CN115715775A - 表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制hpv16感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用，属于医药技术领域。本发明经过试验发现，表没食子儿茶素没食子酸酯可通过下调Wnt/β‑catenin信号通路抑制HPV16感染人类上皮细胞，抑制作用具有时间及浓度依赖性。本发明开辟了表没食子儿茶素没食子酸酯新的应用领域，可用于高危型HPV持续感染阻断治疗的药物制备，有助于推进宫颈癌等HPV相关肿瘤的早期防治，具有一定的理论意义和临床应用前景。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用。

背景技术

高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,hrHPV)持续感染是宫颈癌、头颈部鳞癌等HPV相关肿瘤的的主要危险因素，和5％的人类肿瘤相关。HPV属于乳头瘤病毒家族，是可感染上皮细胞的小型无包膜DNA病毒，目前已发现了超过100多种亚型。按人群平均感染率10％估算，我国4.3亿的适龄女性中约有4300万高危型HPV感染患者，是我国重大的公共健康挑战，疾病经济负担日益沉重。

HPV病毒颗粒通过女性生殖道上皮的微小创口进入组织，只有通过感染复层鳞状上皮的基底细胞才能完成其完整生命周期，产生新的HPV病毒颗粒进入再感染过程，通过感染--释放--再感染的循环，造成持续感染。HPV感染宿主细胞主要依赖2种病毒衣壳蛋白介导病毒和细胞的结合、内化和运输，即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。在持续感染期间，高危型HPV的DNA经常整合到宿主细胞的基因组中，最终可导致宿主细胞的恶性转化。然而目前针对HPV持续性感染并无有效药物，临床策略以随访观察为主，给患者造成极大的心理负担，也容易导致过度治疗，增加社会卫生经济压力。因此，有必要研究开发HPV感染宿主细胞的抑制剂，为阻断HPV持续感染发展为宫颈癌前病变和宫颈癌的疾病进程提供干预手段，有助于推进宫颈癌等HPV相关肿瘤的早期防治。

绿茶是一种天然药用植物，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)的化学名称为2R,3R)-5,7-二羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并吡喃-3-基-3,4,5-三羟基苯甲酸酯，分子量为458.37，分子式为C₂₂H₁₈O₁₁，是绿茶提取物的主要儿茶素，其含量占儿茶素总量的50％～60％。EGCG为2-连苯酚基苯并吡喃与没食子酸形成的酯，化学结构中含有3个芳香环和1个吡喃环，且还有8个酚羟基。EGCG为类白色固体，易溶于水，在酸性条件下较稳定，在碱性条件容易水解。现代研究表明，EGCG具有较强的抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管等生理活性。也有研究表明EGCG在抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)流感病毒等的活性上有较好的作用。同时也有研究发现EGCG可抑制COVID-19病毒的活性。这些提示EGCG有望开发成一种新型的抗病毒药物。EGCG能否抑制高危型HPV(例如HPV16)的感染，目前尚未有此方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提出表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用，发明人经过长期大量的试验发现，EGCG可通过下调Wnt/β-catenin通路抑制HPV16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依赖性，故EGCG可用于制备HPV16感染的抑制剂。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的化学结构式如式Ⅰ所示：

作为本发明的进一步改进，所述表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抑制HPV16感染的药物中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染宿主细胞中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的抑制作用具有时间依赖性。

作为本发明的进一步改进，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的抑制作用具有浓度依赖性。

第一，发明人通过EGCG作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的效应实验发现，EGCG可抑制HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞。

第二，发明人通过EGCG作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时效实验发现，EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞具有时间依赖性。

第三，发明人通过EGCG作用于HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验发现，EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有时间依赖性。

第四，发明人通过EGCG作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的量效实验发现，EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞具有浓度依赖性。

第五，发明人通过EGCG作用于HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的量效实验发现，EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有浓度依赖性。

第六，发明人通过体外人永生化角质形成系HaCat细胞实验发现，EGCG通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞。

由此可以判定，EGCG可通过下调Wnt/β-catenin通路抑制HPV16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依耐性，故EGCG可用于制备HPV16感染的抑制剂。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明经过长期大量的试验发现，EGCG可通过下调Wnt/β-catenin通路抑制HPV16假病毒感染宿主细胞，抑制作用具有时间及浓度依耐性，故EGCG可用于制备HPV16感染的抑制剂。

