CN115813891A - 棉酚在抑制hpv16感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了棉酚在抑制HPV16感染中的应用,属于医药技术领域。发明人经过长期大量的试验发现,棉酚可通过下调Wnt/β‑catenin信号通路抑制HPV16感染人类上皮细胞,抑制作用具有时间及浓度依赖性。本发明开辟了棉酚新的应用领域,可用于高危型HPV持续感染阻断治疗的药物制备,有助于推进宫颈癌等HPV相关肿瘤的早期防治,具有一定的理论意义和临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及棉酚在抑制HPV16感染中的应用。
背景技术
高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hr HPV)持续感染是宫颈癌、头颈部鳞癌等HPV相关肿瘤的的主要危险因素,但是临床上对此并无有效药物,是影响我国人群尤其是育龄期女性健康的重大公共卫生问题。HPV属于乳头瘤病毒家族,是可感染上皮细胞的小型无包膜DNA病毒,目前已发现了超过100多种亚型。高危型HPV(如HPV16等)的感染和5%的人类肿瘤相关,包括了宫颈、外阴、阴道、肛门、阴茎和口咽部肿瘤。
HPV感染宿主细胞主要依赖2种病毒衣壳蛋白介导病毒和细胞的结合、内化和运输,即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPV是极富人类物种特异性和组织特异性的病毒,对子宫颈等处的复层鳞状上皮具有高度组织嗜性。病毒颗粒通过女性生殖道上皮的微小创口进入组织,只有通过感染复层鳞状上皮的基底细胞才能完成其完整生命周期,产生新的HPV病毒颗粒进入再感染过程,通过感染--释放-- 再感染的循环,造成持续感染。在持续感染期间,高危型HPV的DNA 经常整合到宿主细胞的基因组中,最终可导致宿主细胞的恶性转化。然而目前针对HPV持续性感染并无有效药物,临床策略以随访观察为主,给患者造成极大的心理负担,也容易导致过度治疗,增加社会卫生经济压力。因此,有必要研究开发HPV感染宿主细胞的抑制剂,为阻断HPV持续感染发展为宫颈癌前病变和宫颈癌的疾病进程提供干预手段。
棉酚(gossypol)是一种多酚类化合物,是锦葵科草棉、树棉或棉花种子、根皮萃取物。棉酚的含量会随着棉花的品种,种植区域的气候和土壤,水分的不同而变化;在棉花的不同成熟期,棉酚的含量也是在不断变化的;棉酚在棉籽中含量随着棉花的成熟而增加,棉花成熟后其含量最高。棉酚的化学结构为1,1’,6,6’,7,7’-六羟基-3,3’ -二甲基-5,5’-二异丙基-2,2’-联萘-8,8’-二醛,分子式为C300H30O8,分子量为518.55,有两种旋光异构体。因为其含有六个羟基和两个醛基,故可溶于大多数有机溶剂。棉酚作为一种具有多羟基双萘醛结构的天然产物,因其具有广泛的生物活性而备受关注。研究发现棉酚具有抗炎、抗氧化、抗寄生虫、抗生育及抗肿瘤等多种生物学作用。同时,棉酚也具有一定的抗病毒作用。那么棉酚能否抑制高危型HPV (例如HPV16)的感染,目前尚未有此方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提出棉酚在抑制HPV16感染中的应用,发明人经过长期大量的试验发现,棉酚可通过下调Wnt/β-catenin通路抑制HPV16假病毒感染宿主细胞,抑制作用具有时间及浓度依赖性,故棉酚可用于制备HPV16感染的抑制剂。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供棉酚在抑制HPV16感染中的应用。
作为本发明的进一步改进,所述棉酚在抑制HPV16感染宿主细胞中的应用。
作为本发明的进一步改进,所述棉酚在制备抑制HPV16感染的药物中的应用。
作为本发明的进一步改进,所述棉酚的化学结构式如式Ⅰ所示:
作为本发明的进一步改进,所述棉酚的抑制作用具有时间和浓度的依赖性。
第一,发明人通过棉酚作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的效应实验发现,棉酚可抑制HPV16-GFP 假病毒感染HaCat细胞。
第二,发明人通过棉酚作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时效实验发现,棉酚抑制HPV16-GFP 假病毒感染HaCat细胞具有时间依赖性。
第三,发明人通过棉酚作用于HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验发现,棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有时间依赖性。
第四,发明人通过棉酚作用于HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的量效实验发现,棉酚抑制HPV16-GFP 假病毒感染HaCat细胞具有浓度依赖性。
第五,发明人通过棉酚作用于HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的量效实验发现,棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞具有浓度依赖性。
第六,发明人通过体外人永生化角质形成系HaCat细胞实验发现,棉酚可下调Wnt/β-catenin信号通路。
由此可以判定,棉酚可通过下调Wnt/β-catenin通路抑制HPV16 假病毒感染宿主细胞,抑制作用具有时间及浓度依耐性,故棉酚可用于制备HPV16感染的抑制剂。
本发明具有如下有益效果:
1.发明人经过长期大量的试验发现,棉酚可通过下调Wnt/β -catenin通路抑制HPV16假病毒感染宿主细胞,抑制作用具有时间及浓度依耐性,故棉酚可用于制备HPV16感染的抑制剂。
2.本发明发现了棉酚的新应用。我国是一个产棉大国,每年棉酚的提取量约1.75万吨,为提升棉酚的开发利用提供了参考价值;同时,棉酚为天然植物成分,具有良好的生物利用度,毒副作用偏小,来源广泛,研究棉酚及其衍生物的新用途,在医疗领域具有广阔的应用前景,对我国意义重大。
3.本发明为高危型HPV持续感染的治疗提供了新方法和新思路,推动了医学进步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例1免疫荧光显微镜镜下观察棉酚抑制 HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。
图2为本发明的实施例1流式荧光分选检测到棉酚抑制 HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。与对照组结果对比,*表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
图3为本发明的实施例2棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时间效应图。与0h结果对比,* 表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
图4为本发明的实施例3棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时间效应图。与0h结果对比,*表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
