CN116254360A - 用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记、引物及其应用，包括两个InDel分子标记，分别为位于梅花1号染色体5549358～5549382bp处的InDel 9和位于梅花1号染色体6309277～6309290bp处的InDel 90。并开发了用于扩增两个InDel标记的引物。本发明的分子标记可在梅花幼苗期快速、高效的鉴定梅花单瓣、重瓣品种，准确率达100％，与传统育种等待开花需要四年左右相比，该标记应用于辅助育种具有时间早、成本低、准确、快速的优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记、引物及其应用。
背景技术
梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属蔷薇科李亚科李属，是中国传统名花，距今已有3000多年栽培历史，因其独特的观赏性状而深受人们的喜爱，花瓣数是梅花除花色，花香，瓣型，树型外的重要观赏性状之一。梅花原始品种为单瓣型，后在长期的栽培驯化过程中，出现了重瓣、台阁等具有较好观赏价值、被人们喜爱的变异品种。梅花作为木本植物，其童期较长，根据表型性状进行筛选的传统育种方法极大限制了育种效率。
分子标记是在基因水平上的标记，直接在DNA分子水平上检测遗传变异，不受组织和器官种类、发育阶段、生境条件等诸多因素的影响，多态性高、遗传稳定。插入缺失长度多态性(Insertion-Deletion Length Polymorphism,InDel)标记是在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，属于第三代分子标记，主要基于全基因组测序而开发，具有标记特异性高、稳定性好、检测方法简单、经济等优点。
张杰(张杰.梅花高密度遗传图谱构建及部分观赏性状QTL分析[D].北京林业大学，2016.)利用特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq,Specific-Locus AmplifiedFragment Sequencing)技术对梅花进行全基因组范围内的分子标记开发，构建了梅花标记密度最大的一张遗传连锁图谱，并将重瓣性状定位到梅花2号染色体116.46Mb处，同时得到一个可能与梅花重瓣性状紧密连锁的SLAF分子标记。郑唐春等(郑唐春，张启翔，刘伟超，程堂仁，王佳.一种控制梅花单、重瓣性状的的基因及其分子标记与应用)通过BSA分析，鉴定了控制梅花单瓣、重瓣的PmAP2-like基因及InDel标记，但仅在20个梅花品种中进行应用，应用范围较小。
由于此前梅花重瓣性研究不多，目前重瓣性状的分子标记报道较少，或未在品种间进行大规模的验证，无法可靠的对梅花杂交后代的单瓣、重瓣性状进行早期鉴定。因此，有必要进一步开发与梅花单瓣、重瓣连锁的分子标记，辅助梅花重瓣花的育种工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记、引物及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记，其为InDel9，位于基因组版本为Prunus mume Genome v1.0(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn/)梅花1号染色体5549358～5549382bp处，当梅花1号染色体5549358～5549382bp为ATTTTCAAACTTGTACTTATCTAT时，对应于梅花单瓣性状，当梅花1号染色体5549358～5549382bp不含ATTTTCAAACTTGTACTTATCTAT时，对应于梅花重瓣性状。
第二方面，本发明提供用于扩增所述分子标记InDel9的引物，包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和如SEQ ID NO:2所示的下游引物。
第三方面，本发明提供梅花单、重瓣性状检测试剂或试剂盒，其包含引物对SEQ IDNO:1-2。
第四方面，本发明提供所述分子标记InDel9、用于扩增InDel9的引物或包含所述引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
1)用于梅花单、重瓣性状鉴定；
2)用于梅花单、重瓣花型的早期预测；
3)用于梅花分子标记辅助育种。
第五方面，本发明提供梅花单、重瓣性状的鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测梅花基因组DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:1-2所示引物进行PCR扩增；
3)分析扩增产物：若扩增产物大小为204bp，则待测梅花为重瓣性状。
第六方面，本发明提供一种用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记，其为InDel90，位于基因组版本为Prunus mume Genome v1.0(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn/)梅花1号染色体6309277～6309290bp处，当梅花1号染色体6309277～6309290bp为TTGTATGATTGCA时，对应于梅花单瓣性状，当梅花1号染色体6309277～6309290bp不含TTGTATGATTGCA时，对应于梅花重瓣性状。
第七方面，本发明提供用于扩增所述分子标记InDel9的引物，包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物。
第八方面，本发明提供梅花单、重瓣性状检测试剂或试剂盒，其包含引物对SEQ IDNO:3-4。
第九方面，本发明提供所述分子标记InDel9、用于扩增InDel9的引物或包含所述引物的检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
1)用于梅花单、重瓣性状鉴定；
