBE)。 磷脂溶液之非水溶劑可為單一溶劑或其可為溶劑之組合。非水溶劑包含(但不限於)丙二醇(其可在本文中稱作PG)及甘油(其可在本文中稱作G)。二者均提供為液體原料。在一些例子中，磷脂溶液之非水溶劑可僅為PG或其可為PG與G之混合物(其可稱作PG/G)。包含至少PG之非水溶劑在本文中可稱作包含PG之非水溶劑。該PG/G混合物包括介於5:1至1:5 (重量比重量)範圍內之比率。在一些實施例中，使用1:1之PG:G w/w比率(且在本文中稱作1:1混合物)。 磷脂溶液可進一步包含一或多種緩衝液。此類緩衝液為能夠緩衝諸如上文所述彼等之非水溶劑的彼等緩衝液。實例包括(但不限於)乙酸鹽緩衝液(例如乙酸鈉及乙酸之組合)、苯甲酸鹽緩衝液(例如苯甲酸鈉及苯甲酸之組合)及柳酸鹽緩衝液(例如柳酸鈉及柳酸之組合)。其他可使用之緩衝液包括二乙醇胺緩衝液、三乙醇胺緩衝液、硼酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液、麩胺酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液、蘋果酸鹽緩衝液、酒石酸鹽緩衝液、戊二酸鹽緩衝液、烏頭緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液、甘油酸酯緩衝液、葡萄糖酸鹽緩衝液及Tris緩衝液。在一些實施例中，使用乙酸鹽緩衝液。在意欲緩衝液不為磷酸鹽緩衝液的情況下，用於非水溶劑中之緩衝液可為非磷酸鹽緩衝液。 緩衝液濃度將視所使用緩衝液的類型而變化，如一般技術人員將理解且在其進行確定的技術範圍內。非水溶劑中之緩衝液濃度可介於約1 mM至約100 mM範圍內，包括約1 mM至約50 mM、或約1 mM至約20 mM、或約1 mM至約10 mm、或約1 mM至約5 mM，包括約5 mM。 因此，磷脂溶液可包含一或多種磷脂(諸如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)、為PG或包含PG之非水溶劑及視情況諸如乙酸鹽緩衝液之緩衝液。 可以多種方法製造磷脂溶液，下文更詳細描述該等方法中之數種。大體而言，非水溶劑可在與磷脂接觸之前經升溫，且緩衝液(若使用)可在與磷脂接觸之前首先存在於溶劑中。可攪拌該溶劑及隨後的溶液以促進磷脂溶解。 值得注意的是，已發現在非水溶劑中，且由此在製造磷脂溶液之製程中出現與二價金屬陽離子相關之磷脂沈澱。由此，如本文所描述之各種方法包括量測用以製造該磷脂溶液之各種組分之二價金屬陽離子濃度的步驟，包括無論單獨或共同使用之磷脂、諸如PG及G之非水溶劑、諸如乙酸鹽緩衝液之緩衝液(若使用)及其類似者。 在一些實施例中，替代於量測磷脂溶液之二價金屬陽離子濃度或除量測磷脂溶液之二價金屬陽離子濃度之外，可量測磷脂懸浮液之二價金屬陽離子濃度。 可進行目測磷脂溶液以偵測沈澱，但是此不為所需的。圖 1 為展示具有不同程度之沈澱的各種磷脂溶液之相片。 在一些實施例中，磷脂溶液隨後用以製備下文更詳細描述之磷脂懸浮液。 在一些實施例中，使磷脂溶液直接與氣體(諸如全氟化碳氣體)接觸以製造經磷脂囊封之氣體微球體，而非首先使磷脂溶液與含水溶劑接觸。亦即，在一些例子中，藉由(非水)磷脂溶液與氣體之接觸及劇烈搖動(稱作活化)製造經磷脂囊封之氣體微球體。此類微球體可隨後與含水溶劑接觸以形成UCA。 磷脂懸浮液 如本文中所使用，磷脂懸浮液係指包含磷脂溶液及含水溶劑之含水磷脂調配物。該磷脂懸浮液可包含一或多種磷脂，諸如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。磷脂懸浮液將最低限度地包含一或多種磷脂(諸如一或多種磷脂)、非水溶劑(諸如PG)及含水溶劑。 如本文中所使用之含水溶劑為水或包含水作為其主要組分(按重量計)。含水溶劑可進一步包含一或多種鹽，且由此可稱作含水鹽水溶劑。其可另外地或可替代地包含緩衝液，且由此可稱作含水緩衝鹽水溶劑或含水緩衝溶劑。較佳地，無論含水溶劑是否包括鹽或緩衝液，其均為醫藥學上可接受的，此係因為類似於磷脂溶液，將該含水溶劑攜載加入向個體(包括人類個體) 投與之最終UCA調配物中。 可包括於含水溶劑中之鹽包括(但不限於)氯化鈉。 可包括於含水溶劑中之緩衝液包括(但不限於)磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、苯甲酸鹽緩衝液、柳酸鹽緩衝液、二乙醇胺緩衝液、三乙醇胺緩衝液、硼酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液、麩胺酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液、蘋果酸鹽緩衝液、酒石酸鹽緩衝液、戊二酸鹽緩衝液、烏頭緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液、甘油酸鹽緩衝液、葡萄糖酸鹽緩衝液及Tris (三(羥甲基)甲胺)緩衝液。通常，非水溶劑或含水溶劑任一者包含緩衝液，但不是兩者均有。緩衝液濃度將視所使用緩衝液的類型而變化，如一般技術人員將理解且在其進行確定的技術範圍內。含水溶劑中之緩衝液濃度可介於約1 mM至約100 mM範圍內，包括約1 mM至約50 mM、或約10 mm至約30 mM、或約20 mM至約30 mM、或約20 mM至約25 mM，包括約25 mM。 因此，磷脂懸浮液可包含一或多種磷脂(諸如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)、非水溶劑(其為PG或其包含PG)、含水溶劑(其可包含一或多種諸如氯化鈉之鹽)及視情況緩衝液(諸如乙酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液)。磷脂懸浮液物理上可表徵為磷脂懸浮而非溶解於含水溶劑中。 一般藉由使非水磷脂溶液與含水溶劑接觸來製造磷脂懸浮液。含水溶劑可已包含任何鹽及/或任何緩衝液，或者可在與磷脂溶液接觸之後添加彼等鹽及/或緩衝液。可攪拌含水溶劑以便確保磷脂溶液與含水溶劑混合。含水溶劑亦可在與磷脂溶液接觸之前經升溫，該磷脂溶液在一些例子中亦可經升溫。 出人意料地，含水溶劑之二價金屬陽離子濃度不與非水磷脂溶液(及其組合組分)之二價金屬陽離子濃度一樣重要。舉例而言，已意外地發現一旦製備無沈澱之磷脂溶液，其能夠與具有較高二價金屬陽離子濃度之含水溶劑組合而不會誘導任何可識別的磷脂沈澱。由此，已出人意料地發現磷脂對於較高二價金屬陽離子含量之敏感度僅在磷脂溶液中或在非水溶劑之存在下存在，但在越過彼點後不存在。類似地，已發現一旦在磷脂溶液中形成沈澱，與含水溶劑(即使經升溫之含水溶劑)接觸不引起其溶解。迄今為止，並未瞭解到磷脂(且尤其DPPA)對較高二價金屬陽離子水準(諸如鈣水準)之此不同的敏感度，且視其為出人意料的發現。 雖然含水溶劑之二價金屬陽離子濃度似乎不會誘導一或多種磷脂之沈澱，其確實出人意料地誘導其他組分之沈澱，包括最值得注意的磷酸鹽，諸如若磷酸鹽緩衝液用於含水溶劑則可存在之磷酸鹽。由此，在一些例子中，本文所提供之方法可另外包括量測用以製造(包含磷酸鹽的)含水磷脂懸浮液之組分的二價金屬陽離子濃度。或者，該等方法可包括選擇單獨地或以組合形式表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度的單獨組分或組合組分。 磷脂懸浮液可隨後用以製備經磷脂囊封之氣體微球體。 經磷脂囊封之氣體微球體 ， 及包含其之 UCA 調配物 顯而易見，本發明之基於磷脂的超音波顯影劑為經磷脂囊封之氣體微球體。可以多種方法來製造此等微球體。例如，可使磷脂溶液與含水溶劑接觸以形成磷脂懸浮液，且可使該磷脂懸浮液與氣體(諸如全氟化碳氣體)接觸以形成經磷脂囊封之氣體微球體。作為另一實例，可使非水磷脂溶液與氣體(諸如全氟化碳氣體)接觸以形成經磷脂囊封之氣體微球體。在任一情況下，不論磷脂調配物是非水磷脂溶液還是含水磷脂懸浮液，其均以足夠產生經磷脂囊封之氣體微球體的方式與該氣體組合。此通常涉及劇烈搖動或其他攪動。充分搖動或攪動通常使用諸如VIALMIX® 之裝置來達成，且通常並非以人工方式達成。 磷脂溶液或磷脂懸浮液係提供於具有氣體頂部空間的容器(諸如小瓶)中。通常藉由氣體交換製程將全氟化碳氣體(諸如全氟丙烷)引入至此類容器之頂部空間內。隨後劇烈搖晃此小瓶以便形成經磷脂囊封之氣體微球體。由最終用戶或醫療人員在即將投與至個體之前進行此稱作活化之製程。 微球體在其內腔中包含氣體，諸如全氟化碳氣體(包括但不限於全氟丙烷氣體)。囊封氣體之磷脂殼層可排列為單層或雙層，包括單層雙層或多層雙層。微球體可具有小於10微米，或小於6微米，或小於3微米或更佳地小於2微米之平均直徑。此等平均直徑意欲指當分析微球體值群體時，該群體之平均直徑小於10微米，或小於6微米，或小於3微米或更佳地小於2微米。該等微球體可具有介於0.5至3微米，或1至2微米，或1.4至1.8微米，或1.4至1.6微米範圍內之平均直徑。平均直徑可為約1.4微米。 產生經磷脂囊封之氣體微球體的製程稱作活化。包含充足濃度之經磷脂囊封之氣體微球體的調配物在本文中可稱作活化調配物。 應瞭解「充足」之氣體微球體之濃度視是使用磷脂溶液(而不介入含水溶劑之使用)還是使用磷脂懸浮液製造該等氣體微球體而定。通常，投與至個體之UCA調配物包含每ml所投與調配物至少約1×107 數量級之微球體，或每ml至少5×107 個微球體，或每ml，至少7.5×107 個微球體或每ml至少1×108 個微球體，或每ml至少1×109 個微球體，或每ml約5×109 個微球體。在一些例子中，微球體濃度之範圍可為每ml所投與調配物1×107 至1×1010 個微球體，且更通常地為每ml 5×107 至5×109 個微球體。 視如何製造氣體微球體而定，該等氣體微球體可存在於非水溶劑或含水溶劑中。無論如何，在投與至個體之前，其通常在含水溶液中稀釋，該含水溶液可為鹽水溶液，或緩衝含水溶液，或緩衝鹽水溶液。 通常靜脈內投與至個體(包括人類個體)的UCA調配物之pH可在4-8範圍內或4.5-7.5範圍內。在一些例子中，pH可在約6至約7.5的範圍內，或在6.2至約6.8的範圍內。在再其他例子中，pH可為約6.5 (例如，6.5 +/- 0.5或+/- 0.3)。在一些例子中，pH可在5至6.5的範圍內，或在5.2至6.3的範圍內，或在5.5至6.1的範圍內，或在5.6至6的範圍內或在5.65至5.95的範圍內。在再另一例子中，pH可在約5.7至約5.9範圍內(例如，在該範圍內之任一端或兩端+/- 0.1或+/- 0.2或+/- 0.3)。在另一例子中，pH可為約5.8 (例如，5.8 +/- 0.15或5.8 +/- 0.1)。 氣體較佳為大體上不可溶於本文所提供之磷脂調配物，包括磷脂溶液及磷脂懸浮液。氣體可為不可溶氟化氣體，諸如六氟化硫或全氟化碳氣體。全氟化碳氣體之實例包括全氟丙烷、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷。可使用之氣體之實例描述於美國專利第5,656,211號中，且以引用的方式併入本文中。在一重要的實施例中，氣體為全氟丙烷。 二價金屬陽離子及其量測方法 二價金屬陽離子係原子價為2之二價金屬離子。此等金屬離子包括:鋇(2+)、鈹(2+)、鎘(2+)、鈣(2+)、鉻(2+)、鈷(2+)、銅(2+)、銪(2+)、釓(2+)、鍺(2+)、鐵(2+)、鑭(2+)、鉛(2+)、鎂(2+)、錳(2+)、汞(2+)、鎳(2+)、鋨(2+)、鉑(2+)、釕(2+)、鍶(2+)、錫(2+)、鈾(2+)、釩(2+)、釔(2+)及鋅(2+)。 在一些實施例中，所關注的二價金屬陽離子為鈣、鎂及錳。在一些實施例中，所關注的二價金屬陽離子為鈣及鎂，且因此僅量測鈣及鎂，或僅基於組分之鈣含量及鎂含量選擇組分。在一些實施例中，所關注的二價金屬陽離子為鈣，且因此僅量測鈣或僅基於組分之鈣濃度選擇組分。 二價金屬陽離子之影響 如本文所描述，二價金屬陽離子可存在於用以製造調配物之一或多種組分中。直至此類組分與非水溶劑組合以形成磷脂溶液(此時例如可誘導磷脂沈澱)或直至此類組分與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液(此時例如可誘導磷酸鹽沈澱)為止，可能不會瞭解到二價金屬陽離子之存在。出人意料地，根據本發明發現MPEG5000-DPPE磷脂原料含有足夠高濃度之鈣及鎂，以使得一旦組合，引起至少DPPA磷脂沈澱。由此，二價金屬陽離子對不同磷脂可具有不同影響，且磷脂(或其他組分)是否含有足以誘導沈澱之濃度的此類陽離子對於使用者可能不為顯而易見的。 本發明人發現在製備各種UCA調配物之製程中，當非水溶劑與包含DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE磷脂之磷脂摻合物組合時，非水溶劑變混濁。進一步確定該混濁外觀很可能係由DPPA磷脂之沈澱所致。然而，本發明人所不知之事實為MPEG5000-DPPE含有高濃度之鈣及鎂離子，且彼等鈣及鎂濃度很可能引起DPPA沈澱。有趣的是，此類陽離子似乎不影響MPEG5000-DPPE保持在溶液中之能力，且由此使用者將不會瞭解到彼事實，直至此類磷脂在非水混合物中與其他磷脂組合為止。在本文中更詳細描述之其他研究發現，當稍後表徵為高鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料與DPPA組合時出現沈澱，無論添加順序或其他組分(諸如其他磷脂，諸如DPPC及DPPA)之存在如何。甚至更出人意料的是，DPPA在足夠高的二價金屬陽離子濃度(諸如鈣及鎂濃度)存在下在包含PG之非水溶劑中沈澱，但在具有類似高鈣及鎂濃度中任一者或兩者的含水溶劑中不沈澱的敏感度。換言之，引起DPPA在包含PG之非水溶劑中沈澱的鈣濃度確實沒有引起DPPA在含水溶劑中沈澱，且此亦為出人意料的。 不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度 如本文中所使用，選擇表徵或鑑別為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度之組分，其包括無鈣或較低鈣濃度。此類二價金屬陽離子濃度表示為重量比重量量度(亦即，每單位重量的其中存在所關注組分之基礎基質或溶劑之重量中的二價金屬陽離子之重量)。微克每公克濃度可替代地稱作百萬分之一或ppm。 此類組分之無鈣或較低鈣濃度將進一步視使用了多少彼組分，或換言之有多少此類組分經稀釋以形成磷脂溶液或磷脂懸浮液而定。 在最簡單的情況下，僅關注一種組分，且僅量測其之鈣濃度或僅彼組分係基於其鈣濃度來選擇。基於本發明，一般技術者將理解且能夠確定在彼組分中可耐受多少鈣，以便避免磷脂溶液或磷脂懸浮液中之沈澱。 舉例而言，磷脂原料(通常以諸如粉末之固體形式提供)中之鈣濃度表示為每公克磷脂之鈣重量。一個實例為每公克MPEG5000-DPPE之鈣重量或每公克DPPC之鈣重量。當諸如兩種磷脂之兩種組分經組合時，該量度可為每公克經組合之MPEG5000-DPPE及DPPC之鈣重量。 