CN116121401A - 检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法，即基于PCR和Sanger测序技术快速检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法。本发明还提供一套用于检测鸡快慢羽及其纯杂合的特异性引物组合(SEQ ID NO:1‑3)。与常规方法相比，本方法无需通过测交即可快速准确地鉴定快慢羽及其纯杂合，缩短了快慢羽自别雌雄配套系建系时间，节约育种成本。

Description

检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法
技术领域
本发明属于动物遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法。
背景技术
雌鸡和雄鸡有不同的生产与经济价值，现代规模化养鸡生产中，对雏鸡进行雌雄鉴别是一项重要环节。目前雏鸡雌雄鉴别方法主要有翻肛鉴别法、伴性性状(金银羽、快慢羽等)鉴别法。翻肛鉴别是根据初生雏生殖突起的形态特征进行判定，鉴别者需要经过专业的训练，且在鉴别中易对雏鸡造成损伤。伴性性状鉴别是利用伴性遗传基因，培育专门的自别雌雄配套系进行雌雄鉴别，更直观快捷。与金银羽自别雌性相比，快慢羽不受羽色和鸡种的限制，在众多品种中都可以得到应用，是目前最广泛使用的自别雌雄方法。
快慢羽性状是伴Z染色体遗传，慢羽(K)为显性，生产中一般用快羽公鸡(ZkZk)和慢羽母鸡(ZKW)杂交，所产后代快羽均为母鸡，慢羽均为公鸡，从而实现雌雄自别。快慢羽表型判定一般在雏鸡出壳24小时内，其主翼羽长于覆主翼羽2mm以上为快羽，否则为慢羽。因此，选育出快羽系和慢羽系是实现快慢羽自别雌雄的关键。快羽相对慢羽是隐性，快羽系的建立可直接根据表型判定。慢羽公鸡中存在纯合和杂合两种基因型，传统的建系一般通过测交来鉴定，所以需要至少两个世代才能建立起慢羽纯系，耗费时间长。因此，建立快速鉴别快慢羽及其纯杂合的分子生物学方法，对缩短快慢羽建系时间、节约育种成本具有非常重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法，尤其涉及利用特异性引物对及基于PCR和Sanger测序技术快速检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于检测鸡快慢羽及其纯杂合的引物组合，所述引物组合包括两条正向引物F1、F2和一条反向引物R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2所示。
上述引物是根据Elferink等(2008)报道的鸡Z染色体上的重复序列(鸡参考基因组GRCg7b版本Z:11167618-11355728bp)开发的用于鉴别鸡快慢羽及其纯杂合的特异性引物对。基于鸡参考基因组GRCg7b版本，引物F1的位置为Z：11167565-11167588bp，引物F2的位置为Z：11355275-11355295bp，引物R的位置为Z：11167928-11167950bp。
第二方面，本发明提供含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供所述引物组合或含有所述引物组合的检测试剂或试剂盒在鉴定鸡快慢羽及其纯杂合中的应用。
第四方面，本发明提供一种检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用所述引物组合进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
进一步地，PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix 10μL，引物F1、R和F2分别为0.25μL、0.5μL和0.25μL，各引物浓度均为10μM，40-50ng/μL DNA模板1μL，ddH2O 8μL。
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，61℃30s，72℃50s，26个循环；72℃5min；4℃保存。
进一步地，步骤(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据琼脂糖凝胶电泳图的条带数鉴定快慢羽，根据条带亮度鉴定纯杂合，且待测鸡种个体的DNA模板量相同；具体如下：
1)快羽个体仅出现386bp一个条带，慢羽个体出现386bp和786bp两个条带；
2)快羽公鸡386bp条带的亮度是快羽母鸡的二倍；
3)慢羽母鸡386bp条带的亮度为L，786bp条带的亮度为L′；