2)用于梅花单、重瓣花型的早期预测；
3)用于梅花分子标记辅助育种。
第十方面，本发明提供梅花单、重瓣性状的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取待测梅花基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-4所示引物进行PCR扩增；
(3)分析扩增产物：若扩增产物大小为234bp，则待测梅花为重瓣性状。
进一步地，本发明中所用PCR扩增体系包括：50ng/μL DNA模板1μL，10μL 2×TaqPCR mix，10μM上、下游引物各1μL，ddH2O补齐至20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40～60s(优选72℃延伸60s)，30个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。
本发明中，待测梅花品种/材料包括但不限于‘雪梅’、‘粉皮宫粉’以及它们的杂交后代。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供可在早期鉴定梅花单瓣、重瓣性状的InDel分子标记，利用标记引物InDel9 F/R或InDel90 F/R，可在梅花幼苗期快速、高效的鉴定梅花单瓣、重瓣品种，而传统育种等待开花需要四年左右，相比之下，该标记应用于辅助育种具有时间早、成本低、准确、快速的优势。
(二)本发明提供的用于早期鉴定梅花单、重瓣性状的InDel分子标记的方法，相对于SNP等其他标记类型的鉴定方法，利用普通PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测即可，无需进行测序，操作简便、快速、成本低。
(三)本发明的分子标记在69个梅花品种中进行验证，准确率为100％，因此，利用该分子标记早期鉴定梅花单瓣、重瓣品种，结果可靠。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中‘雪梅’ב粉皮宫粉’F1群体各花器官数目的频率分布。
图2为本发明较佳实施例中梅花单瓣和重瓣材料混池变异位点△(All-index)分布情况图。
图3为本发明较佳实施例中△(All-index)在0.4-0.6之间的变异位点的密度分布图。
图4为本发明较佳实施例中梅花单瓣、重瓣品种表型示图(左为单瓣品种、右为重瓣品种)。
图5为本发明较佳实施例中InDel9在69个梅花品种中扩增结果图。
图6为本发明较佳实施例中InDel90在69个梅花品种中扩增结果图。
具体实施方式
本发明提供两个早期鉴定梅花单瓣、重瓣性状的InDel分子标记，InDel 9位于基因组版本为Prunus mume Genome v1.0(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn/)梅花1号染色体5549358～5549382bp处。当梅花1号染色体5549358～5549382bp为ATTTTCAAACTTGTACTTATCTAT时，对应于梅花单瓣性状，当梅花1号染色体5549358～5549382bp不含ATTTTCAAACTTGTACTTATCTAT时，对应于梅花重瓣性状；InDel 90位于梅花1号染色体6309277～6309290bp处，当梅花1号染色体6309277～6309290bp为TTGTATGATTGCA时，对应于梅花单瓣性状，当梅花1号染色体6309277～6309290bp不含TTGTATGATTGCA时，对应于梅花重瓣性状。
利用69个梅花品种进行验证，准确率为100％。
本发明还提供两对用于扩增所述分子标记的引物，分别如下：
正向引物InDel9 F：5’-GCAAGGTCTGTCGTGGA-3’(SEQ ID NO:1)
反向引物InDel9 R：5’-GCAAAACTAATATGGTTGTAGC-3’(SEQ ID NO:2)
正向引物InDel90 F：5’-TATTGTGTTAGGTTTTCCCA-3’(SEQ ID NO:3)
反向引物InDel90 R：5’-CCAGTTTTGACTATTTCGG-3’(SEQ ID NO:4)
进一步地，本发明提供用于早期鉴定梅花单瓣、重瓣性状的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取待鉴定品种或材料的基因组DNA；
步骤2：以步骤1提取的DNA为模板，利用所述分子标记或者所述分子标记引物对对其进行PCR扩增；
步骤3：以步骤2的PCR扩增产物进行电泳分离，获取各样品的带型，如果使用InDel9 F/R引物对扩增得到204bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为重瓣梅花，如果使用InDel90 F/R引物对扩增得到234bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为重瓣梅花。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1梅花单、重瓣性状相关的InDel分子标记的开发
1、实验材料
供试材料为‘雪梅’、‘粉皮宫粉’、以及‘雪梅’ב粉皮宫粉’获得的F1分离群体。亲本在花瓣数量差异显著，母本为单瓣品种，花瓣数为5，父本为重瓣品种，花瓣平均数为23.5。所有材料种植于湖北省武汉市华中农业大学大学生活动中心梅园。
2、混合群体分离法(BSA)全基因组重测序
选取‘雪梅’ב粉皮宫粉’F1群体中10株单瓣性状子代和10株重瓣性状子代，提取DNA后等量混合分别构建单瓣和重瓣基因池。检验合格的DNA样品随机打断成长度为350bp的片段。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illumina HiSeqTM PE150进行测序。
3、BSA分析
