CN115820570A - 一种大肠杆菌噬菌体pd300、组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于噬菌体技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌噬菌体PD300、组合物及其应用。一种大肠杆菌噬菌体PD300及其应用，其噬菌体PD300的保藏编号为CGMCC No.22363。本申请提供了一种大肠杆菌噬菌体PD300，可以防治因致病性大肠杆菌引起的宠物腹泻；用作抑菌组合物，用来预防或治疗大肠杆菌引起的腹泻；用环境杀菌消毒剂，实现对饲养环境的消毒。

Description

一种大肠杆菌噬菌体PD300、组合物及其应用

技术领域

本申请属于噬菌体技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌噬菌体PD300、组合物及其应用。

背景技术

抗生素在各种细菌性疾病领域被用来治疗各种感染。然而，随着越来越多的抗生素更加广泛的作为处方药应用在各种疾病中，已经有很大一部分细菌对抗生素产生了抗性。如今为了达到杀菌效果会使用更多剂量的更有效的抗生素来治疗更具抗性的细菌株。结果，产生了对多种抗生素具有抗性的细菌，而且部分细菌感染已变得不能治疗，由于更多抗生素的使用和显示抗性的细菌的数量增加，已导致需要使用抗生素的时间增长。如今更频繁使用广谱、非特异性抗生素，而其中的一些会产生有害效果。此外，对抗生素显示过敏反应的人畜数量似乎在增加。如此发展，抗生素的耐药性与治疗效果差的问题成为了恶性循环。

在20世纪初期首先发现了感染细菌的异质性病毒群体，即专门杀灭细菌的一类病毒，噬菌体。目前在科学研究例如分子生物学(如基因载体)和医学诊断(如细菌的噬菌体分型)中广泛使用噬菌体。因为噬菌体是天然感染并杀死细菌，且细菌是疾病的主要病因，所以传统上认为在医学治疗上可使用噬菌体，并且应用价值广泛。

噬菌体具有天然的裂解细菌的性能，一旦细菌表面含有噬菌体可以识别的受体就会被噬菌体迅速吸附，当烈性噬菌体裂解细菌时，噬菌体会停止繁殖并且从细菌体内逐渐排出，而进入环境中，产生的子代噬菌体等待时机，再次特异结合其它具有受体的细菌，正因为噬菌体直接裂解细菌，所以细菌不会对噬菌体产生耐药性，是抗生素的一个良好代替品。

随着宠物的饲养量急剧上升，现已成为家庭的重要成员，但是，由于宠物饲养管理不当，使得宠物的疾病明显增多，细菌引起的腹泻是宠物中常见病之一，宠物腹泻可能引起宠物肠道菌群失调，进一步造成宠物其他不适症状的产生，发烧、呕吐、便秘、口臭，现有的宠物腹泻的兽药治愈时间长，愈后易复发。

抗生素的滥用导致细菌耐药性的产生，传统抗生素的治疗细菌性疾病的方法已经行不通，所以急需开发新型和有用的烈性但非毒性的噬菌体治疗剂，该治疗剂可用于预防或治疗宠物由细菌性微生物引起的感染性病症并且改善肠道菌群，提高免疫力，使宠物恢复健康。