慢羽杂合公鸡386bp条带的亮度为2L，786bp条带的亮度为L′；
慢羽纯合公鸡386bp条带的亮度为2L，786bp条带的亮度为2L′。
优选地，琼脂糖凝胶浓度为1.5％，上样量为6μL；电泳条件：120V，30min。
进一步地，步骤(3)通过Sanger测序检测PCR扩增产物，根据Sanger测序峰图鉴定快慢羽，根据双峰区域峰的相对高低鉴定纯杂合；具体如下：
i)快羽个体对应大小约340bp的单峰序列；
ii)慢羽个体对应大小约740bp的峰图序列，其中在约300-350bp处出现双峰峰图；
将第1个双峰记为第1位，则第17位和第31位的双峰作为分子标记用来区分慢羽纯合个体和慢羽杂合个体：
慢羽纯合个体第17位T峰高度等于或大于C峰，第31位T峰高度大于G峰；
慢羽杂合个体第17位T峰高度小于C峰，第31位T峰高度等于或小于G峰。
本发明可以从鸡血液或组织中提取DNA。
第五方面，本发明提供所述方法在鸡的雌雄鉴别和快慢羽鉴定中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供了一种用于鉴别鸡快慢羽基因型特异性引物对及检测方法，与常规方法相比，本方法无需通过测交即可快速准确地鉴定快慢羽及其纯杂合，缩短了快慢羽自别雌雄配套系建系时间，节约育种成本。
(二)本发明根据鸡Z染色体上的重复序列，开发了用于鉴别鸡快慢羽及其纯杂合的特异性引物对，引物特异性好，通过PCR扩增，即可鉴定出快慢羽及其纯杂合，具有易操作、快速、高效、准确率高等优点。
(三)本发明提供了根据胶图和测序峰图双重判定方法，可降低判定错误率，具有更高的鉴定准性。
(四)本发明有效解决了羽速鉴别受时间限制的问题。
(五)与现有的定量方法相比，本发明无需先建立各个基因型的参考范围，可直接根据胶图和测序峰图判断，更直观便捷。
(六)本发明与酶切方法相比，直接跨重复序列进行PCR扩增，无需寻找和建立酶切位点，操作更简单，应用更广泛。
(七)本发明可为鸡快慢羽基因型提供有效鉴定，也为其他物种基因型及其纯杂合鉴定提供参考。
附图说明
图1为本发明鸡Z染色体上重复片段的位置和引物设计位置的示意图。
图2和图3为本发明较佳实施例中不同浓度和循环数的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1为慢羽纯合公鸡，2为慢羽杂合公鸡，3为慢羽母鸡。
图4为本发明较佳实施例中不同基因型PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳示例图。
图5-图7为本发明较佳实施例中部分个体基因型鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。
图8为本发明较佳实施例中不同基因型PCR扩增产物的Sanger测序图。
图9为本发明较佳实施例中部分慢羽公鸡纯杂合鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明旨在提供一种基于PCR和Sanger测序技术快速检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法。该方法能快速准确地鉴定基因型、缩短快慢羽自别雌雄配套系建系时间，提高育种效率、降低育种成本。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供用于快慢羽及其纯杂合检测的特异性引物对。
具体地，本发明将Elferink等(2008)报道的鸡Z染色体上的重复序列(鸡参考基因组GRCg7b版本Z:11167618-11355728bp)作为分子标记，基于重复序列在断点前(Z：11167565-11167588)、段始(Z：11167928-11167950bp)和段尾处(Z：11355275-11355295bp)进行引物设计(图1)，引物序列分别为F1(SEQ ID NO:1)、引物R(SEQ ID NO:2)、引物F2(SEQID NO:3)。该引物能够特异性扩增从而可以根据扩增产物进行快慢羽及其纯杂合的鉴定。
第二方面，本发明提供含有所述引物对的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供快慢羽及其纯杂合鉴定方法。具体包括：
(1)待测鸡种基因组DNA提取；
(2)以提取的DNA为模板，利用引物SEQ ID NO:1-3进行PCR扩增；
(3)琼脂糖凝胶电泳与Sanger测序；
(4)基因型判定(依据电泳图、测序峰图)。
进一步地，提取待测鸡种的基因组DNA步骤可用传统的酚氯仿法提取或者试剂盒提取。
进一步地，PCR扩增体系包括：2×Taq PCR Mix 10μL，引物SEQ ID NO:1-3分别为0.25μL、0.5μL、0.25μL(浓度均为10μM)，DNA模板1μL(40-50ng/μL)，ddH2O 8μL。