如图1所示，‘雪梅’ב粉皮宫粉’F1群体的各花器官数目频率分布结果表明花瓣数和花瓣层数均不符合正态分布，且单瓣和重瓣后代分离比约为1:1，结合桃和月季重瓣的遗传规律，推测梅花重瓣为质量性状。在根据重瓣为显性性状进行分析时，发现单瓣和重瓣子代混池间△(All-index)的曼哈顿图显示1号染色体上有明显的峰值(图2)。进一步参考Dougherty等(2018)方法，筛选△(All-index)为0.4-0.6的变异位点并绘制密度图，结果显示Chr 1:3-14Mb区域的变异密度显著高于平均变异密度，表示其可能与梅花重瓣基因相关，故将其定为重瓣候选区间(图3)(Dougherty et al 2018)。此候选区域内共包含Δ(all-index)为0.4～0.6的变异位点17490个，包括15599个SNP位点和1891个InDel位点。
4、定位区间内InDel标记的开发
随机选取长度大于10bp的InDel位点共196个进行初步筛选。根据梅花参考基因组信息，将筛选得到的位点定位到基因组上，取该InDel位点上下游各200bp碱基序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，产物大小100-450bp，成功设计172对引物。InDel引物初筛所用的材料为‘粉皮宫粉’、‘雪梅’、‘雪梅’ב粉皮宫粉’F1代重瓣混池和F1代单瓣混池，提取其DNA进行PCR扩增。PCR扩增时，PCR扩增体系包括50ng/μLDNA模板1μL，10μL 2×Taq PCR mix，10μM上、下游引物各1μL，ddH2O补齐至20μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，经检测，172对引物均成功扩增。然后通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测到52对引物在单瓣和重瓣之间产生多态性条带。以构建单瓣混池的10个F1代单瓣个体和构建混池的10个F1代重瓣个体为材料，对初步筛选得到的52个InDel引物进行验证，经验证，得到两个与梅花单瓣、重瓣性状连锁的InDel分子标记。
实施例2梅花单、重瓣性状相关的InDel分子标记的验证
1、实验材料
本试验使用69个梅花品种，其中47个重瓣品种，22个单瓣品种(表1、图4)，所有材料保存于中国梅花研究中心(武汉)。
表1 69个梅花品种的信息
2、实验方法
使用Magen HiPure SF Plant DNAMini Kit试剂盒进行梅花品种基因组DNA的提取。以基因组DNA为模板，以InDel9 F/R或InDel90 F/R为引物进行PCR扩增，其中PCR扩增体系使用20μL扩增体系，包括：50ng/μL DNA模板1μL，10μL2×Taq PCR mix，10μM上、下游引物各1μL，添加ddH2O至20μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。使用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，如果使用InDel9 F/R引物对扩增得到204bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为重瓣梅花，如果使用InDel90 F/R引物对扩增得到234bp的片段，则说明待鉴定品种或材料为重瓣梅花。
3、实验结果
使用InDel9 F/R引物对梅花进行检测时，47个梅花重瓣品种均在204bp位置扩增出条带，22个梅花单瓣品种均未在204bp位置扩增出条带(图5)；使用InDel90 F/R引物对梅花进行检测时，47个梅花重瓣品种均在234bp位置扩增出条带，22个梅花单瓣品种均未在234bp位置扩增出条带(图6)。综上所述，InDel9 F/R和InDel90 F/R在69个梅花品种中鉴定单瓣、重瓣性状的准确率均为100％，准确率较高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.用于梅花单、重瓣性状鉴定的InDel分子标记，其特征在于，其为InDel90，位于基因组版本为Prunus mume Genome v1.0梅花1号染色体6309277～6309290bp处，当梅花1号染色体6309277～6309290bp为TTGTATGATTGCA时，对应于梅花单瓣性状，当梅花1号染色体6309277～6309290bp不含TTGTATGATTGCA时，对应于梅花重瓣性状。
2.用于扩增权利要求1述分子标记的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物和如SEQ ID NO:4所示的下游引物。
3.梅花单、重瓣性状检测试剂或试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物。
4.权利要求1所述分子标记、权利要求2所述引物或权利要求3所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
1)用于梅花单、重瓣性状鉴定；
2)用于梅花单、重瓣花型的早期预测；
3)用于梅花分子标记辅助育种。
5.梅花单、重瓣性状的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测梅花基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:3-4所示引物进行PCR扩增；
(3)分析扩增产物：若扩增产物大小为234bp，则待测梅花为重瓣性状。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所用PCR扩增体系包括：50ng/μLDNA模板1μL，10μL 2×Taq PCR mix，10μM上、下游引物各1μL，ddH2O补齐至20μL。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所用PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸40～60s，30个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。
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