发明内容

为了获得强效大肠杆菌噬菌体，本申请提供大肠杆菌噬菌体PD300、组合物及其应用。

第一方面，本申请提供一种大肠杆菌噬菌体。

一种大肠杆菌噬菌体PD300，噬菌体PD300的保藏编号为CGMCC No.22363。

优选的，pH在3～12范围内噬菌体PD300都具有活性。

第二方面，本申请提供一种噬菌体PD300在预防和治疗大肠杆菌引起的疾病的菌剂的应用，通过以下方案实现。

噬菌体PD300为活性成分，所述的噬菌体PD300的保藏编号为CGMCC No.22363。

噬菌体PD300为活性成分，所述的噬菌体PD300的保藏编号为CGMCC No.22363。

第三方面，本申请提供一种组合物，通过以下方案实现。

一种组合物，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD300。

优选的，所述噬菌体PD300为唯一的活性物质。

优选的，所述噬菌体PD300的1×10⁷PFU/mL。

第四方面，本申请提供一种杀菌剂，通过以下方案实现。

一种杀菌剂，包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD300。

优选的，所述噬菌体PD300为唯一的活性物质。

综上，本申请至少具有以下有益效果。

1、本申请提供了一种大肠杆菌噬菌体PD300，可以防治因致病性大肠杆菌引起的宠物腹泻。

2、本申请可以用作抑菌组合物，用来预防或治疗大肠杆菌引起的腹泻。

3、本申请可以用环境杀菌消毒剂，实现对饲养环境的消毒。

4、本申请的大肠杆菌噬菌体可以在pH为3-12的范围内都具有活性，能够适合与更多的环境，与更多的试剂匹配。

说明书附图

图1：噬菌体的pH稳定性趋势图。

图2：噬菌体热稳定性效价变化趋势图。

图3：环境中大肠杆菌数量变化图。

图4：PD300治疗前粪便状态。

图5：使用PD300治疗后的正常粪便图。

图6：宠物粪便评分标准——雀巢普瑞纳系统标准。

具体实施方式

结合附图对本申请做进一步说明。

本发明的大肠杆菌噬菌体PD300，是从中国山东省潍坊市宠物毛发分离获得的，其已经于2021年4月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号是CGMCCNo.22363。

实施例1

1.菌种复苏及菌液制备

取-80℃条件保存的大肠杆菌冻存液，溶解后在MAC培养基上三区划线，于37℃温箱中过夜培养16小时，平板上得到间距适宜且菌落形态一致的单菌落，使用无菌枪头挑取单菌落，接种于5ml的NB营养肉汤中，摇床中37℃，170rpm条件下振荡培养12h，得到细菌增殖液。

2.噬菌体的分离与纯化

将宠物毛发放入盛有200ml NB营养肉汤的泡样瓶中，每个泡样瓶中按比例加入1％体积的大肠杆菌，搅拌均匀后，摇床37℃，170rpm条件下振荡过夜培养。取过夜培养的混合样品，11000rpm，离心5min，使用0.22μm的滤器进行过滤，形成噬菌体原液；将噬菌体原液与宿主菌1:1混合，37℃孵育5min后倒双层平板，待凝固后放入37℃的恒温箱中倒置培养，10h后观察结果，在培养基的菌膜上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。用无菌镊子抠取单个噬菌斑，放在1ml的营养肉汤中，使用无菌镊子夹碎单斑培养基，于摇床170rpm、37℃条件下，浸出30min得到噬菌体浸出液，11000rpm，离心5min，取上清液用双层平板法再次得到单个噬菌斑，如此重复5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑。

3.噬菌体的增殖和效价测定

各取100μl宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5ml营养肉汤中，对照组另取100μl宿主菌加入5ml NB营养肉汤中，对照组与增殖组同时放入37℃，170rpm摇床中培养6h，直至增殖组混合液由浑浊变清亮，得到噬菌体增殖液。10倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行。计数时，取统一稀释梯度噬菌斑在30～300之间的培养皿计数，噬菌斑数为：69、72、74个，计算效价为7.17×10⁹PFU/ml。噬菌体在营养琼脂培养基中形成透亮，大小、形态均一，边缘清晰且规则，直径为1.4mm的斑点。

噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10

4.噬菌体的pH稳定性检测

取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的无菌NB肉汤4.5ml，置于37℃的水浴锅中，静置10分钟待温度稳定之后，各加入500μl，效价为3.60×10⁹PFU/ml的噬菌体增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。每一组设置两个平行。作用结束之后，立即使用HCl或者NaOH调整混合液pH至7，使用双层平板法测定噬菌体的效价。

具体结果见表1和附录图1。

表1 pH稳定性噬菌体效价测定PFU/ml

可见在pH在5～10范围内噬菌体PD300效价非常稳定，维持在1×10⁹PFU/ml以上，尽管在极酸和极碱条件下噬菌体效价下降较为明显，但是该噬菌体对pH的适应范围仍然较广，应用环境多样，应用条件比较宽松，可以开拓多种应用场景。

5.测定噬菌体的最佳感染复数

依据上述3的方法增殖噬菌体PD300以及该噬菌体的宿主菌，增殖完成后测定噬菌体的效价及宿主菌的菌浓度，根据效价以及菌浓度测定结果将噬菌体PD300和宿主菌稀释至合适浓度梯度。按照噬菌体与菌的感染复数(混合比例)为10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的比例各取100μl噬菌体PD300和宿主菌加入到无菌NB肉汤中，于37℃，170rpm摇床中培养至液体变澄清，记录液体澄清时间。噬菌体澄清后，11000rpm离心5min，取离心液进行适当的稀释，用双层平板法测定噬菌体的效价，检测结果见表2。

表2噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果

结果可见噬菌体的最佳感染复数是10^-5，即噬菌体与菌液的比例为0.00001:1，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的效价为3.60×10¹⁰PFU/ml，在7个感染复数中噬菌体效价最高。