無二價金屬陽離子(諸如無鈣)係指此類陽離子之濃度為使用此項技術中已知及/或本文所提供之方法不可偵測的。 磷脂原料中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度將視特定組分而定。 在MPEG5000-DPPE磷脂原料中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於510微克/公克(亦即，每公克之MPEG5000-DPPE的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於510 ppm)，包括小於345 ppm，小於230 ppm，小於115 ppm，小於57.5 ppm及小於11.5。 在DPPC磷脂原料中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於390微克/公克(亦即，每公克之DPPC的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於390 ppm)，包括小於270 ppm，小於180 ppm，小於90 ppm，小於45 ppm及小於9 ppm。 在DPPA磷脂原料中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於3440微克/公克(亦即，每公克DPPA的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於3440 ppm)，包括小於2340 ppm，小於1560 ppm，小於780 ppm，小於390 ppm及小於78 ppm。 在磷脂摻合物中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於210微克/公克(亦即，每公克之磷脂摻合物或MPEG5000-DPPE及DPPC及DPPA之合併重量的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於210 ppm)，包括小於150 ppm，小於100 ppm，小於50 ppm，小於25 ppm及小於5 ppm。 在丙二醇中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於3.1微克/公克(亦即，每公克之丙二醇的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於3.1 ppm)，包括小於2.1 ppm，小於1.4 ppm，小於0.7 ppm，小於0.35 ppm及小於0.07 ppm。 在1:1 (重量比重量)丙二醇及甘油混合物中，不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於10.4微克/公克(亦即，每公克組合之丙二醇及甘油的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於10.4 ppm)，包括小於7.8 ppm，小於5.2 ppm，小於2.6 ppm，小於1.3 ppm及小於0.26 ppm。 在甘油中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於20.4微克/公克(亦即，每公克之甘油的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於20.4 ppm)，包括小於15.3 ppm，小於10.2 ppm，小於5.10 ppm，小於2.6 ppm，小於0.51 ppm。 在包含僅丙二醇作為非水溶劑之磷脂溶液中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度係小於3.1微克/公克(亦即，每公克之磷脂溶液的全部組分的二價金屬陽離子微克數)(亦稱作小於3.1 ppm)，包括小於2.1 ppm，小於1.4 ppm，小於0.7 ppm，小於0.35 ppm及小於0.07 ppm。如將基於磷脂溶液之組成所瞭解的，按重量計主要組分為非水溶劑，在此特定情況下為丙二醇。 應理解相同的濃度極限適用於鈣濃度及鎂濃度以及合併的鈣及鎂濃度。 本發明涵蓋視磷脂溶液之性質而定，量測磷脂溶液之一或多種組分(包括例如一種、兩種或全部三種磷脂原料)中的二價金屬陽離子濃度，視情況一起量測諸如丙二醇及/或甘油之非水溶劑的二價金屬陽離子濃度。若任何此等組分含有超過上文所述之彼等水準的二價金屬陽離子濃度，則預期一旦用此類組分製造磷脂溶液，此類磷脂溶液將易於沈澱。 一些實施例涵蓋分析單一組分之二價金屬陽離子濃度，且若此類濃度為「不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度」，則該組分可與其餘組分合併，即使並未分析此類其餘組分之二價金屬陽離子濃度。磷脂溶液之組分包括磷脂原料(無論其為單獨地提供或作為摻合物提供)、非水溶劑(諸如丙二醇及甘油)及視情況緩衝液。 一些實施例涵蓋量測磷脂溶液之超過一種但少於全部組分之二價金屬陽離子濃度。在一些例子中，若組分中之一者的二價金屬陽離子濃度超過上文所列之「不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度」極限，則其可能不會用以製備磷脂溶液(或磷脂摻合物)。在一些例子中，無一種組分之二價金屬陽離子濃度可表徵或鑑別為超過「不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度」。然而，當組合使用此類組分時，合併二價金屬陽離子濃度可基於各自貢獻給磷脂溶液之量來確定。預期合併二價金屬陽離子濃度可能超出或可能不會超出如上文對於磷脂溶液所定義之「不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度」。 如通篇所論述的，本文所闡述之各種水準在提及二價金屬陽離子時，同等地適用於鈣。實例表明磷脂沈澱明顯之最低鈣濃度為每公克非水溶劑約0.7微克鈣(參見實例1及2)，另外稱作約0.7 ppm。由此，非水磷脂溶液中不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度(諸如無鈣或較低鈣濃度)為小於0.7 ppm，小於0.35 ppm或小於0.07 ppm。應理解磷脂溶液中二價金屬陽離子濃度小於0.7 ppm亦視為不具有二價金屬離子或具有較低二價金屬離子濃度。 可以每公克含水溶劑中的二價金屬陽離子重量之形式提供含水磷脂懸浮液中之二價金屬陽離子濃度。通常，藉由在含水溶劑中將非水磷脂溶液稀釋約20倍來形成磷脂懸浮液。由此，磷脂懸浮液中不具有二價金屬離子或具有較低二價金屬離子濃度為每公克磷脂懸浮液小於0.035微克。類似地，磷脂懸浮液中源自磷脂溶液之鈣濃度為每公克磷脂懸浮液小於0.035微克。 引起磷脂沈澱之二價金屬陽離子濃度可為隨溫度變化的。在較高溫度下，在觀測到沈澱之前可耐受較高濃度之陽離子。在較低溫度下，較低濃度之陽離子可引起沈澱出現。 舉例而言，在約55℃之溫度(例如50-60℃)下，不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子濃度為每公克磷脂溶液或非水溶劑小於0.7微克鈣之二價金屬陽離子濃度。若在較低溫度下製備磷脂溶液，則此水準可略低。或者，若在較高溫度下製備磷脂溶液，則此水準可略高。 鈣源 如實例中所表明的，磷脂溶液意外地且獨特地對特定水準之鈣敏感。迄今為止並未認識到此獨特的敏感度。考慮到鈣對於製備磷脂溶液之影響，且由此最終對UCA之影響，量測且由此控制磷脂溶液之鈣濃度係重要的。鈣可存在於磷脂溶液之每一組分中，包括如下文所描述之磷脂原料及非水溶劑。 鈣及鎂為週期表第2族中之二價鹼土金屬。鈣為地殼中按質量計第五充足的元素，且陽離子Ca2+亦為海水中第五充足的溶解離子。視「硬度」而定，在自來水中以各種水準發現該離子。總水硬度為Ca2+及Mg2+之莫耳濃度的總和，介於軟0-60 ppm至極硬≥181範圍內。 亦在來自生物柴油之粗甘油萃取物中發現不同濃度的鈣及鎂。視用於生物柴油生產之種子油而定，鈣及鎂之水準據報告為分別介於12至163 ppm及4至127 ppm範圍內(J.C.Thompson 2006 Applied Engineering in Agriculture 第22卷(2): 261-265))。甘油之主要供應來自此生物柴油副產物。能夠藉由用活性碳處理以移除有機雜質、用鹼處理以移除未反應之甘油酯及用離子交換處理以移除鹽，來純化粗甘油萃取物。藉由多步驟蒸餾獲得高純度甘油(＞ 99.5%)；由於甘油之高沸點(290℃)，真空係有幫助的。 工業上，自環氧丙烷生產丙二醇。不同的製造商使用200℃ (392℉)至220℃ (428℉)下的非催化高溫製程，或在離子交換樹脂或少量硫酸或鹼存在下在150℃ (302℉)至180℃ (356℉)下進行的催化方法。最終產物含有20%丙二醇、1.5%二丙二醇及少量其他聚丙二醇。進一步純化產生通常為99.5%或更高之成品工業級別或美國藥典/日本藥典/歐洲藥典/英國藥典級別的丙二醇。丙二醇亦可自甘油(生物柴油副產物)轉化。 藥典級別之丙二醇及甘油的鈣及鎂含量並未如美國藥典、歐洲藥典、英國藥典或日本藥典之分析要求證書所定量。 磷脂DPPA含有能夠在適合pH下電離的磷酸鹽。該磷酸鹽之兩個羥基的pKa為6.2及1.8 (Tatulian Ionization and Binding, 511-552 Phospholipid Handbook, G Ceve 1993版)。DPPA為以不同之鹽形式可商購的。通常使用Na鹽，但Ca鹽亦為可獲得的。 DPPC為兩性離子且因此不需要相對離子。 MPEG5000-DPPE為經改質DPPE，其對於磷酸鹽之羥基及乙醇胺之胺的pKa為1.9及9.3 (Tatulian Ionization and Binding, 511-552 Phospholipid Handbook, G Ceve 1993版)。MPEG5000-DPPE為以Na鹽形式可獲得的。 量測二價金屬陽離子濃度之方法 能夠使用數種已知技術中之一種進行二價金屬陽離子濃度之定量。此等方法包括原子光譜法，諸如原子吸收光譜法(AAS)、火焰光度測定法或火焰原子發射光譜法(FAES)、感應耦合電漿-原子發射光譜法(ICP-AES)；及其他方法，諸如感應耦合電漿-質譜法或錯合滴定。該等光譜方法利用鹼金屬(第1族)及鹼土金屬(第II族)之金屬離子在因火焰源所提供之熱能解離時的吸收或發射特性。ICP-MS為能夠偵測極低濃度金屬之質譜法類型。此藉由用感應耦合電漿使樣品電離，且隨後使用質譜儀以對彼等離子進行分離及定量來達成。此等方法中之一些係用於實例中。 錯合滴定為另一種用於偵測二價金屬陽離子濃度之方法。此方法使用乙二胺四乙酸(EDTA，ethylenediaminetetraacetic acid)與鈣及鎂離子錯合來與呈色指示劑競爭。此提供迅速的比色定量。EDTA與鈣及鎂離子形成錯合物。稱作Eriochrome黑色T(ErioT)之藍色染料用作指示劑。此藍色染料亦與鈣及鎂離子形成錯合物，在該過程中顏色自藍色變化至粉紅色。染料-金屬離子錯合物不如EDTA-金屬離子錯合物穩定。對於滴定，使含有鈣及鎂離子之樣品溶液與過量EDTA反應。添加指示劑且當存在之全部Ca2+及Mg2+離子與EDTA錯合時指示劑保持藍色。 使用氯化鎂溶液進行反滴定。此與過量EDTA分子形成錯合物，直至全部過量EDTA已錯合之終點。氯化鎂溶液之剩餘的鎂離子隨後開始與ErioT指示劑錯合，立即使其顏色自藍色變化至粉紅色。 合成方法 本發明提供用於製備磷脂溶液及磷脂懸浮液之方法，該等磷脂溶液及磷脂懸浮液意欲與全氟化碳氣體一起使用以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的UCA調配物。在較佳實施例中，磷脂為DPPA、DPPC及DPPE (諸如MPEG5000-DPPE)。 如下文所描述，可以多種方法製造磷脂溶液。此等方法概括地表徵為摻合方法及非摻合方法。初始磷脂原料可呈固態(例如，粉末)形式或呈液態形式。 摻合方法 摻合方法係指其中磷脂彼此緊密摻合以提供對於其磷脂含量及磷脂分佈更均勻(且由此更均相)之固態磷脂混合物，且在一些例子中該固態磷脂混合物相比於簡單磷脂混合物具有較高純度。 此方法藉由在適合之摻合溶劑系統中溶解或懸浮三種磷脂以產生該三種磷脂之均相分散液，且隨後使該等均勻分佈之磷脂與該溶劑分離。摻合溶劑與磷脂之分離可涉及乾燥、凍乾、蒸餾及其類似者，或其可包括使用額外的摻合溶劑來沈澱。用於中性脂質之摻合溶劑為諸如乙醚或氯仿之相對非極性溶劑。對於自身較為極性之膜相關脂質需要諸如醇((例如甲醇及乙醇)之較為極性之摻合溶劑。亦可使用氯仿，尤其用於中間極性之脂質。當與甲醇混合時，氯仿成為通用溶劑。二氯甲烷(dichloromethane/methylene dichloride)為類似萃取劑但較不可氧化。己烷可以用於較低極性之脂質。其可用於自水/醇混合物萃取中性脂質。石油醚為具有5-8個碳原子之各種烴的混合物且可在一些例子中用以替代己烷。其他摻合溶劑包括(但不限於)環己烷及甲苯。 如本文中將更詳細描述的，藉由以下形成某些摻合物：使一或多種所需磷脂((例如DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE)在摻合溶劑系統中接觸以首先溶解此類磷脂，隨後視情況濃縮此類溶液，隨後自此類溶劑移除摻合溶劑或使磷脂摻合物沈澱。摻合溶劑不應與稍後用以溶解磷脂從而形成磷脂溶液的非水溶劑混淆。亦應明確的是，此沈澱為所需事件且不應與非所需磷脂沈澱混淆，該非所需磷脂沈澱可能在稍後形成磷脂溶液期間藉由鈣、另一種二價陽離子或二價陽離子之組合的存在而發生。 一些製備磷脂溶液之方法涉及使磷脂摻合物與非水溶劑接觸。存在各種製造磷脂摻合物之方法，包含(但不限於)有機溶劑(或如本文中所使用之摻合溶劑)溶解沈澱法及含水懸浮液凍乾法。 有機溶劑溶解沈澱法詳細描述於美國專利第8,084,056號及公開國際申請案第WO99/36104號中，兩者之全部內容以引用之方式併入本文中。此方法之一個實施例涉及以下步驟： (a) 使所需磷脂(例如，DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE或DPPC及MPEG5000-DPPE)與第一摻合溶劑系統接觸。此系統通常為溶劑之組合，例如CHCl3 /MeOH、CH2 Cl2 /MeOH，及甲苯/MeOH。可能需要將所得溶液升溫至足以達成完全溶解的溫度。此類溫度較佳為約25℃至75℃，更佳為約35℃至65℃。溶解之後，可藉由熱過濾或冷卻至室溫隨後過濾來移除未溶解的外來物質。可使用已知的過濾方法(例如，重力過濾、真空過濾或壓力過濾)。 (b) 隨後將溶液濃縮至稠凝膠/半固體。較佳藉由真空蒸餾進行濃縮。亦可使用使溶液濃縮之其他方法，諸如旋轉蒸發。此步驟之溫度較佳為約20℃至60℃，更佳為30℃至50℃。 (c) 隨後將稠凝膠/半固體分散於第二摻合溶劑中。將混合物製成漿料，較佳地接近環境溫度(例如，15℃-30℃)。有用的第二摻合溶劑為引起磷脂沈澱之彼等溶劑。第二摻合溶劑較佳地為甲基第三丁基醚(MTBE)。可使用其他醚及醇。 (d) 隨後收集添加第二摻合溶劑時所生成的固體。較佳地，使用另一份第二摻合溶劑(例如，MTBE)來洗滌所收集固體。可經由真空過濾或離心較佳地在環境溫度下進行收集。收集之後，較佳的係固體在約20℃至60℃之溫度下在真空中乾燥。 所得固體在本文中稱作磷脂摻合物。 某些本文所描述之方法使用呈磷脂摻合物形式之磷脂，包括根據上述摻合方法中之任一者所製造的磷脂摻合物。一些方法使用磷脂摻合物，不包含上述根據甲醇/甲苯/MTBE方法所製造的磷脂摻合物，該方法中甲醇及甲苯混合物用作第一摻合溶劑且MTBE用作第二摻合溶劑。為了清晰起見，上述方法在本文中稱作甲醇/甲苯/MTBE磷脂摻合方法。 如本文中所使用，磷脂摻合物區別於其他磷脂混合物，包括如本文所描述之由僅僅以其固體(包括粉末)形式組合磷脂來製備的彼等混合物。 在含水懸浮液凍乾方法中，使磷脂在高溫下懸浮於水中，且隨後藉由凍乾進行濃縮。 出於多種原因，有機溶劑溶解沈澱法相比含水懸浮液/凍乾法為較佳的，該等原因如美國專利第8,084,056號及公開PCT申請WO 99/36104中所概述，包括使用有機溶解法所產生之均勻分佈的磷脂固體。 一些不為上文所述之甲醇/甲苯/MTBE磷脂摻合方法之摻合方法使用除甲醇及甲苯之外的摻合溶劑系統。在此等方法中，磷脂在不含甲醇及不含甲苯之條件(亦稱作不含甲醇及甲苯之條件)下組合以形成磷脂摻合物。由此，不含甲醇及甲苯之條件係指不包括此等溶劑之兩者的條件。 一些摻和方法在摻合溶劑中組合磷脂以形成磷脂摻合物，且隨後使該摻合溶劑完全蒸發(例如藉由乾燥或蒸餾)以形成經乾燥之磷脂摻合物。在本文所提供之方法中，此經乾燥之磷脂摻合物隨後與諸如PG之非水溶劑接觸。 一些摻合方法在含水溶劑中組合磷脂，且隨後使該混合物凍乾以形成凍乾磷脂組合物。其他摻合方法將磷脂與其他替代水之溶劑系統組合，諸如(但不限於)(1)乙醇及環己烷(例如，1:1，v:v)混合物及(2)第三丁醇(t-丁醇或1,1二甲基乙醇)。在溶解於此等各種溶劑中之後，使組合物。可藉由歷經異丙醇/CO2浴或丙酮/CO2浴來冷凍及在Virtis凍乾器上乾燥直至產物在外觀上呈現乾燥及絮狀來進行凍乾。 各種不為上文所述之甲醇/甲苯/MTBE磷脂摻合方法的摻合方法係描述於公開EP 0923383 (WO1997040858)中，其全部內容以引用的方式併入本文中。 一些不為上文所述之甲醇/甲苯/MTBE磷脂摻合方法的摻合方法在摻合溶劑中組合磷脂(該摻合溶劑可為甲苯及甲醇之混合物)以形成磷脂摻合物，且隨後使此類磷脂摻合物在無MTBE存在下沈澱。此等方法中，在不含MTBE之條件下出現沈澱。 在其他摻合方法中，DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE (或DPPC及MPEG5000-DPPE)可以其乾燥、固體形式組合且隨後可主動及緊密地以乾燥形式混合此類組合(例如，人工地攪拌粉末或使用混合裝置，諸如轉鼓倉混合機、繞轉螺旋混合機、帶狀混合機、擠壓機、高速旋風式混合機(cyclomix)、亨舍爾混合機(henschel mixer)、勞迪吉型混合機(lodige type mixer)、愛立許型混合機(Eirich type mixer)或其他類型之經設計以用於醫藥粉末混合之裝置，其目的在於製備均勻磷脂摻合物(例如在整個混合物中均勻的磷脂分散)。對用於產生均勻乾燥產物之額外的方法可以參考Deveswaran等人，Research J. Pharm. and Tech.2 (2)： 4月-6月，2009)。 非摻合方法 與摻合方法相反，某些非摻合方法涉及簡單混合固體磷脂且此傾向於導致較不均勻的(且由此較不均勻地分散或較非均相地分散)混合物。此等後者混合物在本文中稱作磷脂混合物(或非摻合磷脂混合物)以將其與磷脂摻合物區分。 製備磷脂溶液之一些方法涉及僅僅使磷脂以其固體形式與非水溶劑接觸。該等磷脂可同時或連續地與非水溶劑接觸。若連續地接觸，則可使用任何添加順序。可單獨地將磷脂添加至非水溶劑中，或其可以任何組合首先組合在一起，且隨後添加至非水溶劑中。由此，預期可單獨且同時地、單獨且連續地、組合且同時地及部分組合且連續地將磷脂添加至非水溶劑中。後者之一個實例為，該等磷脂中之兩種以固體形式組合在一起，且隨後在剩餘的磷脂與非水溶劑接觸之前或之後與非水溶劑接觸之例子。 由此，舉例而言，可將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE (或DPPC及MPEG5000-DPPE)磷脂單獨地添加至非水溶劑中。此類單獨的添加可為連續添加或同時添加。若為連續的，則添加順序可為任何順序，儘管在一些例子中可第二個或最後添加DPPA，此係因為其為最不充足且最不可溶的，且可藉由其他磷脂中之一種的存在促進其之溶解。在一些例子中，無論磷脂是否單獨地提供、或以簡單混合物形式提供、或以磷脂摻合物形式提供，其隨後如上文所描述溶解於包含PG或PG/G混合物之非水溶劑中以形成磷脂溶液。磷脂溶液可與氣體組合，或其可與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液，該懸浮液之後與氣體接觸。 在其他例子中，可藉由在例如水、或乙醇及環己烷(例如，1:1，v:v)混合物、或第三丁醇(t-丁醇或1,1二甲基乙醇)中組合磷脂來製備磷脂摻合物，且此類混合物隨後經凍乾，且使該經乾燥產物在含水溶劑中再懸浮。在此等例子中，最終再懸浮產物可與諸如全氟丙烷之氣體組合。本發明預期可分析用於此製備之任何或全部組分的二價金屬陽離子濃度，且可對此類單獨或合併二價金屬陽離子濃度進行定量且將其用以選擇及/或製備UCA。 製備超音波顯影劑之方法 ， 包括活化 藉由組合及劇烈搖動磷脂溶液或磷脂懸浮液與諸如全氟化碳氣體之氣體形成經磷脂囊封之氣體微球體。此製程在本文中稱作活化。如此形成之UCA調配物最低限度地包含磷脂、非水溶劑(諸如PG)及氣體，且由此活化最低限度地引起氣體填充之磷脂微球體。如在本文中更詳細描述的，諸如DEFINITY® 之情況，磷脂可存在於含水溶液中，或諸如包括例如DEFINITY-II之新穎UCA調配物之情況，磷脂可存在於非水溶液中，由此，在一些例子中，活化包含在氣體(諸如全氟化碳氣體(例如，全氟丙烷))存在下搖動含水磷脂懸浮液。在其他例子中，活化包含在氣體(全氟化碳氣體(例如，全氟丙烷))存在下搖動磷脂溶液。應理解全氟丙烷、全氟丙烷氣體及八氟丙烷在本文中可互換地使用。 如本文中所使用，搖動係指攪動溶液(無論含水或非水)以使得氣體自容器(例如，小瓶)內的局部周圍環境引入至溶液中的運動。攪動溶液及導致氣體引入的任何類型之運動可用於搖動。搖動必須具有足夠的力量或速率以使一段時間後形成泡沫。較佳地，搖動具有足夠的力量或速率，以使得泡沫在較短時間段內形成，如由特定UCA調配物所指定。由此，在一些例子中，此類搖動進行約30秒，或約45秒，或約60秒，或約75秒，或約90秒，或約120秒，包括例如30秒，或45秒，或60秒，或75秒，或90秒，或120秒。在一些例子中，活化可進行介於60至120秒之範圍內、或90至120秒之範圍內的時間段。 本發明預期在一些例子中，搖動時間(或持續時間)將視經活化之UCA調配物的類型而變化。舉例而言，在一些例子中，含水UCA調配物相比非水性UCA調配物可搖動較短時間段。本發明預期在此類例子中，搖動速率(或搖動速度，因為彼等術語在本文中可互換地使用)可為恆定。由此，諸如活化或搖動裝置之活化或搖動構件可設定為以一個速率(例如，根據每分鐘搖動動作之數目來定義)搖動持續兩個或多於兩個不同的預定時間段。 本發明進一步預期在一些例子中，搖動速率將視經活化之UCA調配物的類型而變化。舉例而言，在一些例子中，(含水)磷脂懸浮液相比(非水)磷脂溶液可以較慢搖動速率搖動。本發明預期在此類例子中，搖動時間(或持續時間，因為彼等術語在本文中可互換地使用)可為恆定。 如下文所描述可用VIALMIX® 使DEFINITY® 活化。DEFINITY® 活化涉及在全氟丙烷存在下劇烈搖動(含水)磷脂懸浮液，在使用VIALMIX® 的情況下持續約45秒。除非另外指示，否則關於活化時間之術語「約」意指標註時間之+/- 20%(亦即，45 +/- 9秒)的時間。 亦可用VIALMIX® 使DEFINITY-II活化。DEFINITY-II活化涉及在全氟丙烷存在下劇烈搖動(非水)磷脂溶液，持續約60至120秒。在一些例子中，使DEFINITY-II活化約75秒(亦即，75 +/- 15秒)。可使DEFINITY-II活化更長時間段，包括90至120秒。 可藉由渦漩(諸如藉由渦流)、左右或上下運動搖動。此外，可組合不同類型之運動。可藉由搖動容納含水或非水磷脂溶液之容器(例如，小瓶)，或藉由在不搖動容器(例如，小瓶)自身之情況下搖動容器(例如，小瓶)內之含水或非水溶液來進行搖動。藉由機器進行搖動以便使製程標準化。機械搖動器為此項技術中已知的，且其搖動機構或構件可用於本發明之裝置中。實例包括諸如彼等用於牙科應用之拌和器。劇烈搖動涵蓋每分鐘至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少4500、至少5000或更多個搖動動作。在一些例子中，劇烈搖動包括每分鐘搖動4000至4800個範圍內的搖動動作。例如VIALMIX® 以每分鐘搖動4530個「8字形」迴轉為目標，且耐受每分鐘4077至4756個迴轉之範圍內的搖動速率。渦流涵蓋每分鐘至少250、至少500、至少750、至少1000或更多個迴轉。以每分鐘至少1000個迴轉之速率的渦流為劇烈搖動之實例，且在一些例子中更佳。以每分鐘1800個迴轉的渦流為最佳。 搖動速率可影響所需搖動持續時間。較快搖動速率將傾向於減少達成最佳微泡形成所需搖動時間之持續時間。舉例而言，以4530 rpm搖動45秒持續時間將在VIALMIX® 上達成3398個總迴轉。以3000 rpm搖動將要求68秒以達成相同數目之迴轉。所要求之持續時間及搖動速度亦將受行進路徑之形狀及搖動之幅度影響。容器中液體達到之速度及對改變方向施加之力將影響氣體併入。此等態樣將基於搖動器臂長及路徑、容器形狀及尺寸、填充容量及調配物黏度受影響。水在15℃下之黏度大致為1.14 cps。(Khattab, I.S. 等人, Density, viscosity, surface tension, and molar volume of propylene glycol + water mixtures from 293 to 323 K and correlations by the Jouyban-Acree model Arabian Journal of Chemistry (2012)。對比而言，丙二醇在25℃下之黏度為42 cp (Khattab, I.S. 等人, Density, viscosity, surface tension, and molar volume of propylene glycol + water mixtures from 293 to 323 K and correlations by the Jouyban-Acree model Arabian Journal of Chemistry (2012))且甘油在15℃下之黏度為2200 cp (Secut JB, Oberstak HE Viscosity of Glycerol and Its Aqueous Solutions. Industrial and Engineering Chemistry 43. 9 2117- 2120 1951)。DEFINITY-II在15℃下具有1150 cps之較高黏度。此係因為DEFINITY® 主要為水，其比DEFINITY-II黏度低許多。 可藉由泡沫存在於含水或非水溶液頂部及溶液變白來偵測活化時之充氣微球體之形成。 在低於所採用磷脂之凝膠態至液晶態相轉變溫度的溫度下進行活化。藉由「凝膠態至液晶態相轉變溫度」，其意謂在磷脂層(諸如脂質單層或雙層)將自凝膠態轉化至液晶態之溫度。此轉變描述於例如Chapman等人，J. Biol. Chem. 1974 249, 2512-2521中。各種磷脂之凝膠態至液晶態相轉變溫度將對熟習此項技術者為顯而易見的，且描述於例如Gregoriadis編, Liposome Technology, 第I卷, 1-18 (CRC出版社，1984)及Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC出版社，Boca Raton, Fla. 1990)，第139頁中。劇烈搖動可基於搖動速度、持續時間、搖動器臂長及路徑、容器形狀及尺寸、填充容量及調配物黏度引起調配物變熱。 鑒於本發明，熟習此項技術者將理解可在磷脂或磷脂微球體經受本文所提供之方法之前或之後對其進行操縱。舉例而言，在搖動完成之後，充氣微球體可自其容器(例如，小瓶)中抽取出來。可藉由以下來實現抽取：將注射器之針或無針尖端(例如，PINSYNC® )插入至容器中(包括至泡沫中，若適宜)，及藉由抽回柱塞將預定量之液體吸入至注射器之機筒中；或藉由添加含水液體，，混合，及藉由抽回柱塞將預定量之液體吸入至注射器之機筒中。作為另一實例，充氣微球體可經過濾以獲得大體上均一尺寸之微球體。過濾總成可含有可能為或可能不為彼此緊鄰的超過一個過濾器。 使用超音波顯影劑以使個體成像之方法 本文亦提供使用經磷脂囊封之氣體微球體及其調配物的方法。氣體微球體及其調配物可在人類或非人類個體中活體內使用，或其可在活體外使用。其可以用於診斷或治療目的或用於組合之診斷及治療目的。 當用於人類個體中時，經磷脂囊封之氣體微球體及其調配物可直接(純淨的)使用或可進一步在溶液(包括醫藥學上可接受的溶液)中稀釋且以一或多次推注或藉由連續輸液來投與。投與通常為靜脈內注射。隨後在其不久之後進行成像。成像應用可針對心臟或其可涉及對超音波成像敏感的身體之另一區域。成像可為身體之一或多個器官或區域之成像，包括(但不限於)心臟、血管、心血管、肝、腎及頭。 本發明之個體包括(但不限於)人類及動物。在一些例子中人類為較佳的。動物包括諸如狗及貓之伴侶動物，及農業或獎金動物，諸如(但不限於)公牛及馬。 以有效量投與UCA。有效量將為促進或引起預期的活體內反應及/或應用的量。在諸如超音波應用之成像應用的情形中，有效量可為允許個體或個體之區域成像的經磷脂囊封之氣體微球體的量。 實例1 實例方法 1.1磷脂及磷脂摻合物及試劑 磷脂以單獨的粉末形式使用，以粉末形式組合在一起且以混合物形式使用，或藉由溶解及乾燥摻合在一起(下文描述詳情)。除非在摻合物中進行直接量測，否則單獨的磷脂之含量量測值用以估計非水濃縮物或含水製劑中之最終鈣或鎂濃度。具有較低鈣之溶劑用於全部研究。1.1.1 磷脂摻合物 一種磷脂摻合物(LB)藉由以下來製備：將DPPC、DPPA、MPEG5000-DPPE (0.401:0.045:0.304 [wt:wt:wt])溶解於甲苯/甲醇中，用真空及加熱濃縮，且隨後藉由添加甲基第三丁基醚(MTBE)來製成漿料。