CN112569274A - 拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途。该抗宫颈癌药物中含有拳参提取物；拳参提取物具有抑制被HPV18感染的宫颈癌细胞增殖的作用；拳参提取物通过如下方法制备获得：以体积分为50％～95％的乙醇水溶液为提取溶剂，从拳参中提取得到拳参提取物；提取为加热回流提取，至少提取一次，每次提取时间为1h～4h。本发明的拳参提取物的新用途是该提取物具有较好的抑制宫颈癌细胞增殖的作用，可用于制备抗宫颈癌药物。

Description

拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途。

背景技术

拳参，为廖科植物拳参(Polygonum bistorta L.)的根茎，主要功效为清热解毒，消肿，止血；主治赤痢热泻，肺热咳嗽，痈肿瘰疬，口舌生疮，血热吐衄，痔疮出血，蛇虫咬伤等症。

HPV6/11为低危型，不能将病毒基因整合进宿主细胞，是最常见的可以引起尖锐湿尤疾病的病毒型号。而高危型的HPV病毒则可以将病毒基因整合进宿主基因中，并通过致癌基因E6、E7的表达，使细胞发生癌变。

研究显示，有超过70％的宫颈癌与HPV16和HPV18病毒相关。HPV6/11病毒可从临床鉴定为尖锐湿疣的病理组织中获得，并进行抗病毒药物研究。而高危型的HPV病毒一般很难从病理组织或者通过模型获得，目前主要通过整合了高危型HPV的癌细胞系来进行抗宫颈癌药物研究。

宫颈癌(Cervical cancer)，为发生在子宫颈的癌症，源自于不正常细胞的生长，甚至能侵袭或转移至身体其他部位。早期通常并不会有症状，而晚期时可能有不正常的阴道出血、骨盆腔疼痛。在全世界，子宫颈癌是第四常见的癌症，也是女性第四常见癌症死因。据统计，宫颈癌的发病率和死亡率均居全球第4位，2018年全球新增宫颈癌病例57万例，死亡31.1万例，分别占所有女性癌症发病和死亡的6.6％和7.5％。而同期我国宫颈癌的新发病例为10.6万例，占全球宫颈癌新发病例的18.7％，有4.8万名中国女性死于宫颈癌。

E6和E7是高危型HPV的主要致癌基因，E6蛋白通过结合并降解P53蛋白，破坏正常的细胞周期调控，促使细胞永生化；E7蛋白则通过结合并降解pRb蛋白而使其丧失抑癌功能。E6和E7蛋白在正常组织中不表达，只表达于HPV感染组织中，因此E6和E7是制备宫颈癌药物的理想靶点。

至今为止，尚未发现拳参及其提取物具有抑制宫颈癌细胞增殖、抑制宫颈癌细胞致癌基因E6、E7表达作用的研究和报道。

发明内容

为了开发新的抗宫颈癌药物，本发明提供了一种拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，该抗宫颈癌药物中含有拳参提取物；拳参提取物具有抑制被高危型HPV感染的宫颈癌细胞增殖的作用；拳参提取物通过如下方法制备获得：以体积分为50％～95％的乙醇水溶液为提取溶剂，从拳参中提取得到拳参提取物；提取为加热回流提取，至少提取一次，每次提取时间为1h～4h。

进一步地，高危型HPV包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV61。

进一步地，拳参提取物具有抑制HPV致癌基因E6和E7表达的作用。

进一步地，高危型HPV为HPV18。

进一步地，拳参提取物通过抑制HPV18致癌基因E6和E7的表达来抑制被HPV18感染的宫颈癌细胞增殖。

本发明还涉及一种抗宫颈癌药物，其含有上述拳参提取物。

本发明还涉及一种抗宫颈癌组合物，其含有上述拳参提取物。

本发明的拳参提取物的新用途是该提取物具有较好的抑制宫颈癌细胞增殖的作用，可用于制备抗宫颈癌药物或者抗宫颈癌组合物。尤其是拳参提取物对HPV18型宫颈癌细胞HeLa的增殖有显著的抑制作用。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是拳参提取物对HaCaT细胞、HeLa细胞的IC50。

图2是总RNA完整性。M:DL2000为显示核酸大小的电泳Marker；Hela RNA标曲为用于做标准曲线的HeLa细胞总RNA；拳参提取物50μg/mL为实验组HeLa细胞总RNA；EGCG 50μM为阳性药物对照组HeLa细胞总RNA；对照为药物溶媒组HeLa细胞总RNA。

图3是HPV18 E6标准曲线。

图4是HPV18 E7标准曲线。

图5是HPV18 GAPDH标准曲线。

具体实施方式

本发明以下实施例中所涉及的百分比，除特别说明外，均为质量百分比。

实施例1拳参提取物的制备

称取拳参药材粗粉适量，加10倍量50％乙醇回流提取1次，lh/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至相对于含生药量1g/mL，浓缩液加水稀释至相当于含生药量0.25g/mL，充分搅拌均匀，静置过夜，离心得上清液，上清液减压浓缩至浸膏，浸膏冷冻干燥即得拳参提取物(其中鞣质含量35％)。

实施例2、拳参提取物的制备

称取拳参药材粗粉适量，加10倍量70％乙醇回流提取3次，2h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至相对于含生药量1g/mL，浓缩液加水稀释至相当于含生药量0.25g/mL，充分搅拌均匀，静置过夜，离心得上清液，上清液减压浓缩至浸膏，浸膏冷冻干燥即得拳参提取物(其中鞣质含量40％)。