进一步地，PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，61℃30s，72℃50s，26个循环；72℃5min；4℃保存。
所述琼脂糖凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，上样量为6μL，电泳电压为120V，电泳时间为30min。
所述Sanger测序可以在商业测序公司完成。
进一步地，根据电泳图进行基因型判定，具体包括：在照胶仪上进行呈像，调节呈像至条带清晰易辨。快羽个体只有F1-R引物扩增的386bp的一个条带，慢羽个体有两条带，分别是F1-R和F2-R引物扩增的386bp和786bp的条带。根据剂量效应，快羽母鸡扩增出一份386bp条带，快羽公鸡扩增出两份386bp条带，慢羽母鸡扩增出一份386bp条带和一份786bp的条带，慢羽杂合公鸡扩增出两份386bp条带和一份786bp的条带，慢羽纯合公鸡扩增出两份386bp条带和两份786bp的条带。条带亮度结果与剂量一致，386bp条带：快母≈慢母≈1/2快公≈1/2慢纯公≈1/2慢杂公，786bp条带：慢母≈慢杂公≈1/2慢纯公，慢羽杂合个体两个条带亮度基本一致，慢羽纯合个体786bp条带亮度约是386bp的二倍。根据条带的亮度，可以判定快慢羽及纯杂合，还可以进行雌雄分辨。
进一步地，根据测序峰图进行基因型鉴别，具体包括：在商业测序公司进行Sanger测序，用引物R(SEQ ID NO:2)进行测序。测序后，快羽可以看到一段约340bp的单峰序列，慢羽可以看到一段约740bp的峰图序列，在约300-350bp处呈现出双峰峰图。将第一个双峰计为第1位，可以看到约43位峰。将第17位和第31位作为分子标记，慢羽纯合个体第17位T峰高度等于或大于C峰，第31位T峰高度大于G峰；慢羽杂合个体第17位T峰高度小于C峰，第31位T峰高度等于或小于G峰。测序可区分出快慢羽及其纯杂合，不能鉴定雌雄。
第四方面，采用其他可行的技术从鸡血液或组织中提取DNA，也可用于本发明。
本发明提供的方法可在鸡的雌雄鉴别和快慢羽鉴定中应用。可避免翻肛鉴别带来的损伤，鉴定不局限于时间限制，可在鸡的任何生长时间进行，鉴别准确率高。
本发明提供的方法可在鸡的雌雄自别配套系和遗传育种中应用。在鸡快慢羽雌雄自别配套系建立初期，需要进行快慢羽及其纯杂合鉴定。本发明可避免测交，能够简单快捷的鉴定出纯杂合，缩短快慢羽建系时间、节约育种成本。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1用于鉴别鸡快慢羽及其纯杂合的方法
1.引物设计和制备
根据Elferink等(2008)报道的重复序列为分子标记，在重复序列断点前、段始和断尾处利用Primer 5软件进行引物设计，引物分别为F1、R、F2，序列如下：
引物F1：5’-GTTTGACCTGTGCTGTGGTTTGCT-3’(SEQ ID NO:1)
引物R：5’-CTGTGCCCTTCCATCAGTGCTTC-3’(SEQ ID NO:2)
引物F2：5’-GCCATCAGCCAGATCCGTCAG-3’(SEQ ID NO:3)
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2.鸡血液基因组DNA的提取
基因组DNA用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(#DP304-03)提取，提取步骤按照制造厂商说明书进行。
3.PCR条件的摸索
为了获得最佳的鉴定条件，分别对影响PCR的退火温度、循环数、DNA模板浓度进行梯度测试和琼脂糖凝胶电泳检测。在退火温度为60-70℃进行梯度测试，发现最适的退火温度为60-62℃。选择61℃进行循环数(26、28、30、32个)和DNA模板浓度的梯度测试(40ng/uL,60ng/uL,80ng/uL,100ng/uL,150ng/uL,200ng/uL)。26个循环时，各模板浓度均可进行纯杂合鉴定；28个循环时，40ng/uL和60ng/uL模板浓度可以进行鉴定；30和32个循环时，4个浓度均不能鉴定纯杂合。因此，最适的鉴定条件为：退火温度61℃，DNA模板浓度40-200ng/uL(在鉴定时要保证所有个体加入的模板量浓度基本相同)，反应循环数为26个(图2和图3)。
PCR条件摸索和下述基因型鉴定所用的2×Taq PCR Mix来自北京汇天东方科技有限公司，商品编号为HT201。
4.PCR扩增