收集固體材料，用MTBE洗滌且經乾燥(與專利US8084056一致)。或者，在55℃下將DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE (0.401:0.045:0.304 [wt:wt:wt])溶解於甲醇中。隨後使甲醇蒸發且以磷脂摻合物形式回收固體。類似地，DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE (0.401:0.045:0.304 [wt:wt:wt])作為固體粉末組合在一起且用刮勺將該等粉末混合在一起。1.1.1.1 用於磷脂摻合物之殘餘溶劑法 使用GC頂部空間藉由FID測定磷脂摻合物中之殘餘溶劑。將樣品稱重，轉移至另外的20 cc頂部空間小瓶中且溶解於N-甲基吡咯啶酮中。在N-甲基吡咯啶酮中製備一組殘餘溶劑標準品。使用GC頂部空間藉由FID分析標準品及樣品。各殘餘溶劑之濃度計算自彼溶劑之校準曲線。1.1.2 鈣量測 使用ICP-MS或AA對單獨的脂質、脂質摻合物、甘油及丙二醇中之鈣水準進行定量。亦利用此等方法在一些樣品中量測鎂及其他金屬離子。1.1.1.2 ICP - MS ( 感應耦合電漿 - 質譜法 ) 法 樣品藉由以下來製備：將其稱入預清潔的石英消化罐中。添加基質加標(matrix spike)，且隨後與硝酸及鹽酸混合。在封閉的容器微波消化系統中消化樣品。冷卻後添加內標溶液，且經稀釋，且藉由ICP-MS使用He碰撞模式來分析。1.1.1.3 AA ( 原子吸收光譜法 ) 法 樣品藉由以下來製備：稱入乾燥的「痕量金屬清除」消化容器，且用硝酸及鹽酸溶解，且與H2 O2 一起回流。用水洗滌樣品溶液且過濾。一組標準品用以校準AA，且隨後自校準曲線讀取樣品之吸光度。單獨脂質、磷脂摻合物及調配物溶劑之結果提供於表 1 中。表 1 . 單獨脂質 、 脂質摻合物及溶劑中之 Ca + 2 及 Mg + 2 水準 a a 藉由ICP-MS測定b ppm=百萬分之一且等效於µg/gc 磷脂摻合物由DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE (0.401:0.045:0.304 [wt:wt:wt])組成d 使用MPEG5000-DPPE(高Ca+2 )批次1製備脂質摻合物，批次2 1.2含水調配物製備 1.2.1 非水磷脂濃縮物 ： 在於55℃至70℃下恆定攪拌的情況下藉由以下來製備磷脂濃縮物：以任何順序將單獨脂質(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE低Ca+ 2 或MPEG5000-DPPE高Ca+ 2 或組合)、將磷脂摻合物(LB)、或將含有高水準Ca+ 2 之LB添加至25-115 ml丙二醇(PG)、或1:1 v/v丙二醇/甘油(PG/G)或甘油媒劑中。在一些情況下，在無DPPA之情況下或在於添加脂質之前添加乙酸鈣的情況下製備脂質濃縮物。1.2.2 含水調配物 ： 在於55℃至70℃下恆定攪拌的情況下藉由向400至500 mL水中添加以下來製備含水調配物：七水合磷酸氫二鈉；單水合磷酸二氫鈉；氯化鈉；丙二醇；甘油及最終之非水磷脂濃縮物。在一些情況下，在將非水磷脂濃縮物添加至本體混配溶液中之前或之後添加乙酸鈣。在其他情況下，不包括磷酸鹽緩衝液。 1.3非水調配物製備 1.3.1 非水調配物 在於60℃±5℃下恆定攪拌的情況下，將以任何順序之單獨脂質(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE低Ca+ 2 或MPEG5000-DPPE高Ca+ 2 或兩者之組合)、LB或含有高水準Ca+ 2 之LB添加至25至100 mL含有0.005 M乙酸鹽緩衝液(90/10，乙酸鈉/冰乙酸)媒劑之丙二醇(PG)中。在溶解之後，隨後添加甘油以產生非水調配物。 1.4使用儲備溶液添加鈣及 / 或鎂 1.4.1 初步研究 於丙二醇中製備僅乙酸鈣、僅乙酸鎂之儲備溶液及兩者之混合物(分別為25.4 µg Ca+ 2 /g、28.0 µg Mg+ 2 /g及14.0 µg Ca+ 2 /g與12.7 µg Mg+ 2 /g)。單獨的儲備溶液以等分添加至33 mL含有脂質摻合物(15 mg/mL)之丙二醇中達到至多總共1 mL。將該等溶液與僅丙二醇相比較，且記錄首先展示混濁之溶液。1.4.2 使用參考標度之後續研究 於丙二醇(299 Ca+ 2 µg/g)、丙二醇及甘油(299 Ca+ 2 µg/g)或水(6085 Ca+ 2 µg/g)中製備單水合乙酸鈣之儲備溶液，且媒劑在添加至丙二醇、非水磷脂濃縮物或含水調配物中(在添加非水磷脂濃縮物之前或之後)時匹配。添加鈣原料最大值為始終＜總容積之12%。 一些非水磷脂濃縮物用乙酸鈣來滴定。藉由目視檢查以0、+、++、+++標度評估外觀。圖 1 提供用於測定之標度，且使用以15 mg總脂質/mL調配於丙二醇中之低Ca+ 2 脂質(DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE；0.401:0.045:0.304 [wt:wt:wt])來產生。 1.5過濾： 1.5.1 含水調配物 所製備的磷脂含水懸浮液樣品在過濾之前保持在55℃下。將樣品置放於55℃溫度經控制之60 mL注射器中，該注射器附接有13 mm親水性的聚偏二氟乙烯(PVDF) 0.22 µm膜針筒過濾器。將5 psi氮氣排出壓力施加於注射器。藉由隨時間對過濾溶液進行稱重且每30秒讀取一次來測定流動速率。計算每時間點之流動速率，且將在9至10分鐘之間的平均流動與初始流動(0至1分鐘)相比且以百分比表示。過濾全程連同樣品一起收集預過濾樣品用於磷脂濃度分析。1.5.2 非水調配物 所製備的磷脂非水溶液之樣品在過濾之前保持在60℃下。將樣品置放於60℃溫度經控制之60 mL注射器中，該注射器附接有25 mm親水性聚醚碸(PES) 0.2 µm膜針筒過濾器。將10 psi氮氣排出壓力施加於注射器。藉由隨時間對過濾溶液進行稱重且每30秒讀取一次來測定流動速率。計算每時間點之流動速率，且將在8至9分鐘之間的平均流動與初始流動(0至1分鐘)相比且以百分比表示。當過濾器經升溫時發現澄清溶液中之流動速率隨著時間增加。如上文所概述收集樣品。 1.6磷脂分析： 在一些情況下分析樣品之磷脂含量。將樣品轉移至HPLC小瓶且藉由逆相HPLC分離及電暈電霧式偵測器(CAD；HPLC With Charged Aerosol Detection for the Measurement of Different Lipid Classes, I.N. Acworth, P.H. Gamache, R. McCarthy及D. Asa, ESA Biosciences Inc., Chelmsford, MA, USA; J. Waraska 及I.N. Acworth, American Biotechnology Laboratory, 2008年1月)來分析，且相對於參考標準品來定量。 1.7產物製備及測試 1.7.1 含水調配物 將經過濾之含水調配物(參見章節1.5.1)等分(1.76 mL)至2 cc惠頓小瓶中，頂部空間空氣用全氟丙烷(PFP)氣體替換，該瓶用韋斯特(West)灰色丁基塞子密封，且用鋁密封件捲邊。1.7.2 非水調配物 將經過濾之含水調配物(參見章節1.5.2)等分(0.35 mL)至2 cc惠頓小瓶中，頂部空間空氣用全氟丙烷(PFP)氣體替換，該瓶用韋斯特(West)灰色丁基塞子密封，且用鋁密封件捲邊。1.7.3 Sysmex 微球體尺寸測定 (sizing) ： 使用粒徑分析儀(Malvern FPIA-3000 Sysmex)分析樣品之數目及尺寸分佈。最佳使用VIALMIX®活化含水或非水樣品，用鹽水稀釋經活化產物的一部分，且隨後轉移至Sysmex之樣品容器。Sysmex使用適合之外鞘溶液且使用低功率場及高功率場兩者分析樣品以產生指定尺寸範圍(在目前研究中1至80 µm)之尺寸測定資料。1.7.4 活化產物之超音波顯影： 使用Philips Sonos 5500臨床超音波成像系統量測所選擇樣品之聲衰減。在用VIALMIX® 最佳活化之後，將10微升樣品在室溫下吸取加入至含有200 ml 0.9%鹽水之250 mL燒杯內。圓形帶葉片之38 mm直徑攪拌棒保持溶液均一性且充當聲反射器。超音波系統之s3臨床換能器位於燒杯之頂部，恰好進入溶液中且在攪拌棒上緣之上方4.8 cm處。隨後在引入樣品之後的10秒時開始，數位採集五秒之120 Hz影像且寫入磁碟。美國系統以IBS模式使用，對於所有深度TGC固定於最小值下，且禁用LGC。機械指數(MI)為0.2以及功率設定最大值之下18 dB。接收增益固定為90且壓縮固定為0。對於經測試之各樣品，在樣本注入之前(空白組)及之後獲取美國資料採集。 使用Philips QLab 2.0版進行影像分析，其讀取由美國系統產生之檔案且以dB為單位計算IBS模式之數值。所關注區域在攪拌棒上繪出且將dB值導出至Excel。隨後在完整5秒(大致360視訊圖框)採集內對此等值進行平均。藉由自平均空白組ROI值減去平均樣品ROI值(兩者均以dB為單位)獲得衰減量測值。將此量測值除以美國換能器與攪拌棒上緣之間距離的兩倍以得到以dB/cm為單位之衰減。數值隨後除以所計算的燒杯內微泡濃度且根據每百萬微泡/毫升的每公分dB衰減來表示。實例 1 ： 將鈣添加至非水磷脂溶液中之影響 此實例表明鈣及鎂離子對於磷脂沈澱之影響。實例 1 . 1 ： 對於將鈣及鎂添加至非水溶液中之影響的初始研究 在初始研究中，將表徵為具有較低二價金屬離子濃度之脂質摻合物(LB，批次1) (實例方法中之表 1 )在55℃±5℃下添加至丙二醇中且攪拌。藉由目測驗證磷脂已完全溶解且所得溶液為澄清的。用鈣(25.4 µg Ca+ 2 /g)、鎂(28.0 µg Mg+ 2 /g)或組合(1:1以製造含有14.0 µg Ca+ 2 /g及12.7 µg Mg+ 2 /g之溶液)滴定此LB溶液且分別在3.60 µg Ca+ 2 /g、4.23 µg Mg+ 2 /g及2.35 µg/g組合金屬離子/g非水磷脂溶液下展示混濁。實例 1 . 2 ： 對於將鈣添加至非水溶液中之影響的後續研究 實驗如下進行：將表徵為具有較低二價金屬離子濃度之DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(實例方法中之表 1 )單獨地(以表 2 中所展示之順序)添加或作為混合物或摻合物添加至經加熱(55℃±5℃)及經攪拌之丙二醇(PG)中或丙二醇與甘油之1:1混合物(PG/G)中。藉由目測驗證磷脂已完全溶解且所得溶液為澄清的(=0：等級標度參見實例方法章節 1 . 4 . 2 ， 圖 1 )。圖 2 說明當連續添加DPPC、MPEG5000-DPPE、DPPA及乙酸鈣原料(添加1 mL每mL 299 µg Ca+ 2 之原料以產生具有每g溶液11.1 µg Ca+ 2 之脂質濃縮物)時脂質濃縮物在丙二醇中的外觀。脂質濃縮物並未變混濁，直至添加鈣。 藉由一系列少量添加之鈣滴定PG或1:1混合物PG/G中之磷脂溶液。每次添加之後，評定溶液之澄清度(等級標度參見實例方法章節 1 . 4 . 2 ， 圖 1 )，且在表 2 中展示產生+、++及+++評分之最低鈣濃度。圖 3 展示用於研究4滴定之代表性溶液。表 2 . 將鈣添加至非水磷脂溶液中之影響 a 定義於方法章節1.4中b 用乙酸鈣儲備溶液(299 µg Ca+ 2 /g儲備溶液)滴定c 藉由將單獨的磷脂添加至丙二醇(25 mL)中來達成DPPA (0.9 mg/ml)、DPPC (8.02 mg/ml)及MPEG5000-DPPE (6.08 mg/ml)最終濃度d 磷脂摻合物(15 mg/ml)，在55℃下利用甲醇溶解磷脂隨後乾燥，溶解於25 mL丙二醇中來製造e 磷脂混合物：DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE(0.045:0.401:0.304)，粉末經攪拌在一起且用於在25 mL丙二醇中混配。最終濃度為15 mg/mLf 藉由將單獨的磷脂[DPPA (0.9 mg/mL)、DPPC (8.02 mg/mL)及MPEG5000-DPPE (6.08 mg/mL)]添加至25 mL，1:1 (v/v)丙二醇:甘油中來製造磷脂溶液g 藉由將單獨的磷脂[DPPA (0.225 mg/mL)、DPPC (2.00 mg/mL)及MPEG5000-DPPE (1.70 mg/mL)]添加至100 mL，1:1 (v/v)丙二醇:甘油中來製造磷脂溶液 鈣滴定在磷脂溶液中產生明顯隨濃度變化的沈澱，無論磷脂係如何添加(單獨地、作為混合物或作為摻合物)至丙二醇中(參見表 2 )。脂質不可溶於僅甘油或25 mL 1:1 PG/G任一者中，但當添加至100 mL 1:1 PG/G (研究8)中時確實獲得澄清溶液。鈣在脂質溶液中產生隨濃度變化的沈澱，與初始發現一致(參見表 2 )。總體而言，此等滴定研究指示產生沈澱之最低鈣濃度、鎂濃度及組合濃度為1.5 µg Ca+ 2 /g、4.23 µg Mg+ 2 /g及2.35 µg組合金屬離子/g非水磷脂溶液。實例 2 ： 含有鈣之磷脂溶液組分在混合時之影響 實例 2 . 1 ： PG 中之 鈣 研究9如下進行：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPC、MPEG5000-DPPE及DPPA粉末(參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 3 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之含有11 µg/g鈣的PG中。評定澄清度(參見章節 1 . 4 )且在DPPC溶解之後溶液為澄清的，在添加DPPA之後變為且保持混濁，且在添加MPEG5000-DPPE之後保持混濁。觀測到的混濁度評分為+++ (圖 1 ， 章節 1 . 4 )。此與當此等磷脂(包括DPPA)添加至含有較低鈣之PG (研究1之初始溶液)中時所產生的澄清溶液相反。此進一步藉由研究12來強調，其中僅含有高Ca+ 2 水準之磷脂DPPC及MPEG5000-DPPE經溶解且此溶液即使在鈣之存在下仍保持澄清。實例 2 . 2 ： 脂質摻合物中來自 MPEG5000 - DPPE 之 鈣 初始實驗對磷脂摻合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沈澱出磷脂摻合物來製造)進行，該磷脂摻合物含有DPPC、DPPA及分別含有較低(未偵測到Ca+ 2 及1 µg Mg+ 2 /g，MPEG5000-DPPE)或較高(980 µg Ca+ 2 /g及150 µg Mg+ 2 /g，MPEG5000-DPPE 批次1)鈣及鎂的MPEG5000-DPPE，將其添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之丙二醇中。