6.噬菌体的热稳定性试验

将初始效价为8.42×10⁹PFU/ml的噬菌体PD300增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下，水浴作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组，一共设置30个实验组，使用双层平板法测定噬菌体的效价，取其平均值记录如下：具体实验结果见表3和附录图2。

表3热稳定性噬菌体效价测定结果PFU/ml

温度	20min	40min	60min
				40℃	6.52×10<sup>9</sup>	6.47×10<sup>9</sup>	6.05×10<sup>9</sup>
50℃	6.30×10<sup>9</sup>	6.40×10<sup>9</sup>	6.14×10<sup>9</sup>
				60℃	3.44×10<sup>9</sup>	3.69×10<sup>9</sup>	4.53×10<sup>9</sup>
70℃	2.13×10<sup>8</sup>	2.15×10<sup>7</sup>	1.57×10<sup>6</sup>
				80℃	6.93×10<sup>4</sup>	5.77×10<sup>2</sup>	-

结果可见噬菌体在40～60℃作用1h后效价仍然很高；70℃作用1h后，虽然噬菌体效价有所下降，但是仍然保持在10⁶PFU/ml以上；80℃作用对噬菌体效价影响较大，1h后噬菌体完全失活。

由此可见PD300的热稳定性较好，对于宠物生活及应用环境的范围比较广，不会轻易失活，可以在多个场景进行使用。

实施例2

本实施例是噬菌体PD300的安全性验证。

选取60只体重相近，生长状况良好的7日龄AA肉雏鸡，分为试验组和对照组，每组各30只，使用效价为2.53×10⁹PFU/mL的噬菌体PD300灌服实验组雏鸡，每天每只雏鸡灌服200μL；使用无菌NB肉汤培养基灌服对照组雏鸡，每天每只灌服200μL，连续灌服一周，观察雏鸡健康状况，包括精神状态、体重变化等。一周之后对雏鸡进行剖检，观察脏器的变化。

实验结果显示，对照组和实验组的行为没有异常表现，在脏器中，肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等脏器正常，与对照组无明显差别，说明该噬菌体无毒、安全性高。

实施例3噬菌体PD300对环境中大肠杆菌的消毒效果。

选取部分青岛宠物医院作为实验地点，试验分为两组，对照组与试验组各9个料盘，分为3个平行、3个时间点。两组料盘表面均匀喷洒1×10⁹CFU/mL的致病性大肠杆菌各1ml；对照组喷洒生理盐水，试验组喷洒1×10⁹PFU/mL的噬菌体PD300，喷洒量为每盘各1mL。喷洒噬菌体或生理盐水后1、3、5h分别使用10ml生理盐水冲洗对照组和实验组的3个料盘，每个时间点3个平行，适当倍数稀释后检测大肠杆菌的数量。实验结果见表4上半部分，数据柱状图见图3。

表4两种噬菌体对于环境中大肠杆菌抑菌比对结果

检测结果表明，喷洒噬菌体1h后的料槽表面大肠杆菌的平均数量下降明显，抑菌率为93.1％；3h后器具表面大肠杆菌的数量持续降低，抑菌率为99.9％；5h后器具表面大肠杆菌的数量继续下降，抑菌率为99.9％。对照组喷洒生理盐水的料槽的大肠杆菌数量一直保持在10⁸CFU/ml以上，说明该噬菌体可以有效杀灭饲养环境(饲养器具)中的大肠杆菌。

使用申请人已申请的公开号为:CN111349618B中的噬菌体PD06和PD114的组合物同时进行比对实验，实验结果见表4下半部分。检测结果表明，喷洒噬菌体PD06和PD114后，1h料槽表面大肠杆菌的平均数量并未见下降趋势，于对照组基本保持一致；3h后器具表面大肠杆菌的数量开始降低，抑菌率为88.65％；5h后器具表面大肠杆菌的数量继续下降，抑菌率为99.9％，但是抑菌效率以及抑菌效果明显低于PD300(3h抑菌率99.99％)，所以优选PD300作为环境中宠物源大肠杆菌裂解噬菌体。

实施例4噬菌体对腹泻粪便中致病菌及样品裂解率的测定。

临床分离宠物源大肠杆菌总共354株，并对临床分离菌株进行血清型分析，发现主要流行血清型为O₁、O₂、O₈、O₈₈，O₂₆、O₁₅₇部分菌株为使用双层平板法测定噬菌体对临床分离菌株的裂解谱。

