CN117248073B - 一种桃果皮纯色基因相关的kasp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定桃果皮纯色的KASP标记及其应用，属于分子育种技术领域。本发明提供的KASP标记能够在桃授粉后准确判断桃果皮颜色，可以快速准确地根据育种目标进行选育，不仅可以提高桃的外观、改善品质还能缩短育种年限，同时还能有效减少人工操作费用，推进桃品质改良的商业化。
Description
技术领域
本发明属于分子育种技术领域，尤其涉及一种桃果皮纯色基因相关的KASP标记及其应用。
背景技术
桃具有营养丰富、柔软多汁等特点，文化上蕴含着丰富独特的象征意义，深受人们喜爱。近些年来，纯白、纯黄等纯色桃受到市场欢迎，但这些纯色桃多数是通过套袋技术实现的。现实情况中套袋技术的实施，不仅对果实品质发育会带来不利影响，而且会大幅度增加生产成本。桃品种资源丰富，现有栽培品种中就有一些果皮着色很少，甚至果皮纯色(不着色)的品种，如‘豫白’、‘玉美人’等，通过发掘和利用丰富的种质资源，培育果皮纯色桃品种，可以实现免套袋生产不着色桃，为丰富市场、满足不同消费需求奠定基础。
果树童期长，且以果实为生产目的，育种中很多重要表型的观评价都需要等到开花结果之后，这导致育种周期长，效率低下；同时，果树杂种实生苗田间定植需占用大量土地，管理成本高，也限制了育种规模的扩大。现代分子生物学技术的发展实现了可以利用与相关性状紧密连锁的分子标记来进行亲本选择或对杂种后代进行预先筛选，提高育种效率。但是现有技术仍有操作复杂成分过高以及准确率不足的缺陷。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供的能够鉴定果皮纯色的KASP标记有助于桃的分子辅助选择育种的发展，可以快速准确地根据育种目标进行选择，缩短育种年限。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种鉴定桃果皮纯色的KASP标记，所述KASP标记的位置为桃基因组第3号染色体上第18222033位处；在本发明中，所述桃基因组优选为第2版的桃基因组。
本发明还提供了一种用于检测上述KASP标记的引物，所述KASP标记的引物包括Purecolor-F1、Purecolor-F1和Purecolor-F1；
所述Purecolor-F1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述Purecolor-F1的序列如SEQ ID No.2所示；
所述Purecolor-F1的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种用于检测上述KASP标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物。
本发明提供了上述KASP标记、上述引物或上述试剂盒在提高桃的质量中的应用。
本发明提供了上述KASP标记、上述引物或上述试剂盒在改善桃的品质中的应用。
本发明提供了上述KASP标记、上述引物或上述试剂盒在改善桃的外观中的应用。
本发明提供了上述KASP标记、上述引物或上述试剂盒在鉴定桃果皮纯色中的应用。
本发明还提供了一种鉴定桃果皮纯色的方法，包括如下步骤：以待测桃基因组DNA为模板，利用上述的引物进行基因分型。
在本发明中，当基因分型结果为PP时，所述桃果皮为纯合非纯色类型，当基因分型结果为Pp时，所述桃果皮为杂合非纯色类型，当基因分型结果为pp时，所述桃果皮为纯色类型。桃果皮纯色和桃果皮非纯色的对比示意图如图1所示。
本发明在桃授粉后利用上述KASP标记能够准确判断桃果皮颜色，可以快速准确地根据育种目标进行选育，不仅可以提高桃的外观、改善品质还能缩短育种年限，同时还能有效减少人工操作费用(如套袋操作等)，推进桃品质改良的商业化。
附图说明
图1为桃果皮纯色和桃果皮非纯色对比示意图；
图2为IGV软件3个品种重测序变异位点图；
图3为64份种质KASP分型结果；
图4为33份实生单株KASP分型结果。
具体实施方式
实施例
1、DNA提取
采用常规CTAB法提取待测桃样品组织的DNA，去除RNA，使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，微量紫外分光光度计检测DNA浓度，浓度稀释至50～100ng/mL。
2、SNP位点及侧翼序列
SNP位点位于桃基因组第2版的第3号染色体上第18222033位处。利用IGV软件查看3个品种(果皮纯色基因型已知)重测序变异位点，显示纯色品种中桃白玉(BRY)该位点为GG，含有纯色基因的非纯色品种有明(YM)该位点为杂合AG，非纯色品种春美(CM)该位点为AA。IGV软件重测序变异位点如图2所示。
该位点附近序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示(加重有下划线处为位点)：
Pp03:18221865..18222181