混合兩種脂質摻合物以提供大致為0、1.75、4.11及12.9 µg組合Ca+ 2 及Mg+ 2 /g非水磷脂溶液之樣品。1.75 µg組合Ca+ 2 及Mg+ 2 /g非水磷脂溶液展示混濁。 後續研究10及11如下進行：將含有DPPC、DPPA及含有較高(980 ppm Ca+ 2 ，150 ppm Mg+ 2 ，批次1)或較低(4 ppm Ca+ 2 )鈣之MPEG5000-DPPE的磷脂摻合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沈澱出磷脂摻合物來製造)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之PG中。評定澄清度(參見章節 1 . 4 )且在含有較高鈣(量測為370 ppm Ca+ 2 及54 ppm Mg+ 2 )之磷脂摻合物之情況下觀測到輕微混濁(+；參見章節 1 . 4 中之實例方法)。此與藉由溶解含有較低鈣(不可偵測水準之Ca+ 2 及Mg+ 2 )之磷脂摻合物(參見表 3 )所產生的澄清溶液相反。表 3 . 含有鈣之磷脂溶液組分在混合時之影響 a 定義於方法章節1.4中b 藉由將單獨的磷脂添加至丙二醇(25 mL)中來達成DPPA (0.9 mg/mL)、DPPC (8.02 mg/mL)及MPEG5000-DPPE (6.08 mg/mL)最終濃度c 當DPPC溶解時溶液為澄清的，在添加MPEG5000-DPPE之後保持澄清 在添加DPPA之後變混濁d DPPC (8.02 mg/mL)及含有Ca+ 2 之MPEG5000-DPPE (6.08 mg/mL；980 ppm Ca+ 2 及150 ppm Mg+ 2 )；藉由將單獨的磷脂添加至丙二醇(25 mL)中來達成最終濃度，不添加DPPAe 當添加DPPC及MPEG5000-DPPE時溶液為澄清的f 使用甲苯及甲醇以溶解磷脂且添加MTBE以沈澱出磷脂摻合物，溶解於中25 mL丙二醇中，來製造磷脂摻合物(15 mg/mL)實例 2 . 3 ： 來 自單獨地添加之 MPEG5000 - DPPE 的 鈣 研究13至17如下進行：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPA及DPPC (參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 4 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之PG中。添加含有不同的比例之「較低」及「較高」鈣及鎂物質之MPEG5000-DPPE。評定澄清度(參見章節 1 . 4 ， 圖 1 中之實例方法)且觀測到隨鈣及鎂濃度變化的沈澱(參見表 4 及圖 4 )。表 4 . 來自作為單獨的組分添加之 MPEG5000 - DPPE 的 鈣及鎂 a 定義於方法章節1.4中b 藉由將單獨的磷脂添加至丙二醇(25 mL)中來達成DPPA (0.9 mg/mL)、DPPC (8.02 mg/mL)及MPEG5000-DPPE (6.08 mg/mL)最終濃度c MPEG5000-DPPE之百分比；相對於總計之較低Ca+2 [4 ppm]及較高Ca+2 [520 ppm Ca+2 ，110 ppm Mg+2 ]d n/p = 未進行；磷脂[DPPC (8.02 mg/mL)及DPPA (0.9 mg/mL)]未溶解於丙烯及二醇溶劑系統e 丙二醇及甘油50:50 (v/v)實例 2 之概述 此等研究總體上表明在非水溶劑中或經由磷脂摻合物或以作為單獨的化合物之MPEG5000-DPPE添加時，鈣之添加均引起沈澱。對於實例 2 有影響之濃度與實例 1 中之彼等濃度相比為類似的。產生混濁(+)之最低鈣濃度為0.7 µg/g Ca+ 2 (0.8 µg/g總Ca+ 2 及Mg+ 2 )。此為類似於實例1 中所發現的1.5至2.6 µg/g之濃度。實例 3 ： 將非水磷脂溶液添加至含水溶劑中 實例 3 . 1 ： 非水磷脂溶液中之鈣對向含水溶劑中添加的影響 進行一系列研究以檢查在轉移至含水調配物中之前非水磷脂溶液中之鈣的影響。此等研究涉及以下步驟：1)製備非水磷脂溶液，2)製備含水溶液及3)組合來自1及2之溶液。實例 3 . 1 . 1 ： 製備非水溶液 ： 在磷脂溶解之後將鈣添加至非水溶液中 與實例 2 一致，研究19、20及22中之第一步驟為如下：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 5 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃，除研究22之外，其為加熱至70℃)且經攪拌之丙二醇中。藉由目測驗證磷脂已完全溶解且所得溶液為澄清的(參見章節 1 . 4 ， 圖 1 中之實例方法)。如表 5 中所指示添加乙酸鈣[Ca(OAc)2 ]於丙二醇中之溶液，該溶液經攪拌且觀測外觀中之變化，與溶劑空白組相比較且記錄澄清度之評定。當添加乙酸鈣時，溶液變混濁。此等丙二醇濃縮物如下文所描述轉移至水相。實例 3 . 1 . 2 製備非水溶液： MPEG5000 - DPPE 中之 鈣 研究21及25中之第一步驟為如下：將DPPC、DPPA(未包括於研究25中)及含有鈣之MPEG5000-DPPE粉末(980 ppm，MPEG5000-DPPE 批次1；參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 5 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之PG中。評定澄清度且在研究21中添加DPPA之後觀測到顯著混濁(+++；參見章節 1 . 4 ， 圖 1 中之實例方法)，且在添加MPEG5000-DPPE之後保持混濁，而在不含有DPPA之研究25中未觀測到混濁。此等非水磷脂溶液如下文所描述轉移至水相。實例 3 . 1 . 3 ： 製備非水溶液 ： 脂質摻合物中來自 MPEG5000 - DPPE 之 鈣 與實例 2 一致，研究23及24中之第一步驟如下進行：將含有DPPC、DPPA及分別含有較低(4 ppm 批次2)或較高(980 ppm，MPEG5000-DPPE 批次1)鈣之MPEG5000-DPPE的磷脂摻合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沈澱出磷脂摻合物來製造)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之丙二醇中。評定澄清度且在含有較高鈣之磷脂摻合物的情況下觀測到顯著混濁(+++；參見章節 1 . 4 ， 圖 1 中之實例方法)。此與藉由溶解含有較低鈣之磷脂摻合物(參見表 5 )所產生的澄清溶液相反。此等非水磷脂溶液如下文所描述轉移至水相。實例 3 . 1 . 4 ： 製備非水溶液 ： 添加磷脂之前 PG 中之 鈣 與實例 2 一致，研究28及30中之第一步驟如下進行：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 5 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之PG中，PG分別含有11 µg/g鈣或含有添加磷脂之後所添加的鈣。評定澄清度(參見章節 1 . 4 ， 圖 1 中之實例方法)且在研究28中，在DPPC及MPEG5000-DPPE溶解之後溶液為澄清的，但在添加DPPA之後變為且保持混濁。在研究30中，在DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE溶解之後溶液為澄清的，且在添加Ca+ 2 之後變混濁。兩個研究之混濁度均評分為+++(參見表 5 )。此等非水磷脂溶液如下文所描述轉移至水相。實例 3 . 2 ： 製備含水溶液 ： 對於全部研究，含水溶液如下製備：在另一分開之容器中，將氯化鈉(NaCl)、七水合磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 •7H2 O)及磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 •H2 O)添加至在攪拌容器中之水中，且混合直至溶解。亦按需要添加丙二醇及甘油，如此最終添加之磷脂濃縮物將重新構成為8:1:1水:甘油:丙二醇組合物。此經攪拌之溶液保持在55℃±5℃下(除其中含水溶液保持在70℃下之研究22以外)。實例 3 . 3 ： 組合非水溶液及含水溶液 對於全部研究，將非水磷脂濃縮物添加至含水溶液中如下進行：添加丙二醇中之溫熱磷脂且以100至150 rpm攪拌。記錄目測結果且指出用於完全分散或溶解(澄清或混濁任一者)之時間。隨後收集此等含水懸浮液且在55℃下在5 psi排出壓力下通過0.2 μm過濾器過濾。量測流動速率且收集樣品以用於磷脂量測(程序參見實例方法)。分析過濾前及過濾後樣品以確定與過濾有關的磷脂損失水準。表 5 . 非水磷脂溶液中之二價金屬離子對向含水溶劑中添加的影響 a 藉由在55℃下以所列順序將DPPC (C)、MPEG5000-DPPE (E)及DPPA (A)以0.401:0.304:0.045之比率溶解在丙二醇中來製備15 mg/mL之磷脂濃縮物。b 將磷脂濃縮物添加至混配容器中，該混配容器含有：每mL混配溶液中水(800 mg)；七水合磷酸氫二鈉(2.16 mg)；單水合磷酸二氫鈉(2.34 mg)；氯化鈉(4.84 mg)、甘油(126 mg)及丙二醇(51.75 mg)。物質在55℃下以所列順序組合。c 定義於方法章節 1 .4 .2 中d 具有CAD偵測之HPLC描述於章節 1 .6 中e 在添加脂質之後，在轉移至含水混配溶液中之前，1 mL、2 mL及2 mL(分別為研究20、22及30)每g PG 299 µg Ca+2 之原料f 含有Ca+2 (6.08 mg/mL；520及110 ppm Ca+2 及Mg+2 )之MPEG5000-DPPE用於實驗g 全部混配均在70℃下進行h 含有Ca+2 (6.08 mg/mL；980及150 ppm Ca+2 及Mg+2 )之MPEG5000-DPPE用於實驗i 使用甲苯及甲醇以溶解脂質且添加MTBE以沈澱出脂質摻合物來製造。將所得脂質摻合物添加至25 mL丙二醇(15 mg/mL)中。研究23使用低Ca+2 脂質摻合物且研究24使用含有Ca+2 及Mg+2 (分別為370及54 µg/g)之脂質摻合物。k 在添加脂質之前，添加1 mL每g PG 299 µg Ca+2 之原料 與前述實例一致，此等研究展示當存在較高的鈣或鈣及鎂時，非水磷脂溶液中出現沈澱。無論鈣是在添加磷脂之前存在於丙二醇中、在添加磷脂之後添加還是與磷脂組分中之一種一起(與MPEG5000 DPPE一起或在磷脂摻合物中)添加，均出現此沈澱。一旦沈澱形成，在與含水溶劑混合時其不分散。此產生混濁含水製劑，該含水製劑具有減小之初始過濾速率且經常阻塞0.2 µm過濾器(表 5 ；圖 5 )。混濁含水製劑之濾過物為澄清的，但磷脂量測指示DPPA水準始終降低。此影響對於單獨地添加之磷脂及以摻合物形式添加之磷脂兩者均為明顯的。實例 3 . 4 ： 將 非水磷脂溶液添加至含有鈣之含水溶劑中的影響 進行一系列研究以檢查溶液含水中之鈣對於磷脂懸浮液製備的影響。此等研究涉及以下步驟：1)製備非水磷脂溶液，2)製備含水溶液及3)組合來自1及2之溶液。實例 3 . 4 . 1 ： 製備非水溶液 與實例 1 一致，研究26、27及29中之第一步驟如下進行：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 6 中所展示之順序)添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之丙二醇中。藉由目測驗證磷脂完全溶解且所得溶液為澄清的。此等丙二醇濃縮物如下文所描述轉移至水相。實例 3 . 4 . 2 ： 製備含水溶液 在另一分開之容器中，將氯化鈉(NaCl)、七水合磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 •7H2 O)及磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 •H2 O)添加至在攪拌容器中之水中，且混合直至溶解(對於研究29，調配物不包括磷酸鹽)。亦按需要添加丙二醇及甘油，如此最終添加之非水磷脂溶液將重新構成為8:1:1水:甘油:丙二醇組合物。在一些研究中，如表 6 中所指示添加乙酸鈣[Ca(OAc)2 ]於水中之溶液。此含水溶液經攪拌，保持在55℃±5℃下。鑑別出在無任何磷脂存在下添加48.4 µg/g鈣引起含水溶液中顯著的絮凝(參見表 6 ， 研究A)。在12.2 µg/g鈣下，含水溶液中無沈澱產生(參見表 6 ， 研究B)。實例 3 . 4 . 3 ： 組合非水溶液及含水溶液 對於全部研究，將非水磷脂濃縮物添加至含水溶液中如下進行：添加溶解於丙二醇中之溫熱磷脂且以100至150 rpm攪拌。記錄目測結果且指出用於完全分散或溶解係穩定(澄清或混濁任一者)之時間。對於研究27，含水調配物初始為澄清的。鈣經滴定且在≥30.4 µg/g之濃度下形成混濁沈澱(參見表 6 )。然而，注意到在48.4 µg/g下，不含磷脂之含水溶液已顯著沈澱(研究A；表 6 )。在研究27中，在僅未影響含水溶液之鈣水準下(基於研究B，表 6 ，12.2 µg/g)，未發現對於含水磷脂調配物澄清度之影響。此在研究26中得到確認，其中在與非水磷脂濃縮物組合之前，將鈣添加至含水溶液中(12.2 µg/g)。此進一步在研究29中擴展，其中含水溶液不包括磷酸鹽緩衝液。初始地，在與非水磷脂濃縮物組合之前將鈣添加至含水溶液中(12.2 µg/g)且調配物為澄清的。在添加磷脂之後將額外的鈣添加至該調配物中直至96 µg/g且未觀測到沈澱。 隨後收集來自研究26及29之含水調配物且在55℃下在5 psi排出壓力下通過0.2 µm過濾器過濾。在10分鐘處的流動速率與初始流動相比未減小；全部樣品為經過濾的且總體上過濾類似於不含鈣之製劑(參見研究19、23及25)。收集過濾前及過濾後樣品且相比較以確定與過濾有關之磷脂損失。沒有明顯的顯著磷脂損失(參見表 6 )。表 6 . 將非水磷脂溶液添加至含有二價金屬離子之含水溶劑中的影響 a 全部混配均在55℃下進行。將非水磷脂溶液添加至含水混配容器中，除非在腳註中另外指示，否則該混配容器含有：水(800 mg)；七水合磷酸鈉(2.16 mg/mL)、單水合磷酸鈉(2.34 mg/mL)、氯化鈉(4.84 mg/mL)、甘油(126 mg)及丙二醇(51.75 mg)。