制备宿主菌的菌悬液，菌浓度为1×10⁹CFU/ml，使用宿主菌增殖噬菌体，效价为3.20×10⁹PFU/ml，采用10倍比稀释的方法将噬菌体稀释至合适梯度，选取354株不同地区腹泻宠物来源的大肠杆菌增殖液，取菌液110μl和噬菌体稀释液110μl充分混合，37℃条件下静置孵育5min，分别取孵育液200μl加入已融化的50℃上层培养基中，上层混合培养基倒入下层平板中，等待冷却凝固，过夜培养，观察噬菌体是否形成透亮噬菌斑。

取不同来源地不同血清型的354株大肠杆菌，裂解数量为323株。结果显示噬菌体PD300对不同来源地不同血清型的354株大肠杆菌的裂解率为91.24％具体裂解谱信息见表5。

将申请人已申请的公开号为:CN111349618B中的噬菌体PD06和PD114噬菌体组合物对上述354株大肠杆菌进行裂解，比较PD06、PD114噬菌体组合物与本次申请的大肠杆菌噬菌体PD300的裂解性差异，结果显示PD06、PD114噬菌体组合物可以裂解其中283株大肠杆菌，裂解率为79.94％。

表5不同来源地大肠杆菌噬菌体裂解情况统计

实施例5噬菌体对腹泻粪便的杀菌效果实验

选取腹泻宠物样品17份，使用噬菌体PD300对腹泻宠物粪样进行处理，设置试验组(500μl粪样+500μl PD300)，对照组(500μl粪样+500μl生理盐水)，总体积1ml，PD300初始效价为1×10⁸PFU/ml。同时放入37℃摇床，170rpm振荡培养，分别在1h、2h、4h三个时间点进行取样，10倍梯度稀释后使用倾注法检测菌含量。实验结果见表6。

表6粪便大肠杆菌菌落数结果

注：表中菌浓度单位为CFU/ml

根据实验结果得出：17份样品中16份在不同处理时间点，均出现菌浓度下降现象，4h后实验组肠杆菌含量下降接近2个滴度，说明噬菌体PD300可以有效杀灭并抑制粪便中大肠杆菌增殖，对腹泻宠物的肠道中大肠杆菌具有调节菌群平衡的效果。

实施例6噬菌体PD300对临床腹泻病例治疗效果检验

选取全国不同地区的18家宠物医院中51例细菌性腹泻的宠物犬猫，其中包括29猫、22狗，使用噬菌体PD300进行药物治疗，其中多数犬猫腹泻问题比较严重，抗生素的治疗效果并不理想，粪便不成型，偏稀软，见附图3。

使用噬菌体PD300口服治疗，按照4kg体重喂食1g的治疗方式进行拌料饲喂，每日1次，饲喂7天后观察粪便状态。其中有48例犬猫不同程度的腹泻问题得到改善，评分均降至正常范围内(2分、3分)治愈率达到94.12％，详见表7。

表7宠物治疗前后粪便状态统计表

其中治愈病例中最快见效时间为使用一次噬菌体后发现粪便已经成型、干燥，病患犬恢复正常饮食饮水；最慢见效时间在使用3次后粪便开始呈现好转，继续使用1周之后，粪便完全正常成型，食欲恢复健康且精神状态良好。康复后的粪便状态见附图4，治愈标准参考粪便评分标准，详见图6。

针对宠物的腹泻问题，不同品种、年龄段的犬猫不尽相同，由于引起腹泻的问题较为复杂，不是由于单一因素引起，所以治疗过程相对复杂，但是根据临床的治愈数和治愈率可以看出，噬菌体PD300可以有效杀灭宠物体内致病大肠杆菌，从而改善甚至治愈因其引起的腹泻问题，达到临床治疗效果。以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、结构、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种大肠杆菌噬菌体PD300，其特征在于：噬菌体PD300的保藏编号为CGMCCNo.22363。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD300，其特征在于：pH在3~12范围内噬菌体PD300都具有活性。

3.一种噬菌体PD300在预防和治疗大肠杆菌引起的疾病的菌剂的应用，其特征在于：噬菌体PD300为活性成分，所述的噬菌体PD300的保藏编号为CGMCC No.22363。

4.一种组合物，其特征在于：包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD300。

5.根据权利要求4所述的一种组合物，其特征在于：所述噬菌体PD300为唯一的活性物质。

6.根据权利要求4所述的一种组合物，其特征在于：所述噬菌体PD300效价≥1×10⁷PFU/mL。

7.一种杀菌剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体PD300。

8.根据权利要求7所述的一种杀菌剂，其特征在于：所述噬菌体PD300为唯一的活性物质。

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