图5为本发明的实施例4棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的浓度效应图。与对照组结果对比, *表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
图6为本发明的实施例5棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的浓度效应图。与对照组结果对比,*表示P<0.05 差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
图7为本发明的实施例6棉酚抑制人永生化角质形成细胞系 HaCat细胞Wnt/β-catenin通路的效应图。与对照组结果对比,*表示 P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在美国ATCC细胞库购买的人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。 HaCat细胞培养条件为:DMEM高糖培养基(ATCC)+10%胎牛血清(Gibco),37℃,5%二氧化碳,PH值7.2-7.4,无菌恒温培养。细胞特性:该细胞源自一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤,角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋白阳性,贴壁生长。
在MCE公司购买的棉酚(目录号:HY-13407。CAS号:303-45-7),分子量518.55,分子式C30H30O8,纯度99.56%。所述棉酚的结构式如式Ⅰ所示:
实施例1:棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞
在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中,加入20μM棉酚(实例 1-6中均为储存液(DMSO:33.33mg/mL)溶解);作用8h,MOI=100 的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h,换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测 HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。
由图1可知,免疫荧光显微镜镜下观察到棉酚作用后可降低 HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率。由图2可知,流式荧光分选检测到棉酚作用后可降低HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率(感染率下降84.27%)。由此可知,棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞。
实施例2:棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞系HaCat细胞的时效实验
在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中,加入10μM棉酚。分别作用0h、2h、4h和8h后,MOI=100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h,换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。
由图3可知,棉酚分别作用2h、4h和8h后,HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降12.97%、55.67%和88.90%。由此可知,棉酚对HPV16-GFP假病毒感染HaCat细胞的抑制效果具有时间依赖性。
实施例3:棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的时效实验
在原代人宫颈上皮细胞中,加入10μM棉酚。分别作用0h、2h、 4h和8h后,MOI=100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药) 12h,换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染情况。
由图4可知,棉酚分别作用2h、4h和8h后,HPV16-GFP假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降4.44%、56.36%和86.67%。由此可知,棉酚对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。
实施例4:棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染人永生化角质形成细胞HaCat细胞的浓度效应实验
在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中,分别加入0μM、5μM、 10μM和20μM棉酚。分别作用4h后,MOI=100的HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h,换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP假病毒对HaCat 细胞的感染情况。
由图5可知,5μM、10μM和20μM棉酚作用后,HPV16-GFP 假病毒对HaCat细胞的感染率依次下降17.17%、58.23%和84.76%。由此可知,棉酚对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有时间依赖性。
实施例5:棉酚抑制HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞细胞的浓度效应实验
在原代人宫颈上皮细胞中,分别加入0μM、5μM、10μM和20 μM棉酚。分别作用4h后棉酚。分别作用4h后,MOI=100的 HPV16-GFP假病毒感染(感染时不撤药)12h,换液培养72小时后分别通过免疫荧光显微镜镜下观察和流式荧光分选检测HPV16-GFP 假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染情况。
由图6可知,5μM、10μM和20μM棉酚作用后,HPV16-GFP 假病毒对原代人宫颈上皮细胞的感染率依次下降8.99%、54.71%和 87.67%。由此可知,棉酚对HPV16-GFP假病毒感染原代人宫颈上皮细胞的抑制效果具有浓度依赖性。
实施例6:人永生化角质形成细胞HaCat细胞内棉酚可下调Wnt/ β-catenin信号通路
在人永生化角质形成细胞HaCat细胞中,分别加入10μM棉酚和 0.5μM Wnt通路抑制剂IWP-2,作用4h后,使用RT-qPCR检测β -catenin的表达水平。
由图7可知,与对照组相比,棉酚组(10μM,4h)和Wnt通路抑制剂IWP-2组(0.5μM,4h)的HaCat细胞中β-catenin的表达水平显著下降。由此可知,棉酚可下调人永生化角质形成细胞HaCat 细胞的Wnt/β-catenin信号通路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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