2.本发明发现了EGCG的新应用，为提升绿茶的开发利用提供了参考价值；同时，EGCG为天然植物成分，具有良好的生物利用度，而在绿茶中含量丰富，毒副作用偏小，来源广泛，在医疗领域具有广阔的应用前景。

3.本发明为高危型HPV持续感染的治疗提供了新方法和新思路，推动了医学进步。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的实施例1免疫荧光显微镜镜下观察EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。

图2为本发明的实施例1流式荧光分选检测到EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。与对照组结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

图3为本发明的实施例2EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时间效应图。与0h结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

图4为本发明的实施例3EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时间效应图。与0h结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

图5为本发明的实施例4EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的浓度效应图。与对照组结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

图6为本发明的实施例5EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的浓度效应图。与对照组结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

图7为本发明的实施例6EGCG抑制人永生化角质形成细胞系HaCat细胞Wnt/β-catenin通路的效应图。与对照组结果对比，*表示P＜0.05差异显著，**表示P＜0.01差异极显著。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在美国ATCC细胞库购买的人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。HaCat细胞培养条件为：DMEM高糖培养基(ATCC)+10％胎牛血清(Gibco),37℃，5％二氧化碳，pH值7.2-7.4，无菌恒温培养。细胞特性：该细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性，贴壁生长。

在MCE公司购买的EGCG(目录号:HY-13653。CAS号：989-51-5)，为类白色固体，分子量458.37，分子式C₂₂H₁₈O₁₁，纯度99.87％。所述EGCG的结构式如式Ⅰ所示：

实施例1：EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞

在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中，加入20μM EGCG(实例1-6中均为储存液(DMSO:30mg/mL)溶解)；作用8h，MOI＝100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。

由图1可知，免疫荧光显微镜镜下观察到EGCG作用后可降低HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率。由图2可知，流式荧光分选检测到EGCG作用后可降低HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率(感染率下降50.49％)。由此可知，EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。

实施例2：EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时效实验

在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中，加入10μM EGCG。分别作用0h、1h、2h和4h后，MOI＝100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。

由图3可知，EGCG分别作用1h、2h和4h后，HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降0.87％、13.29％和28.64％。由此可知，EGCG对HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞的抑制效果具有时间依赖性。

实施例3：EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验

在原代人宫颈上皮细胞中，加入10μM EGCG。分别作用0h、1h、2h和4h后，MOI＝100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。

由图4可知，EGCG分别作用1h、2h和4h后，HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降5.19％、14.52％和26.51％。由此可知，EGCG对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。

实施例4：EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞HaCat细胞的浓度效应实验

在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中，分别加入0μM、1μM、5μM和10μM EGCG。分别作用4h后，MOI＝100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。

由图5可知，1μM、5μM和10μM EGCG作用后，HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降3.62％、6.83％和19.97％。由此可知，EGCG对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。

实施例5：EGCG抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞细胞的浓度效应实验

在原代人宫颈上皮细胞中，分别加入0μM、1μM、5μM和10μM EGCG。分别作用4h后EGCG。分别作用4h后，MOI＝100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h，换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染情况。

由图6可知，1μM、5μM和10μM EGCG作用后，HPV16-GFP假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染率依次下降3.95％、7.49％和31.99％。由此可知，EGCG对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有浓度依赖性。

实施例6：人永生化角质形成细胞HaCat细胞内EGCG可下调Wnt/β-catenin信号通路

在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中，分别加入10μMEGCG和0.5μM Wnt通路抑制剂IWP-2，作用4h后，使用RT-qPCR检测β-catenin的表达水平。

由图7可知，与对照组相比，EGCG组(10μM，4h)和Wnt通路抑制剂IWP-2组(0.5μM，4h)的HaCat细胞中β-catenin的表达水平显著下降。由此可知，EGCG可下调人永生化角质形成细胞HaCat细胞的Wnt/β-catenin信号通路。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的化学结构式如式Ⅰ所示：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯在制备抑制HPV16感染的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯在抑制HPV16感染宿主细胞中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的抑制作用具有时间依赖性。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的抑制作用具有浓度依赖性。

Images