20μL的PCR扩增体系包括：2×Taq PCR Mix 10μL，引物F1(SEQ ID NO:1)、R(SEQID NO:2)、F2(SEQ ID NO:3)分别为0.25μL、0.5μL、0.25μL(浓度均为10μM)，DNA模板1μL(40-50ng/μL)，ddH2O 8μL。
PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，61℃30s，72℃50s，26个循环；72℃5min；4℃保存。
5.琼脂糖凝胶电泳Sanger测序
琼脂糖凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶的浓度为1.5％，上样量为6μL，电泳电压为120V，电泳时间为30min，电泳后，在凝胶成像仪上进行呈像，调节呈像至条带清晰易辨。
Sanger测序：Sanger测序在北京擎科生物科技有限公司完成。
6.基因型判定
(1)根据琼脂糖凝胶电泳图进行基因型判定
快羽个体只有F1-R引物扩增出的386bp的一个条带；慢羽个体有两条带，分别是F1-R和F2-R引物扩增的386bp和786bp的条带根据剂量效应，快羽母鸡扩增出一份386bp条带，快羽公鸡扩增出两份386bp条带，慢羽母鸡扩增出一份386bp条带和一份786bp的条带，慢羽杂合公鸡扩增出两份386bp条带和一份786bp的条带，慢羽纯合公鸡扩增出两份386bp条带和两份786bp的条带(表1)。条带亮度结果与剂量基本一致，386bp条带：快母≈慢母≈1/2快公≈1/2慢纯公≈1/2慢杂公，786bp条带：慢母≈慢杂公≈1/2慢纯公。慢羽杂合个体两个条带亮度基本一致，慢羽纯合个体786bp条带亮度约是386bp的二倍。根据条带数量，可以判定快羽或慢羽，根据条带亮度，可以判定纯杂合及公母(图4-图7)。
表1不同基因型PCR扩增出的条带数
Figure BDA0003999735140000061
(2)根据测序峰图进行基因型判定
用引物R(SEQ ID NO:2)进行测序。测序后，快羽可以看到一段340bp的单峰序列，慢羽可以看到一段740bp的峰图序列，在约300-350bp处呈现出双峰峰图。导致慢羽峰图的原因：R引物至断点位置，快慢羽序列一致，测序后呈现单峰；由于慢羽中含有重复序列，过断点后快慢羽扩增出的序列不一样，所以会出现一段双峰，直至序列到达引物F1位置处；过F1引物后，只有慢羽可以扩增出F2-R片段，峰图呈现单峰直至F2引物处。由于剂量效应，双峰处纯杂合碱基浓度的相对差异导致了峰图高低的差异。将断点过后双峰区段的第一个双峰计为第1位，可以看到约43位峰，寻找纯杂合峰图高度差异明显的位点作为分子标记。本发明主要将第17位和第31位作为分子标记，慢羽纯合个体第17位T峰高度等于或大于C峰，第31位T峰高度大于G峰；慢羽杂合个体第17位T峰高度小于C峰，第31位T峰高度等于或小于G峰。根据测序峰图可判定快慢羽及其纯杂合(图8)。
7.琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序的比较
在相同的PCR扩增条件下，琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序均可以鉴定出快慢羽及其纯杂合，但琼脂糖凝胶电泳还可以根据条带的亮度鉴定出公母。
需要说明的是，(1)由于使用PCR仪和Taq酶的差异可能会造成扩增效率的差异，导致最适的PCR条件与本发明有所不同，在实践应用中，需要先进行Tm值的摸索，寻找最适Tm值，使条带亮度尽可能接近理论状态(符合剂量效应的状态)，否则判定误差较大。(2)通过胶图鉴定基因型时，要保证PCR扩增中所有待测个体加入的模板总量基本相同，否则只能鉴定出快慢羽，无法鉴定纯杂合；测序鉴定时PCR扩增的模板总量可以不一致，纯杂合鉴定受模板量影响较小。(3)在不同的PCR扩增效率下，琼脂糖凝胶电泳条带亮度和Sanger测序峰图的高度也会有所变化。在鉴定时扩增效率、条带亮度和峰图可能与本实例不完全相同，可根据本发明的判定思路，找到类似的条带亮度规律和峰图标记完成基因型鉴定。(4)鉴定过程中，如果对同性别的待测样品进行鉴定，不需要设定参照样本，根据琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序均可进行快慢羽及其纯杂合鉴定；如果对不同性别的样品进行鉴定，需要设置参考样本，建议参考样本为慢羽母鸡，PCR扩增后可通过琼脂糖凝胶电泳条带的亮度鉴定基因型及公母，也可以根据测序来鉴定基因型。
实施例2寿光鸡快慢羽鉴定