b 「A」為DPPA (0.9 mg/mL)，「C」為DPPC (8.02 mg/mL)且「E」為MPEG5000-DPPE (6.08 mg/mL)，將其以所列順序添加至25 mL丙二醇中c 定義於方法章節 1 .4 中d 具有CAD偵測之HPLC描述於章節 1 .6 中e 在將脂質濃縮物添加至含水混配容器中之前，對於研究26、29、A及B分別添加1 mL、1 mL、4 mL及1 mL乙酸鈣濃縮物(每g水6.085 mg Ca+2 )。 此等研究表明，即使在高達96 µg/g時，鈣仍不引起磷脂在含水調配物中沈澱。然而，在高於12.2 µg/g之鈣水準下，磷酸鹽開始沈澱。實例 4 ： 二價金屬離子對於磷脂溶解於緩衝丙二醇中且伴隨添加甘油的影響 實例 4 . 1 ： 緩衝非水磷脂濃縮物中之鈣滴定 研究31及32如下進行：將表徵為具有較低鈣濃度之DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE粉末(參見實例方法中之表 1 )單獨地(以表 7 中所展示之順序)添加或以磷脂摻合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沈澱出脂質摻合物來製造)形式添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之乙酸緩衝的丙二醇。藉由目測驗證脂質已完全溶解且所得溶液為澄清的(參見章節 1 . 4 中之實例方法)。乙酸鈣[Ca(OAc)2 ]於丙二醇中之溶液用以藉由一系列少量添加來滴定磷脂溶液。溶液經攪拌且如在每次添加之後與空白組溶劑相比較，觀測在滴定期間外觀中之變化，且記錄對澄清度之評定。得到基於此評定之混濁度評分(方法參見章節 1 . 4 ， 圖 1 )且在表 7 中展示產生+、++及+++評分之最低鈣濃度。表 7 . 鈣對於磷脂溶解於緩衝丙二醇中之影響 a 將單獨的脂質[DPPC (4.01 mg)、DPPA (0.45 mg)及MPEG5000-DPPE (3.04 mg)，以所列順序]或脂質摻合物(7.5 mg)在60℃下伴隨攪拌添加至每mL含有乙酸鈉(0.74 mg)及乙酸(0.06 mg)之丙二醇中。b 定義於方法章節1.4中c 使用甲苯及甲醇以溶解脂質且添加MTBE以沈澱出脂質摻合物來製造。實例 4 . 2 ： 緩衝非水磷脂濃縮物中來自 MPEG5000 - DPPE 之 鈣滴定 研究33至36如下進行：將DPPC、DPPA及含有較高(980 ppm，批次1)或較低Ca+ 2 (4 ppm)之MPEG5000-DPPE單獨地(以表 8 中所展示之順序)添加或以磷脂摻合物(使用甲苯及甲醇以溶解且添加MTBE以沈澱出脂質摻合物來製造)形式添加至經加熱(55℃±5℃)且經攪拌之乙酸緩衝的丙二醇。評定澄清度(參見實例方法章節 1 . 4 )且對於含有較高鈣之磷脂摻合物觀測到混濁(+或++；參見實例方法，圖 1 )。此與藉由溶解含有較低鈣之磷脂摻合物(參見表 8 )所產生的澄清溶液相反。實例 4 . 3 ： 添加甘油 在以300 rpm攪拌下將甘油轉移至此等緩衝非水磷脂溶液中。許多氣泡滯留在混合溶液中但一旦攪拌棒停止則得到清除。記錄目測結果且標註澄清度水準(澄清或混濁任一者)。隨後收集此等PG/G溶液且在60℃下在10 psi排出壓力下通過0.2 µm過濾器過濾。量測流動速率且收集用於磷脂量測之樣品。比較過濾前及過濾後樣品以確定與過濾有關之磷脂損失。表 8 . 鈣對於磷脂溶解於緩衝丙二醇及添加甘油的影響 a 將單獨的脂質[DPPC (4.01 mg)、DPPA (0.45 mg)及MPEG5000-DPPE (3.04 mg)，以所列順序]或脂質摻合物(7.5 mg)在60℃下伴隨攪拌添加至每mL含有乙酸鈉(0.74 mg)及乙酸(0.06 mg)之丙二醇中。b 用甘油1:1 (v/v)稀釋含有乙酸鹽緩衝液及磷脂之丙二醇。c 定義於方法章節 1 .4 中d 具有CAD偵測之HPLC描述於章節 1 .6 中e 使用甲苯及甲醇以溶解及添加MTBE以沈澱出脂質摻合物來製造脂質摻合物，較低Ca+2 (批次1)用於研究33且較高Ca+2 (370 Ca+2 及54 ppm Mg+2 ；批次2)用於研究34。f 含有Ca+2 (3.04 mg/mL；980及150 ppm Ca+2 及Mg+2 ；批次1)之MPEG5000-DPPE用於此實驗 此等研究展示沈澱以隨鈣濃度變化之方式出現於緩衝非水磷脂溶液中。無論該緩衝非水磷脂溶液是用單獨的磷脂製造還是用脂質摻合物製造且處於並非顯著不同之濃度，均出現此沈澱。對於緩衝溶液引起初始沈澱之濃度(5.8至11.3 µg/g Ca+ 2 )高於非緩衝溶液(1.5-2.3 µg Ca+ 2 /g：參見表 2 ， 研究1至4)，指示緩衝液之影響， 如在非緩衝溶液中所發現的，來自脂質摻合物之鈣在緩衝非水磷脂溶液中引起沈澱。一旦沈澱形成，在與甘油混合時其不分散。此產生混濁非水調配物，該非水調配物具有減小之初始過濾速率且經常阻塞0.2 µm過濾器(表 8 ；圖 6 )。混濁製劑之濾過物為澄清的，但磷脂量測指示DPPA水準略微降低。實例 5 ： 微球體形成及製品之聲偵測 實例 5 . 1 ： 含水磷脂懸浮液 研究37及38如下進行：在小瓶中製備來自研究19及23之經過濾物質(參見實例方法章節 1 . 7 . 1 ) 。在VIALMIX® 之後，分析活化樣品之微球體尺寸及數目(參見方法章節 1 . 7 . 3 ) 及臨床超音波聲屬性(參見方法章節 1 . 7 . 4 ) ，參見表 9 。 表 9 . 含水磷脂懸浮液微球體數目及尺寸及聲活動性。 a 對於1至80微米範圍內微球體之平均微球體直徑。b 對於1至80微米範圍內微球體之平均微球體濃度。C 詳情參見實例方法章節 此等研究表明當組分具有較低鈣濃度時，可使用單獨的磷脂或磷脂摻合物來產生含水磷脂懸浮液。兩種產物均具有在DEFINITY® 之說明書(參見DEFINITY® 藥品說明書)內之微球體直徑，且對於臨床超音波機器具有較強超音波聲衰減。 態樣及實施例 下文列舉本發明所提供之各種態樣及實施例。 條項1. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料， 量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者的鈣濃度， 將該等DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項2. 如條項1之方法，其進一步包含量測該非水溶劑之鈣濃度。 條項3. 如條項1之方法，其中該等DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料之合併鈣濃度量測值為較低的。 條項4. 如條項1或3之方法，其中該等DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料及該非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的。 條項5. 如條項1之方法，其中量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度。 條項6. 如條項2之方法，其中量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度且該等DPPA、DPPC、MPEG-DPPE原料及該非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的。 條項7. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料， 量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者的鈣濃度， 將具有較低合併鈣濃度量測值的DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項8. 如條項7之方法，其中量測該非水溶劑之鈣濃度且該等DPPA、DPPC、MPEG500-DPPE原料及該非水溶劑具有較低合併鈣濃度量測值。 條項9. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中該MPEG5000-DPPE原料、該DPPA原料、該DPPC原料及該非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項10. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其之一者、兩者或全部三者具有鈣濃度表徵值，其中合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項11. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項12. 如條項11之方法，其中該非水溶劑具有鈣濃度表徵值，且該等MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料及該非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低的。 條項13. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項14. 如條項11之方法，其中該非水溶劑包含(i)丙二醇或(ii)丙二醇及甘油。 條項15. 如條項13或14之方法，其中該非水溶劑包含緩衝液。 條項16. 如條項13或14之方法，其中該非水溶劑包含乙酸鹽緩衝液。 條項17. 如條項13或14之方法，其中該含水溶劑包含緩衝液。 條項18. 如條項13或14之方法，其中該含水溶劑包含磷酸鹽緩衝液。 條項19. 如條項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料單獨地與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。 條項20. 如條項13至18中任一項之方法，其中將該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料以無關順序之方式連續地與該非水溶劑組合，以形成該磷脂溶液。 條項21. 如條項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂混合物，且該磷脂混合物隨後與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。 條項22. 如條項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂摻合物，且該磷脂摻合物隨後與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。 條項23. 如條項22之方法，其中使用有機溶劑溶解沈澱法形成該磷脂摻合物，該方法包含將該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解於甲醇及甲苯之混合物中，視情況濃縮該磷脂/甲醇/甲苯混合物，且隨後使該經濃縮之磷脂/甲醇/甲苯混合物與甲基第三丁基醚(MTBE)接觸以使該等磷脂沈澱，以形成該磷脂摻合物。 條項24. 如條項13至23中任一項之方法，其中該較低鈣濃度為小於115 ppm。 條項25. 如條項13至24中任一項之方法，其進一步包含將該磷脂懸浮液置放在小瓶中，且將全氟化碳氣體導入至該小瓶之頂部空間內。 條項26. 如條項25之方法，其進一步包含用該全氟化碳氣體活化該磷脂懸浮液以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。 條項27. 如條項26之方法，其進一步包含將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。 條項28. 如條項13至27中任一項之方法，其進一步包含量測該DPPA原料及/或DPPC原料及/或磷脂混合物及/或磷脂摻合物之鈣濃度。 條項29. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測DPPC原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之DPPC原料與DPPA原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項30. 如條項29之方法，其中該較低鈣濃度為小於90 ppm。 條項31. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測DPPA原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之DPPA原料與DPPC原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項32. 如條項31之方法，其中該較低鈣濃度為小於780 ppm。 條項33. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測非水溶劑之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之非水溶劑與DPPA原料、DPPC原料及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項34. 如條項33之方法，其中該較低鈣濃度為小於0.7 ppm。 條項35. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項36. 如條項35之方法，其中該MPEG5000-DPPE原料進一步表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子含量。 條項37. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項38. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由如條項1至37中任一項之方法來製備該磷脂懸浮液。 條項39. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成該磷脂懸浮液。 條項40. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項41. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項42. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在低鈣或無鈣條件下，單獨地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含丙二醇(PG)之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項43. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在低鈣或無鈣條件下，以無關順序之方式，連續地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項44. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在不含甲醇及甲苯之條件下，將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂摻合物， 在低鈣或無鈣條件下，將該磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項45. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物， 使該摻合溶劑蒸發以形成經乾燥之磷脂摻合物， 在低鈣或無鈣條件下，將該經乾燥之磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項46. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物， 在不含MTBE之條件下使用第二摻合溶劑使該磷脂摻合物沈澱， 在低鈣或無鈣條件下，將經沈澱之磷脂摻合物與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。 條項47. 如條項42至46中任一項之方法，其中該無鈣或較低鈣濃度為小於0.7 ppm。 條項48. 如條項42至47中任一項之方法，其進一步包含將該磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。 條項49. 如條項48之方法，其進一步包含將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。 條項50. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由如條項42至47中任一項之方法來製備該磷脂懸浮液。 條項51. 一種組合物，其包含 包含非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE且具有較低鈣濃度的磷脂溶液。 條項52. 一種組合物，其包含 包含非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE的磷脂溶液，其中該DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及該非水溶劑具有較低的合併鈣離子含量表徵值。 條項53. 如條項51或52之組合物，其中該非水溶劑包含丙二醇。 條項54. 如條項51或52之組合物，其中該非水溶劑包含丙二醇及甘油。 條項55. 條項51至54中任一項之組合物，其中該非水溶劑包含緩衝液。 條項56. 如條項55之組合物，其中該緩衝液為乙酸鹽緩衝液。 條項57. 如條項51至56中任一項之組合物，其進一步包含全氟化碳氣體。 條項58. 如條項57之組合物，其中該全氟化碳氣體為全氟丙烷。 等效物 在本文中已描述及說明數種創造性實施例的同時，一般技術者將易於設想用於進行本文所描述之功能及/或獲得本文所描述之結果及/或獲得本文所描述之優點中之一或多者的多種其他手段及/或結構，且將此類變化及/或修改中之每一者視為在本文所描述之創造性實施例之範疇內。更一般化地，熟習此項技術者將易於瞭解本文所描述之所有參數、尺寸、物質及組態意欲為例示性且實際參數、尺寸、材料及/或組態將視使用創造性教示所針對之一或多個特定應用而定。熟習此項技術者在最多使用常規實驗的情況下將認識到或能夠確定本文中所描述之特定創造性實施例的許多等效物。因此，應理解前述實施例僅借助於實施例呈現，且在所附申請專利範圍及其等效物之範疇內，創造性實施例可以與特定所描述及所主張不同之方式實踐。本發明之創造性實施例係關於本文所描述之每個單獨的特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法相互間無不一致，則兩種或多於兩種此類特徵、系統、物品、物質、套組及/或方法之任何組合包括於本發明之創造性範疇內。 如本文所定義及使用之全部定義應理解為相對於辭典定義、以引用之方式併入的文獻中的定義及/或所定義術語之普通含義起支配作用。 本文所揭示之全部文獻、專利及專利申請案關於各者所引用之主題以引用之方式併入，其在一些情況下可涵蓋文件之全文。 除非明確相反指示，否則如本文在說明書及申請專利範圍中所使用之不定冠詞「一(a)」及「一(an)」應理解為意謂「至少一」。 如本文在說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應理解為意謂如此結合之要素的「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下結合地存在且在其他情況下未結合地存在的要素。使用「及/或」列出的多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之「一或多個」要素。可視情況存在除了藉由「及/或」條項所具體鑑別之要素以外的其他要素，無論與具體鑑別之彼等要素相關或不相關。由此，作為非限制性實例，提及「A及/或B」在結合諸如「包含」之開放式措辭使用時，在一個實施例中，可僅指A (視情況包括除了B以外的要素)；在另一實施例中，可僅指B (視情況包括除了A以外的要素)；在又一實施例中，可指A及B兩者(視情況包括其他要素)；等等。 如本文在說明書及申請專利範圍中所使用，「或」應理解為具有與如上文所定義之「及/或」相同的含義。舉例而言，當分隔清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括多個要素或要素清單中之至少一者(且亦包括至少一者)及(視情況)額外未列出項目。僅明確相反指示之術語，諸如「中之僅一者」或「中之恰好一者」或當用於申請專利範圍中時「由……組成」將指包括多個要素或要素清單中之恰好一個要素。一般而言，如本文中所使用之術語「或」當放在諸如「任一者」、「中之一者」、「中之僅一者」或「中之恰好一者」、「基本上由……組成」等排他性術語之前時應僅解釋為指示排他性替代物(亦即，「一個或另一個但非兩者」)當用於申請專利範圍中時，應具有如在專利法律之領域中所使用的一般含義。 如本文在說明書及申請專利範圍中所使用，關於一或多個要素之清單的片語「至少一個」應理解為意謂選自要素清單中之任何一或多個要素的至少一個要素，但未必包括要素之清單內具體列出的每一及每個要素中之至少一者，且不排除要素清單中之要素的任何組合。此定義亦允許可視情況存在除了片語「至少一個」所指的要素之清單內具體鑑別之要素以外的要素，而無論與具體鑑別的彼等要素是相關還是不相關。由此，作為非限制性實例，「A及B中之至少一者」(或等效地「A或B中之至少一者」或，等效地「A及/或B中之至少一者」)可在一個實施例中指至少一個(視情況包括超過一個) A而不存在B (且視情況包括除B以外的要素)；在另一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個) B而不存在A (且視情況包括除A之外的要素)；在又一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個) A及至少一個(視情況包括超過一個) B (且視情況包括其他要素)；等等。 亦應理解除非明確相反地指示，否則在本文中所主張的包括超過一種步驟或行為之任何方法中，該方法之步驟或行為的順序並非必需限制於敍述該方法之步驟或動作的順序。 在申請專利範圍中以及在上文說明書中，諸如「包含」、「包括」、「攜載」、「具有」、「含有」、「涉及」、「容納」、「由……組成」及其類似者之全部過渡性片語應理解為開放的，亦即，意謂包括但不限於。僅過渡片語「由……組成」及「主要由……組成」應分別為封閉或半封閉過渡性片語，如美國專利局手冊專利考察程序章節2111.03中所闡述。
圖 1 為具有不同程度之沈澱的四種磷脂溶液之相片。該圖說明如實例中所使用之0、+、++及+++的外觀標度定義。圖 2 為展示當連續添加DPPC、MPEG5000-DPPE、DPPA及乙酸鈣時溶液外觀之相片。圖 3 為展示用於如描述於實例中之研究4之滴定溶液外觀的相片。圖 4 為用不同比例之MPEG5000-DPPE及含有較高鈣(Ca+2)水準的MPEG5000-DPPE所製備之溶液外觀的相片。圖 5 為展示由含有較高鈣或較低鈣之單獨的磷脂或磷脂摻合物所製成的磷脂含水調配物之過濾流動速率的圖表。研究19及23用較低鈣組分進行而研究20及24含有較高鈣水準(詳情參見表 6 )。每個圖示的點為各研究內在對應時間下三次連續之過濾速率量測值的平均值。圖 6 為展示由含有較高鈣或較低鈣之單獨的磷脂或磷脂摻合物所製成的磷脂非水調配物之過濾流動速率的圖表。研究33及35用較低鈣組分進行而研究34及36含有較高鈣水準(詳情參見表 9 )。每個圖示的點為各研究內在對應時間下三次連續之過濾速率量測值的平均值。

Claims (91)

  1. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料， 量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者的鈣濃度， 將該等DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含量測該非水溶劑之鈣濃度。
  3. 如請求項1之方法，其中該等DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料之合併鈣濃度量測值為較低的。
  4. 如請求項1或3之方法，其中該等DPPA、DPPC及/或MPEG-DPPE原料及該非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的。
  5. 如請求項1之方法，其中量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度。
  6. 如請求項2之方法，其中量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度且該等DPPA、DPPC、MPEG-DPPE原料及該非水溶劑之合併鈣濃度量測值為較低的。
  7. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 提供DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料， 量測該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料中之一或多者的鈣濃度， 將具有較低合併鈣濃度量測值的DPPA、DPPC及/或MPEG5000-DPPE原料與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  8. 如請求項7之方法，其中量測該非水溶劑之鈣濃度且該等DPPA、DPPC、MPEG500-DPPE原料及該非水溶劑具有較低合併鈣濃度量測值。
  9. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中該MPEG5000-DPPE原料、該DPPA原料、該DPPC原料及該非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  10. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其之一者、兩者或全部三者具有鈣濃度表徵值，其中合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  11. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇各自具有鈣濃度表徵值之MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料及DPPC原料，其中合併鈣濃度表徵值為較低鈣濃度， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  12. 如請求項11之方法，其中該非水溶劑具有鈣濃度表徵值，且該等MPEG5000-DPPE、DPPA及DPPC原料及該非水溶劑之合併鈣濃度表徵值為較低的。
  13. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  14. 如請求項11之方法，其中該非水溶劑包含(i)丙二醇或(ii)丙二醇及甘油。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該非水溶劑包含緩衝液。
  16. 如請求項13或14之方法，其中該非水溶劑包含乙酸鹽緩衝液。
  17. 如請求項13或14之方法，其中該含水溶劑包含緩衝液。
  18. 如請求項13或14之方法，其中該含水溶劑包含磷酸鹽緩衝液。
  19. 如請求項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料個別地與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。
  20. 如請求項13至18中任一項之方法，其中將該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料以無關順序之方式連續地與該非水溶劑組合，以形成該磷脂溶液。
  21. 如請求項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂混合物，且該磷脂混合物隨後與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。
  22. 如請求項13至18中任一項之方法，其中該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料彼此組合以形成磷脂摻合物，且該磷脂摻合物隨後與該非水溶劑組合以形成該磷脂溶液。
  23. 如請求項22之方法，其中使用有機溶劑溶解沈澱法形成該磷脂摻合物，該方法包含將該等DPPC、DPPA及MPEG5000-DPPE原料溶解於甲醇及甲苯之混合物中，視情況濃縮該磷脂/甲醇/甲苯混合物，且隨後使該經濃縮之磷脂/甲醇/甲苯混合物與甲基第三丁基醚(methyl t-butyl ether；MTBE)接觸以使該等磷脂沈澱，以形成該磷脂摻合物。