TTGTAGATGTTGTAACATATATGATCACTATGTTTTACGATTCACAGAGACTAAGATACATCATGCATGGCTTCATGGCCCTTCTAGTGCTTTTTTGTGGTTGTGCATGCGTACTGAGATAAACAAGAGAAGATATAATATAGAAAACAACACGGGATGCATGTCGGCAATTGTGGATTTTAGGTTTTTTTGAATGGTATGTGATGAAAGAACCATGTGGGATAAGGAAAGAGACATTTATTGGTACCTGTTTCCTAAAAGCTTGTGAAGCCTAATGATTAGATCTACTTCATCCTCTGCAAACTCTCCTCTCTTGA
或
TTGTAGATGTTGTAACATATATGATCACTATGTTTTACGATTCACAGAGACTAAGATACATCATGCATGGCTTCATGGCCCTTCTAGTGCTTTTTTGTGGTTGTGCATGCGTACTGAGATAAACAAGAGAAGATATAATATAGAAAACAACACGGGATGCATGTCGGCGATTGTGGATTTTAGGTTTTTTTGAATGGTATGTGATGAAAGAACCATGTGGGATAAGGAAAGAGACATTTATTGGTACCTGTTTCCTAAAAGCTTGTGAAGCCTAATGATTAGATCTACTTCATCCTCTGCAAACTCTCCTCTCTTGA
3、KASP分子标记开发
KASP具有三条引物，其中两条正向引物的最后一个碱基为SNP位点，设计好两条正向引物后分别加上5’端加上荧光接头，分别为：
FAM接头：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，SEQ ID No.6，
HEX接头：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，SEQ ID No.7。
反向引物从SNP位点下游设计，最终的PCR产物长度为72bp。两条正向引物和反向引物合成序列Purecolor-F1，Purecolor-F2，Purecolor-R，选用ULTRPAGE纯化方式。
表1桃果皮纯色KASP引物序列信息
将引物干粉溶解，F1、F2浓度为36mM，R浓度为90mM，然后三种引物按体积比1:1:1混匀为Primer mix。具体的KASP反应体系如表2所示。
表2 KASP反应体系
| 成分 | 体积(mL) |
| DNA模板(50～100ng/mL) | 5 |
| KASP PCR MIX | 5 |
| 引物Primer mix | 0.14 |
KASP反应程序如表3所示。
表3 KASP反应程序
反应结束后，根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况，不同的荧光信号获得不同的基因型。
应用例1
对64份已知果皮纯色表型的种质进行KASP分子标记验证，结果如图3和表4所示。将KASP基因分型结果，用基因型表示PP、Pp、pp。PP代表纯合非纯色类型，Pp代表杂合非纯色类型，pp代表纯色类型。KASP分型图中PP、Pp和pp分别为别用蓝、红、绿三种颜色表示。从鉴定结果可以看出，在4份果皮纯色种质中，分型均为pp，与预期结果一致；在60份果皮非纯色种质中，13份为杂合Pp，47份为纯合非纯色PP。综上，果皮纯色的表型准确率为100％。
表4 64份种质KASP验证表型
应用例2
对2个实生群体已知果皮纯色表型的共33个单株进行KASP分子标记验证，结果如图4和表5所示。将KASP基因分型结果，用基因型表示PP、Pp、pp。PP代表纯合非纯色类型，Pp代表杂合非纯色类型，pp代表纯色类型。KASP分型图中Pp和pp分别为别用红和绿两种颜色表示。从鉴定结果可以看出，在4份果皮非纯色单株中，分型均为Pp，与预期结果一致；在29份果皮纯色单株中，分型均为pp。综上，果皮纯色的表型准确率为100％
表5 33份实生单株KASP验证表型
本发明提供的KASP标记具有准确度高、成本低的优势，而且操作简单、快捷，有助于桃分子辅助选择育种的发展。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用于检测KASP标记的引物，其特征在于，所述KASP标记的引物为Purecolor-F1、Purecolor-F1和Purecolor-R；
所述Purecolor-F1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述Purecolor-F1的序列如SEQ ID No.2所示；
所述Purecolor-R的序列如SEQ ID No.3所示；
所述KASP标记的位置为桃基因组第3号染色体上第18222033位处。
2.一种用于检测权利要求1所述KASP标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物。
3.权利要求1所述的引物或权利要求2所述试剂盒在鉴定桃果皮纯色中的应用。
4.一种鉴定桃果皮纯色的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测桃基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行基因分型；
当基因分型结果为AA时，所述桃果皮为纯合非纯色类型，当基因分型结果为AG时，所述桃果皮为杂合非纯色类型，当基因分型结果为GG时，所述桃果皮为纯色类型。
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