利用实施例1的方法，对已知表型的34只快羽寿光公鸡、48只慢羽寿光公鸡、74只快羽寿光母鸡、76只慢羽寿光母鸡进行基因型鉴定，所有快羽鸡均扩增出一条386bp的条带，所有慢羽鸡均扩增出两条带(386bp和786bp)，快慢羽鉴定准确率100％。48只慢羽寿光公鸡基因型鉴定纯合19只，杂合29只，与矮小鸡快羽母鸡进行测交验证，若后代出雏5个以上慢羽雏鸡和0个快羽，即判定此个体是纯合，若后代既出现快羽又出现慢羽，则判定此个体是杂合。测交结果显示，除了1个基因型鉴定为纯合的公鸡后代出现13个慢羽雏鸡和1个快羽雏鸡外，其他均符合基因型鉴定结果。对该快羽雏鸡进行基因型鉴定，发现该个体和其父亲间不符合孟德尔遗传定律，推测该个体不是纯合公鸡的后代，可能是由于种蛋收集或孵化过程中拿错种蛋或写错编号等因素造成的。因此测交结果与基因型鉴定结果一致(图9)。
实施例3地方鸡种纯杂合鉴定
利用实施例1的方法，对未知慢羽纯杂合的59只北京油鸡公鸡、27只藏鸡公鸡、17只绿壳公鸡、1只斗鸡公鸡进行基因型鉴定。结果显示，油鸡纯合37只、杂合22只；藏鸡纯合3只、杂合24只；绿壳纯合3只、杂合14只；斗鸡杂合1只。对分型后的慢羽公鸡和快羽母鸡进行测交验证，若后代出雏5个以上慢羽雏鸡和0个快羽，则判定此个体是纯合，若后代既出现快羽又出现慢羽，则判定此个体是杂合。测交结果显示，除了1只基因型鉴定为纯合的绿壳公鸡后代出现20个慢羽雏鸡和1个快羽雏鸡外，其他103只慢羽公鸡与基因型鉴定结果一致，纯杂合鉴定准确率大于99％。对该快羽雏鸡进行基因型鉴定，发现该个体和其父亲间不符合孟德尔遗传定律，推测该个体不是纯合绿壳公鸡的后代，可能是由于种蛋收集或孵化过程中拿错种蛋或写错编号等因素造成的。因此测交结果与基因型鉴定结果一致。
以上结果表明，本发明鉴定方法能够鉴别鸡种快慢羽基因型，具有较高的准确性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于检测鸡快慢羽及其纯杂合的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括两条正向引物F1、F2和一条反向引物R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:2所示。
2.含有权利要求1所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述引物组合或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在鉴定鸡快慢羽及其纯杂合中的应用。
4.检测鸡快慢羽及其纯杂合的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix 10μL，引物F1、R和F2分别为0.25μL、0.5μL和0.25μL，各引物浓度均为10μM，40-50ng/μLDNA模板1μL，ddH2O 8μL；
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，61℃30s，72℃50s，26个循环；72℃5min；4℃保存。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据琼脂糖凝胶电泳图的条带数鉴定快慢羽，根据条带亮度鉴定纯杂合，且待测鸡种个体的DNA模板量相同；具体如下：
1)快羽个体仅出现386bp一个条带，慢羽个体出现386bp和786bp两个条带；
2)快羽公鸡386bp条带的亮度是快羽母鸡的二倍；
3)慢羽母鸡386bp条带的亮度为L，786bp条带的亮度为L′；
慢羽杂合公鸡386bp条带的亮度为2L，786bp条带的亮度为L′；
慢羽纯合公鸡386bp条带的亮度为2L，786bp条带的亮度为2L′。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，琼脂糖凝胶浓度为1.5％，上样量为6μL；电泳条件：120V，30min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)通过Sanger测序检测PCR扩增产物，根据Sanger测序峰图鉴定快慢羽，根据双峰区域峰的相对高低鉴定纯杂合；具体如下：
i)快羽个体对应大小340bp的单峰序列；
ii)慢羽个体对应大小740bp的峰图序列，其中在300-350bp出现双峰峰图；
将第1个双峰记为第1位，则第17位和第31位的双峰作为分子标记用来区分慢羽纯合个体和慢羽杂合个体：
慢羽纯合个体第17位T峰高度等于或大于C峰，第31位T峰高度大于G峰；
慢羽杂合个体第17位T峰高度小于C峰，第31位T峰高度等于或小于G峰。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，从鸡血液或组织中提取DNA。
10.权利要求4-9任一项所述方法在鸡的雌雄鉴别和快慢羽鉴定中的应用。
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