  24. 如請求項13至23中任一項之方法，其中該較低鈣濃度為小於115 ppm。
  25. 如請求項13至24中任一項之方法，其進一步包含將該磷脂懸浮液置放在小瓶中，且將全氟化碳氣體導入至該小瓶的頂部空間內。
  26. 如請求項25之方法，其進一步包含用該全氟化碳氣體活化該磷脂懸浮液以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。
  27. 如請求項26之方法，其進一步包含將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。
  28. 如請求項13至27中任一項之方法，其進一步包含量測該DPPA原料及/或DPPC原料及/或磷脂混合物及/或磷脂摻合物之鈣濃度。
  29. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測DPPC原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之DPPC原料與DPPA原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  30. 如請求項29之方法，其中該較低鈣濃度為小於90 ppm。
  31. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測DPPA原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之DPPA原料與DPPC原料、MPEG5000-DPPE原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  32. 如請求項31之方法，其中該較低鈣濃度為小於780 ppm。
  33. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 量測非水溶劑之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之非水溶劑與DPPA原料、DPPC原料及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  34. 如請求項33之方法，其中該較低鈣濃度為小於0.7 ppm。
  35. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  36. 如請求項35之方法，其中該MPEG5000-DPPE原料進一步表徵為不具有二價金屬陽離子或具有較低二價金屬陽離子含量。
  37. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  38. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中藉由如請求項1至37中任一項之方法來製備該磷脂懸浮液。
  39. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中係藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 量測MPEG5000-DPPE原料之鈣濃度， 將具有較低鈣濃度量測值之MPEG5000-DPPE原料與DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成該磷脂懸浮液。
  40. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中係藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 選擇表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之MPEG5000-DPPE原料， 將該MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  41. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中係藉由包含以下之方法來製備該磷脂懸浮液 將MPEG5000-DPPE原料、DPPA原料、DPPC原料及非水溶劑組合以形成表徵為不具有鈣或具有較低鈣濃度之磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  42. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在低鈣或無鈣條件下，個別地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含丙二醇(propylene glycol；PG)之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  43. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在低鈣或無鈣條件下，以無關順序之方式，連續地將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  44. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 在不含甲醇及甲苯之條件下，將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料組合以形成磷脂摻合物， 在低鈣或無鈣條件下，將該磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  45. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物， 使該摻合溶劑蒸發以形成經乾燥之磷脂摻合物， 在低鈣或無鈣條件下，將該經乾燥之磷脂摻合物與包含PG之非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  46. 一種用於製備磷脂懸浮液之方法，其包含 將DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE原料與摻合溶劑組合以形成磷脂摻合物， 在不含MTBE之條件下，使用第二摻合溶劑使該磷脂摻合物沈澱， 在低鈣或無鈣條件下，將經沈澱之磷脂摻合物與非水溶劑組合以形成磷脂溶液，及 將該磷脂溶液與含水溶劑組合以形成磷脂懸浮液。
  47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該無鈣或較低鈣濃度為小於0.7 ppm。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其進一步包含將該磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑。
  49. 如請求項48之方法，其進一步包含將該超音波顯影劑投與至個體，及獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波影像。
  50. 一種用於使個體成像之方法，其包含 將磷脂懸浮液與全氟化碳氣體組合以形成包含經磷脂囊封之氣體微球體的超音波顯影劑， 將該超音波顯影劑投與至個體，及 獲得該個體之一或多個顯影增強型超音波顯影影像，其中係藉由如請求項42至47中任一項之方法來製備該磷脂懸浮液。
  51. 一種組合物，其包含 包含非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE且具有較低鈣濃度的磷脂溶液。
  52. 一種組合物，其包含 包含非水溶劑中之DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE的磷脂溶液，其中該DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及該非水溶劑具有較低的合併鈣離子含量表徵值。
  53. 如請求項51或52之組合物，其中該非水溶劑包含丙二醇。
  54. 如請求項51或52之組合物，其中該非水溶劑包含丙二醇及甘油。
  55. 如請求項51至54中任一項之組合物，其中該非水溶劑包含緩衝液。
  56. 如請求項55之組合物，其中該緩衝液為乙酸鹽緩衝液。
  57. 如請求項51至56中任一項之組合物，其進一步包含全氟化碳氣體。
  58. 如請求項57之組合物，其中該全氟化碳氣體為全氟丙烷。
  59. 一種使個體超音波顯影成像之方法，其包含 (a) 用全氟化碳氣體活化磷脂懸浮液以形成經脂質囊封之氣體微球體，其中該磷脂懸浮液包含具有一或多種磷脂及非水溶劑之磷脂溶液，其之一或多者具有較低鈣濃度表徵值， (b) 將該經脂質囊封之氣體微球體投與至個體，及 (c) 獲得該個體之超音波影像。
  60. 如請求項59之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPC及MPEG5000-DPPE。
  61. 如請求項59之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
  62. 如請求項61之方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE係以10比82比8 (10:82:8)之莫耳%比率存在。
  63. 如請求項61之方法，其中對於DPPA之較低鈣濃度表徵值為小於780 ppm，對於DPPC為小於90 ppm，且對於MPEG5000-DPPE為小於115 ppm。
  64. 如請求項59之方法，其中該非水溶劑包含(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
  65. 如請求項59之方法，其中對於該非水溶劑之較低鈣濃度表徵值為小於0.7 ppm。
  66. 如請求項59之方法，其中該磷脂溶液不具有可偵測之磷脂沈澱。
  67. 一種使個體超音波顯影成像之方法，其包含 (a) 用全氟化碳氣體活化磷脂懸浮液以形成經脂質囊封之氣體微球體，其中該磷脂懸浮液包含具有一或多種磷脂及非水溶劑且在不含甲醇及甲苯之條件及不含甲基第三丁基醚之條件下製造的磷脂溶液，其中該等磷脂中之一或多者及非水溶劑具有較低鈣濃度， (b) 將該經脂質囊封之氣體微球體投與至個體，及 (c) 獲得該個體之超音波影像。
  68. 如請求項67之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPC及MPEG5000-DPPE。
  69. 如請求項67之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
  70. 如請求項69之方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE係以10比82比8 (10:82:8)之莫耳%比率存在。
  71. 如請求項69之方法，其中對於DPPA之較低鈣濃度為小於780 ppm，對於DPPC為小於90 ppm，且對於MPEG5000-DPPE為小於115 ppm。
  72. 如請求項67之方法，其中該非水溶劑包含(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
  73. 如請求項67之方法，其中對於該非水溶劑之較低鈣濃度為小於0.7 ppm。
  74. 如請求項67之方法，其中該磷脂溶液不具有可偵測之磷脂沈澱。
  75. 一種用於製備經脂質囊封之氣體微球體的方法，其包含 將一或多種磷脂及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中該等磷脂中之一或多者及/或該非水溶劑具有較低鈣濃度表徵值， 將該磷脂溶液與含水溶液組合以形成磷脂懸浮液，及 用全氟化碳氣體活化該磷脂懸浮液以形成經脂質囊封之氣體微球體。
  76. 如請求項75之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPC及MPEG5000-DPPE。
  77. 如請求項75之方法，其中該一或多種磷脂包含DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
  78. 如請求項77之方法，其中DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE係以10比82比8 (10:82:8)之莫耳%比率存在。
  79. 如請求項77之方法，其中對於DPPA之較低鈣濃度表徵值為小於780 ppm，對於DPPC為小於90 ppm，且對於MPEG5000-DPPE為小於115 ppm。
  80. 如請求項75之方法，其中該非水溶劑包含(a)丙二醇或(b)丙二醇及甘油。
  81. 如請求項75之方法，其中對於該非水溶劑之較低鈣濃度表徵值為小於0.7 ppm。
  82. 如請求項75之方法，其中該磷脂溶液不具有可偵測之磷脂沈澱。
  83. 一種用於製備經脂質囊封之氣體微球體的方法，其包含 在不含甲醇及甲苯且不含甲基第三丁基醚之條件下，將一或多種磷脂及非水溶劑組合以形成磷脂溶液，其中該等磷脂中之一或多者及/或該非水溶劑具有較低鈣濃度， 將該磷脂溶液與含水溶液組合以形成磷脂懸浮液，及 用全氟化碳氣體活化該磷脂懸浮液，以形成經脂質囊封之氣體微球體。
  84. 如請求項83之方法，其中該一或多種脂質包含(a) DPPC及MPEG5000-DPPE，或(b) DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE及/或(c)呈10比82比8 (10:82:8)之莫耳%比率的DPPA、DPPC及MPEG5000-DPPE。
  85. 如請求項84之方法，其中對於DPPA之較低鈣濃度為小於780 ppm，對於DPPC為小於90 ppm，且對於MPEG5000-DPPE為小於115 ppm。
  86. 如請求項83之方法，其中該非水溶劑包含(a)丙二醇，或(b)丙二醇及甘油。
  87. 如請求項83之方法，其中對於該非水溶劑之較低鈣濃度為小於0.7 ppm。
  88. 如請求項83之方法，其中該磷脂溶液不具有可偵測之磷脂沈澱。
  89. 如請求項67之方法，其中該等磷脂中之一或多者或該非水溶劑具有較低鈣濃度表徵值。
  90. 如請求項89之方法，其中該較低鈣濃度表徵值係使用原子吸收光譜法來測定。
  91. 如請求項67之方法，其中該較低鈣濃度係使用原子吸收光譜法來測定。
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