实施例3、拳参提取物的制备

称取拳参药材粗粉适量，加10倍量95％乙醇回流提取2次，4h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至相对于含生药量lg/mL，浓缩液加水稀释至相当于含生药量0.25g/mL，充分搅拌均匀，静置过夜，离心得上清液，上清液减压浓缩至浸膏，浸膏冷冻干燥即得拳参提取物(其中鞣质含量43％)。

实施例4拳参提取物对HeLa细胞的增殖抑制作用

实验材料：

细胞：HaCaT细胞(人类永生化表皮细胞)、HeLa细胞(一种宫颈癌细胞系)，购自中科院细胞库。

受试药物：拳参提取物(实施例1制备的样品)，溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，制备得60mg/mL母液。

实验方法：HeLa细胞、HaCaT细胞按常规方法培养，次日接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度药物测试液，置细胞培养箱培养48小时。取出96孔板，加入CCK-8检测液进行检测。实验结果如表1、表2和图1所示。

表1、拳参提取物对HaCaT细胞的抑制率

表2、拳参提取物对HeLa细胞的抑制率

以上的实验结果表明，拳参提取物对宫颈癌细胞株HeLa的增殖具有抑制作用，且表现出浓度依赖性。抑制作用具有一定的选择性，相同药物浓度下，对HPV阳性的宫颈癌细胞HeLa的抑制作用强于HPV阴性的普通角质细胞HaCaT。尤其是拳参提取物的药物剂量在100μg/mL左右时，对HPV阳性的宫颈癌细胞HeLa的抑制作用显著强于HPV阴性的普通角质细胞HaCaT。拳参提取物对两种细胞的抑制率差异从另一方面也证明拳参提取物的安全性，即拳参提取物对HPV阴性细胞的毒性要低于HPV阳性的细胞。

实施例5拳参提取物对HeLa细胞E6/E7表达的抑制作用

实验材料：

细胞：HeLa细胞，购自中科院细胞库。

受试药物：拳参提取物(实施例2制备的样品)，溶解于DMSO中，制备得60mg/mL母液。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，溶解于DMSO中，制备得100mM母液。

实验方法：HeLa细胞按常规方法培养，次日接种于12孔板，待细胞贴壁后，加入50μg/mL拳参药物测试液，置细胞培养箱培养。48小时后提取细胞总RNA，利用随机引物反转录生成cDNA作为模板，应用相对标准曲线法对HPV18 E6和E7进行定量PCR分析基因表达情况，使用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行归一化处理。其中，HPV18 E6的扩增引物对如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；扩增产物如SEQ ID NO.3所示。HPV18 E7的扩增引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；扩增产物如SEQ ID NO.6所示。GAPDH的扩增引物对如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；扩增产物如SEQ ID NO.9所示。实验结果如表3、图2-5所示。

表3、拳参提取物对HeLa(HPV18)细胞E6、E7 mRNA的下调作用

图2的结果显示提取的HeLa细胞总RNA条带清晰完整。图3-5显示各项参数符合定量PCR的要求。表3的结果表明，拳参提取物作用HPV18型宫颈癌细胞48小时后，与对照组相比，对HPV E6/E7 mRNA的表达均有显著抑制作用。

综上所述，拳参提取物对宫颈癌细胞的增殖具有很好的抑制作用，可用于制备抗宫颈癌药物，或者进一步制成抗病毒药物组合物。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心

<120> 拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途

<130> CN101-20001PICN

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ctatagaggc cagtgccatt cg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ttatacttgt gtttctctgc gtcg 24

<210> 3

<211> 79

<212> DNA

<213> human papilloma virus 18

<400> 3

ctatagaggc cagtgccatt cgtgctgcaa ccgagcacga caggaacgac tccaacgacg 60

cagagaaaca caagtataa 79

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

taatcatcaa catttaccag cccg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

cgtctgctga gctttctact acta 24

<210> 6

<211> 163

<212> DNA

<213> human papilloma virus 18

<400> 6

taatcatcaa catttaccag cccgacgagc cgaaccacaa cgtcacacaa tgttgtgtat 60

gtgttgtaag tgtgaagcca gaattgagct agtagtagaa agctcagcag acgaccttcg 120

agcattccag cagctgtttc tgaacaccct gtcctttgtg tgt 163

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

cagggctgct tttaactctg gtaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

gggtggaatc atattggaac atgt 24

<210> 9

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

cagggctgct tttaactctg gtaaagtgga tattgttgcc atcaatgacc ccttcattga 60

cctcaactac atggtttaca tgttccaata tgattccacc c 101

Claims (7)

1.一种拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，其特征在于，所述抗宫颈癌药物中含有所述拳参提取物；所述拳参提取物具有抑制被高危型HPV感染的宫颈癌细胞增殖的作用；所述拳参提取物通过如下方法制备获得：以体积分为50％～95％的乙醇水溶液为提取溶剂，从拳参中提取得到所述拳参提取物；所述提取为加热回流提取，至少提取一次，每次提取时间为1h～4h。

2.如权利要求1所述的拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，其特征在于，所示高危型HPV包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV61。

3.如权利要求1所述的拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，其特征在于，所述拳参提取物具有抑制HPV致癌基因E6和E7表达的作用。

4.如权利要求1所述的拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，其特征在于，所示高危型HPV为HPV18。

5.如权利要求4所述的拳参提取物在制备抗宫颈癌药物中的用途，其特征在于，所述拳参提取物通过抑制HPV18致癌基因E6和E7的表达来抑制被HPV18感染的宫颈癌细胞增殖。

6.一种抗宫颈癌药物，其特征在于，含有如权利要求1所述的拳参提取物。

7.一种抗宫颈癌组合物，其特征在于，含有如权利要求1所述的拳参提取物。

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